Summary
Homeobox genes son genes reguladores, a menudo asociados con tumores en los organismos adultos. Investigamos su expresión comparativa por inmunohistoquímica y análisis PCR en tiempo real, en normal e inflamatoria de la mucosa nasal y en neoplasmas de sinonasal para utilizarlas como posibles dianas diagnósticas y terapéuticas.
Abstract
Los genes homeobox (HB) OTX se expresan durante la morfogénesis embrionaria y durante el desarrollo del epitelio olfativo en organismos adultos. Las mutaciones en estos genes suelen relacionarse con la tumorigénesis en humanos. No hay datos están disponibles en la actualidad respecto a la posible correlación entre los genes OTX y tumores de la cavidad nasal. El objetivo de este trabajo es entender si OTX1 y OTX2 pueden considerarse como marcadores moleculares en el desarrollo de tumores nasales. Se seleccionaron los adenocarcinomas nasales y sinonasal para investigar la expresión de los genes OTX1 y OTX2 mediante inmunohistoquímica y análisis PCR en tiempo real. OTX1 y OTX2 estuvieron ausentes en todas las muestras de sinonasal Adenocarcinomas de tipo Intestinal (ITACs). OTX1 mRNA fue identificado solamente en los Adenocarcinomas de tipo Intestinal no (NITACs) mientras que el mRNA de OTX2 fue expresado solamente en Neuroblastomas olfatorios (ONs). Hemos demostrado que la expresión génica diferencial de los genes OTX1 y OTX2 podría ser un marcador molecular útil para distinguir los diferentes tipos de tumores sinonasal.
Introduction
OTX Los genes de la HB son el homólogo vertebrado de los genes de orthodenticle de Drosophila (otd) codifican para factores de transcripción que se expresan normalmente durante la morfogénesis embrionaria, y puede expresarse también en el organismo adulto con diversas funciones . Durante el desarrollo embrionario que controlan la especificación de identidad celular, diferenciación celular y la colocación de la axis¹ del cuerpo. La familia OTX incluye genes OTX1 y OTX2 que muestran diversas funciones. OTX1 participa en el cerebro y el desarrollo del órgano sensorial. En el organismo adulto, que se expresa en órganos sensoriales y se transcribe en niveles bajos en el lóbulo anterior de la hipófisis2; también desempeña un papel en la hematopoyesis, se expresa en hematopoyéticas pluripotenciales y progenitoras de las células3. OTX2 participa en el desarrollo de la cabeza rostral y sus actos de proteína traducida como un morfógeno porque genera un gradiente a través de qué otros genes activados o reprimidos de manera espacio-temporal, contribuyendo así a la célula proliferación y diferenciación. En el organismo adulto, OTX2 se encuentra exclusivamente en la glándula pineal y plexo coroideo4.
Mutaciones en genes OTX suelen relacionarse con la aparición de defectos congénitos, somáticas o metabólicos humanos. Ganancia o pérdida de mutaciones en genes OTX podrían promover tumorigenesis si no son capaces de controlar adecuadamente el crecimiento y diferenciación celular5. En leucemias y linfomas, así como en muchos tumores sólidos (e.g., meduloblastomas6, linfomas no Hodgkin agresivos2, carcinomas de mama7, cánceres colorrectales8y retinoblastoma9), la expresión desregulada de OTX HB genes es bien documentado10. Además, se han demostrado mutaciones de OTX2 en casos de anophthalmia y microphtalmia11 debido al papel crucial de este gen en el control del desarrollo del ojo.
En el contexto de neoplasias sólidas, el descubrimiento de marcadores moleculares y fenotípicos es un reto importante para el diagnóstico, clasificación y tratamiento de varios tipos de tumor11, los que se originan en la cavidad nasal y paranasal incluidos senos paranasales. De hecho, a pesar de estas áreas ocupan sólo un modesto espacio anatómico, epitelio de la mucosa, glándulas, tejidos blandos, hueso, cartílago o neural/neuroectodermal y hematolymphoid células pueden ser a menudo el sitio del origen del complejo e histológicamente diferentes grupos de tumores. Diferentes tipos de tumores que involucran el tracto sinonasal presentan una variedad de características que superan lo que se ve generalmente en la zona aerodigestive superior o incluso a través de la mayoría de las partes del cuerpo12. Malignidades de sinonasal son raras y presentan una incidencia anual de 1: 100.000 habitantes en todo el mundo, y así que esto evita que los estudios sobre las vías implicadas en la tumorigénesis y la prueba de estrategias de tratamiento alternativas. A pesar de ello, los avances en proyección de imagen técnicas, abordajes quirúrgicos y radioterapia han mejorado el manejo clínico de cáncer sinonasal. Por otra parte, el desarrollo de líneas celulares, así como modelos animales y perfiles genéticos de cáncer actualmente constituyen la base para las futuras terapias contra el cáncer dirigidas a13. Hasta la fecha, no hay ningún informe sobre expresión OTX1 y OTX2 , en neoplasias de la cavidad nasal, senos paranasales y nasofaringe. Ya anteriormente hemos observado que OTX1 y OTX2 están implicados en el cáncer de mama7, nos preguntamos si estos genes podrían estar presentes no sólo en la mucosa nasal normal sino en tumores de la cavidad nasal. Para lograr este objetivo que hemos obtenidos del Departamento de patología de la «Ospedale di Circolo"en muestras de Varese de mucosa normal y adenocarcinomas nasales y sinonasal 1985 para 2012 y se clasifican según la Organización Mundial de la salud (OMS) clasificación de tumores de cabeza y cuello. Elegimos analizar a través de análisis en tiempo real de PCR e inmunohistoquímica y evaluamos la expresión OTX1 y OTX2 para determinar si pueden considerarse marcadores moleculares para estos tipos de tumores.
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Protocol
Todos los estudios fueron realizados según la declaración de Helsinki (1975) con el consentimiento informado por escrito y aprobado por el Comité de ética de la Universidad de Insubria en Varese.
1. recolección de las muestras
- Recoger y todas las muestras humanas de Formalin-Fixed Paraffin-Embedded (FFPE) se dividen en diferentes subgrupos según la clasificación del WHO de tumores de cabeza y cuello14.
Nota: Aquí utilizamos las siguientes muestras: mucosa sinonasal Normal como control (10 muestras); Papiloma invertido (PI, código de la CIE-O 8121/1); ITAC Sinonasal (ICD-O code 8144/3, 32 muestras); NITAC (código de la CIE-O 8140/3, 12 muestras); Carcinoma enquistado adenoideo (ACC, código 8200/3 de la CIE-O); Adenoma Pleomórfico (PA, código 8941/3 de la CIE-O); (Código de la CIE-O 9522/3, 13 muestras); Poco diferenciado Carcinoma del Neuroendocrine (PDNEC, código de la CIE-O 8041/3, 19 muestras); Tumor neuroendocrino (neto, código de la CIE-O 8041/3).
2. inmunoquímica
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Parafina y rehidratación de secciones
- Calentar los portaobjetos de la muestra en un horno a 60 ° C por 30 min y rehidratar 3 μm espesor secciones FFPE usando una serie de alcohol al agua.
- Lave el portaobjetos en xileno durante 10 minutos y repita este paso; lavar los portaobjetos durante 5 minutos en alcohol al 100% y repita este paso con alcohol 95%, 85% y 75% en serie. Enjuague los portaobjetos durante 5 minutos en agua destilada.
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Bloqueando la actividad endógena
- Bloquear la actividad endógena mediante la colocación de las diapositivas en 3% peróxido de hidrógeno acuoso durante 12 minutos.
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Recuperación de antígeno
- Tratar con 10 mM de tampón de citrato (pH 6) por 10 min en un tratamiento de microondas para realizar recuperación de antígeno.
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Incubación con el anticuerpo primario
- Lavar los cortes en tampón TBS (pH 7.4) y luego añadir solución de bloqueo durante 10 minutos.
- Lavar los cortes en tampón TBS (pH 7.4) y luego añadir 0,2% Tritón X.
- Incubar durante una noche a 4 ° C con cabra anti-humano OTX2 anticuerpo diluido 1: 100.
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Incubación con el anticuerpo secundario
- Incubar las secciones por 1 h a temperatura ambiente con biotinilado conejo anticuerpo secundario de anti-cabra diluido 1: 200 seguido de ABC peroxidasa complejo (véase Tablas de materiales).
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Desarrollar el immunoreaction
- Desarrollar el immunoreaction con 3, tetrahydrochloride 3'-diaminobenzidina y contratinción los núcleos con Harris Hematoxylin.
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Montaje y proyección de imagen
- Deshidratan las secciones utilizando una escala creciente de alcohol y aclarar a través de una sustancia de limpieza de origen terpeno (véase Tabla de materiales). Insertar secciones en medio de montaje, coloque las secciones en un portaobjetos de microscopio y observar las secciones a través de un microscopio óptico.
3. ARN extracción y reverso-transcripción
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Extracción de RNA
- Extracto de RNA de las secciones por realizar el primer paso del Protocolo de inmunoprecipitación (ver sección 2.1) y mantener los portaobjetos en agua destilada. Sobreponga las secciones sin manchas con la hematoxylin-eosina correspondiente secciones manchada para identificar fragmentos de interés.
- Realizar la extracción de RNA utilizando un kit comercial de extracción de RNA para muestras FFPE (véase Tabla de materiales) y siguiente las instrucciones.
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Reverso-transcripción del RNA
- Utilice un kit comercial para retro-transcribir RNA en cDNA (véase Tabla de materiales) siguiendo el protocolo. Retro-transcribir por lo menos 1.000 ng de RNA total para llevar a cabo varios análisis.
4. en tiempo real PCR y análisis de datos
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PCR en tiempo real
- Realizar análisis PCR en tiempo real cuantitativos (qRT-PCR) con tecnología de punta de prueba (véase Tabla de materiales) y un termociclador.
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Preparación de la mezcla de reacción de PCR
- Preparar la mezcla de reacción de PCR usando 12,5 μl de la mezcla principal basada en sondeos, 1.25 μl de OTX1 y OTX2 ACTB sondas (véase Tabla de materiales), 50 ng del cDNA y libre de nucleasas hasta 25 μl de volumen total de agua.
- Llevar a cabo todas las reacciones por triplicado utilizando el gen ACTB como control endógeno para normalizar los niveles de expresión génica.
- Centrifugar la placa a 1.109 x g durante 3 min y guardar la placa protegida de la luz a 4 ° C hasta que el experimento.
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Ajuste el termociclador
- Conjunto el perfil de Termociclador con un caliente inicio ciclo a 50 ° C por 2 min y 95 ° C durante 10 min, seguido de 40 ciclos a 95 ° C por 15 s y un ciclo final a 60 ° C durante 1 minuto.
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Análisis nivel de expresión génica
- Normalizar los niveles de expresión génica mediante el método de umbral (ΔCt) ciclo comparativo utilizando el gen ACTB como control endógeno.
- Evaluar los niveles de expresión génica utilizando el método 2-ΔCt y trazar los resultados.
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Análisis estadísticos
- Realizar análisis estadísticos usando de Student t-Test, considerando los resultados estadísticamente significativos con p < 0.05.
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Representative Results
En la mucosa normal se observó reactividad nuclear fuerte y homogénea para los genes OTX en el epitelio seudoestratificado ciliado de tipo respiratorio y en las células glandulares submucosas (figura 1A). Encontramos expresión nuclear para OTX1 en todas NITACs las muestras (figura 1B), mientras que poco o ausente immunoreactivity fue destacada en ITACs (figura 1). Immunoreactivity intenso estuvo presente en los complementos (figura 1); entre PDNECs, expresión de OTX variaron en intensidad y porcentaje de células positivas (Figura 1E). El análisis estadístico se realizó con Chi cuadrado y prueba exacta de Fisher de Immunohistochemical demostró que la ausencia de genes OTX en muestras ITAC fue estadísticamente significativa (n = 23, p < 0.01).
Análisis PCR en tiempo real confirman la expresión de los genes OTX1 y OTX2, en muestras de control (figura 2A–B); OTX1 pero no OTX2 fue expresada en muestras NITAC y ambos genes eran totalmente regulada en ITACs (figura 2A–B). En muestras encontramos sólo la expresión del gen OTX2 OTX1 fue regulada, y entre las muestras PDNEC la expresión de ambos genes variados (figura 2A–B).
Prueba de t de Student realizada en PCR en tiempo real confirmado datos estadísticamente significativos para OTX1 en controles vs ITACs (n = 9, p < 0.05), controles vs ONs (n = 6, p < 0.05), controles vs PDNECs (n = 8, p < 0.05), y OTX2 control vs NITACs (n = 5, p < 0.05), controles vs ITACs (n = 9, p < 0.05), controles vs ONs (n = 6, p < 0.05) y controles vs PDNECs (n = 8, p < 0.05).
Figura 1 : Imágenes representativas de la expresión inmunohistoquímica OTX en los tejidos neoplásicos y control de. La reacción desarrollada por el anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa reveló que la señal (marrón oscuro) era visible en 5 secciones de FFPE control de mucosa sinonasal normal (A), 7 casos de adenocarcinomas de tipo intestinal no (NITACs) (B), 7 olfatorios neuroblastomas (ONs) (D) los casos, 11 casos pobremente diferenciado carcinomas neuroendocrinos (PDNECs) (E), mientras que no hay inmunoreactividad se detecta en los 23 casos de adenocarcinomas de tipo Intestinal (ITACs) analizados (C). DAB-hematoxilina; magnificación original: 200 x, barra de escala = 100 μm.
Figura 2 : Análisis de PCR en tiempo real de OTX1 (A) y OTX2 (B) mRNA expresión en tejidos nasal normales y neoplásticos. Para análisis PCR en tiempo real, se utilizaron las siguientes muestras: 5 secciones FFPE de mucosa normal de control, 5 casos de adenocarcinomas de tipo intestinal no (NITACs), 9 casos de adenocarcinomas de tipo Intestinal (ITACs), 6 casos de neuroblastomas olfatorios (ONs), 8 casos de mal distinguieron carcinomas neuroendocrinos (PDNEC). En el eje X se informa del tipo de muestra, mientras que el eje Y representa los valores de-ΔCt 2. Obtuvieron datos estadísticamente significativos (p < 0.05) entre el control y tumores de Student t-test y se resaltan con asteriscos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este estudio muestra por primera vez que, a niveles del mRNA, se expresan los genes de la HB OTX1 y OTX2 sinonasal normal mucosa y las glándulas submucosal, pólipos inflamatorios, papilomas de Schneiderian sinonasal y en las distintas epiteliales y neuroectodérmicos Neoplasias, incluyendo epidermoide sinonasal adenocarcinomas de tipo no-intestinales, tumores tipo glándula salival, neoplasias neuroendocrinas y ONs.
Modificaciones y resolución de problemas:
Para evitar la degradación del RNA, se realizó el protocolo de parafina en el laboratorio de patología. Después vamos arañando las diapositivas, todas las muestras fueron rápidamente enfriadas y almacenadas en hielo seco hasta su uso posterior. Realizamos todos los análisis posteriores en una campana de flujo laminar seguridad usando un conjunto dedicado de pipetas con puntas estériles para mantener condiciones asépticas experimentales y para evitar contaminaciones de RNA.
Limitaciones de la técnica:
La principal limitación de la técnica se basa en la disponibilidad de muestras ya que a menudo son raros tumores de la cavidad sinonasal. Otra cuestión importante es la cantidad de RNA extraído debido a extracción de RNA de muestras FFPE ARN fragmentado es difícil de analizar.
Importancia con respecto a los métodos existentes:
El diagnóstico de tumores de la cavidad nasal consiste en generalmente el análisis de rayos x, Examen endoscópico de la cavidad nasal, tomografía computarizada, resonancia magnética (RMN) y biopsia. En los últimos años, los avances de la instrumentación quirúrgica y el progreso de técnicas de imagen llevaron cirugía endoscópica como la estrategia preferida para los tumores sinonasal. En particular, esta técnica ha sido reportada como factibles para los diferentes tipos benignos o malignos de tumores sinonasal15. Nuestra técnica basada en qRT-PCR permite la identificación de biomarcadores moleculares, que pueden discriminar diferencialmente las muestras de los diferentes tumores: de hecho, proporcionamos evidencia que la ausencia de ambos genes de la HB en ITACs puede utilizarse como marcadores moleculares para esto tipo de tumor así como la ausencia de OTX2 en NITACs. Además, esta técnica puede aplicarse inmediatamente después de la biopsia y puede dar resultados definitivos en menos de 6 horas con respecto a los días o las semanas necesarias para el informe del hospital.
Futuras aplicaciones:
Nuestros estudios futuros implican análisis de gen y niveles de expresión de la proteína de los genes OTX1 y OTX2 HB mediante análisis PCR de tiempo real, Western blot e inmunofluorescencia con anticuerpos específicos para detectar no sólo OTX1 y OTX2, pero también niveles de la familiar expresión de p53. Puesto que hemos demostrado anteriormente que OTX1 expresión está regulada por p53 en cáncer de pecho7, sería interesante conocer si este Reglamento existe también en tumores de cavidad nasal. Un análisis de la inmunofluorescencia y un ensayo de inmunoprecipitación de cromatina (ChiP) pueden revelar, respectivamente, una proteína y una interacción DNA-proteína entre p53 y OTXs. Si se encuentra esa conexión, el silenciamiento dirigido de p53 (miembros de la familia, p63 y p73), revelará si la sobre expresión o regulación de los genes OTX es dependiente de p53.
pérdida de p53 de la función, a través de la mutación en p53 sí o perturbaciones en las vías de señalización de p53, es una característica común en la mayoría de los cánceres humanos16. La mayoría de las mutaciones de p53 se agrupan dentro del dominio de unión al ADN; por lo tanto, actividad DNA-que atan es la función crítica que es alterada, sugiriendo que los cambios en los genes transcripcionales podrían ser la clave del mutante p53 actividad16. mutaciones de p53 se han divulgado como una característica común de cáncer sinonasal, con una frecuencia global de 77%, y muestran Asociación de adenocarcinoma y la exposición al polvo de madera17. Así, en nuestras muestras, sería interesante evaluar los niveles de mRNA y proteína (por análisis de Western Blot y PCR qR) y realizar la secuenciación de este gen, con el fin de identificar o excluir la presencia de mutaciones activar/inactivar. Finalmente, si una mutación recurrente específica del tipo de tumor es encontrado, sería significativo para producir ingeniería de células y ratones (con un alelo mutante) que albergan esta mutación y examinar si la mutación puede recapitular la enfermedad.
Pasos críticos:
Pasos críticos de este estudio incluyen la obtención de las muestras bien conservadas, como las biopsias almacenadas en búfer protectora RNA o muestras FFPE de al menos 8 μm de espesor y la extracción de al menos 200 ng de ARN para realizar análisis de qRT-PCR.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por Centro Grandi Strumenti Università dell'Insubria, Fundación Comunitaria del año, Fundación del Monte de Lombardía y Fondazione Anna Villa e Felice Rusconi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation | Applied Biosystem | AM1975 | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystem | 4368814 | |
| TaqMan Universal PCR Master Mix, no AmpErase UNG | Applied Biosystem | 4326614 | |
| ABI Prism 7000 | Applied Biosystem | 270001857 | |
| ACTB probe | Applied Biosystem | Out of production. Sequence protected by copyright | |
| OTX1 probe | Applied Biosystem | Out of production. Sequence protected by copyright | |
| OTX2 probe | Applied Biosystem | Out of production. Sequence protected by copyright | |
| Acqueous Hydrogen Peroxide | Merk | 1072090250 | |
| Citrate Buffer | Sigma-Aldrich | 20276292 | |
| Triton | Sigma-Aldrich | 101473728 | |
| Tris | Merk | 108382 | |
| NaCl | Merk | 106404 | |
| Goat Anti-OTX2 Antibody | Vector Laboratories | Out of production. Catalog number not available | |
| Rabbit Anti-Goat Antibody | Vector Laboratories | BA5000 | |
| ABC-Peroxidase Complex | Vector Laboratories | PK6100 | |
| 3,3'-diaminobenzidine tetrahydrocloride (DAB) | Sigma-Aldrich | D5905 | |
| Harris Hematoxylin | Bioptica | 0506004/L | |
| Pertek | Kaltek SRL | 1560 | |
| BioClear | Bioptica | W01030799 |
References
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