Summary
HOXD gener er regulerings gener ofte forbundet med tumorer i de voksne organismer. Vi undersøgt deres komparative udtryk ved immunhistokemiske og real-time PCR analyse, i normal og inflammatoriske nasal mucosae og sinonasal neoplasmer for at bruge dem som mulige diagnostiske og terapeutiske mål.
Abstract
OTX HOXD (HB) gener er udtrykt under embryonale morfogenese og under udviklingen af Lugtepithelet i voksen organismer. Mutationer i disse gener er ofte knyttet til tumordannelse i human. Ingen data er tilgængelige i dag med hensyn til den mulige sammenhæng mellem OTX gener og tumorer i næsehulen. Formålet med dette arbejde er at forstå, hvis OTX1 og OTX2 kan betragtes som molekylære markører i udviklingen af nasal tumorer. Vi valgte nasal og sinonasal adenocarcinomer at undersøge udtryk for OTX1 og OTX2 gener gennem immunhistokemiske og real-time PCR analyser. Både OTX1 og OTX2 var fraværende i alle prøver af sinonasal tarm-Type adenocarcinomer (ITACs). OTX1 mRNA blev identificeret kun i Non-tarm Type adenocarcinomer (NITACs), mens OTX2 mRNA blev udtrykt kun i olfaktoriske Neuroblastomas (ONs). Vi har demonstreret, at den differentiale genekspression for både OTX1 og OTX2 gener kan være en nyttig Molekylær markør for at skelne de forskellige typer af sinonasal tumorer.
Introduction
OTX HB gener er de hvirveldyr homolog Drosophila orthodenticle gener (otd) og de koder for transkriptionsfaktorer, der udtrykkes normalt i løbet af embryonale morfogenese, men de kan også udtrykkes i den voksne organisme med forskellige funktioner . Under fosterudviklingen kontrollerer de specifikation af celle-id'et, Celledifferentiering og positionering af kroppen axis¹. Familien OTX omfatter OTX1 og OTX2 gener, som viser forskellige funktioner. OTX1 er involveret i hjernen og sanseorgan udvikling. Den voksne organisme, det er udtrykt i sanseorganer og er transskriberet på et lavt niveau i den anteriore lap på hypofysen2; det spiller også en rolle i bloddannelsen, udtrykkes i hæmatopoietisk pluripotente og stamfader celler3. OTX2 er involveret i udviklingen af den rostralt hoved og sin oversatte protein-fungerer som en morphogen fordi det genererer et forløb gennem hvilke andre gener er aktiveret eller undertrykt i en spatio-temporale måde og dermed bidrage til celle spredning og differentiering. I den voksne organisme findes OTX2 udelukkende i chorioideus plexus og pinealkirtlen4.
Mutationer i OTX gener er ofte knyttet til udseendet af menneskets medfødte, somatiske eller metabolisk mangler. Tab eller gevinst mutationer i gener, OTX kunne fremme tumordannelse, hvis de ikke er i stand til korrekt styrer cellulære vækst og/eller differentiering5. I leukæmi og lymfomer samt mange solide tumorer (fx medulloblastomas6, aggressive ikke-Hodgkin lymfomer2, bryst karcinomer7, tyktarms-og endetarmskræft8og Retinoblastom9), den dereguleret udtryk for OTX HB gener er veldokumenteret10. Derudover er OTX2 mutationer blevet påvist i tilfælde af anophthalmia og microphtalmia11 på grund af den afgørende rolle for dette gen i kontrollen af øjet udvikling.
I forbindelse med solid neoplasmer er opdagelsen af molekylære og fænotypiske markører en vigtig udfordring for diagnose, klassificering og behandling af flere typer af tumor11, herunder dem, der har oprindelse i næsehulen og paranasalis bihuler. Faktisk, trods at disse områder indtager kun et beskedent anatomiske rum, slimhinde epitel, kirtler, bløde væv, knogler, brusk eller neural/neuroectodermal, og hematolymphoid celler kan ofte stedet for oprindelsen af komplekse og histologisk adskiller grupper af tumorer. Forskellige typer af neoplasmer involverer sinonasal tarmkanalen præsentere en række funktioner, der overvinde hvad der normalt ses i den øverste aerodigestive tarmkanalen eller endda hele de fleste dele af kroppen12. Sinonasal maligne sygdomme er sjældne og fremlægge en årlig incidens af 1:100,000 indbyggere på verdensplan, og så forhindrer undersøgelser vedrørende veje involveret i tumordannelse og afprøvning af alternative behandling strategier. På trods af dette fremskridt i imaging teknikker, har kirurgisk tilgange, og strålebehandling forbedret den kliniske behandling af sinonasal kræft. Desuden udviklingen af cellelinjer og dyremodeller samt kræft genetisk profilering i øjeblikket udgør grundlaget for fremtidige målrettede anticancer behandlinger13. Til dato, er der ingen rapporter om OTX1 og/eller OTX2 udtryk i neoplasmer af næsehulen, paranasalis bihuler og nasopharynx. Da vi har tidligere observeret at OTX1 og OTX2 er involveret i bryst kræft7, vi spekulerede på, hvis disse gener kan være til stede i normale næseslimhinden, men også i tumorer af næsehulen. At nå dette mål, vi fik fra Institut patologi af den "Ospedale di Circolo" i Varese prøver af normale slimhinde og nasal og sinonasal adenocarcinomer indsamlet fra 1985 til 2012 og klassificeret ifølge World Health organisation (WHO) klassificering af hoved og hals tumorer. Vi vælger at analysere dem gennem real-time PCR og Immunhistokemi analyser og vi vurderet, OTX1 og OTX2 udtryk for at afgøre, om de kan anses molekylære markører for disse typer af tumorer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle undersøgelser blev udført ifølge erklæringen fra Helsinki (1975) med skriftlig informeret samtykke og godkendt af den etiske komité, Universitet Insubria i Varese.
1. indsamling af prøver
- Indsamle og dele alle de menneskelige Formalin-Fixed Paraffin-Embedded (FFPE) prøver i forskellige undergrupper ifølge WHO klassifikationen af hoved og hals tumorer14.
Bemærk: Her vi brugte følgende prøver: Normal sinonasal slimhinde som kontrol (10 prøver); Inverteret Papilloma (IP, ICD-O kode 8121/1); Sinonasal ITAC (ICD-O kode 8144/3, 32 prøver); NITAC (ICD-O code 8140/3, 12 prøver); Adenoid cystisk karcinom (ACC, ICD-O kode 8200/3); Polymorfe adenom (PA, ICD-O kode 8941/3); PÅ (ICD-O kode 9522/3, 13 prøver); Dårligt differentieret neuroendokrine karcinom (PDNEC, ICD-O kode 8041/3, 19 prøver); Neuroendokrine Tumor (netto, ICD-O kode 8041/3).
2. immunochemistry
-
Deparaffinization og rehydrering af sektioner
- Varme prøve dias i en ovn ved 60 ° C i 30 min og rehydrere 3 µm tykt FFPE sektioner ved hjælp af en alkohol-serien til vand.
- Kort vaske dias i xylen i 10 minutter og Gentag dette trin; vask dias i 5 min i 100% alkohol og Gentag dette trin, ved hjælp af 95%, 85% og 75% alkohol seriefremstillede. Skyl dias i 5 min i destilleret vand.
-
Blokerer den endogene aktivitet
- Bloker den endogene aktivitet ved at placere dias i 3% vandig hydrogenperoxid i 12 min.
-
Antigen hentning
- Udføre antigen hentning ved at behandle med 10 mM citratbuffer (pH 6) i 10 min i en mikrobølgeovn behandling.
-
Inkubering med primær antistof
- Vaske sektioner i TBS buffer (pH 7,4), derefter tilføje blokerende løsning i 10 min.
- Vaske sektioner i TBS buffer (pH 7,4), hvorefter der tilsættes 0,2% Triton X.
- Der inkuberes natten over ved 4 ° C med gede-anti-humant OTX2 antistof fortyndet 1: 100.
-
Inkubering med sekundær antistof
- Inkuber sektioner i 1 time ved stuetemperatur med biotinylated kanin anti-gede sekundær antistof fortyndet 1:200 efterfulgt af ABC-peroxidase kompleks (Se Tabeller af materialer).
-
Udvikle immunoreaction
- Udvikle immunoreaction ved hjælp af 3, 3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride og counterstain kerner med Harris Hematoxylin.
-
Montering og billedbehandling
- Dehydrere sektioner ved hjælp af en halvmåne alkohol-skala og afklare dem ved hjælp af en clearing stof af terpen oprindelse (Se Tabel af materialer). Integrere sektioner i montering medium, placere dele på et objektglas, og observere afsnittene gennem et optisk mikroskop.
3. RNA udvinding og omvendt-transskription
-
RNA udvinding
- Uddrag RNA fra sektionerne ved at udføre de første trin i immunoprecipitation protokol (Se afsnit 2.1) og holde dias i destilleret vand. Overlap de unstained sektioner med den tilsvarende hæmatoxylin-eosin farves sektioner for at identificere fragmenter af interesse.
- Udføre RNA udvinding ved hjælp af en kommerciel RNA udvinding kit for FFPE prøver (Se Tabel af materialer) og følgende producentens anvisninger.
-
RNA reverse-transskription
- Brug en kommerciel kit til retro-transskribere RNA i cDNA (Se Tabel af materialer) efter protokollen. Retro-transskribere mindst 1.000 ng af total RNA til at udføre flere analyser.
4. real-time PCR og dataanalyse
-
Real-time PCR
- Udføre kvantitative real-time PCR analyser (qRT-PCR) med sonde-baseret teknologi (Se Tabel af materialer) og en termisk cycler.
-
Forberedelse af PCR-mastermix
- Forberede PCR-mastermix bruger 12,5 µL af sonde-baserede master mix, 1,25 µL af OTX1, OTX2 og ACTB sonder (Se Tabel af materialer), 50 ng af cDNA, og nukleasen-gratis vand op til 25 µL af samlede volumen.
- Udføre alle reaktioner i tre eksemplarer ved hjælp af ACTB-gen som endogen kontrol til at normalisere gen expression niveauer.
- Centrifugeres plade på 1,109 x g i 3 min og gemme på pladen, beskyttet mod lys ved 4 ° C indtil eksperimentet.
-
Indstilling af den termiske cycler
- Sæt den termiske cycler profil med en indledende hot start cyklus ved 50 ° C i 2 min. og 95 ° C i 10 min, efterfulgt af 40 cyklusser ved 95 ° C til 15 s og en sidste cyklus på 60 ° C i 1 minut.
-
Gen expression niveau analyser
- Normalisere gen expression niveauer gennem metoden sammenlignende cyklus tærskel (ΔCt) ved hjælp af ACTB-gen som endogen kontrol.
- Evaluere gen expression niveauer ved hjælp af metoden 2-ΔCt og plot resultaterne.
-
Statistiske analyser
- Udføre statistiske analyser ved hjælp af Student's t-Test, overvejer statistisk signifikante resultater med p < 0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I den normale slimhinde konstaterede vi stærke og homogen nukleare reaktivitet for OTX gener både ciliated pseudostratified respiratorisk-type epitel og submukøse glandulær celler (figur 1A). Vi fandt nukleare udtryk for OTX1 i alle NITACs prøver (figur 1B), mens lille eller fraværende immunoreactivity blev fremhævet i ITACs (figur 1 c). Intens immunoreactivity var til stede i alle ONs (fig. 1 d); blandt PDNECs, OTX udtryk varierede i intensitet og procentdelen af positive celler (figur 1E). Immunhistokemiske statistisk analyse udført med Chi firkantede og/eller Fisher eksakt test viste, at fraværet af OTX gener i ITAC prøver var statistisk signifikant (n = 23, p < 0,01).
Real-time PCR analyser bekræftet udtryk for både OTX1 og OTX2 gener i kontrolprøver (figur 2A-B); OTX1 men ikke OTX2 var udtrykt i NITAC prøver og begge gener var helt downregulated i ITACs (figur 2A-B). I prøver fandt vi kun et udtryk for OTX2 gen mens OTX1 var downregulated, og blandt PDNEC prøverne varierede udtryk for begge gener (figur 2A-B).
Student's t -test udført på realtid PCR bekræftede statistisk signifikante data for OTX1 i kontrolelementer vs ITACs (n = 9, p < 0,05), kontrol vs. ONs (n = 6, p < 0,05), kontrol vs PDNECs (n = 8, p < 0,05), og for OTX2 i kontrol vs NITACs (n = 5, p < 0,05), kontrol vs ITACs (n = 9, p < 0,05), kontrol vs. ONs (n = 6, p < 0,05), og kontrol vs PDNECs (n = 8, p < 0,05).
Figur 1 : Repræsentant billeder af OTX immunhistokemiske udtryk i kontrol og neoplastisk væv. Den reaktion, der er udviklet af det peroxidasekonjugerede sekundær antistof afslørede signal (mørk brun) var synlig i 5 kontrol FFPE sektioner af normale sinonasal slimhinde (A), 7 tilfælde af ikke-tarm-type adenocarcinomer (NITACs) (B), 7 tilfælde olfaktoriske neuroblastomas (ONs) (D), 11 tilfælde dårligt differentieret neuroendokrine karcinom (PDNECs) (E), mens ingen immunoreactivity er fundet i de 23 tilfælde af tarm-type adenocarcinomer (ITACs) analyseres (C). DAB-hæmatoxylin; oprindelige forstørrelse: 200 x skalalinjen = 100 µm.
Figur 2 : Real-time PCR analyse af OTX1 (A) og OTX2 (B) mRNA udtryk i normale og neoplastiske nasal væv. For real-time PCR analyser, følgende prøver blev brugt: 5 FFPE sektioner af kontrol normale slimhinde, 5 tilfælde af ikke-tarm-type adenocarcinomer (NITACs), 9 tilfælde af tarm-type adenocarcinomer (ITACs), 6 tilfælde af olfaktoriske neuroblastomas (ONs), 8 tilfælde af dårligt differentieret neuroendokrine karcinom (PDNEC). På X-aksen rapporterede type prøve, mens Y-aksen repræsenterer de 2- ΔCt -værdier. Statistisk signifikante data (p < 0,05) mellem kontrol og tumorer blev indhentet af Student's t-test og fremhæves med stjerner. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne undersøgelse viser for første gang, at baseret på mRNA niveau, HB gener OTX1 og OTX2 er udtrykt i normal sinonasal slimhinde og submukøse kirtler, inflammatoriske polypper, sinonasal Schneiderian papillomer, og i de forskellige epitel og neuroectodermal neoplasmer, herunder planocellulære karcinomer, ikke-tarm type sinonasal adenocarcinomer, spytkirtel-type tumorer, neuroendokrine svulster og ONs.
Ændringer og fejlfinding:
For at undgå RNA nedbrydning, udførte vi deparaffinization protokol i laboratoriet i patologi. Efter vi ridset dias, blev alle prøver hurtigt afkøles og opbevares i tøris indtil videre brug. Vi udførte alle de efterfølgende analyser i en laminar flow sikkerhed hood ved hjælp af et særligt sæt af pipetter med steril tips at opretholde aseptisk forsøgsbetingelser og undgå RNA forureninger.
Begrænsninger af teknikken:
Den vigtigste begrænsning af teknikken er baseret på tilgængeligheden af prøver da tumorer i sinonasal hulrum er ofte sjældne. Mængden af ekstraheret RNA er et andet vigtigt spørgsmål, fordi RNA udvinding fra FFPE prøver resulterer i fragmenterede RNA, som er vanskelige at analysere.
Betydning med hensyn til eksisterende metoder:
Diagnosticering af tumorer i næsehulen består normalt af røntgenstråler analyser, endoskopisk eksamen i næsehulen, CT-scanning, magnetisk resonans (RMN) og biopsi. I løbet af de seneste år ført fremskridt i kirurgisk instrumentering og forløbet af imaging teknikker endoskopisk kirurgi som den foretrukne strategi for sinonasal tumorer. Navnlig, er denne teknik blevet rapporteret som muligt for forskellige godartet eller ondartet sinonasal tumorer15. Vores teknik baseret på qRT-PCR giver mulighed for identifikation af molekylære markører, som kan varierende diskriminere prøver af forskellige tumorer: faktisk har vi dokumentere at fraværet af begge HB gener i ITACs kan bruges som molekylære markører for dette type af tumor samt fravær af OTX2 i NITACs. Desuden, denne teknik kan anvendes umiddelbart efter biopsi og kan give definitive resultater i mindre end 6 timer til dage eller uger nødvendigt for rapporten fra hospitalet.
Fremtidige ansøgninger:
Vores fremtidige undersøgelser inddrage analysere gen og protein udtryk niveau af OTX1 og OTX2 HB gener af real-time PCR analyser, vestlige skamplet og immunfluorescens med specifikke antistoffer til påvisning af ikke kun OTX1 og OTX2, men også p53 familie udtryk niveauer. Da vi tidligere har påvist, at OTX1 udtryk er reguleret af p53 i bryst kræft7, ville det være interessant at forstå hvis sådan forordning findes også i næsehulen tumorer. En immunofluorescens analyse og en kromatin Immunoprecipitation (ChiP) analysen kan afsløre, henholdsvis, en protein-protein og en DNA-protein interaktion mellem p53 og OTXs. Hvis sådan en forbindelse er fundet, vil målrettet hæmning af p53 (familiemedlemmer, p63 og p73), afsløre hvis overdrevne udtryk eller ned-regulering af OTX gener er afhængig af p53.
P53 tab af funktion, gennem mutation i p53 selve eller perturbationer i veje signalerer til p53, er et fælles træk i fleste menneskelige kræftformer16. De fleste af p53 mutationer klynge inden for DNA-bindende domæne; Derfor er DNA-bindende aktivitet den kritiske funktion, der er ændret, tyder på, at ændringer i transcriptional gener kunne være nøglen til muterede p53 aktivitet16. P53 mutationer er blevet rapporteret som et fælles træk ved sinonasal kræft, med en samlet hyppigheden af 77%, og de viser association til adenocarcinom og træ-støv eksponering17. I vores prøver, ville det således være interessant at vurdere mRNA og protein niveauer (ved qR-PCR og Western Blot analyse) og til at udføre sekvenseringen af dette gen, for at identificere eller udelukke forekomsten af aktivere/inaktivere mutationer. Endelig, hvis en tumor-type specifikke tilbagevendende mutation er fundet, det ville være værd at producere manipuleret celler og mus (med én mutant allel), at havnen denne mutation, og undersøge, om mutationen kan sammenfatte sygdommen.
Kritiske trin:
Kritiske trin i denne undersøgelse omfatter opnåelse af godt gemt prøver, enten som biopsier gemt i RNA beskyttende buffer eller FFPE prøver af mindst 8 µm tykt og udvinding af mindst 200 ng af RNA til at udføre qRT-PCR analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Centro Grandi at Università dell'Insubria, Fondazione Comunitaria del Varesotto, Fondazione del Monte di Lombardia og Fondazione Anna Villa e Felice Rusconi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation | Applied Biosystem | AM1975 | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystem | 4368814 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix, no AmpErase UNG | Applied Biosystem | 4326614 | |
| ABI Prism 7000 | Applied Biosystem | 270001857 | |
| ACTB probe | Applied Biosystem | Out of production. Sequence protected by copyright | |
| OTX1 probe | Applied Biosystem | Out of production. Sequence protected by copyright | |
| OTX2 probe | Applied Biosystem | Out of production. Sequence protected by copyright | |
| Acqueous Hydrogen Peroxide | Merk | 1072090250 | |
| Citrate Buffer | Sigma-Aldrich | 20276292 | |
| Triton | Sigma-Aldrich | 101473728 | |
| Tris | Merk | 108382 | |
| NaCl | Merk | 106404 | |
| Goat Anti-OTX2 Antibody | Vector Laboratories | Out of production. Catalog number not available | |
| Rabbit Anti-Goat Antibody | Vector Laboratories | BA5000 | |
| ABC-Peroxidase Complex | Vector Laboratories | PK6100 | |
| 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrocloride (DAB) | Sigma-Aldrich | D5905 | |
| Harris Hematoxylin | Bioptica | 0506004/L | |
| Pertek | Kaltek SRL | 1560 | |
| BioClear | Bioptica | W01030799 |
References
- Boncinelli, E., Simeone, A., Acampora, D., Gulisano, M. Homeobox genes in the developing central nervous system. Ann genet. 36 (1), 30-37 (1993).
- Omodei, D., et al. Expression of the Brain Transcription Factor OTX1 Occurs in a Subset of Normal Germinal-Center B Cells and in Aggressive Non-Hodgkin Lymphoma. American J. Pathol. 175, 2609-2617 (2009).
- Levantini, E., et al. Unsuspected role of the brain morphogenetic gene Otx1 in hematopoiesis. Proc. Natl. Acad. Sci USA. 100 (18), 10299-10303 (2003).
- Larsen, K. B., Lutterodt, M. C., Mollgard, K., Moller, M. Expression of the homeobox OTX2 and OTX1 in the early developing human brain. J. Histochem. Cytochem. 58, 669-678 (2010).
- Abate-Shen, C. Deregulated homeobox gene expression in cancer: cause or consequence? Nat. Rev. Cancer. 2, 777-785 (2002).
- de Haas, T., et al. OTX1 and OTX2 expression correlates with the clinicopathologic classification of medulloblastomas. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 65, 176-186 (2006).
- Terrinoni, A., et al. OTX1 expression in breast cancer is regulated by p53. Oncogene. 30 (27), 3096-3103 (2001).
- Yu, K., et al. OTX1 promotes colorectal cancer progression through epithelial-mesenchymal transition. Biochem. Biophys Res Commun. 44 (1), 1-5 (2014).
- Glubrecht, D. D., Kim, J. H., Russel, L., Bamforth, J. S., Godbout, R. Differential CRX and OTX2 expression in human retina and retinoblastoma. J. Neurochem. 111 (1), 250-263 (2009).
- Coletta, R. D., Jedlicka, P., Gutierrez-Hartamn, A., Ford, H. L. Transcriptional control of the cell cycle in mammary gland development and tumorigenesis. J. mammary gland Biol. Neoplasia. 9, 39-53 (2004).
- Cordes, B., et al. Molecular and phenotypic analysis of poorly differentiated sinonasal neoplasms: an integrated approach for early diagnosis and classification. Hum Pathol. 40, 283-292 (2009).
- Stelow, E. B., Bishop, J. A. Update from the 4th Edition of the World Health Organization Classification of Head and Neck Tumours: Tumors of the Nasal Cavity, Paranasal Sinuses and Skull Base. Head Neck Pathol. 11 (1), 3-15 (2017).
- Llorente, J. L., et al. Sinonasal carcinoma: clinical, pathological, genetic and therapeutic advances. Nat. Rev. Clin. Oncol. 11 (8), 460-472 (2014).
- Sidransky, D. World health organization classification of tumors. Pathology and genetics of head and neck tumors. 9, WHO Press. (2005).
- Radulesku, T., et al. Endoscopic surgery for sinonasal tumors: The transcribriform approach. J Stomatol Oral Maxillofac Surg. 118 (4), 248-250 (2017).
- Muller, P. A. J., Vousden, K. H. p53 mutations in cancer. Nature cell biology. 15 (1), 2-8 (2013).
- Holmila, R., et al. Profile of TP53 gene mutations in sinonasal cancer. Mutat Res. 686 (1-2), 9-14 (2010).
