Summary
Homeobox gener er regulatory gener ofte assosiert med svulster i voksen organismer. Vi undersøkt deres komparative uttrykk av immunohistochemical og sanntid PCR analyse, normal og provoserende nasal mucosae og sinonasal neoplasms for å bruke dem som mulige diagnostiske og terapeutiske mål.
Abstract
OTX homeobox (HB) gener som er uttrykt i løpet embryonale morphogenesis og under utviklingen av olfactory epitel i voksen organismer. Mutasjoner som forekommer i disse genene er ofte knyttet til tumorigenesis i menneskelig. Ingen data er tilgjengelig i dag om mulig sammenheng mellom OTX gener og svulster av nesehulen. Formålet med dette arbeidet er å forstå hvis OTX1 og OTX2 kan betraktes som molekylære markører i utviklingen av nese svulster. Vi valgte nese og sinonasal adenocarcinomas undersøke uttrykk for OTX1 og OTX2 gener gjennom immunohistochemical og sanntid PCR analyser. Både OTX1 og OTX2 var fraværende i alle prøvene av sinonasal Intestinal-Type Adenocarcinomas (ITACs). OTX1 mRNA ble identifisert i ikke-tarm Type Adenocarcinomas (NITACs) mens OTX2 mRNA ble uttrykt i Olfactory Neuroblastomas (ONs). Vi har vist at den differensial genuttrykk for både OTX1 og OTX2 gener kan være en nyttig molekylær markør å skille ulike sinonasal svulster.
Introduction
OTX HB gener er den virveldyr homologue av Drosophila orthodenticle genene (otd) og de kode for transkripsjonsfaktorer som uttrykkes vanligvis under embryonale morphogenesis, men de kan også uttrykkes i voksen organisme med ulike funksjoner . Under embryonale utviklingen kontrollere de spesifikasjonen av cellen identitet, celledifferensiering og posisjonering av kroppen axis¹. OTX familien inkluderer OTX1 og OTX2 gener som viser ulike funksjoner. OTX1 er involvert i hjernen og sensoriske orgel utvikling. Voksen organismen, det uttrykkes i sensoriske organer og er transkribert på lave nivåer i fremre flik av hypofysen2; Det spiller også en rolle i hematopoiesis, uttrykt i blodkreft pluripotent og stamfar celler3. OTX2 er involvert i utviklingen av rostral hodet og dens oversatt protein fungerer som en morphogen fordi den genererer en forløpning gjennom hvilke andre gener er aktivert eller undertrykt på en spatio-temporale måte, noe som bidro til celle spredning og differensiering. I voksen organismen, er OTX2 funnet i choroid plexus og pinealkjertelen4.
Mutasjoner i OTX gener er ofte knyttet til visningen av menneskelig medfødt, somatiske eller metabolske mangler. Vinning mutasjoner i OTX gener kan fremme tumorigenesis hvis de ikke kunne kontrollere riktig mobilnettet vekst og/eller differensiering5. I leukemias og lymfomer så vel som mange solide tumorer (f.eks medulloblastomas6, aggressive non-Hodgkin lymfomer2, bryst kreftsvulster7, kolorektal kreft8og retinoblastoma9), den deregulert uttrykk for OTX HB gener er godt dokumentert10. I tillegg har OTX2 mutasjoner blitt vist i tilfeller av anophthalmia og microphtalmia11 på grunn av avgjørende rollen for dette genet i kontroll av øye utvikling.
I forbindelse med solid neoplasms er oppdagelsen av molekylære og fenotypiske markører en viktig utfordring for diagnose, klassifisering og behandling av flere typer av svulst11, inkludert de som kommer i nesehulen og paranasal bihulene. Faktisk, til tross for at disse områdene okkupere bare en beskjeden anatomiske plass, mucosal epitel, kjertler, myke vev, bein, brusk eller nevrale/neuroectodermal, og hematolymphoid celler kan ofte stedet for opprinnelsen til komplekse og histologisk forskjellig grupper av svulster. Ulike typer neoplasms som involverer sinonasal skrift presenterer en rekke funksjoner som overvinne hva er vanligvis sett i øvre aerodigestive skrift eller selv i de fleste deler av kroppen12. Sinonasal malignitet er sjeldne og presentere en årlig forekomst av 1:100,000 innbyggere over hele verden, og så dette hindrer studier om veier tumorigenesis og testing av alternativ behandling strategier. Til tross for dette, fremskritt i imaging teknikker, har kirurgiske metoder, og strålebehandling forbedret klinisk forvaltning av sinonasal kreft. Videre utvikling av linjer som dyremodeller og kreft genetisk profilering for tiden utgjør grunnlaget for fremtidige målrettet anticancer terapi13. Hittil er det ingen rapporter om OTX1 og/eller OTX2 uttrykk i neoplasms av nesehulen, paranasal bihulene og nasopharynx. Siden vi har tidligere observert at OTX1 og OTX2 er involvert i bryst kreft7, lurte vi hvis disse genene kan finnes ikke bare i den normale nasal mucosa, men også i svulster av nesehulen. Å nå dette målet vi innhentet fra avdeling for patologi på "Ospedale di Circolo" i vareprøver av normal mucosa og nese og sinonasal adenocarcinomas samlet fra 1985 til 2012 og klassifisert i henhold til Verdens helseorganisasjon (WHO) klassifisering av hodet og halsen svulster. Vi vil analysere dem gjennom sanntids PCR og immunohistochemistry analyser og vi vurdert OTX1 og OTX2 uttrykk for å finne ut om de kan betraktes molekylære markører for disse typer av svulst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle studier ble utført ifølge erklæringen av Helsinki (1975) med skriftlig samtykke og godkjent av den etiske komiteen Insubria University i Varese.
1. innsamling av prøvene
- Samle inn og dele alle menneskelige Formalin-Fixed Paraffin-Embedded (FFPE) prøvene i forskjellige undergruppene ifølge WHO klassifiseringen av hodet og halsen svulster14.
Merk: Her vi brukte følgende prøver: Normal sinonasal mucosa som kontroll (10 prøver); Invertert Papilloma (IP, ICD-O koden 8121/1); Sinonasal ITAC (ICD-O koden 8144/3, 32 prøver); NITAC (ICD-O koden 8140/3, 12 prøver); Adenoid cystisk Carcinoma (ACC, ICD-O koden 8200/3); Pleomorphic adenom (PA, ICD-O koden 8941/3); PÅ (ICD-O koden 9522/3, 13 prøver); Dårlig differensiert Neuroendocrine Carcinoma (PDNEC, ICD-O koden 8041/3, 19 prøver); Nevroendokrine (netto, ICD-O koden 8041/3).
2. immunochemistry
-
Deparaffinization og rehydrering seksjoner
- Varme eksempellysbilder i en ovn ved 60 ° C i 30 min og rehydrate 3 µm tykk FFPE inndelinger ved hjelp av en alkohol-serien til vann.
- Kort vaske lysbildene i xylen for 10 min og gjenta dette trinnet; Gjenta dette trinnet med 95% og 85% 75% alkohol serielt vaske lysbilder for 5 min 100% alkohol. Skyll lysbilder for 5 min med destillert vann.
-
Blokkerer endogene aktiviteten
- Blokkere endogene aktiviteten ved å plassere lysbildene i 3% vandig Hydrogenperoksid i 12 minutter.
-
Antigen henting
- Utføre antigen henting ved å behandle med 10 mM Citrate Buffer (pH 6) i 10 minutter i en mikrobølgeovn-behandling.
-
Inkubasjon med primære antistoff
- Vask delene i TBS buffer (pH 7.4), deretter legge blokkerer løsning for 10 min.
- Vask delene i TBS buffer (pH 7.4), deretter legge 0,2% Triton X.
- Ruge over natten ved 4 ° C med geit anti-OTX2 antistoff utvannet 1: 100.
-
Inkubasjon med sekundær antistoff
- Inkuber delene 1t ved romtemperatur med biotinylated kanin anti-geit sekundære antistoff fortynnet 1:200 etterfulgt av ABC-peroxidase kompleks (se Tabellene av materialer).
-
Utvikling av immunoreaction
- Utvikle immunoreaction ved hjelp av 3, 3-diaminobenzidine tetrahydrochloride og counterstain kjerner med Harris Hematoxylin.
-
Montering og bildebehandling
- Tørke delene med en halvmåne alkohol-skala og klargjøre dem ved hjelp av en lysning stoff terpene opprinnelse (se Tabell for materiale). Bygge inn inndelinger i montering medium, plasserer delene på en microscope skyve og observere delene gjennom en optisk mikroskop.
3. RNA utvinning og omvendt-transkripsjon
-
RNA utvinning
- Ekstra RNA fra delene den første grepet av immunoprecipitation protokollen (se § 2.1) og holde lysbildene i destillert vann. Overlappe delene unstained kvinne med det tilsvarende hematoxylin-eosin farget deler for å identifisere fragmenter av interesse.
- Utføre RNA utvinning bruker en kommersiell RNA utvinning kit for FFPE prøver (se Tabell for materiale) og følgende produsentens instruksjoner.
-
RNA omvendt-transkripsjon
- Bruk en kommersiell kit retro-transkribere RNA i cDNA (se Tabell for materiale) følger protokollen. Retro-transkribere minst 1000 ng av totale å utføre flere analyser.
4. sanntid PCR og dataanalyse
-
Sanntid PCR
- Utføre kvantitativ sanntid PCR analyser (qRT-PCR) med sonde-basert teknologi (se Tabell for materiale) og en termisk cycler.
-
Utarbeidelse av PCR reaksjonen blanding
- Forberede PCR reaksjonen blanding med 12.5 µL av sonden-baserte master mix, 1,25 µL hver OTX1, OTX2 og ACTB sonder (se Tabell for materiale), 50 ng cDNA, og nuclease-gratis vann opptil 25 µL av totalt volum.
- Utfør alle reaksjoner i tre eksemplarer bruker ACTB genet som endogene kontrollen for å normalisere gene expression nivå.
- Sentrifuge platen 1,109 x g for 3 min og lagre platen beskyttet mot lys i 4 ° C før eksperimentet.
-
Angi den termiske cycler
- Sett termisk cycler profilen med en innledende varmt start syklusen på 50 ° C i 2 minutter og 95 ° C i 10 min, etterfulgt av 40 sykluser på 95 ° C for 15 s og en siste syklus på 60 ° C i 1 min.
-
Gene expression nivå analyser
- Normalisere gene expression nivåene gjennom sammenlignende syklus terskelen (ΔCt) metode med ACTB genet som endogene kontrollen.
- Evaluere gene expression nivåer med metoden 2-ΔCt og vise resultatene.
-
Statistiske analyser
- Utføre statistiske analyser ved hjelp av Student t-Test, vurderer statistisk betydelige resultater med p < 0,05.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I normal mucosa observerte vi sterke og homogen kjernefysiske reaktivitet for OTX gener i tungeformet pseudostratified åndedretts-type epitel og i de submucosal kjertler cellene (figur 1A). Vi fant kjernefysiske uttrykk for OTX1 i alle NITACs prøver (figur 1B), mens liten eller fraværende immunoreactivity ble understreket i ITACs (figur 1 c). Intens immunoreactivity var til stede i alle ONs (figur 1 d); blant PDNECs store OTX uttrykk i intensitet og prosentandel av positive celler (figur 1E). Immunohistochemical statistisk analyse utført med Chi kvadrat og/eller Fishers eksakt test viste at fravær av OTX gener i ITAC prøver var statistisk signifikant (n = 23, p < 0,01).
Sanntid PCR analyser bekreftet uttrykk for både OTX1 og OTX2 gener i kontroll prøver (figur 2A-B); OTX1 men ikke OTX2 ble uttrykt i NITAC prøver og både gener var helt downregulated i ITACs (figur 2A-B). I på prøver funnet vi bare uttrykk for OTX2 gene mens OTX1 var downregulated, og blant de PDNEC prøvene uttrykk for både gener variert (figur 2A-B).
T -test for studenter på sanntid PCR bekreftet statistisk signifikante data for OTX1 kontroller vs ITACs (n = 9, p < 0,05), kontroller vs ONs (n = 6, p < 0,05), kontroller vs PDNECs (n = 8, p < 0,05), og for OTX2 kontroll vs NITACs (n = 5, p < 0,05), kontroller vs ITACs (n = 9, p < 0,05), kontroller vs ONs (n = 6, p < 0,05), og kontroller vs PDNECs (n = 8, p < 0,05).
Figur 1 : Representant bilder av OTX immunohistochemical uttrykk i kontroll og neoplastic vev. Reaksjonen utviklet av peroxidase-konjugerte sekundære antistoffer avslørt signalet (mørk brun) var synlig i 5 kontroll FFPE deler av normal sinonasal mucosa (A), 7 tilfeller av ikke-tarm-type adenocarcinomas (NITACs) (B) 7 tilfeller Olfactory neuroblastomas (ONs) (D) 11 tilfeller dårlig differensiert neuroendocrine kreftsvulster (PDNECs) (E), mens ingen immunoreactivity oppdages i 23 tilfeller av Intestinal-type adenocarcinomas (ITACs) analyserte (C). DAB-Hematoxylin; opprinnelige visningsstørrelsen: 200 x, skala bar = 100 µm.
Figur 2 : Real-time PCR analyse av OTX1 (A) og OTX2 (B) mRNA uttrykk i normal og neoplastic nasal vev. For sanntids PCR analyser, følgende eksempler ble brukt: 5 FFPE deler av kontroll normalt mucosa, 5 tilfeller av ikke-tarm-type adenocarcinomas (NITACs), 9 tilfeller av Intestinal-type adenocarcinomas (ITACs), 6 tilfeller av olfactory neuroblastomas (ONs), 8 tilfeller av dårlig differensiert neuroendocrine kreftsvulster (PDNEC). På X-aksen er av prøven rapportert, mens Y-aksen representerer de 2- ΔCt -verdiene. Statistisk signifikante data (p < 0,05) mellom kontrollen og svulst ble innhentet av Student t-test og er merket med stjerner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne studien viser for første gang som, basert på mRNA nivåer, HB gener OTX1 og OTX2 uttrykkes i normal sinonasal mucosa og submucosal kjertler, inflammatorisk polypper, sinonasal Schneiderian papillomas, og de forskjellige epitel og neuroectodermal neoplasms, inkludert squamous kreftsvulster, ikke-tarm type sinonasal adenocarcinomas, salivary kjortelen-type svulster, neuroendocrine neoplasms og ONs.
Endringer og feilsøking:
For å unngå RNA fornedrelse, utført vi deparaffinization protokollen i laboratorium for patologi. Når vi riper lysbildene, var alle prøvene raskt avkjølt og lagret i tørris inntil videre bruk. Vi utført alle etterfølgende analysene i laminær-flow sikkerhet hette med et eget sett med Pipetter sterilt tips å opprettholde aseptiske eksperimentelle forhold og å unngå RNA forurensing.
Begrensninger av teknikken:
Den viktigste begrensningen av teknikken avhengig av tilgjengeligheten av prøver siden svulster i sinonasal hulrom er ofte sjeldne. Mengden av utdraget er en annen viktig sak fordi RNA utvinning fra FFPE prøver gir fragmentert RNA som er vanskelig å analysere.
Betydning når det gjelder eksisterende metoder:
Diagnostisering av svulster av nesehulen består vanligvis av røntgenstråler analyser, endoscopic eksamen nesehulen, CT scan, magnetisk resonans (RMN) og biopsi. Under de siste årene, hadde fremskritt i kirurgiske instrumentering og fremdriften for imaging teknikker ledet endoskopisk kirurgi som den foretrukne strategien for sinonasal svulster. Denne teknikken er spesielt rapportert som mulig for ulike godartet eller ondartet sinonasal svulster15. Våre teknikk basert på qRT PCR lar identifikasjon av molekylære biomarkers, som kan ulikt diskriminere prøver av forskjellige svulster: faktisk vi beviser at fravær av både HB genene i ITACs kan brukes som molekylære markører for dette type svulst som fravær av OTX2 i NITACs. Dessuten, denne teknikken kan brukes umiddelbart etter biopsy og kan gi klare resultater på mindre enn 6 timer med hensyn til dager eller uker nødvendig for rapporten fra sykehuset.
Fremtidige programmer:
Våre fremtidige studier innebære analysere genet og protein uttrykk nivåer av OTX1 og OTX2 HB gener bruker sanntid PCR analyser og Western blot immunofluorescence med spesifikke antistoffer for å oppdage ikke bare OTX1 og OTX2, men også p53 familie uttrykk nivåer. Siden vi viste tidligere at OTX1 uttrykk er regulert av p53 i bryst kreft7, ville det være interessant å forstå hvis slike bestemmelser finnes også i nesehulen svulster. Immunofluorescence analysen og en Chromatin Immunoprecipitation (ChiP) analysen kan avsløre, henholdsvis en protein-protein og en DNA-protein interaksjon mellom p53 og OTXs. Hvis slik forbindelse, vil målrettet silencing p53 (familiemedlemmer, p63 og p73), avdekke om over-uttrykk eller ned-regulering av OTX gener er avhengig av p53.
p53 tap av funksjon, gjennom mutasjon i p53 selv eller forstyrrelser i trasé signalisering til p53, er vanlig i fleste kreft hos mennesker16. De fleste av p53 mutasjoner klyngen på DNA-bindende domene; Derfor er DNA-bindende aktiviteten kritisk funksjonen endres, noe som tyder på at endringer i transcriptional gener kan være nøkkelen til mutant p53 aktivitet16. p53 mutasjoner har blitt rapportert som et felles trekk ved sinonasal kreft, med en samlet frekvens på 77%, og de viser association adenocarcinoma og tre-støv eksponering17. Dermed i våre prøver, ville det være interessant å vurdere mRNA og protein nivåer (ved qR PCR og Western Blot analyse) og utføre sekvensering av dette genet, for å identifisere eller utelate tilstedeværelsen av aktivering/inaktivere mutasjoner. Til slutt, hvis en svulst-type bestemt tilbakevendende mutasjon er funnet, det ville være bemerkelsesverdig utvikling celler og mus (med en mutant allelet) som havn denne mutasjonen, og undersøke om mutasjonen kan recapitulate sykdommen.
Avgjørende skritt:
Avgjørende skritt av denne studien omfatter obtainment av godt lagret prøver, enten som biopsier lagret i RNA beskyttende buffer eller FFPE eksempler på minst 8 µm tykk og utvinning av minst 200 ng av å utføre qRT PCR-analyser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Centro Grandi Strumenti Università dell'Insubria, Fondazione Comunitaria del Varesotto, Fondazione del Monte di Lombardia og Fondazione Anna Villa e Felice Rusconi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation | Applied Biosystem | AM1975 | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystem | 4368814 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix, no AmpErase UNG | Applied Biosystem | 4326614 | |
| ABI Prism 7000 | Applied Biosystem | 270001857 | |
| ACTB probe | Applied Biosystem | Out of production. Sequence protected by copyright | |
| OTX1 probe | Applied Biosystem | Out of production. Sequence protected by copyright | |
| OTX2 probe | Applied Biosystem | Out of production. Sequence protected by copyright | |
| Acqueous Hydrogen Peroxide | Merk | 1072090250 | |
| Citrate Buffer | Sigma-Aldrich | 20276292 | |
| Triton | Sigma-Aldrich | 101473728 | |
| Tris | Merk | 108382 | |
| NaCl | Merk | 106404 | |
| Goat Anti-OTX2 Antibody | Vector Laboratories | Out of production. Catalog number not available | |
| Rabbit Anti-Goat Antibody | Vector Laboratories | BA5000 | |
| ABC-Peroxidase Complex | Vector Laboratories | PK6100 | |
| 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrocloride (DAB) | Sigma-Aldrich | D5905 | |
| Harris Hematoxylin | Bioptica | 0506004/L | |
| Pertek | Kaltek SRL | 1560 | |
| BioClear | Bioptica | W01030799 |
References
- Boncinelli, E., Simeone, A., Acampora, D., Gulisano, M. Homeobox genes in the developing central nervous system. Ann genet. 36 (1), 30-37 (1993).
- Omodei, D., et al. Expression of the Brain Transcription Factor OTX1 Occurs in a Subset of Normal Germinal-Center B Cells and in Aggressive Non-Hodgkin Lymphoma. American J. Pathol. 175, 2609-2617 (2009).
- Levantini, E., et al. Unsuspected role of the brain morphogenetic gene Otx1 in hematopoiesis. Proc. Natl. Acad. Sci USA. 100 (18), 10299-10303 (2003).
- Larsen, K. B., Lutterodt, M. C., Mollgard, K., Moller, M. Expression of the homeobox OTX2 and OTX1 in the early developing human brain. J. Histochem. Cytochem. 58, 669-678 (2010).
- Abate-Shen, C. Deregulated homeobox gene expression in cancer: cause or consequence? Nat. Rev. Cancer. 2, 777-785 (2002).
- de Haas, T., et al. OTX1 and OTX2 expression correlates with the clinicopathologic classification of medulloblastomas. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 65, 176-186 (2006).
- Terrinoni, A., et al. OTX1 expression in breast cancer is regulated by p53. Oncogene. 30 (27), 3096-3103 (2001).
- Yu, K., et al. OTX1 promotes colorectal cancer progression through epithelial-mesenchymal transition. Biochem. Biophys Res Commun. 44 (1), 1-5 (2014).
- Glubrecht, D. D., Kim, J. H., Russel, L., Bamforth, J. S., Godbout, R. Differential CRX and OTX2 expression in human retina and retinoblastoma. J. Neurochem. 111 (1), 250-263 (2009).
- Coletta, R. D., Jedlicka, P., Gutierrez-Hartamn, A., Ford, H. L. Transcriptional control of the cell cycle in mammary gland development and tumorigenesis. J. mammary gland Biol. Neoplasia. 9, 39-53 (2004).
- Cordes, B., et al. Molecular and phenotypic analysis of poorly differentiated sinonasal neoplasms: an integrated approach for early diagnosis and classification. Hum Pathol. 40, 283-292 (2009).
- Stelow, E. B., Bishop, J. A. Update from the 4th Edition of the World Health Organization Classification of Head and Neck Tumours: Tumors of the Nasal Cavity, Paranasal Sinuses and Skull Base. Head Neck Pathol. 11 (1), 3-15 (2017).
- Llorente, J. L., et al. Sinonasal carcinoma: clinical, pathological, genetic and therapeutic advances. Nat. Rev. Clin. Oncol. 11 (8), 460-472 (2014).
- Sidransky, D. World health organization classification of tumors. Pathology and genetics of head and neck tumors. 9, WHO Press. (2005).
- Radulesku, T., et al. Endoscopic surgery for sinonasal tumors: The transcribriform approach. J Stomatol Oral Maxillofac Surg. 118 (4), 248-250 (2017).
- Muller, P. A. J., Vousden, K. H. p53 mutations in cancer. Nature cell biology. 15 (1), 2-8 (2013).
- Holmila, R., et al. Profile of TP53 gene mutations in sinonasal cancer. Mutat Res. 686 (1-2), 9-14 (2010).
