Summary
I geni homeobox sono geni regolatori spesso associati con i tumori negli organismi adulti. Abbiamo studiato la loro espressione comparativa di immunohistochemical e l'analisi di PCR in tempo reale, nelle mucose nasali normali ed infiammatorie e nei neoplasma sinonasal al fine di utilizzarli come possibili bersagli terapeutici e diagnostici.
Abstract
OTX geni homeobox (HB) sono espressi durante la morfogenesi embrionale e durante lo sviluppo dell'epitelio olfattivo negli organismi adulti. Mutazioni che accadono in questi geni sono spesso legate al tumorigenesis in essere umano. Non ci sono dati disponibili oggi per quanto riguarda la possibile correlazione tra geni OTX e tumori della cavità nasale. Lo scopo di questo lavoro è quello di capire se OTX1 e OTX2 può essere considerato come marcatori molecolari nello sviluppo dei tumori nasali. Abbiamo selezionato gli adenocarcinomi sinonasal e nasale per studiare l'espressione dei geni OTX1 e OTX2 attraverso analisi PCR in tempo reale e immunohistochemical. Sia OTX1 e OTX2 erano assenti in tutti i campioni di sinonasal intestinale-tipo adenocarcinomi (ITACs). OTX1 mRNA è stata identificata solo in adenocarcinomi di tipo Non-intestinali (NITACs) mentre OTX2 mRNA è stato espresso solo in Neuroblastomas olfattivi (ONs). Abbiamo dimostrato che l'espressione genica differenziale per geni OTX1 e di OTX2 potrebbe essere un utile marker molecolare per distinguere i diversi tipi di tumori sinonasal.
Introduction
OTX Geni di HB sono l'omologo vertebrato dei geni orthodenticle Drosophila (otd) ed essi codificano per fattori di trascrizione che sono normalmente espressi durante la morfogenesi embrionale, ma possono anche essere espressi nell'organismo adulto con funzioni diverse . Durante lo sviluppo embrionale controllano la specifica di identità cellulare, differenziazione cellulare e il posizionamento del axis¹ corpo. La famiglia OTX comprende OTX1 e OTX2 geni che mostrano diverse funzioni. OTX1 è coinvolto nel cervello e sviluppo organo sensoriale. Nell'organismo adulto, è espresso in organi sensoriali e viene trascritto a bassi livelli nel lobo anteriore della ghiandola pituitaria2; svolge anche un ruolo nell'ematopoiesi, espresso in emopoietiche pluripotenti e di cellule progenitrici3. Otx2 è coinvolto nello sviluppo della testa rostrale e relativi atti di proteina tradotta come morfogeno perché genera un gradiente attraverso quali altri geni sono attivati o repressi in modo spazio-temporale, contribuendo così al cellulare proliferazione e differenziazione. Nell'organismo adulto, OTX2 si trova esclusivamente nella ghiandola pineale e del plesso coroidico4.
Mutazioni nei geni OTX sono spesso legate alla comparsa di difetti umani congeniti, somatiche o metabolici. Guadagno o perdita di mutazioni nei geni OTX potrebbero promuovere il tumorigenesis se non sono in grado di controllare adeguatamente la crescita e/o differenziazione cellulare5. Nelle leucemie e linfomi anche come in molti tumori solidi (ad esempio, medulloblastomi6, linfomi non-Hodgkin aggressivo2, seno carcinoma7, cancri colorettali8e retinoblastoma9), il espressione diregolarizzata di geni HB OTX è ben documentato10. Inoltre, mutazioni di OTX2 sono state dimostrate nei casi di anoftalmia e microftalmia11 a causa del ruolo cruciale per questo gene nel controllo dello sviluppo dell'occhio.
Nel contesto delle neoplasie solide, l'individuazione di marcatori molecolari e fenotipici è una sfida importante per la diagnosi, classificazione e trattamento di diversi tipi di tumore11, compresi quelli che hanno origine nella cavità nasali e paranasali seni paranasali. Infatti, nonostante che queste aree occupano solo un modesto spazio anatomico, epitelio della mucosa, ghiandole, tessuti molli, osso, cartilagine o neurale/neuroectodermal e cellule del hematolymphoid possono essere spesso il sito per l'origine del complesso e istologicamente diverse gruppi di tumori. Diversi tipi di neoplasie che coinvolgono il tratto sinonasal presentano una varietà di caratteristiche che superare ciò che è veduto solitamente nel tratto aerodigestive superiore o anche durante la maggior parte delle parti del corpo12. Le malignità sinonasal sono rare e presentano un'incidenza annuale di 1: 100 000 abitanti in tutto il mondo, e così questo impedisce studi per quanto riguarda le vie coinvolte nella tumorigenesi e la sperimentazione di strategie alternative di trattamento. Nonostante questo, i progressi nelle tecniche di imaging approcci chirurgici e la radioterapia hanno migliorato la gestione clinica di cancro sinonasal. Inoltre, lo sviluppo di linee cellulari e modelli animali nonché assetto genetico cancro attualmente costituiscono la base per le future terapie anticancro mirate13. Fin qui, ci sono rapporti per quanto riguarda OTX1 e/o OTX2 espressione nelle neoplasie della cavità nasale, seni paranasali e del nasopharynx. Dal momento che abbiamo precedentemente osservato che OTX1 e OTX2 sono coinvolti nel cancro di seno7, ci siamo chiesti se questi geni potrebbero essere presenti non solo nella mucosa nasale normale ma anche nei tumori della cavità nasale. Per raggiungere questo obiettivo che abbiamo ottenuto dal dipartimento di patologia di "Ospedale di Circolo" nei campioni di Varese di mucosa normale e adenocarcinomi sinonasal e nasale raccolti dal 1985 al 2012 e classificati secondo l'organizzazione mondiale della sanità (OMS) classificazione dei tumori di collo e testa. Scegliamo di analizzarli attraverso analisi in tempo reale di PCR e immunohistochemistry e abbiamo valutato l'espressione OTX1 e OTX2 per determinare se possono essere considerati marcatori molecolari per questi tipi di tumori.
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Protocol
Tutti gli studi sono stati effettuati secondo la dichiarazione di Helsinki (1975) con il consenso informato scritto e approvato dal comitato etico dell'Università dell'Insubria di Varese.
1. raccolta dei campioni
- Raccogliere e dividere tutti i campioni di Formalin-Fixed Paraffin-Embedded (FFPE) umano in diversi sottogruppi secondo la classificazione del WHO dei tumori di collo e testa14.
Nota: Qui abbiamo utilizzato i seguenti campioni: mucosa normale sinonasal come controllo (10 campioni); Papilloma invertito (IP, codice ICD-O 8121/1); ITAC Sinonasal (codice ICD-O 8144/3, 32 campioni); NITAC (codice ICD-O 8140/3, 12 campioni); Carcinoma cistico adenoideo (CRNA, codice ICD-O 8200/3); Adenoma pleomorphic (PA, codice ICD-O 8941/3); (Codice ICD-O 9522/3, 13 campioni); Scarsamente differenziato Carcinoma neuroendocrino (PDNEC, codice ICD-O 8041/3, 19 campioni); Tumore neuroendocrino (NET, codice ICD-O 8041/3).
2. immunochimica
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Sparaffinatura e reidratazione delle sezioni
- Riscaldare le diapositive di esempio in un forno a 60 ° C per 30 min e reidratare 3 µm sezioni spesse FFPE utilizzando una serie di alcool all'acqua.
- Brevemente lavare i vetrini in xilene per 10 min e ripetere questo passaggio; lavare i vetrini per 5 min in alcole a 100% e ripetere questo passaggio utilizzando alcol 95%, 85% e 75% in serie. Sciacquare i vetrini per 5 min in acqua distillata.
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Bloccando l'attività endogena
- Bloccare l'attività endogena mettendo le diapositive in acquoso perossido di idrogeno 3% per 12 min.
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Ricupero dell'antigene
- Eseguire ricupero dell'antigene trattando con 10 mM di tampone citrato (pH 6) per 10 min in un trattamento di microonda.
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Incubazione con anticorpo primario
- Lavare le sezioni in tampone TBS (pH 7,4), quindi aggiungere la soluzione bloccante per 10 min.
- Lavare le sezioni in tampone TBS (pH 7,4), poi aggiungere 0,2% Triton X.
- Incubare per una notte a 4 ° C con capra anti-umani OTX2 anticorpo diluito 1: 100.
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Incubazione con anticorpo secondario
- Incubare le sezioni per 1 h a temperatura ambiente con anticorpo secondario anti-capra diluito 1: 200 di biotinylated coniglio, seguita da ABC-perossidasi complesso (Vedi Tabelle materiali).
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Sviluppando il immunoreaction
- Sviluppare il immunoreaction utilizzando 3, 3'-diaminobenzidina tetrahydrochloride e colorante di contrasto i nuclei con Harris Hematoxylin.
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Montaggio e imaging
- Disidratare le sezioni utilizzando una mezzaluna alcool-scala e chiarirli utilizzando una sostanza di schiarimento di origine terpene (Vedi Tabella materiali). Incorporare sezioni in mezzo di montaggio, inserire le sezioni su un vetrino da microscopio e osservare le sezioni attraverso un microscopio ottico.
3. RNA estrazione e inversione-trascrizione
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Estrazione del RNA
- Estrarre RNA da sezioni eseguendo la prima fase del protocollo di immunoprecipitazione (Vedi sezione 2.1) e tenere i vetrini in acqua distillata. Si sovrappongono le sezioni non macchiate con il corrispondente ematossilina-eosina macchiato sezioni al fine di identificare i frammenti di interesse.
- Eseguire l'estrazione di RNA utilizzando un kit di estrazione di RNA commerciale per campioni FFPE (Vedi Tabella materiali) e le istruzioni del produttore riportato di seguito.
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RNA d'inversione-trascrizione
- Utilizzare un kit commerciale per retro-trascrizione del RNA in cDNA (Vedi Tabella materiali) seguendo il protocollo. Retrò-trascrivere almeno 1.000 ng di RNA totale per eseguire diverse analisi.
4. Real-Time PCR e analisi dei dati
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PCR in tempo reale
- Eseguire analisi PCR in tempo reale quantitative (qRT-PCR) con tecnologia basata su sonda (Vedi Tabella materiali) e un termociclatore.
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Preparazione della miscela di reazione PCR
- Preparare la miscela di reazione PCR utilizzando 12,5 µ l di mix master basata su probe, 1.25 µ l di OTX1, OTX2 e ACTB sonde (vedere Tabella materiali), 50 ng di cDNA e nucleasi-free fino a 25 µ l di volume totale di acqua.
- Eseguire tutte le reazioni in triplice copia utilizzando il gene ACTB come il controllo endogeno per normalizzare i livelli di espressione genica.
- Centrifugare la piastra a 1.109 x g per 3 min e memorizzare la piastra riparo dalla luce a 4 ° C fino all'esperimento.
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Impostazione del termociclatore
- Insieme al profilo del termociclatore con un avvio a caldo iniziale ciclo a 50 ° C per 2 min e 95 ° C per 10 minuti, seguiti da 40 cicli a 95 ° C per 15 s e un ciclo finale a 60 ° C per 1 min.
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Analisi livello di espressione genica
- Normalizzare i livelli di espressione genica mediante il metodo di soglia (ΔCt) ciclo comparativa utilizzando il gene ACTB come il controllo endogeno.
- Valutare i livelli di espressione genica utilizzando il metodo 2-ΔCt e rappresentare graficamente i risultati.
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Analisi statistiche
- Eseguire analisi statistiche utilizzando di Student t-Test, considerando i risultati statisticamente significativi con p < 0.05.
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Representative Results
Nella mucosa normale abbiamo osservato reattività nucleare forte ed omogenea per geni OTX sia nell'epitelio ciliated pseudostratified tipo respiratorio e nelle cellule ghiandolari submucosal (Figura 1A). Abbiamo trovato espressione nucleare per OTX1 in tutti i campioni di NITACs (Figura 1B), mentre poco o assente il immunoreactivity è stato evidenziato in ITACs (Figura 1). Immunoreactivity intenso era presente in tutti i ONs (Figura 1); tra PDNECs, espressione di OTX varia in intensità e percentuale di cellule positive (Figura 1E). Immunohistochemical analisi statistica eseguita con Chi quadrato e/o test esatto di Fisher ha dimostrato che l'assenza di geni OTX in campioni di ITAC era statisticamente significativa (n = 23, p < 0.01).
Analisi in tempo reale di PCR ha confermato l'espressione dei geni sia OTX1 e OTX2 nei campioni di controllo (Figura 2A–B); OTX1 ma non OTX2 è stato espresso nei campioni di NITAC ed entrambi i geni sono stati completamente downregulated in ITACs (Figura 2A–B). In su campioni abbiamo trovato solo l'espressione del gene OTX2 mentre OTX1 downregulated, e tra i campioni PDNEC l'espressione di entrambi i geni variato (Figura 2A–B).
Test t di Student eseguita su Real-Time PCR ha confermato statisticamente i dati significativi per OTX1 nei controlli vs ITACs (n = 9, p < 0,05), controlli vs ONs (n = 6, p < 0,05), controlli vs PDNECs (n = 8, p < 0,05), e per OTX2 nel controllo vs NITACs (n = 5, p < 0,05), controlli vs ITACs (n = 9, p < 0,05), controlli vs ONs (n = 6, p < 0,05) e controlli vs PDNECs (n = 8, p < 0,05).
Figura 1 : Immagini rappresentative di espressione immunohistochemical OTX nel controllo e nei tessuti neoplastici. La reazione ha sviluppata dall'anticorpo secondario coniugato a perossidasi ha rivelato che il segnale (marrone scuro) era visibile in 5 sezioni FFPE controllo di sinonasal normale mucosa (A), 7 casi di adenocarcinomi di tipo Non-intestinale (NITACs) (B), 7 casi neuroblastomas olfattivi (ONs) (D), 11 casi scarsamente differenziano carcinoma neuroendocrini (PDNECs) (E), mentre nessun immunoreactivity viene rilevato in 23 casi di adenocarcinoma di tipo intestinale (ITACs) analizzati (C). DAB-ematossilina; ingrandimento originale: 200 x, barra della scala = 100 µm.
Figura 2 : Analisi Real-Time PCR di OTX1 (A) e l'espressione di OTX2 (B) mRNA nei tessuti nasali normali e neoplastici. Per le analisi PCR in tempo reale, sono stati utilizzati i seguenti campioni: 5 sezioni FFPE di mucosa normale controllo, 5 casi di adenocarcinomi Non-intestinale-tipo (NITACs), 9 casi di adenocarcinoma di tipo intestinale (ITACs), 6 casi di neuroblastomas olfattivi (ONs), 8 casi di scarsamente differenziano carcinoma neuroendocrini (PDNEC). Sull'asse X è segnalato il tipo di campione, mentre l'asse Y rappresenta i 2 valori di-ΔCt . Dati statisticamente significativi (p < 0,05) fra controllo ed i tumori sono stati ottenuti da di Student t-test e sono evidenziati con un asterisco. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo studio dimostra per la prima volta che, sulla base dei livelli di mRNA, i geni di HB OTX1 e OTX2 sono espressi in mucosa normale sinonasal e ghiandole submucosal, polipi infiammatori, sinonasal Schneiderian papillomi e nelle diverse epiteliale e neuroectodermal neoplasie, compresi i carcinomi squamosi, adenocarcinomi sinonasal di tipo non-intestinale, i tumori delle ghiandole salivari-tipo, neoplasie neuroendocrine e ONs.
Le modifiche e la risoluzione dei problemi:
Per evitare la degradazione del RNA, abbiamo effettuato il protocollo Sparaffinatura in laboratorio di patologia. Dopo abbiamo graffiato le diapositive, tutti i campioni sono stati rapidamente raffreddati e conservati in ghiaccio secco fino al successivo utilizzo. Abbiamo effettuato tutte le analisi successive in una cappa a flusso laminare usando un set dedicato di pipette con punte sterili per mantenere condizioni asettiche sperimentale e per evitare contaminazioni di RNA.
Limiti della tecnica:
La principale limitazione della tecnica si basa sulla disponibilità dei campioni poiché i tumori della cavità sinonasal spesso sono rari. La quantità di RNA estratto è un'altra questione importante perché estrazione di RNA da campioni FFPE risultati nel RNA frammentato che è difficile da analizzare.
Significato per quanto riguarda i metodi esistenti:
La diagnosi dei tumori della cavità nasale consiste solitamente delle analisi di raggi x, esame endoscopico della cavità nasale, TAC, risonanza magnetica (RMN) e biopsia. Negli ultimi anni, i progressi della strumentazione chirurgica e il progresso delle tecniche di imaging aveva condotto chirurgia endoscopica come la strategia preferita per i tumori sinonasal. In particolare, questa tecnica è stata segnalata come fattibile per i diversi tipi di benigni o maligni di sinonasal tumori15. La nostra tecnica basata su qRT-PCR permette l'identificazione di biomarcatori molecolari, quali differenzialmente in grado di discriminare i campioni di tumori diversi: infatti, forniamo la prova che l'assenza di entrambi i geni di HB in ITACs possa essere usato come indicatori molecolari per questo tipo di tumore, nonché l'assenza di OTX2 in NITACs. Inoltre, questa tecnica può essere applicata immediatamente dopo la biopsia e può dare risultati definitivi in meno di 6 ore per quanto riguarda i giorni o le settimane necessarie per il report dall'ospedale.
Future applicazioni:
I nostri futuri studi coinvolgono l'analisi genica e i livelli di espressione della proteina dei geni OTX1 e HB OTX2 utilizzando analisi di real time PCR, Western blot e immunofluorescenza con anticorpi specifici per rilevare non solo OTX1 e OTX2, ma anche i livelli di espressione della famiglia di p53. Poiché abbiamo precedentemente dimostrato che OTX1 espressione è regolata da p53 in seno cancro7, sarebbe interessante capire se tale regolamento esiste anche nei tumori della cavità nasale. Un'analisi di immunofluorescenza e un saggio di immunoprecipitazione della cromatina (ChiP) può rivelare, rispettivamente, una proteina-proteina e un'interazione DNA-proteina tra p53 e OTXs. Se la connessione non viene trovata, il silenziamento mirati di p53 (e membri della famiglia, p63 e p73), rivelerà se la sovra-espressione o down-regulation dei geni OTX è dipendente da p53.
p53 perdita di funzione, attraverso la mutazione in p53 stessa o perturbazioni nelle vie di segnalazione di p53, è una caratteristica comune nella maggior parte dei cancri umani16. La maggior parte delle mutazioni p53 del cluster all'interno del dominio di legame al DNA; Pertanto, l'attività DNA-legante è la funzione critica che è alterata, suggerendo che le modifiche trascrizionale dei geni potrebbero essere la chiave del mutante p53 attività16. le mutazioni di p53 sono state segnalate come una caratteristica comune di sinonasal cancro, con una frequenza totale di 77%, e mostrano associazione di adenocarcinoma e di esposizione alle polveri di legno17. Così, nei nostri campioni, sarebbe interessante per valutare i livelli di mRNA e proteina (da qR-PCR e Western Blot analisi) ed eseguire la sequenza di questo gene, al fine di identificare o escludere la presenza di mutazioni di attivazione/inattivazione. Infine, se una mutazione ricorrente specifico tipo di tumore è trovato, sarebbe degno di nota per la produzione di cellule ingegnerizzate e topi (con un allele mutante) che porto questa mutazione ed esaminare se la mutazione può ricapitolare la malattia.
Fasi critiche:
Fasi critiche di questo studio includono l'ottenimento di campioni ben immagazzinati, sia come biopsie memorizzate in RNA protezione buffer o campioni FFPE di almeno 8 µm di spessore e l'estrazione di almeno 200 ng di RNA per eseguire analisi di qRT-PCR.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dal Centro Grandi Strumenti Università dell'Insubria, Fondazione Comunitaria del Varesotto, Fondazione del Monte di Lombardia e la Fondazione Anna Villa e Felice Rusconi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation | Applied Biosystem | AM1975 | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystem | 4368814 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix, no AmpErase UNG | Applied Biosystem | 4326614 | |
| ABI Prism 7000 | Applied Biosystem | 270001857 | |
| ACTB probe | Applied Biosystem | Out of production. Sequence protected by copyright | |
| OTX1 probe | Applied Biosystem | Out of production. Sequence protected by copyright | |
| OTX2 probe | Applied Biosystem | Out of production. Sequence protected by copyright | |
| Acqueous Hydrogen Peroxide | Merk | 1072090250 | |
| Citrate Buffer | Sigma-Aldrich | 20276292 | |
| Triton | Sigma-Aldrich | 101473728 | |
| Tris | Merk | 108382 | |
| NaCl | Merk | 106404 | |
| Goat Anti-OTX2 Antibody | Vector Laboratories | Out of production. Catalog number not available | |
| Rabbit Anti-Goat Antibody | Vector Laboratories | BA5000 | |
| ABC-Peroxidase Complex | Vector Laboratories | PK6100 | |
| 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrocloride (DAB) | Sigma-Aldrich | D5905 | |
| Harris Hematoxylin | Bioptica | 0506004/L | |
| Pertek | Kaltek SRL | 1560 | |
| BioClear | Bioptica | W01030799 |
References
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