Summary
Здесь мы демонстрируем детальный процесс анализа помаркой количественных точка (QDB) путем определения абсолютное содержание целевых белков, укупорочные актина белка, гельсолин как (ЦАПГ), в трех различных мыши тканях. Мы продемонстрировать высокую пропускную способность, удобный, количественных immunoblot техника для биомаркер проверки на уровне клеточной и тканевой.
Abstract
Не имея удобный, immunoblot метод количественной, высокая пропускная способность для абсолютного определения содержания определенных белков на уровне клеточной и тканевой значительно препятствует прогрессу в протеомических исследований. Результаты, полученные из имеющихся в настоящее время immunoblot методы также относительный, предотвращая любые усилия для объединения независимых исследований с масштабный анализ образцов белка. В этом исследовании мы демонстрируем процесс анализа помаркой количественных точка (QDB) для достижения абсолютной количественной оценки в формате высокой пропускной способности. Используя стандартный коммерчески доступных белка, мы способны определять абсолютное содержание укупорки актина белка, гельсолин как (ЦАПГ) в образцах белка, приготовленный из трех различных мыши тканей (почки, селезенки и простаты) вместе с подробный объяснение экспериментальных деталей. Мы предлагаем анализ QDB как удобный, количественных, высокая пропускная способность immunoblot метод абсолютного количественной оценки индивидуальных белков на уровне клеточной и тканевой. Этот метод поможет существенно биомаркер проверки и проверки пути в различных областях биологических и биомедицинских исследований.
Introduction
Наряду с захватывающих достижений в геномных исследований в последние годы, биомедицинских исследований также свидетелей значительные улучшения в протеомических исследований. С увеличением накопления биологических данных на обоих геномных и протеомных уровнях, использование bioinformatic инструменты для анализа этих данных стал в центре внимания биомедицинских исследований в будущем воспринимаемого. Следовательно, успех биоинформатический исследования повышает спрос на все больше и лучше качество данных из сообщества биологических и биомедицинских исследований, задача может быть решена только путем улучшения техники в геномной и протеомных уровнях.
Масс-спектрометрия (МС) и анализ immunoblot сейчас два преобладающих методов анализа белка. MS доминирует протеомических исследований в последние годы для включения анализа тысяч индивидуальных белков одновременно. Методы, основанные на immunoblot, включая западную помарку и дот-блот, с другой стороны, также играют значительную роль в исследованиях белка даже с момента его изобретения в1,2,3,4, 5. Фермента связан иммуноферментного анализа (ИФА)5,6,7 и обратная фаза протеина microarray дна (RPPM)8,9 можно считать высокой пропускной способности формат immunoblot анализ. Однако все эти методы иммуноферментного анализа, ELISA, кроме измерять относительный уровень экспрессии определенных белков. Относительный характер этих методов станет реальной проблемой для демографических исследований, анализа должно быть сделано в то же время, предотвращая любые усилия, чтобы увеличить размер пула через несколько анализов. Кроме того результаты, полученные от этих исследований являются только полуколичественного, что затрудняет любые усилия биоинформатики в анализе данных. Тем временем хотя ELISA хорошо подходит для высокой пропускной способности абсолютной анализ образцов белка, этот метод кажется для решения задач в сложных средах, таких как клетки или ткани из-за его низкой связывающая способность и мультиплексирования10.
Мы разработали метод immunoblot для демографических исследований с ключевыми характеристиками быть удобным, высокая пропускная способность, количественных и подходит для абсолютного определения содержания белка и назвал этот метод количественного дот-блот анализ (QDB)11. В этом исследовании мы представить подробный протокол для QDB анализа и продемонстрировать метод, определяя содержание абсолютного белка определенного белка, ЦАПГ, в трех различных мыши тканях, включая почки, селезенки и простаты. Мы считаем, что этот подробный протокол хорошо иллюстрирует возможности и удобство этого метода и дать указания о том, как избежать потенциальных ошибок в практику этого метода.
Protocol
Все животные процедуры были проведены в соответствии с Пиньчжоу медицинского университета животных использования директивы и утверждены Советом этическим Пиньчжоу медицинского университета.
1. Пробоподготовка
- Взять 50 мг мыши ткани в 1,5 мл трубки. Добавить 200 мкл буфера lysis (50 мм Hepes, рН 7,4, 137 мм NaCl, 5 мм ЭДТА, 5 мм EGTA, MgCl 1 мм2, 10 мм Na2P2O7, 1% тритон X-100, 10% глицерина), дополненный ингибиторами протеазы и фосфатазы (100 мм NaF, 0,1 мм phenylmethylsulfonyl Фторид, pepstatin 5 мкг/мл, 10 мкг/мл leupeptin, Апротинин 5 мкг/мл).
- Однородный ткани с гомогенизатор для 1 мин на льду.
- Центрифуги для 10 мин на 8 000 x g при 4 ° C.
- Собирать супернатант в новые трубы (1,5 мл) и вынуть 1 мкл для концентрации assay протеина с BCA kit.
Примечание: Все часто используемые лизис буферы для Западный анализ помаркой и Dot блот анализ может использоваться для QDB анализа.
2. Определение Специфичность антител
- Подготовка образца лизатов (20 мкг) в разделе 1.4, IgG бесплатные BSA (20 мкг), белка (600 pg), стандартные для Западный анализ помаркой.
Примечание: IgG бесплатно BSA используется как отрицательный контроль и стандартные белок используется как позитивный элемент управления. Специфичность Антитела свидетельствует показаны одна полоса правильный размер, используя Западный анализ помаркой.
3. Определение диапазона линейной QDB анализа
- Растворите Стандартный белка с ddH2O. раствор белка концентрацию 1200 ПГ/мкл.
- Разбавьте концентрированный белка из подготовленных образцов в разделе 1.4 до 4 мкг/мкл.
- Растворите BSA с ddH2O. раствор белка концентрацию 1200 ПГ/мкл и 4 мкг/мкл.
- Серия разрежения стандартных белка и подготовлены образцы были подготовлены под руководством таблице 1 и таблице 2.
- Смесь 10 мкл разрежения стандартных белка или разбавления подготовлены образцы и 10 мкл 2 x загрузки буфера (120 мм трис-HCl pH 6.8, 20% глицерина, SDS 4%, 0,2% Bromphenol голубой, 200 мм DTT) вместе.
| S1 (0pg/мкл) |
S2 (33.3pg / мкл) | S3 (100pg/мкл) |
S3 (300pg/мкл) |
S5 (600pg/мкл) |
S6 (1200pg/мкл) |
|
| стандартные protein(1200pg/µl) | 0 | 1.39 | 4.17 | 12.5 | 25 | 50 |
| IgG бесплатно BSA (4pg/мкл) |
50 | 48,61 | 45,83 | 37,5 | 25 | 0 |
| Итого | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 |
Таблица 1. Разбавление схема для стандартных белка кривой.
| X1 (0µg/мкл) |
X2 (0.25µg / мкл) |
X3 (0.5µg / мкл) |
X4 (1µg/мкл) |
X5 (2µg/мкл) |
X6 (4 мкг/мкл) |
|
| Sample(4µg/µL) | 0 | 3.125 | 6.25 | 12.5 | 25 | 50 |
| Бесплатные BSA(4µg/µl) igG | 50 | 46.875 | 43,75 | 37,5 | 25 | 0 |
| Итого | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 |
Таблица 2. Разбавление схема для подготовленных образцов
- Тепло смеси на 85 ° C за 5 мин.
4. процесс анализа QDB
-
Пример приложения
- Поддержка QDB пластины избежать в нижней части плиты, поверхности стола. Например используйте поле Подсказка пустым пипеткой как поддержка.
- Загрузите до 2 мкл образца к центру мембраны в нижней части отдельных подразделения QDB пластины.
-
Сушка пластины
- Загружен QDB пластину за 1 ч на номер умеренных (RT) или в качестве альтернативы отпуска в пластину загружен при 37 ° C 15 мин в хорошо проветриваемом помещении.
-
Блокирование пластины
- DIP QDB пластины в буфер передачи (0.039 М глицин, 0,048 М трис, 0,37% SDS, 20% метилового спирта) и осторожно встряхивайте пластину для 10 s.
- Промойте пластины QDB нежно с TBST (трис буфер солевой, 0.1% 20 анимации) три раза, а затем вымыть пластину для 5 минут при постоянном встряхивании в TBST.
- Блокировать пластину QDB с блокирующий буфер (5% обезжиренное молоко в TBST (100 мкл/ну) за 1 ч при постоянном встряхивании.
-
Основное антитело инкубации
- Разбавить основное антитело в блокирующем буфере в выбранной концентрации (от 1:500 до 1:5 000) и 100 мкл каждого индивидуального хорошо обычных 96 хорошо пластины. Вставьте пластину 96 хорошо QDB пластины и инкубировать и комбинированных плит либо 2 h на RT, или на ночь при 4 ° C при постоянном встряхивании.
- Альтернативно установите QDB пластину внутри коробки и заполните поле с блокирующем буфере 2-3 мм выше мембранные часть плиты, если же антитела используется для целую тарелку. Добавьте основное антитело в выбранной концентрации и инкубировать пластины либо 2 h на RT, или на ночь при 4 ° C, при постоянном встряхивании.
- Промойте пластины нежно с TBST три раза, прежде чем он омывается с TBST три раза, каждый раз в течение 5 мин при постоянном встряхивании.
-
Инкубация вторичного антитела
- Разбавить вторичное антитело в блокирующем буфере на выбранной концентрации (от 1:1, 000 до 1:50 000) и либо аликвота 100 мкл/хорошо в 96 хорошо плиту или в коробке как описано в разделе 4.4.2 и затем инкубировать пластину QDB внутри либо загружен 96 хорошо пла Поле для 1 h под постоянной тряски на RT или TE.
- Промойте пластины QDB нежно 3 раза с TBST, а затем промойте пластины для 3 раза по 5 минут с TBST под постоянной тряски.
-
Количественная оценка
- Подготовка субстрата увеличенная хемолюминесценция (ЭСЛ), следуя инструкциям производителя.
- Аликвота ECL субстрат в 96 хорошо пластины (100 мкл/а) и вставьте пластину QDB внутри 96 хорошо плита на 2 мин под постоянной тряски.
- Удалите QDB пластина из 96 хорошо пластины и трясти кратко, чтобы удалить лишнюю жидкость. Место пластину на белой микротитровальных плиту.
- Включите Считыватель микропланшетов и выберите «тарелка с крышкой» в пользовательском интерфейсе до размещения комбинированных плит (QDB плита + белые пластины адаптера) внутри Считыватель микропланшетов для количественной оценки.
Примечание: Убедитесь в том, использовать пластину белая, непрозрачная микротитровальных как адаптер, чтобы избежать какого-либо вмешательства от плиты. Не забудьте выбрать «тарелка с крышкой» во избежание помех машины при сочетании пластины (QDB плита + 96 хорошо пластины адаптера) помещаются внутри Считыватель микропланшетов.
Representative Results
Определение абсолютное количество любого белка, включая ЦАПГ белка в мыши ткани требует специфического антитела и очищенный протеин в стандартной комплектации. Линейный спектр анализа белка стандартных и лизатов также необходимо установить перед любой масштабный анализ. Линейный спектр антитела крайне зависимой от антитела per se, и спектр специфическое антитело соответствующие разрежения необходимо проверить каждого индивидуального пользователя.
Мы сначала определили специфику ЦАПГ антител в мыши почек, селезенки и простаты ткани, Западный анализ помаркой с помощью отрицательного контроля (IgG бесплатно BSA) и положительный контроль (коммерчески доступных ЦАПГ белка) (рис. 1A). Антитела анти ЦАПГ является конкретным против лизатов от мыши селезенки, сердца, мышц и простаты (обнаружена одна полоса). Неспецифическая полосы были замечены в лизатов из почек и печени. Однако в почках lysate, неспецифичных были значительно слабее, чем конкретные группы, которая предполагает, что антитела подходит для анализа ткани почек. Далее линейный спектр стандартных белка и количество лизатов для анализа были определены два бок о бок доза кривых. Коммерчески доступных белка ЦАПГ серийно разводили как указано в таблице 1 , на основе нашего прошлого опыта и ткани лизатов мыши почки, селезенки и простаты также разводили на основании количество общего белка в лизатов определяется в комплект определение общего белка BCA. Две дозы исследования были выполнены бок о бок и нанесены вместе в Рисунок 1B. Соответствующее количество лизатов мыши почек, селезёнки и предстательной железы были выбраны на основании сигналов QDB, измеряется Считыватель микропланшетов в произвольных единицах. Оригинальные чтения для этого эксперимента показано в таблице 3.
В последний шаг, серийно разреженных стандарт ЦАПГ белка и лизатов от мыши почки селезенки и простаты были загружены на QDB пластину. В этом случае мы решили нагрузки 0,3 мкг/образца для лизатов от мыши почек и селезенки и 1 мкг/образца для лизатов от мыши простат анализа, как на этих уровнях, чтение QDB был на хотя бы 20 раз на фоне, в то время как хорошо в пределах диапазона линейной анализа на основе кривой доза лизатов и стандартные белка. Пластину был подвергнут описанных QDB протокол до пластины был количественно непосредственно, Считыватель микропланшетов. С помощью последовательно разреженных очищенный протеин ЦАПГ, мы могли бы создать кривая доза реакция, уравнение и R2 путем простой регрессионного анализа с использованием доступного программного обеспечения (например, Microsoft office excel). QDB сигналы от лизатов мыши почек, селезенки и простат были преобразованы в абсолютное количество ЦАПГ белка в этих лизатов по установленной формуле, и результаты были исправлены на величину общего белка, в этом случае, 0,3 мкг для лизатов от мышь селезенки и почки и 1 мкг для лизатов от мыши простат, для окончательного концентрацию белка ЦАПГ в этих тканях как pg/мкг. Результаты показаны на рисунке 1C с оригинального прочтения, показано в Таблица 4.
Рисунок 1 . Представитель результат QDB анализа для определения абсолютных уровней ЦАПГ в три мыши тканях (почки, селезенки и предстательной железы). A. изучения специфичность антитела анти ЦАПГ кролика, с помощью мыши ткани лизатов готовится из селезенки, сердца, мышц, почек, печени и простаты с помощью западных блот анализ с отрицательного контроля (IgG бесплатно BSA) и положительный контроль (коммерчески доступные ЦАПГ белка). Б. определение линейного диапазона QDB анализ антитела анти ЦАПГ кролика с помощью лизатов, приготовленный из простаты, почек, селезенки и с использованием очищенного рекомбинантной ЦАПГ белка стандарта. Результаты были в среднем triplicates. C. абсолютное определение уровней ЦАПГ в лизатов, приготовленный из мыши почки, селезенки и предстательной. Каждый бар представляет собой один из ткани от индивидуальных мыши. Результаты были в среднем трех экземплярах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Таблица 3: Результатом Считыватель микропланшетов дозы исследований с использованием как серийно разводили, обобщённые лизатов от мыши селезенки, почек и предстательной и очищенного рекомбинантных белков ЦАПГ.
Таблица 4: Результат от Считыватель микропланшетов QDB анализа абсолютного уровня ЦАПГ мыши почками (8), селезенки (4) и предстательной (5) с помощью рекомбинантных белков ЦАПГ как стандарт.
Discussion
Среди всех текущих доступных иммуноанализа методов анализа белков за исключением ELISA QDB анализ является единственным способом для достижения абсолютного содержания определенного белка на клеточных и тканевых уровнях в формате высокой пропускной способности. Хотя с стабильный изотоп меченых стандарт, масс-спектрометрия способна добиться абсолютной количественной оценки несколько белков, этот метод не предназначен для высокой производительности. В этом исследовании мы продемонстрировали процесс анализа QDB для достижения абсолютной определение уровня белка ЦАПГ в тканях мыши, включая почки, селезенки и простаты. ЦАПГ уровни были обнаружены между 200 до 360 ПГ/г в тканях почек мыши, 460 до 650 ПГ/г в мыши селезенки и 330 до 390 ПГ/г в тканях предстательной железы мыши.
По сравнению с ELISA, QDB анализ требует минимальных усилий разрабатываться в регулярных лаборатории. Во-первых пластину QDB является основанный на нитроцеллюлозную мембрану к ликвидации покрытие шаг в ELISA. Во-вторых QDB анализ требует только один вместо двух специфических антител в сэндвич ELISA. В-третьих высокая связывающая способность нитроцеллюлозную мембрану по сравнению с поверхности пластины ELISA также позволяет мембраны выдерживать жесткие Стиральная шаги обычно используется в анализе immunoblot для уменьшения фона помех. Эта функция очень полезна при анализе сложных лизатов, приготовленный из клеток и тканей. Напротив из-за относительно низкой связывающая способность ELISA плит, сокращение фона при анализе сложных клеточные и тканевые лизатов становится реальной проблемой в процессе развития.
QDB анализ может быть легко принят в любой лаборатории с доступом специфическое антитело. Однако важно отметить, что специфичность антитела является относительным термином, ограничиваются такими факторами, включая виды, типы тканей и типов клеток. Как показано на рис. 1А, ЦАПГ антитела конкретных при анализе lysate от мыши почки, селезенки и простаты и еще становится неспецифической при анализе мыши печени. В самом деле мы регулярно нашли один антитело быть специфичным для одной ткани типа, но не всегда конкретных для других тканей типа из того же вида. Таким образом предварительное Западный анализ помаркой необходима для обеспечения специфика QDB анализа. В самом деле относительную специфичность антитела могут быть причиной ложных результатов, часто ассоциируется с анализа ELISA, как независимо от того, сколько усилий, возможно, потратили производственной компании обеспечить специфика assay, они не могут исчерпать все возможные типы образцов пользователи могут выбрать для анализа с использованием их ELISA продуктов.
Как с всеми immunoassays, потенциальная проблема с методом QDB анализа является отсутствие согласованности качества коммерческих антитела. Даже если явное качество антитела из той же компании (же каталог число, и т.д.) используется, могут существовать значительные различия в другой из-за изменчивости партии партии от одной покупки. Поэтому если не полное доверие достигается в качестве антитела доступны, повторно характеризующие антитела после каждой покупки имеет важное значение.
В целом мы предлагаем здесь подробный протокол и пример при использовании QDB метода анализа для достижения абсолютной количественного определения определенного белка на тканевом уровне. Мы покажем, что метод анализа QDB является удобным инструментом для тех, кто заинтересован в высокой пропускной способности, immunoblot количественного анализа. Ее способность достичь абсолютной определение содержания определенных белков на уровне клеточной и тканевой также отличить эту технику от традиционных immunoblot методов. Эта функция позволяет для комбинации и сравнение результатов из нескольких анализов, шаг, особенно в крупных демографических исследований и реализации соответствующих ассоциации исследований на уровне белка в ближайшем будущем.
Disclosures
Авторы Yunyun Чжан, Чжан Wenfeng и Zhang Джанди являются сотрудниками Zestern биотехнологий, который производит QDB пластин, используемых в этой статье. Чжан Wenfeng и Yunyun Zhang объявить конфликт интересов, и Чжан Джанди подал патентных заявок. Другие утверждают, не конкурирующие интересы.
Acknowledgments
Эта работа поддерживается, Тайшань ученых строительство инженерных (г.т.), Шаньдун Потрясающе молодой ученый премии (ZR2016JL026 Г.т.), национальные естественные науки фонд Китая (31771284, 3167070448 и 81641108), Шаньдун провинциального природного научный фонд (ZR2016JL026, 2017GSF18103), провинции Шаньдун науки и техники (J14LE01 и J15LK03) плана, Yantai науки и техники plan(2015ZH083) и Пиньчжоу медицинского университета научно исследовательские фонды (BY2013KYQD17, BY2013KYQD18), Шведский исследовательский совет предоставить 621-2011-4423 и 2015-4870. Эта работа также авторами «Yantai двойной сотен талант» и «Yantai Hi-Tech зоны Blue Ocean талант плана».
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microplate reader | Tecan | Tecan Infinite 200 PRO | |
| QDB plate | Yantai Zestern Co.Ltd | Plates are available upon request for verification purpose either through email or visiting www.zestern.net. | |
| Peroxidase AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rat, Shp Sr Prot) | jackson | 711-035-152 | |
| Enhanced chemiluminesence substrate | Thermo | 32134 | |
| Rabbit anti-CAPG | Sino Biologic Inc | 14213-T52 | |
| CAPG protein | Sino Biologic Inc | 14213-HNAE | |
| Hepes | Sigma | H4034 | |
| Nacl | Tianjin Ruiji Jin special Chemical Co., Ltd | 10461220 | |
| Mgcl2 | Tianjin Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd | 20120802 | |
| EDTA | Sigma | E9884-500G | |
| EGTA | Sigma | BNN1913 | |
| Na2P2O7 | Haituo Chinese medicine test | 20160914 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Glycerol | Sigma | G7757 | |
| phenylmethylsulfonyl fluoride | Sigma | P7626-5G | |
| pepstatin | Sigma | Z290033 | |
| leupeptin | Sigma | L2884 | |
| aprotinin | Sigma | A3428 | |
| Tris-Hcl | Sigma | T6455 | |
| SDS | Sigma | L5750-500G | |
| DTT | Sigma | 43815-1G | |
| Bromphenol Blue | Sigma | B-0126 | |
| NaF | Sigma | S7920 |
References
- Renart, J., Reiser, J., Stark, G. R. Transfer of proteins from gels to diazobenzyloxymethyl-paper and detection with antisera: a method for studying antibody specificity and antigen structure. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (7), 3116-3120 (1979).
- Burnette, W. N. "Western blotting": electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Anal Biochem. 112 (2), 195-203 (1981).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Uhlen, M., et al. A proposal for validation of antibodies. Nat Methods. 13 (10), 823-827 (2016).
- Hawkes, R., Niday, E., Gordon, J. A dot-immunobinding assay for monoclonal and other antibodies. Anal Biochem. 119 (1), 142-147 (1982).
- Engvall, E., Perlmann, P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin. G. Immunochemistry. 8 (9), 871-874 (1971).
- Engvall, E., Jonsson, K., Perlmann, P. Enzyme-linked immunosorbent assay. II. Quantitative assay of protein antigen, immunoglobulin G, by means of enzyme-labelled antigen and antibody-coated tubes. Biochim Biophys Acta. 251 (3), 427-434 (1971).
- Paweletz, C. P., et al. Reverse phase protein microarrays which capture disease progression show activation of pro-survival pathways at the cancer invasion front. Oncogene. 20 (16), 1981-1989 (2001).
- Tibes, R., et al. Reverse phase protein array: validation of a novel proteomic technology and utility for analysis of primary leukemia specimens and hematopoietic stem cells. Mol Cancer Ther. 5 (10), 2512-2521 (2006).
- Solier, C., Langen, H. Antibody-based proteomics and biomarker research - current status and limitations. Proteomics. 14 (6), 774-783 (2014).
- Tian, G., et al. Quantitative dot blot analysis (QDB), a versatile high throughput immunoblot method. Oncotarget. 8 (35), 58553-58562 (2017).
