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Cancer Research

OTX1 और OTX2 के रूप में दो संभव आणविक मार्करों sinonasal कार्सिनोमा और घ्राण neuroblastomas के लिए की पहचान

doi: 10.3791/56880 Published: February 28, 2019
* These authors contributed equally

Summary

homeobox जीन नियामक जीन अक्सर वयस्क जीवों में ट्यूमर के साथ जुड़े रहे हैं । हम immunohistochemical और वास्तविक समय पीसीआर विश्लेषण द्वारा उनके तुलनात्मक अभिव्यक्ति की जांच की, सामान्य और भड़काऊ नाक mucosae में और sinonasal अर्बुद में आदेश उन्हें संभव नैदानिक और चिकित्सीय लक्ष्यों के रूप में उपयोग करने के लिए.

Abstract

otx homeobox (HB) जीन भ्रूण की उत्पत्ति के दौरान और वयस्क जीवों में घ्राण उपकला के विकास के दौरान व्यक्त किए जाते हैं । इन जीन में होने वाले उत्परिवर्तन प्रायः मानव में ट्यूमर उत्पत्ति से संबंधित होते हैं । कोई डेटा आज otx जीन और नाक गुहा के ट्यूमर के बीच संभव सहसंबंध के बारे में उपलब्ध हैं । इस काम का उद्देश्य अगर OTX1 और OTX2 नाक ट्यूमर के विकास में आणविक मार्करों के रूप में माना जा सकता है समझने के लिए है । हमने इम्यूनोहिस्टोकेमिकल और रीयल-टाइम पीसीआर विश्लेषण के माध्यम से OTX1 और OTX2 जीन की अभिव्यक्ति की जांच करने के लिए नासिका और सिनोन्सल adenocarcinomas का चयन किया । दोनों OTX1 और OTX2 सिनोन्सल आंत्र प्रकार adenocarcinomas (itacs) के सभी नमूनों में अनुपस्थित थे. OTX1 mrna केवल गैर आंत्र प्रकार adenocarcinomas में पहचान की थी (nitacs) जबकि OTX2 mrna केवल घ्राण neuroblastomas (ONs) में व्यक्त किया गया था । हम प्रदर्शित किया है कि दोनों OTX1 और OTX2 जीन के लिए अंतर जीन अभिव्यक्ति एक उपयोगी आणविक मार्कर sinonasal ट्यूमर के विभिंन प्रकार के भेद हो सकता है ।

Introduction

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otx एचबी जीन ड्रॉसोफिला ऑर्थोडेन्टिकल जीन (ओटीआरडी) के कशेरूका होमोलॉग होते हैं और वे ट्रांसक्रिप्शन कारकों के लिए सांकेतिक शब्दों में व्याख्या करते हैं जो कि सामान्य रूप से भ्रूण की उत्पत्ति के दौरान व्यक्त किए जाते हैं, लेकिन वे विभिन्न कार्यों के साथ वयस्क जीव में भी व्यक्त किए जा सकते हैं . भ्रूणीय विकास के दौरान वे कोशिका पहचान के विनिर्देश, कोशिका विभेद, और शरीर अक्ष ¹ की स्थिति को नियंत्रित करते हैं । otx परिवार में OTX1 और OTX2 जीन शामिल हैं जो विभिन्न कार्यों को प्रदर्शित करते हैं । OTX1 मस्तिष्क और संवेदी अंग विकास में शामिल है । वयस्क जीव में, यह संवेदी अंगों में व्यक्त किया जाता है और पिट्यूटरी ग्रंथि2के पूर्वकाल पालि में निम्न स्तर पर प्रतिलिखित है; यह हेमेटोपोइसिस में एक भूमिका निभाता है, जो हेमटोपोइटिक प्लूरिपोटेंट और जनक कोशिकाओं3में व्यक्त किया जा रहा है । OTX2 रोस्ट्रल सिर के विकास में शामिल है और इसके अनुवादित प्रोटीन एक morphogen के रूप में कार्य करता है क्योंकि यह एक ढाल के माध्यम से जो अंय जीन सक्रिय या एक spatio-लौकिक तरीके में दमन कर रहे है उत्पंन करता है, इस प्रकार सेल में योगदान प्रसार और भेदभाव । वयस्क जीव में, OTX2 विशेष रूप से कोरॉइड जाल और पिनियल ग्रंथि4में पाया जाता है ।

otx जीन में परिवर्तन अक्सर मानव जंमजात, दैहिक, या चयापचय दोषों की उपस्थिति से संबंधित हैं । लाभ या हानि otx जीन में उत्परिवर्तन tumorigenesis को बढ़ावा देने के अगर वे ठीक से सेलुलर विकास और/ ल्यूकोमियास और लिम्फोमा के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कई ठोस ट्यूमर में (जैसे, medulloblastomas6, आक्रामक गैर hodgkin लिम्फोमा2, स्तन कार्सिनोमा7, कोलोरेक्टल कैंसर8, और रेटिनोब्लास्टोमा9), otx HB जीन की अपमानजनक अभिव्यक्ति अच्छी तरह से10प्रलेखित है । इसके अलावा, नेत्र विकास के नियंत्रण में इस जीन के लिए महत्वपूर्ण भूमिका के कारण OTX2 म्यूटेशन anophthalmia और microphtalmia11 के मामलों में प्रदर्शन किया गया है.

ठोस neoplasms के संदर्भ में, आणविक और लक्षणप्ररूपी मार्करों की खोज निदान, वर्गीकरण के लिए एक महत्वपूर्ण चुनौती है, और ट्यूमर11के कई प्रकार के उपचार, उन है कि नाक गुहा और प्राणसाल में उत्पन्न सहित Sinuses. वास्तव में, के बावजूद कि इन क्षेत्रों में केवल एक मामूली संरचनात्मक स्थान पर कब्जा, श्लेष्मल उपकला, ग्रंथियों, कोमल ऊतकों, हड्डी, उपास्थि या तंत्रिका/neuroectodermal, और हेमाटॉलफॉइड कोशिकाओं अक्सर जटिल और histologically अलग की उत्पत्ति के लिए साइट हो सकता है ट्यूमर के समूह । सिनोनेसल ट्रैक्ट से जुड़े नियोप्लाम्स के विभिन्न प्रकारों में कई प्रकार की विशेषताएं मौजूद हैं जो आमतौर पर ऊपरी वायुपाचन तंत्र में या यहां तक कि शरीर के अधिकांश हिस्सों में12में देखी जाती हैं । सिनोन्सल दुर्मताओं दुर्लभ हैं और 1:100000 निवासियों को दुनिया भर में एक वार्षिक घटना वर्तमान, और इसलिए यह tumorigenesis में शामिल रास्ते और वैकल्पिक उपचार रणनीतियों के परीक्षण के बारे में अध्ययन से बचाता है । इस के बावजूद, इमेजिंग तकनीकों में अग्रिमों, सर्जिकल दृष्टिकोण, और रेडियोथेरेपी sinonasal कैंसर के नैदानिक प्रबंधन में सुधार हुआ है. इसके अलावा, सेल लाइनों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से पशु मॉडल और कैंसर आनुवंशिक रूपरेखा के विकास वर्तमान में भविष्य के लक्षित विरोधी चिकित्सा13के लिए आधार का गठन । तिथि करने के लिए, वहां कोई OTX1 और/या नाक गुहा के अर्बुद में अभिव्यक्ति OTX2 के बारे में रिपोर्ट कर रहे हैं, paranasal साइनस, और nasopharynx । चूंकि हम पहले से देखा है कि OTX1 और OTX2 स्तन कैंसर7में शामिल हैं, हम अगर इन जीन न केवल सामांय नाक म्यूकोसा में लेकिन यह भी नाक गुहा के ट्यूमर में मौजूद हो सकता है सोचा । इस लक्ष्य तक पहुंचने के लिए हम के पैथोलॉजी विभाग से प्राप्त "ospedale डि circolo" सामान्य mucosa के varese नमूनों में, और नाक और sinonasal adenocarcinomas से एकत्र १९८५ करने के लिए २०१२ और वर्गीकृत के अनुसार विश्व स्वास्थ्य संगठन (डब्ल्यूएचओ) सिर और गर्दन के ट्यूमर का वर्गीकरण । हम उन्हें वास्तविक समय पीसीआर और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री विश्लेषण के माध्यम से विश्लेषण करने के लिए चुनते हैं और हम OTX1 और OTX2 अभिव्यक्ति का मूल्यांकन करते हैं ताकि वे इन प्रकार के ट्यूमर के लिए आणविक मार्करों पर विचार किया जा सके ।

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Protocol

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सभी अध्ययनों को हेलसिंकी की घोषणा के अनुसार किया गया (१९७५) लिखित सूचित सहमति के साथ और वर्से में यूनिवर्सिटी ऑफ इंसबरिया की एथिकल कमेटी द्वारा अनुमोदित.

1. नमूनों का संग्रह

  1. इकट्ठा करने और विभाजित सभी मानव formalin-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड (ffpe) के नमूने के अनुसार विभिन्न उपसमूहों में सिर और गर्दन के ट्यूमर14.
    नोट: यहाँ हम निम्नलिखित नमूनों का इस्तेमाल किया: नियंत्रण (10 नमूनों) के रूप में सामान्य सिनोनासल म्यूकोसा; उल्टे पैपिलोमा (आईपी, आईसीडी-ओ कोड 8121/1); सिनोनसल इटैक (आईसीडी-ओ कोड 8144/3, ३२ नमूने); nitac (आईसीडी-ओ कोड 8140/3, 12 नमूने); adenoid पित्ताशय कार्सिनोमा (एसीसी, आईसीडी-ओ कोड 8200/3); प्लेओमॉर्फिक एडेनोमा (पीए, आईसीडी-ओ कोड 8941/3); पर (आईसीडी-ओ कोड 9522/3, 13 नमूने); खराब विभेदित न्यूरोएंडोर्सिन कार्सिनोमा (pdnec, आईसीडी-ओ कोड 8041/3, 19 नमूने); न्यूरोएंडोर्सिन ट्यूमर (नेट, आईसीडी-ओ कोड 8041/3) ।

2. इम्यूनोकेमिस्ट्री

  1. अनुभागों का प्रस्थान और पुनर्जलयोजन
    1. 30 मिनट के लिए ६० डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में नमूना स्लाइड हीट और 3 μm मोटी ffpe वर्गों पानी के लिए एक शराब श्रृंखला का उपयोग कर rehydrate ।
    2. संक्षेप में 10 मिनट के लिए xylene में स्लाइड धोने और इस कदम को दोहराएं; १००% अल्कोहल में 5 मिनट के लिए स्लाइड्स को धोएं और ९५%, ८५%, और ७५% अल्कोहल प्रश्नपत्र का उपयोग करके इस चरण को दोहराएं । आसुत जल में 5 मिनट के लिए स्लाइड कुल्ला ।
  2. अंतर्जात गतिविधि को अवरोधित करना
    1. 12 मिनट के लिए 3% जलीय हाइड्रोजन पेरोक्साइड में स्लाइड रखकर अंतर्जात गतिविधि ब्लॉक ।
  3. प्रतिजन पुनःप्राप्ति
    1. एक माइक्रोवेव उपचार में 10 मिनट के लिए 10 मिमी साइट्रेट बफर (पीएच 6) के साथ इलाज करके antigen पुनःप्राप्ति करते हैं ।
  4. प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन
    1. tbs बफर (पीएच ७.४) में वर्गों धो लें, तो 10 मिनट के लिए अवरुद्ध समाधान जोड़ें ।
    2. tbs बफर (pH ७.४) में अनुभागों को धोएं, फिर ०.२% ट्राइटन एक्स जोड़ें ।
    3. बकरी विरोधी मानव OTX2 एंटीबॉडी के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर सेते 1:100 पतला ।
  5. द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ ऊष्मायन
    1. बायोटिनिलेटेड खरगोश विरोधी बकरी माध्यमिक एंटीबॉडी पतला 1:200 के साथ कमरे के तापमान पर 1 एच के लिए वर्गों सेते एबीसी-peroxidase परिसर के बाद ( सामग्री की तालिकाओंदेखें) ।
  6. immunoreaction का विकास
    1. 3, 3 '-डायमिनोबेंजिडीन टेट्राहाइड्रोक्लोराइड का उपयोग करके immunoreaction का विकास करें और हैरिस हेमाटोक्सिलिन के साथ नाभवी का सामना करना ।
  7. आरोपण और इमेजिंग
    1. एक वर्धमान शराब के पैमाने का उपयोग कर वर्गों dehydrate और उंहें स्पष्ट terpene मूल के एक समाशोधन पदार्थ का उपयोग कर ( सामग्री की तालिकादेखें) । बढ़ते माध्यम में वर्गों एंबेड, एक खुर्दबीन स्लाइड पर वर्गों जगह है, और एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के माध्यम से वर्गों का निरीक्षण ।

3. आरएनए निष्कर्षण और रिवर्स-transcription

  1. आरएनए निष्कर्षण
    1. आरएनए इम्यूनोरेसिपिटेशन प्रोटोकॉल के पहले चरण का प्रदर्शन करके अनुभागों से निकालें (अनुभाग २.१ देखें) और स्लाइडों को आसुत जल में रखें । ब्याज के टुकड़ों की पहचान करने के लिए इसी hematoxylin-eosin दाग वर्गों के साथ unstained वर्गों ओवरलैप ।
    2. आरएनए निष्कर्षण ffpe नमूनों के लिए एक वाणिज्यिक आरएनए निष्कर्षण किट का उपयोग कर प्रदर्शन ( सामग्री की तालिकादेखें) और निर्माता के निर्देश के बाद ।
  2. आरएनए रिवर्स-ट्रांसक्रिप्शन
    1. cdna ( सामग्री तालिकादेखें) प्रोटोकॉल के बाद में रेट्रो टाइप rna के लिए एक वाणिज्यिक किट का प्रयोग करें । रेट्रो-प्रतिलेखन कुल आरएनए के कम से १,००० एनजी कई विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए ।

4. रीयल-टाइम पीसीआर और डेटा विश्लेषण

  1. रीयल-टाइम पीसीआर
    1. जांच-आधारित प्रौद्योगिकी के साथ मात्रात्मक रीयल-टाइम पीसीआर विश्लेषण (qrt-पीसीआर) निष्पादित करें ( सामग्री तालिकादेखें) और एक थर्मल cycler ।
  2. पीसीआर रिएक्शन मिक्स की तैयारी
    1. जांच-आधारित मास्टर मिक्स के १२.५ μl का उपयोग करते हुए पीसीआर रिएक्शन मिक्स को तैयार करें, १.२५ μl प्रत्येक OTX1, OTX2, और actb जांच ( सामग्री तालिकादेखें), cdna के ५० एनजी, और कुल मात्रा के 25 μl तक न्यूकेटाबेस-मुक्त पानी ।
    2. जीन अभिव्यक्ति के स्तर को सामान्य करने के लिए अंतर्जात नियंत्रण के रूप में actb जीन का उपयोग कर तपसिल में सभी प्रतिक्रियाओं प्रदर्शन.
    3. 3 मिनट के लिए १,१०९ एक्स जी पर प्लेट अपकेंद्रितकरें और प्रयोग तक 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रकाश से संरक्षित थाली की दुकान ।
  3. थर्मल cycler की स्थापना
    1. थर्मल cycler प्रोफ़ाइल सेट के साथ एक प्रारंभिक गर्म शुरू चक्र में ५० डिग्री सेल्सियस के लिए 2 मिनट और ९५ डिग्री सेल्सियस के लिए 10 मिनट, ४० चक्र के बाद ९५ ° c के लिए 15 s और एक अंतिम चक्र के लिए ६० ° c पर 1 मिनट.
  4. जीन एक्सप्रेशन स्तर का विश्लेषण
    1. तुलनात्मक चक्र थ्रेशोल्ड (δ ct) विधि के माध्यम से जीन अभिव्यक्ति के स्तर को एंडोजेनस नियंत्रण के रूप में actb जीन का उपयोग करके सामान्य ।
    2. 2-δ सीटी विधि का उपयोग कर जीन अभिव्यक्ति के स्तर का मूल्यांकन और परिणाम साजिश ।
  5. सांख्यिकीय विश्लेषण
    1. छात्र के टीपरीक्षण का उपयोग सांख्यिकीय विश्लेषण प्रदर्शन, पी < ०.०५ के साथ सांख्यिकीय महत्वपूर्ण परिणाम पर विचार ।

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Representative Results

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सामान्य म्यूकोसा में हम दोनों पक्ष्माभी स्यूडोस्ट्रैटिफाइड श्वसन प्रकार उपकला में otx जीन के लिए मजबूत और समरूप परमाणु जेट मनाया और सबम्यूकोसल ग्रंथियों कोशिकाओं में (चित्रा 1a). हम सभी नाइटाक्स नमूनों में OTX1 के लिए परमाणु अभिव्यक्ति पाया (चित्रा 1b), जबकि थोड़ा या अनुपस्थित immunoreactivity itacs में प्रकाश डाला गया था (चित्रा 1c). तीव्र immunoreactivity सभी ONs में मौजूद था (चित्रा 1d); pdnecs के बीच में, otx अभिव्यक्ति तीव्रता और सकारात्मक कोशिकाओं के प्रतिशत में विविध (चित्रा 1e). इम्यूनोहिस्टोकेमिकल सांख्यिकीय विश्लेषण ची स्क्वायर और/फिशर के सटीक परीक्षण के साथ प्रदर्शन किया है कि itac नमूनों में otx जीन की अनुपस्थिति सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण था (n = 23, p < ०.०१) ।

रीयल-टाइम पीसीआर विश्लेषण ने नियंत्रण नमूनों में OTX1 और OTX2 जीन दोनों की अभिव्यक्ति की पुष्टि की (चित्र 2a-B); OTX1 लेकिन नहीं OTX2 nitac नमूनों में व्यक्त किया गया था और दोनों जीन itacs में पूरी तरह से downregulated थे (चित्रा 2a-B). नमूनों पर हम केवल OTX2 जीन की अभिव्यक्ति पाया, जबकि OTX1 downregulated था, और pdnec नमूनों के बीच दोनों जीन विभिंन (चित्रा 2a-बी) की अभिव्यक्ति ।

छात्र का टी टेस्ट रीयल-टाइम पीसीआर पर किया प्रदर्शन OTX1 के लिए सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण डेटा बनाम itacs नियंत्रण में (n = 9, p < ०.०५), नियंत्रण बनाम ONs (n = 6, p < ०.०५), नियंत्रण बनाम pdnecs (n = 8, p < ०.०५), और नियंत्रण बनाम nitacs में OTX2 के लिए (n = 5, p < ०.०५), नियंत्रण बनाम itacs (n = 9, p < ०.०५), नियंत्रण बनाम ONs (n = 6, p < ०.०५), और नियंत्रण बनाम pdnecs (n = 8, p < ०.०५).

Figure 1
चित्रा 1 : नियंत्रण और नियोप्लास्टिक ऊतकों में otx इम्यूनोहिस्टोकेमिकल अभिव्यक्ति के प्रतिनिधि छवियों. peroxidase द्वारा विकसित प्रतिक्रिया-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी संकेत से पता चला (डार्क ब्राउन) 5 नियंत्रण ffpe वर्गों में दिखाई दे रहा था सामान्य sinonasal म्यूकोसा (एक), गैर आंत्र प्रकार adenocarcinomas के 7 मामलों (nitacs) (बी), 7 मामलों घ्राण neuroblastomas (ONs) (डी), 11 मामलों में खराब विभेदित neuroendocrine कार्सिनोमा (pdnecs) (), जबकि कोई immunoreactivity का पता लगाया है 23 आंतों के मामलों प्रकार adenocarcinomas (itacs) विश्लेषण (C). डैब-हेमतॉक्सिलिन; मूल आवर्धन: 200x, स्केल बार = १०० μm ।

Figure 2
चित्रा 2 : सामान्य और नियोप्लास्टिक नाक के ऊतकों में OTX1 (ए) और OTX2 (ख) mrna अभिव्यक्ति का वास्तविक समय पीसीआर विश्लेषण । रीयल-टाइम पीसीआर विश्लेषण के लिए, निम्नलिखित नमूनों का उपयोग किया गया था: 5 ffpe नियंत्रण सामान्य mucosa के वर्गों, गैर आंत्र प्रकार adenocarcinomas के 5 मामलों (nitacs), आंतों प्रकार adenocarcinomas के 9 मामलों (itacs), घ्राण neuroblastomas के 6 मामलों (ONs), 8 खराब विभेदित न्यूरोएंडोटीन कार्निसोनास (pdnec) के मामले । X अक्ष पर नमूना के प्रकार की रिपोर्ट की गई है, जबकि Y अक्ष 2-δ ct मान का प्रतिनिधित्व करता है । सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण डेटा (पी < ०.०५) नियंत्रण और ट्यूमर के बीच छात्र की टीपरीक्षण द्वारा प्राप्त किए गए थे और तारों के साथ प्रकाश डाला. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

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Discussion

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यह अध्ययन पहली बार पता चलता है कि, एमआरएनए स्तर पर आधारित, एचबी जीन OTX1 और OTX2 सामान्य sinonasal म्यूकोसा और सबम्यूकोसल ग्रंथियों, भड़काऊ जंतु, sinonasal schneiderian पैपिलोमास में व्यक्त कर रहे हैं, और विभिन्न उपकला और neuroectodermal में neoplasms, स्क्वैमस कार्सिनोमास सहित, गैर आंत्र प्रकार sinonasal adenocarcinomas, लार ग्रंथि-प्रकार ट्यूमर, न्यूरोएंडोस्टीन neoplasms, और ONs.

संशोधन और समस्या निवारण:

आरएनए क्षरण से बचने के लिए, हमने पैथोलॉजी की प्रयोगशाला में डिपैरिसनीकरण प्रोटोकॉल का प्रदर्शन किया । हम स्लाइड खरोंच के बाद, सभी नमूनों को तेजी से ठंडा किया गया और आगे का उपयोग करने तक सूखी बर्फ में संग्रहीत । हम एक laminar प्रवाह सुरक्षा हुड में सभी बाद का विश्लेषण किया सुझावों के साथ एक समर्पित सेट का उपयोग करने के लिए सड़न रोकनेवाला प्रयोगात्मक शर्तों को बनाए रखने और आरएनए contaminations से बचने के ।

तकनीक की सीमाएं:

तकनीक के प्रमुख सीमा नमूनों की उपलब्धता पर निर्भर करता है क्योंकि sinonasal गुहा के ट्यूमर अक्सर दुर्लभ हैं । निकाला आरएनए की राशि एक और महत्वपूर्ण मुद्दा है क्योंकि rna निष्कर्षण ffpe नमूनों से खंडित आरएनए में परिणाम है जो विश्लेषण करने के लिए मुश्किल है ।

मौजूदा तरीकों के संबंध में महत्व:

नाक गुहा के ट्यूमर का निदान आमतौर पर एक्स-रे विश्लेषण, नाक गुहा, सीटी स्कैन, चुंबकीय अनुनाद (आरएमएन), और बायोप्सी के इंडोस्कोपिक परीक्षा होते हैं । हाल के वर्षों के दौरान, सर्जिकल इंस्ट्रूमेंटेशन के अग्रिमों और इमेजिंग तकनीकों की प्रगति ने इंडोस्कोपिक सर्जरी को सिनोनासल ट्यूमर के लिए पसंदीदा रणनीति के रूप में नेतृत्व किया था । विशेष रूप से, इस तकनीक को विभिन्न सौम्य या घातक प्रकार के सिनोनासल ट्यूमर के लिए संभव बताया गया है15. हमारे qrt पर आधारित तकनीक-पीसीआर आणविक biomarkers की पहचान की अनुमति देता है, जो व्यवकलीय अलग ट्यूमर का भेदभाव नमूने कर सकते हैं: वास्तव में, हम सबूत है कि दोनों itacs में एचबी जीन के अभाव में इस के लिए आणविक मार्कर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है प्रदान ट्यूमर के प्रकार के रूप में के रूप में अच्छी तरह से nitacs में OTX2 की अनुपस्थिति । इसके अलावा, इस तकनीक को बायोप्सी के तुरंत बाद लागू किया जा सकता है और अस्पताल से रिपोर्ट के लिए आवश्यक दिनों या हफ्तों के संबंध में 6 घंटे से भी कम समय में निश्चित परिणाम दे सकते हैं ।

भविष्य के अनुप्रयोगों:

हमारे भविष्य के अध्ययन में जीन और प्रोटीन की अभिव्यक्ति का स्तर OTX1 और OTX2 HB वास्तविक समय पीसीआर विश्लेषण, वेस्टर्न ब्लॉट, और विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग न केवल OTX1 और OTX2 का पता लगाने के जीन का विश्लेषण शामिल है, लेकिन यह भी p53 परिवार अभिव्यक्ति का स्तर । जब से हम पहले प्रदर्शन किया है कि OTX1 अभिव्यक्ति स्तन कैंसर7में p53 द्वारा विनियमित है, यह समझना दिलचस्प होगा अगर इस तरह के एक विनियमन भी नाक गुहा ट्यूमर में मौजूद है । एक इम्यूनोफ्लोरेसेंस परख और एक chromatin इम्यूनोफ्लोरेसेंस (चिप) परख, क्रमशः, एक प्रोटीन प्रोटीन और p53 और otxs के बीच एक डीएनए प्रोटीन संपर्क प्रकट कर सकते हैं । यदि ऐसा कनेक्शन पाया जाता है, तो p53 (और परिवार के सदस्यों, p63 और p73) के लक्षित सीलेंसिंग से पता चलता है कि यदि ओएक्स जीन का ओवर-एक्सप्रेशन या डाउन-रेगुलेशन p53 पर निर्भर है ।

p53 समारोह के नुकसान, p53 में उत्परिवर्तन के माध्यम से ही या p53 के लिए संकेत रास्ते में क्षोभ, मानव कैंसर के बहुमत में एक आम सुविधा है16। डीएनए-बाइंडिंग डोमेन के भीतर p53 म्यूटेशन क्लस्टर; इसलिए, डीएनए बाध्यकारी गतिविधि महत्वपूर्ण कार्य है कि बदल दिया है, सुझाव है कि transcriptional जीन में परिवर्तन उत्परिवर्ती p53 गतिविधि16के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है । p53 म्यूटेशन sinonasal कैंसर की एक आम सुविधा के रूप में सूचित किया गया है, ७७% की एक समग्र आवृत्ति के साथ, और वे एडेनोकार्सीनोमा और लकड़ी के लिए एसोसिएशन दिखाने धूल जोखिम17। इस प्रकार, हमारे नमूनों में, यह mrna और प्रोटीन के स्तर का मूल्यांकन करने के लिए दिलचस्प होगा (qR-पीसीआर और वेस्टर्न ब्लॉट विश्लेषण द्वारा) और इस जीन के अनुक्रमण प्रदर्शन करने के लिए, की पहचान करने के लिए या सक्रिय करने की उपस्थिति को बाहर निकालने/ अंत में, यदि एक ट्यूमर प्रकार विशिष्ट आवर्ती उत्परिवर्तन पाया जाता है, यह इंजीनियर कोशिकाओं और चूहों का उत्पादन करने के लिए उल्लेखनीय होगा (एक उत्परिवर्ती विकल्पी के साथ) कि इस उत्परिवर्तन बंदरगाह, और यदि उत्परिवर्तन रोग दोहराऊंगा कर सकते हैं की जाँच.

महत्वपूर्ण कदम:

इस अध्ययन के महत्वपूर्ण चरणों में अच्छी तरह से संग्रहीत नमूनों का समावेश शामिल है, या तो बायोप्सी के रूप में आरएनए सुरक्षात्मक बफर या एफपीई के नमूनों में कम से 8 μm मोटी, और qrt-पीसीआर विश्लेषण करने के लिए आरएनए के कम से २०० एनजी की निकासी ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम centro grandi strumenti università dell ' insubria, fondazione comunitaria डेल वारेसोत्तो, fondazione डेल मोंटे डि लोम्बार्डिया, और fondazione अन्ना Villa ई फेलीस rusconi द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation Applied Biosystem AM1975
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Applied Biosystem 4368814
TaqMan Universal PCR Master Mix, no AmpErase UNG Applied Biosystem 4326614
ABI Prism 7000  Applied Biosystem 270001857
ACTB probe Applied Biosystem Out of production. Sequence protected by copyright
OTX1 probe Applied Biosystem Out of production. Sequence protected by copyright
OTX2 probe Applied Biosystem Out of production. Sequence protected by copyright
Acqueous Hydrogen Peroxide Merk 1072090250
Citrate Buffer Sigma-Aldrich 20276292
Triton Sigma-Aldrich 101473728
Tris Merk 108382
NaCl Merk 106404
Goat Anti-OTX2 Antibody Vector Laboratories Out of production. Catalog number not available
Rabbit Anti-Goat Antibody Vector Laboratories BA5000
ABC-Peroxidase Complex Vector Laboratories PK6100
3,3'-diaminobenzidine tetrahydrocloride (DAB) Sigma-Aldrich D5905
Harris Hematoxylin Bioptica 0506004/L
Pertek Kaltek SRL 1560
BioClear Bioptica W01030799

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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OTX1 और OTX2 के रूप में दो संभव आणविक मार्करों sinonasal कार्सिनोमा और घ्राण neuroblastomas के लिए की पहचान
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Micheloni, G., Millefanti, G., Conti, A., Pirrone, C., Marando, A., Rainero, A., Tararà, L., Pistochini, A., Lo Curto, F., Pasquali, F., Castelnuovo, P., Acquati, F., Grimaldi, A., Valli, R., Porta, G. Identification of OTX1 and OTX2 As Two Possible Molecular Markers for Sinonasal Carcinomas and Olfactory Neuroblastomas. J. Vis. Exp. (144), e56880, doi:10.3791/56880 (2019).More

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