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Cancer Research

Sinonasal Carcinomas과 후 각 Neuroblastomas에 대 한 두 가지 가능한 분자 마커로 OTX1 OTX2의 식별

doi: 10.3791/56880 Published: February 28, 2019
* These authors contributed equally

Summary

Homeobox 유전자는 종종 종양 성인 유기 체와 관련 된 규제 유전자. 우리 immunohistochemical와 실시간 PCR 분석, 정상 및 염증 코 거칠어 고 가능한 진단 및 치료 대상으로 그들을 사용 하려면 sinonasal 신생 그들의 비교 식을 조사.

Abstract

OTX homeobox (HB) 유전자는 배아 morphogenesis 그리고 성인 유기 체에 있는 후 각 상피의 개발에 표현 됩니다. 이 유전자에서 발생 하는 돌연변이 종종 인간의 tumorigenesis 관련이 있습니다. 데이터가는 OTX 유전자와 비 강 종양 간의 가능한 상관 관계에 관한 오늘 사용할 수 있습니다. 이 작품의 목적은 경우 OTX1OTX2 분자 마커 비 강 종양의 개발에서로 간주 될 수 있습니다 이해 하는 것입니다. 우리가 선택한 immunohistochemical 및 실시간 PCR 분석 통해 OTX1OTX2 유전자의 표정을 조사 하 강과 sinonasal adenocarcinomas. 모두 OTX1 OTX2 했다 결 석 sinonasal Intestinal 형 Adenocarcinomas (ITACs)의 모든 샘플에서. OTX1 mRNA OTX2 mRNA 후 각 Neuroblastomas (기능)에 표현 하는 동안 비 장 유형 Adenocarcinomas (NITACs)에 확인 되었다. 우리 OTX1OTX2 유전자에 대 한 차동 유전자 발현 sinonasal 종양의 종류를 구별 하는 유용한 분자 마커 수 있습니다 설명 했다.

Introduction

OTX HB 유전자 초파리 orthodenticle 유전자 (otd)의 척추 homologue 그리고 그들은 일반적으로 배아 morphogenesis 동안 표현 녹음 방송 요인에 대 한 인코딩 하지만 그들은 또한 다른 기능을 가진 성인 유기 체에 표현 될 수 있습니다. . 배아 개발 하는 동안 그들은 셀 정체성, 세포 분화, 및 몸 axis¹의 위치 지정을 제어 합니다. OTX 가족 포함 OTX1OTX2 유전자는 서로 다른 기능을 표시 합니다. OTX1 두뇌와 감각 기관이 개발에 참여 하고있다. 성인 유기 체에서 그것은 감각 기관에서 표현 되며 뇌2;의 앞쪽 엽의 낮은 수준에서 복사했습니다 그것은 또한 조, 만능 조 혈 및 조상 세포3에 표현 되 고 있는 역할을 하고있다. OTX2 rostral 머리의 개발에 참여 하 고는 morphogen로 그것의 번역된 단백질 행위는 다른 유전자를 통해 그라데이션 생성 하기 때문에 활성화 또는 따라서 셀에 기여 spatio 시간적 방식 억압 확산 그리고 감 별 법입니다. 성인 유기 체에서 OTX2 맥락 막 신경 총 및 송과선4에서 독점적으로 발견 된다.

종종 OTX 유전자에 있는 돌연변이 인간의 선 천 적, 체세포, 또는 신진 대사 결함의 모양을 관련이 있습니다. 이득 또는 손실 OTX 유전자에 있는 돌연변이 세포 성장 및 분화5를 제대로 제어할 수 없는 경우 tumorigenesis 홍보 수 있습니다. Leukemias과 lymphomas 또한 많은 고체 종양 (예를 들어, medulloblastomas6, 적극적인 비 Hodgkin 림프 종2, 유 방 carcinomas7, 대 장 암8및 retinoblastoma9)로 규제 완화 표현의 OTX HB 유전자는 잘 문서화 되어10입니다. 또한, OTX2 돌연변이 눈 개발의 컨트롤에이 유전자에 대 한 중요 한 역할 때문에 anophthalmia와 microphtalmia11 의 경우에 증명 했습니다.

단단한 신생에서 분자 및 phenotypic 마커의 발견은 진단, 분류, 그리고 종양11, 비 강 및 코에를 포함 하 여 여러 종류의 치료에 대 한 중요 한 도전 sinuses입니다. 사실, 그럼에도 불구 하 고이 지역을 차지할만 겸손 해 부 공간, 점 막 상피, 샘, 부드러운 조직, 뼈, 연골 또는 신경/neuroectodermal, 및 hematolymphoid 세포는 종종 복잡 하 고 다른 조직학의 기원에 대 한 사이트가 될 수 있습니다. 종양의 그룹입니다. 신생 sinonasal로 관련 된 다른 유형의 다양 한 기능 위 aerodigestive로 또는 본문12의 대부분의 부품에 걸쳐도 본 것 일반적으로 극복을 제시. Sinonasal 악성 드물다 전세계 1:100,000 주민의 연간 발생률을 제시 하 고 그래서이 방지는 tumorigenesis와 대체 치료 전략의 테스트에 관련 된 경로 관한 연구. 그럼에도 불구 하 고, 영상 기법, 진보 수술 방법과 방사선 치료 sinonasal 암의 임상 관리를 개선 했습니다. 또한, 셀 라인으로 동물 모델 및 암 유전자 프로 파일링의 개발 현재13미래 표적으로 한 항 암 치료 대 한 기초를 구성 한다. 날짜 하려면, 비 강, paranasal sinuses과 nasopharynx의 신생에 OTX1 또는 OTX2 식에 관한 보고 있다. 이후 우리가 이전 OTX1OTX2 유 방 암7에 참여 관찰, 우리가이 유전자는 정상적인 비 강 점 막 뿐만 아니라 비 강에 종양에 존재 수 궁금해. 우리는 "스타지오네 디 Circolo" 바레 세 샘플에 정상적인 점 막, 그리고 2012 년 1985에서 수집 하 고 분류 하는 세계 보건 기구 (WHO)에 따르면 코와 sinonasal adenocarcinomas의의 병 리 학과에서 얻은이 목표에 도달 하 머리와 목 종양의 분류입니다. 우리 실시간 PCR 및 immunohistochemistry 분석을 통해 분석을 선택 하 고 우리가 만약 그들이 이러한 유형의 종양에 대 한 분자 마커 간주 될 수 있습니다 확인 하려면 OTX1OTX2 식 평가.

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Protocol

모든 연구 동의 서 면 및 바레 세에서 Insubria의 대학 윤리 위원회에 의해 승인와 (1975) 헬싱키의 선언에 따르면 수행 했다.

1입니다. 샘플의 수집

  1. 수집 하 고 모든 인간 Formalin-Fixed Paraffin-Embedded (FFPE) 샘플14머리와 목 종양의 WHO 분류에 따라 서로 다른 하위 그룹으로 나눕니다.
    참고: 여기 우리는 다음 예제 사용: 일반 sinonasal 점 제어 (10 샘플); 거꾸로 유 두 종 (IP, ICD O 코드 8121/1); Sinonasal 그것 (ICD O 코드 8144/3, 32 샘플); NITAC (ICD O 코드 8140/3, 12 샘플); Adenoid 낭 성 암 (ACC, ICD O 코드 8200/3); Pleomorphic Adenoma (PA, ICD O 코드 8941/3); (ICD O 코드 9522/3, 13 샘플); 가난 하 게 분화 신경 내 분 비 암 종 (PDNEC, ICD O 코드 8041/3, 19 샘플); 신경 내 분 비 종양 (NET, ICD O 코드 8041/3).

2입니다. immunochemistry

  1. Deparaffinization 및 리하이드레이션 섹션의
    1. 30 분 동안 60 ° C에 오븐에 있는 샘플 슬라이드를 열 고 3 µ m 두께 FFPE 사용 하 여 섹션 물 알코올 시리즈를 rehydrate.
    2. 간단히 10 분 동안 크 실 렌에 슬라이드를 세척 하 고 반복이 단계; 100% 술에 5 분에 대 한 슬라이드를 세척 하 고 직렬로 95%, 85%, 및 75% 알코올을 사용 하 여이 단계를 반복. 증류수에 5 분에 대 한 슬라이드를 씻어.
  2. 생 활동 차단
    1. 12 분 동안 3% 수성 수소 과산화물에 슬라이드를 삽입 하 여 내 인 성 활동을 차단 합니다.
  3. 항 원 복구
    1. 10 m m 구 연산 염 버퍼 (pH 6) 치료를 전자 레인지에 10 분 동안 치료 하 여 항 원 복구를 수행 합니다.
  4. 1 차적인 항 체를 가진 외피
    1. TBS 버퍼 (pH 7.4)에 섹션을 씻어 다음 10 분 동안 차단 솔루션을 추가 합니다.
    2. TBS 버퍼 (pH 7.4)에 섹션을 씻어 다음 0.2% 트리톤 X를 추가 합니다.
    3. 염소 안티 인간 OTX2 항 체 희석 1: 100으로 4 ° C에서 밤새 품 어.
  5. 이차 항 체를 가진 외피
    1. ABC-과산화 효소 복잡 한 뒤에 biotinylated 토끼 반대로 염소 이차 항 체 희석 1: 200으로 실 온에서 1 h에 대 한 섹션을 품 어 ( 테이블의 자료를 참조).
  6. immunoreaction 개발
    1. 3, 3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride를 사용 하 여 immunoreaction를 개발 하 고 해리스 Hematoxylin와 핵을 counterstain.
  7. 장착 및 이미징
    1. 초승달 알코올 규모를 사용 하 여 섹션을 탈수 하 고 명확히 terpene 근원의 개간 물질을 사용 하 여 ( 재료의 표참조). 설치 중간에 섹션을 포함, 섹션 현미경 슬라이드에 놓고 광학 현미경을 통해 섹션을 관찰 합니다.

3. RNA 추출 및 역-전사

  1. RNA 추출
    1. Immunoprecipitation 프로토콜 (참조 섹션 2.1)의 첫 번째 단계를 수행 하 여 섹션에서 RNA를 추출 하 고 증류수에 슬라이드를 유지 합니다. 해당 되며 오신 관심의 조각 식별 섹션 스테인드과 흠 없는 섹션을 겹칩니다.
    2. RNA 추출 FFPE 샘플 ( 재료의 표참조) 및 다음 제조업체의 지침에 대 한 상업적인 RNA 추출 키트를 사용 하 여 수행 합니다.
  2. RNA 리버스-전사
    1. 상업 키트를 사용 하 여 cDNA로 RNA 복고풍 녹음 ( 재료의 표참조) 다음 프로토콜. 여러 가지 분석을 수행 하기 위해 총 RNA의 레트로 녹음 적어도 1000 ng

4. 실시간 PCR 및 데이터 분석

  1. 실시간 PCR
    1. 프로브 기반 기술로 양적 실시간 PCR 분석 (qRT-PCR) 수행 ( 재료의 표참조) 및 열 cycler.
  2. PCR 반응 혼합의 준비
    1. 프로브 기반 마스터 믹스의 12.5 µ L를 사용 하 여 PCR 반응 혼합 준비, 1.25 µ L 각 OTX1, OTX2, 및 ACTB의 프로브 ( 재료의 표참조), 50 ng cDNA, 그리고 nuclease 무료 물 총 볼륨의 최대 25 µ L.
    2. 3 중 유전자 표현 레벨을 정상화 하 생 컨트롤로 ACTB 유전자를 사용 하 여 모든 반응을 수행 합니다.
    3. 1109 x g 3 분에 격판덮개 원심 고 실험까지 4 ° C에서 빛에서 보호 하는 접시를 저장.
  3. 열 cycler 설정
    1. 설정 열 cycler 프로필 초기 뜨거운 시작 2 분 및 10 분 동안 95 ° C 50 ° C에서 사이클 15 95 ° C에서 40 주기 다음 s와 1 분 동안 60 ° C에서 최종 주기.
  4. 진 식 수준 분석
    1. 생 제어 ACTB 유전자를 사용 하 여 비교 주기 임계값 (ΔCt) 메서드를 통해 유전자 표현 레벨을 정상화.
    2. 2-ΔCt 메서드를 사용 하 여 유전자 식 레벨을 평가 하 고 결과 플롯.
  5. 통계 분석
    1. 학생의 t를 사용 하 여 통계 분석을 수행- p < 0.05를 통계적으로 유의 한 결과 고려 하 고 테스트.

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Representative Results

정상 점 막에서 OTX 유전자 ciliated pseudostratified 형 호흡 상피와 submucosal 선 세포 (그림 1A)에 대 한 강력 하 고 동종 핵 반응을 관찰합니다. 우리는 모든 NITACs 샘플에 (그림 1B), 작은 동안 또는 immunoreactivity 결 석 OTX1 핵 식을 ITACs (그림 1C)에서 강조 했다 발견. 강렬한 immunoreactivity는 모든 기능 (그림 1D);에 PDNECs, 중 OTX 식 강도에 긍정적인 세포 (그림 1E)의 백분율 변화. 통계 분석 치 평방 또는 피셔의 정확한 시험 수행 Immunohistochemical 시연 OTX 그것 견본에서 유전자의 부재 했다 통계적 (n = 23, p < 0.01).

실시간 PCR 분석 확인 컨트롤 샘플 (그림 2A-B); OTX2와 OTX1 유전자의 표현 OTX1 하지만 하지 OTX2 NITAC 샘플에 표현 했다 고 두 유전자 ITACs (그림 2A-B)에서 downregulated 완전히 했다. 샘플에 우리가 발견 OTX2 유전자의 표현에만 동안 OTX1 downregulated, PDNEC 샘플 중 두 유전자의 표정 변화 (그림 2A-B).

학생의 t 시험 실시간 PCR 수행 ITACs 대 컨트롤에서 OTX1 통계적 데이터 확인 (n = 9, p < 0.05), 컨트롤 기능 대 (n = 6, p < 0.05), PDNECs 대 컨트롤 (n = 8, p < 0.05), OTX2 NITACs 대 컨트롤에 대 한 (n = 5, p < 0.05), ITACs 대 컨트롤 (n = 9, p < 0.05), 컨트롤 기능 대 (n = 6, p < 0.05), 및 PDNECs 대 (n = 8, p < 0.05).

Figure 1
그림 1 : 제어 및 종양 약 조직 OTX immunohistochemical 식의 대표 이미지. 과산화 효소 활용 된 이차 항 체에 의해 개발 된 반응 공개 신호 (짙은 갈색)은 정상적인 sinonasal 점 막 (A), 비-장 형 adenocarcinomas (NITACs) (B), 7의 7 경우의 5 제어 FFPE 섹션에 표시 후 각 neuroblastomas (기능) (D)의 경우, 11의 경우는 23의 경우에 Intestinal 형 adenocarcinomas (ITACs) 분석 (C) neuroendocrine carcinomas (PDNECs) (E), 아무 immunoreactivity 감지 하는 동안 제대로 분화. DAB 되며; 원래 확대: 눈금 막대 x 200 = 100 µ m.

Figure 2
그림 2 : OTX1 (A) 및 정상 및 종양 약 코 조직에서 OTX2 mRNA (B) 식의 실시간 PCR 분석. 실시간 PCR 분석에 대 한 다음 샘플을 사용 되었다: 제어 정상 점 막, 비-장 형 adenocarcinomas (NITACs)의 5 경우, Intestinal 형 adenocarcinomas (ITACs)의 9의 경우, 후 각 neuroblastomas (ONs), 8의 6 경우 5 FFPE 섹션 저조한의 경우 분화 신경 내 분 비 carcinomas (PDNEC). X 축에서 Y 축 2-ΔCt 값을 나타내는 샘플 형식을 보고 됩니다. 제어 및 종양 사이 통계적으로 중요 한 데이터 (p < 0.05) 학생의 t에 의해 가져온-테스트 및 별표와 함께 강조 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

이 연구는, mRNA 수준에 따라 처음으로 보여줍니다 OTX1 및 OTX2 HB 유전자가 정상적인 sinonasal 점 막과 submucosal 선, 염증 성 폴립, sinonasal Schneiderian 갑, 그리고 다른 표현 상피와 neuroectodermal 신생, 편평 carcinomas, 비-장의 유형 sinonasal adenocarcinomas, 침 샘 타입 종양, 신경 내 분 비 신생 및 기능을 포함 하 여

수정 및 문제 해결:

RNA 저하를 방지 하려면 우리 병 리의 실험실에서 deparaffinization 프로토콜을 수행 합니다. 후에 우리가 긁힌 슬라이드, 모든 샘플 급속 하 게 냉각 되었고 추가 사용까지 드라이 아이스에 저장. 우리는 층 류 흐름 안전 후드 무 균 실험 조건 유지 하 고 RNA 오염 방지 살 균 팁 펫 전용된 세트를 사용 하 여 모든 후속 분석을 수행 합니다.

기술의 한계:

기술의 주요 제한 때문에 sinonasal 구멍의 종양은 드문 종종 샘플의 가용성에 의존 합니다. 추출 된 RNA의 양을 FFPE 샘플에서 RNA 추출 분석 하기 어려운 조각난된 RNA에 발생 하기 때문에 또 다른 중요 한 문제입니다.

기존의 방법에 관하여 의미:

X-레이 분석, 비 강, CT 검사, 자기 공명 (RMN) 및 생 검 내 시경 시험이 비 강 종양의 진단에 의하여 일반적으로 이루어져 있다. 최근 몇 년 동안 수술 장비의 발전과 기술 이미징의 진행 sinonasal 종양에 대 한 기본 전략으로 내 시경 수술을 주도 했다. 특히,이 기술은 양성 또는 악성의 종류 sinonasal 종양15에 대 한 실현 가능한 것으로 보고 되었습니다. QRT-PCR에 기초를 둔 우리의 기술은 수 다른 종양의 샘플을 차별 차동 수 분자 마커의 식별: 우리 ITACs에서 모두 HB 유전자의 부재 분자 마커로 사용 될 수 있다는 증거를 제공 하는 사실, NITACs에서 OTX2의 부재로 서 종양의 유형입니다. 또한,이 기술은 생 검 후 즉시 적용 될 수 있다 고 일 또는 병원에서 보고서에 필요한 주 6 시간 이내에 최종 결과 줄 수 있다.

미래의 응용 프로그램:

우리의 미래 연구 분석 하는 유전자 및 단백질 식 수준의 OTX1와 OTX2 HB 유전자를 사용 하 여 실시간 PCR 분석, 서쪽 오 점, 그리고 면역 형광 특정 항 체를 검출 뿐만 아니라 OTX1 OTX2, 뿐만 아니라 p53 가족 식 수준을 포함 한다. 때문에 우리는 이전 OTX1 식 유 방 암7에서 p53에 의해 규제 됩니다 시연, 그것은 이러한 규제 비 강 종양에도 있는지 이해 흥미로울 것입니다. 면역 형광 시험 고 Chromatin Immunoprecipitation (칩) 분석 결과 밝힐 수 있다, 각각, 단백질-단백질 및 p53와 OTXs 간의 DNA 단백질 상호 작용. 이러한 연결을 발견 하는 경우 오버 식 또는 다운 레 귤 레이 션 OTX 유전자의 p53 의존 인지 밝힐 것 이다 p53 (가족 구성원, p63 및 p73), 대상에 게 침묵.

p53 손실의 기능, p53 돌연변이 통해 자체 또는 p53 신호 경로에 섭, 대부분 인간의 암16의 일반적인 기능입니다. P53 돌연변이의 대부분 클러스터 도메인 내에서 DNA 바인딩; 따라서, DNA 바인딩 활동 변경, 변경 transcriptional 유전자에 돌연변이 p53 활동16키 수 제안 하는 중요 한 기능입니다. p53 돌연변이 77%의 전반적인 주파수 sinonasal 암의 일반적인 기능으로 보고 되었습니다 그리고 그들은 보여 선 암 및 나무 먼지 노출17협회. 따라서, 우리의 샘플 mRNA와 단백질 레벨 (qR-PCR 및 서쪽 오 점 분석)를 평가 하 고 식별 하거나 활성화/비활성화 변이의 존재를 제외,이 유전자의 시퀀싱을 수행 하기 위해 재미 있을 것. 마지막으로, 경우 종양 형 특정 재발 돌연변이 발견, 그것은 주목할 만한 조작된 세포와이 돌연변이 항구 (와 1 개의 돌연변이 체 대립 유전자) 마우스를 생산 하 고 돌연변이 질병 정리 수 면 검사 됩니다.

중요 한 단계:

이 연구의 중요 한 단계는 biopsies RNA 보호 버퍼 또는 적어도 8 µ m 두께의 FFPE 샘플 및 적어도 200의 추출에 저장으로 잘 저장 된 샘플의 획득을 포함 qRT-PCR 분석을 수행 하는 RNA의 ng.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

이 작품은 센트 가족 Strumenti 사크 dell'Insubria, 피코 Comunitaria del Varesotto, 피코 델에 의해 지원 되었다 몬테 디 롬바르디아와 피코 안 나 빌라 e 펠리 Rusconi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation Applied Biosystem AM1975
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Applied Biosystem 4368814
TaqMan Universal PCR Master Mix, no AmpErase UNG Applied Biosystem 4326614
ABI Prism 7000  Applied Biosystem 270001857
ACTB probe Applied Biosystem Out of production. Sequence protected by copyright
OTX1 probe Applied Biosystem Out of production. Sequence protected by copyright
OTX2 probe Applied Biosystem Out of production. Sequence protected by copyright
Acqueous Hydrogen Peroxide Merk 1072090250
Citrate Buffer Sigma-Aldrich 20276292
Triton Sigma-Aldrich 101473728
Tris Merk 108382
NaCl Merk 106404
Goat Anti-OTX2 Antibody Vector Laboratories Out of production. Catalog number not available
Rabbit Anti-Goat Antibody Vector Laboratories BA5000
ABC-Peroxidase Complex Vector Laboratories PK6100
3,3'-diaminobenzidine tetrahydrocloride (DAB) Sigma-Aldrich D5905
Harris Hematoxylin Bioptica 0506004/L
Pertek Kaltek SRL 1560
BioClear Bioptica W01030799

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References

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Micheloni, G., Millefanti, G., Conti, A., Pirrone, C., Marando, A., Rainero, A., Tararà, L., Pistochini, A., Lo Curto, F., Pasquali, F., Castelnuovo, P., Acquati, F., Grimaldi, A., Valli, R., Porta, G. Identification of OTX1 and OTX2 As Two Possible Molecular Markers for Sinonasal Carcinomas and Olfactory Neuroblastomas. J. Vis. Exp. (144), e56880, doi:10.3791/56880 (2019).More

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