Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

تطبيق [رني] والحرارة الناجمة عن صدمة "التعبير عامل النسخ" إلى "إعادة برمجة الخلايا الجرثومية" إلى الخلايا العصبية في C. ايليجانس

doi: 10.3791/56889 Published: January 1, 2018

Summary

ويصف هذا البروتوكول كيفية دراسة العمليات الخلوية أثناء التحويل مصير الخلية في ايليجانس كاينورهابديتيس المجراة. ويمكن ملاحظة استخدام الحيوانات المحورة وراثيا، والسماح overexpression يحركها المروج الحرارة-الصدمة العصبية الذي يحفز مصير عامل النسخ تشي-1 واستنفاد وساطة [رني] تنظيم الكروماتين عامل لين-53 جرثومة الخلية بإعادة برمجة الخلايا العصبية في فيفو.

Abstract

دراسة العمليات البيولوجية الخلية أثناء تحويل الهويات لأنواع محددة من الخلايا يوفر نظرة ثاقبة إليه مهمة الحفاظ على وحماية الهويات الخلوية. تحويل الخلايا الجرثومية إلى الخلايا العصبية المحددة في السلكية ايليجانس كاينورهابديتيس (C. ايليجانس) هو أداة قوية لأداء شاشات الجينية من أجل تفتيت المسارات التنظيمية التي تحمي هوية الخلية المحددة. ويتطلب إعادة برمجة الخلايا الجرثومية لنوع معين من الخلايا العصبية تسمى بورصة عمان الحيوانات المحورة وراثيا التي تسمح واسعة التعبير المفرط عن النسخ إصبع الزنك عامل (TF) تشي-1. الذاتية تشي-1 هو أعرب حصرا في اثنين من الخلايا العصبية الرأس ومطلوب لتحديد مصير الخلايا العصبية جلوتاماتيرجيك بورصة عمان، التي يمكن بسهولة تصور مراسل جسي-5prom::gfp . عبر جينات التي تحتوي على بنية التعبير الجيني يحركها المروج تشي-1 صدمة الحرارة يتيح التعبير سوء واسع تشي-1 في الحيوان الكامل عند العلاج بالصدمة الحرارة. الجمع بين [رني] ضد عامل تنظيم الكروماتين لين-53 والتعبير المفرط الناجم عن الصدمة الحرارة تشي-1 يؤدي إلى إعادة برمجة الخلية الجرثومية في الخلايا العصبية مثل بورصة عمان. ونحن تصف هنا محددة [رني] الإجراءات والشروط المناسبة للعلاج بالصدمة الحرارة من الحيوانات المحورة وراثيا من أجل حمل الخلية الجرثومية لتحويل الخلايا العصبية بنجاح.

Introduction

خلية مصير إعادة برمجة بحمل خارج الرحم TF التعبير مثل دخولها TF شذوذ، التي، عند أوفيريكسبريسيد، الليفية يحول مباشرة إلى خلايا العضلات مثل1، تركيز على بحوث منذ عقود. ومع ذلك، الخلايا المتمايزة غالباً ما تكون الصهر لهذه العملية، بسبب آليات للحفاظ على هويتهم الخلوية. إظهار الخلايا الجرثومية بدرجة مماثلة من الحماية وهناك الآليات الكامنة التي كثيرا ما تعمل كحاجز لمنع تحويل الخلية الجرثومية إلى أنواع الخلايا الأخرى عند التعبير المفرط عن TF يحفز مصير. بشكل عام، يفرض التنظيم جينية مثل التعديلات هيستون وهيكل الكروماتين عائقا لتحويل الخلية مصائر2،3. لدينا سبق تطبيق علم الوراثة العكسي باستخدام [رني] تدق هبوطاً في C. ايليجانس وحدد عوامل الحفاظ على الهويات الخلوية والتصدي وبالتالي إعادة برمجة الخلايا الجرثومية في الخلايا العصبية4. على وجه التحديد، بوليكومب القمعية المعقدة 2 (PRC2) ووصي هيستون عاليا يحافظ لين-53 (CAF-1/ربب/4/7 في البشر) منع التحويل المباشر للخلايا الجرثومية في أنواع محددة من الخلايا الجسدية مثل طعم جلوتاماتيرجيك من الخلايا العصبية في C. ايليجانس 4 , 5-تحديد هذه الخلية الجرثومية إعادة برمجة العوامل الحاجز، استخدمنا الحيوانات المحورة وراثيا تحمل الحرارة-الصدمة إيندوسيبلي إصبع الزنك TF CHE-1. عادة يتم التعبير عن تشي-1 في الخلايا العصبية رأس اثنين من C. ايليجانس، حيث أنها تحدد مصير جلوتاماتيرجيك طعم الخلايا العصبية تسمى بورصة عمان6. يمكن تصور مصير العصبية بورصة عمان بالتعبير عن مراسل الفلورسنت الخاصة ببورصة عمان جسي-5prom::gfp. جسي-5 تشيموريسيبتور أعرب فقط في بورصة عمان العصبية الحق7. عند استنفاد لين-53 من [رني] وتحريض واسعة التعبير حمل خارج الرحم تشي-1 صدمة الحرارة، يمكن تحويل الخلايا الجرثومية إلى الخلايا العصبية في فيفو4،5. الأهم من ذلك، توقيت المعاملة [رني] حاسمة كالديدان الكبار فقط (الجيل P0) تتعرض ل لين-53 [رني] تؤدي إلى الحيوانات ذرية F1 مع الخط التي متساهلة لإعادة برمجة في الخلايا العصبية4.

يمكن استخدام الخلية الجرثومية المذكورة أعلاه لإجراء التحويل العصبية في C. ايليجانس لدراسة مجموعة متنوعة من المسائل البيولوجية مثل الأثر المترتب على إشارات المسارات في إعادة برمجة مصير الخلية. على سبيل المثال، قمنا باستخدام الخلية الجرثومية التي يسببها تشي-1 إعادة برمجة في الخلايا العصبية بورصة عمان عند [رني] ضد لين-53 من أجل دراسة الآثار المترتبة على الشق مما يشير إلى مسار عملية الخلية الجرثومية إعادة برمجة8. عن طريق إجراء [رني] مزدوجة إلى استنزاف شارك لين-53 وهيستون ديميثيلاسي-ترميز الجينات أوتكس-1 واظهرنا أن الشق مما يشير إلى مسار يصد إسكات الجينات PRC2 بوساطة بتفعيل التعبير أوتكس-1 في germline8 . يوضح هذا الاستنتاج أن تحويل الخلية الجرثومية إلى الخلايا العصبية المبينة في هذا البروتوكول يمكن أن تستخدم لدراسة عملية بيولوجية معقدة مثل إعادة برمجة الهاتف الخلوي في الكائن حي سليمة، وفي سياق مختلف الإنمائية والبيئية شروط. وعلاوة على ذلك، يوفر منظور لتحدي الخلايا الجرثومية بالإفراط الإعراب عن TFs يحفز مصير مختلفة لدراسة دورها في تقييد اللدونة الخلوية9، أو لتقييم قدرتها على حفز إعادة برمجة الخلايا الجرثومية إلى أنواع الخلايا الأخرى في الجسم الحي.

بينما الثدييات الأنسجة الثقافات تسمح أيضا دراسة الجوانب المختلفة لإعادة برمجة مصير الخلية، الخلايا التي نمت في الثقافة محدودة القدرة على تقليد مما يشير إلى ظروف الطريق مقارنة بالكائن حي سليمة. ولذلك، C. ايليجانس نموذج متعدد الاستخدامات لدراسة أدوار مختلف العمليات البيولوجية مثل الشق الإشارات أثناء إعادة برمجة في فيفو. بالإضافة إلى ذلك، هو نموذج قوية للشاشات الوراثية التي من السهل نسبيا الحفاظ على وتعديلها وراثيا لتكاليف منخفضة.

Protocol

نالت موافقة جميع الأساليب الموصوفة هنا فيما يتعلق برعاية الحيوان لاجيسو في "برلين، ألمانيا"

1-حل إعداد

  1. لوحات NGM أجار (1 لتر)
    1. إضافة 3 غرام من كلوريد الصوديوم و 2.5 g ببتون وسائط (مثل، بكتو-ببتون) 20 غراما من أجار. بعد التعقيم، أضف 1 مل من نسبة الكولسترول في الدم (5 ملغ/مل في الأسهم EtOH 95%)، 1 مل 1 مجسو م4، 1 مل 1 م CaCl2، 25 مل م 1 K2PO4، و 1 مل من الامفوتريسين ب (2.5 ملغ/مل الأسهم).
  2. [رني] أجار NGM لوحات (1 لتر)
    1. إضافة 3 غرام من كلوريد الصوديوم و 2.5 g وسائط ببتون 20 غراما من أجار. بعد التعقيم إضافة، 1 مل من نسبة الكولسترول في الدم (5 ملغ/مل في الأسهم EtOH 95%)، 1 مل 1 م MgSO4، 1 مل من 1 م CaCl2، 25 مل م 1 ك2ص4، 1 مل من الامفوتريسين ب (2.5 ملغ/مل الأسهم)، 1 مل 1 م إيبتج ، و 1 مل كاربينيسيلين (50 ملغم/مل).
  3. رطل-أجار (1 لتر)
    1. إضافة 10 جرام ببتون وسائط الإعلام، وانتزاع 5 غ خميرة، 5 غ من كلوريد الصوديوم، 20 غراما أجار، 10 مل من 1 م تريس pH 8.0. إضافة ح2س 1 ل. بعد التعقيم، أضف 1 مل كاربينيسيلين 50 ملغ/مل و 2.5 مل من التتراسيكلين 5 ملغ/مل.
  4. المتوسطة رطل (1 لتر)
    1. إضافة 10 جرام ببتون وسائط الإعلام، وانتزاع 5 غ خميرة، 5 غ من كلوريد الصوديوم، و 10 مل من 1 م تريس pH 8.0. إضافة ح2س 1 ل. بعد التعقيم، أضف 1 مل كاربينيسيلين 50 ملغ/مل.
  5. M9-المخزن المؤقت (1 لتر)
    1. إضافة 6.0 ز غ2هبو4ز 3 خ2ص4، 5 غ من كلوريد الصوديوم و 50 مغ من الجيلاتين. قبل الاستخدام، قم بإضافة 1 مل من 1 م MgSO4.
  6. حل تبيض (10 مل)
    1. أضف 1 مل من ناكلو و 2 مل من هيدروكسيد الصوديوم N 5. إضافة H2O إلى 10 مل.

2-إعداد لوحات [رني]

ملاحظة: يتم عادة مثقف C. ايليجانس في المختبر على ألواح بيتري 6 سم يحتوي على 7.5 مل من "ديدان أسطوانية النمو المتوسطة أجار" (NGM-أجار)10،11. هذا البروتوكول هو الأمثل للديدان في 15 درجة مئوية. إعداد لوحات مع NGM، استخدام تقنيات عقيمة القياسية لمنع التلوث بالفطريات والبكتيريا. التالي هو بروتوكول إعداد لوحات NGM تكملة مع الكواشف ل [رني].

  1. إعداد لوحات NGM أجار [رني] 6-سم يحتوي على 1 مم الأيزوبروبيل β-د-1-ثيوجالاكتوبيرانوسيدي (إيبتج) و 50 ميكروغرام/مل كاربينيسيلين. والسماح لهم الجافة ح 24 – 48 في درجة حرارة الغرفة في الظلام12.
    1. تبقى لوحات [رني] في 4 درجات مئوية في الظلام. لا تستخدم إذا مضى عليها أكثر من 14 يوما.
  2. حدد [رني] استنساخ البكتيريا (الإشريكيّة القولونية HT115) التي تحتوي على بلازميد L4440 مع تسلسل الحمض النووي الجينات لين-53 من المخزون والغليسيرول المجمدة من المكتبة [رني] المتاحة13 رطل-أجار لوحات تحتوي على 50 ميكروغرام/مل على كاربينيسيلين والتتراسيكلين 12.5 ميكروغرام/مل باستخدام نمط streaking ثلاث مراحل. تنمو هذه البكتيريا في12من 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. ويسمح هذا استنساخ الإنتاج المعتمدة على إيبتج من دسرنا لين-53 في البكتيريا.
    1. بالإضافة إلى ذلك، تنمو البكتيريا [رني] التي تحتوي على بلازميد L4440 دون أي تسلسل الجين ك عنصر التحكم فارغاً من النواقل14.
  3. وفي اليوم التالي اختيار مستعمرة واحدة من 53 لين أو لوحات فارغة ناقلات رطل-أجار استخدام ماصة 200 ميليلتر نصيحة وتطعيم كل منها في أنبوب ثقافة منفصلة تحتوي على 2 مل من المتوسط السائل LB14 تستكمل مع 50 ميكروغرام/مل كاربينيسيلين. تنمو الثقافات بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية حتى بلوغهم بكثافة بصرية (OD) 600 نيوتن متر 0.6 – 0.8. قياس القطر الخارجي باستخدام جهاز المطياف الضوئي15.
    تنبيه: لا وسائط الإعلام رطل السائلة التي ينبغي أن تتضمن التتراسيكلين على النقيض من لوحة رطل-أجار المستخدمة ل streaking البكتيريا من المخزون والغليسيرول، منذ إدراج التتراسيكلين أثناء التغذية يؤدي إلى انخفاض كفاءة [رني] 12
  4. إضافة 500 ميليلتر من كل ثقافة البكتيرية (لين-53 أو متجه فارغة) إلى لوحات NGM أجار [رني] 6 سم باستخدام مولتيبيبيتي. احتضان لوحات مع غطاء مغلق بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة في الظلام لتجف. وخلال هذا الوقت، سوف إيبتج في لوحات NGM الحث على إنتاج دسرنا في البكتيريا.
    1. استخدام لوحات على الأقل 3 كل ثقافة البكتيرية كل تجربة. وهذا سيوفر 3 التقنية وإنشاء نسخ متماثلة لكل تجربة.
  5. تخزين لوحات [رني] NGM أجار المجففة مع البكتيريا في 4 درجات مئوية في الظلام لمدة تصل إلى أسبوعين.

3-إعداد C. ايليجانس سلالة BAT28

  1. الحفاظ على سلالة دودة BAT288 تتضمن المتسلسلات otIs305 [hsp-16.2prom::che-rol-6(su1006) 1،] و ntIs1 [جسي 5prom::gfp] على البكتيريا OP50 باستخدام معيار NGM-أجار لوحات عند 15 درجة مئوية.
    ملاحظة: لبروتوكول مفصلة بشأن الثقافة السلكية، انظر10. Rol-6(su1006) اليل مهيمنة ويشيع استخدام حقن المظهرية علامة16 التي تسبب حركة المتداول نموذجية. يتم استخدامه في التحوير otIs305 لتعقب hsp-16.2prom::che-1.
    1. سلالة BAT28 في 15 درجة مئوية في جميع الأوقات لمنع التنشيط وقائي للحفاظ hsp-16.2prom::che-1 التحوير. الحد من التعرض لدرجات حرارة أعلى من 15 درجة مئوية أثناء التعامل مع الإجهاد بقدر الإمكان.
  2. العمر-مزامنة الديدان، استخدام تقنية تبيض17.
    1. يغسل 6 سم NGM أجار لوحات تحتوي على البالغين والبيض من BAT28 استخدام ميليلتر 900 M9 المخزن المؤقت. إزالة الديدان بيليه سينتريفوجينج في 900 غ س للحد الأدنى 1 المادة طافية.
    2. إضافة 0.5 – 1 مل من التبييض الحل ويهز الأنبوب لحوالي 1 دقيقة حتى تبدأ الديدان الكبار انفجار مفتوحة. رصد استخدام ستيريوميكروسكوبي قياسية.
    3. إزالة الديدان بيليه سينتريفوجينج في 900 غ س للحد الأدنى 1 المادة طافية.
    4. أغسل بيليه دودة 3 مرات بإضافة 800 ميليلتر من المخزن المؤقت M9 وسينتريفوجينج في 900 x ز.
    5. وضع البيض تنظيفها على NGM-لوحات جديدة المصنف مع البكتيريا OP50. ينمو عدد سكان المبيضة على البكتيريا OP50 عند 15 درجة مئوية حتى تصل إلى مرحلة L4 (حوالي 4 أيام). يمكن التعرف على يرقات L4 بتصحيح اللون أبيض تقريبا في منتصف الطريق على طول الجانب البطني من دودة18 ستيريوميكروسكوبي قياسية باستخدام.
      ملاحظة: تحقيقا للخلية الجرثومية للعصبية تحويل النمط الظاهري عند استنفاد لين-53، فإنه يحتاج إلى أن تنضب في جيل الآباء (P0).
ويجري التهديف للنمط الظاهري التحويل في الجيل التالي (الأبناء الجيل F1). تحقيق تستنزف لين-53 في P0 الفعل، تتعرض الحيوانات L4 إلى [رني].
  • نقل L4 50 مرحلة الديدان الواحدة وتكرار استخدام سلك البلاتين لصفيحة NGM التي لا تحتوي على أي بكتيريا واسمحوا الديدان الابتعاد عن أي نقل البكتيريا OP50 يدوياً. واسمحوا الديدان التحرك على اللوحة لمدة حوالي 5 دقائق. استخدام البكتيريا من لوحات NGM أجار [رني] المصنف سابقا مع لين-53 [رني] البكتيريا (أو ناقلات فارغة) لنقل إلى اللوحات [رني] كل منهما.
    1. تجنب نقل البكتيريا OP50 إلى اللوحات [رني] الفعلية. العمل بسرعة لتقليل زمن التعرض للضغط لدرجات حرارة أعلى من 15 درجة مئوية.
  • احتضان الديدان على لوحات NGM أجار [رني] في 15 درجة مئوية لمدة 7 أيام تقريبا حتى يصل إلى ذرية F1 من الديدان L3-L4 المرحلة. أنها يمكن أن يفصل بوضوح من الحيوانات P0 نظراً لأنها أكبر وأكثر سمكا من ذرية F1.
    1. بصريا الاختيار تحت ستيريوميكروسكوبي قياسية ما إذا كانت الديدان ذرية F1 إظهار النمط الظاهري الفرج (بفول) بارزة كما هو مبين في الشكل 1. [رني] ضد لين-53 قد آثار بليوتروبيك، ويؤدي النمط الظاهري بفول التي يمكن استخدامها لتقييم ما إذا كانت نجحت [رني] ضد لين-53 .
      ملاحظة: يمكن أن يسبب [رني] ضد لين-53 الفتك الأجنة F1. يزيد هذا التأثير إذا لوحات معرضة لدرجات أعلى من 15 درجة مئوية قبل الحيوانات مرحلة L3-L4. يمكن التعرف على أجنة ميتة بالتنمية المقبوض عليهم وعدم الفقس.
    2. احتضان لوحات في الظلام منذ إيبتج حساسة للضوء.
  • 4-تنظيم دورات تعريفية لإعادة برمجة الخلية الجرثومية

    1. احتضان النظر [رني] لوحات تتضمن لين-53 وإفراغ ذرية F1 يعامل [رني] ناقل لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في الظلام لتنشيط تشي-1. استخدام حاضنة التهوية حيث أنه يسمح لصدمة حرارة أكثر كفاءة.
    2. السماح للحيوانات صدمة الحرارة استرداد لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام واحتضان ثم لوحات عند 25 درجة مئوية بين عشية وضحاها في الظلام.
    3. استخدام ستيريوميكروسكوبي قياسية بالإضافة إلى مصدر ضوء فلورية، فحص الحيوانات تحت التصفية بروتينات فلورية خضراء جسي-5prom::gfp-المشتقة إشارات في منطقة منتصف الجسم من الديدان كما هو مبين في الشكل 2. مجهر تعيين إشارات التجارة والنقل: الإثارة القصوى في 488 نانومتر مع الانبعاثات الحد الأقصى في 509 نانومتر.
    4. تقييم درجة الخلية الجرثومية لتحويل الخلايا العصبية بالحيوانات المتصاعدة مع إشارات التجارة والنقل في منطقة منتصف الجسم على أجار المحتوية على منصة الفحص المجهري الشرائح19.
      1. حساب عدد الحيوانات عرض الخلية الجرثومية لتحويل الخلايا العصبية مقابل الحيوانات الظلام لتقييم penetrance النمط الظاهري. عادة، حوالي 30% الحيوانات تظهر منفصلة بروتينات فلورية خضراء إشارات في germline عند استنفاد لين-53 ، بينما لا يزيد عن 5 في المائة الحيوانات تظهر التشتيت بروتينات فلورية خضراء إشارات في germline عند متجه فارغة [رني].

    Representative Results

    كما هو مبين في الشكل 1، توضح الحيوانات F1 الذي يحمل النمط الظاهري بفول التطبيق الناجح ل لين-53 [رني]. هذه الحيوانات المعرضة للسماح بتحويل تلك الخلايا الجرثومية إلى الخلايا العصبية مثل بورصة عمان بناء على تحريض صدمة الحرارة التعبير المفرط تشي-1 كما هو مبين في الشكل 2. وعلى النقيض من الديدان التي نمت في عنصر التحكم فارغة متجهة لين-53 [رني] [رني] سوف تسفر عن معاملة الحيوانات التي تعرض إشارات بروتينات فلورية خضراء خارج الرحم في منطقة منتصف الجسم بعد صدمة الحرارة وحضانة 25 درجة مئوية بين عشية وضحاها ك سابقة وصف4، 8-دراسة أوثق تحت مجهر ابيفلوريسسينسي هذه الديدان تكشف عن أن الخلايا تظهر إشارات التجارة والنقل أيضا عرض الإسقاطات العصبية مثل (الشكل 2B، الأسهم البيضاء) التي نموذجية للخلايا العصبية. إذا كان [رني] ضد لين-53 لم يكن ناجحاً أو ظروف الحرارة-صدمة غير مناسبة سوف تشبه إشارات التجارة والنقل لتلك الموجودة في عنصر التحكم [رني] الحيوانات المعالجة (الشكل 2). الأهم من ذلك، تجنب حمل التعبير المفرط تشي-1 بالاستقراء الحرارة قبل أن تصل الحيوانات إلى منتصف المرحلة L3. الحيوانات التي كانت صغيرة جداً في ذلك الوقت التعريفي overexpression تشي-1 عرض التعبير 5prom::gfp جسي حمل خارج الرحم في مناطق أخرى من الجسم مثل الفرج النامي كما هو موضح في الشكل 313.

    Figure 1
    رقم 1: النمط الظاهري بفول الناجمة عن [رني] ضد لين-53- (أعلى) صورة DIC L4/الشباب مرحلة الكبار F1 ذرية الديدان المستمدة من الأمهات [رني] التعامل مع عنصر تحكم أو لين-53 . تغيير حجم أشرطة = 20 ميكرومتر. (أسفل) الحيوانات تعامل مع لين-53 [رني] عرض النمط الظاهري الفرج (بفول) بارزة (السهم الأسود-الرؤساء). النمط الظاهري بفول يؤكد أن [رني] ضد لين-53 وكانت ناجحة. تغيير حجم أشرطة = 20 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

    Figure 2
    رقم 2: الديدان أعيدت برمجتها بنجاح في الخلية الجرثومية في الخلايا العصبية. (أ) BAT28 سلالة الحيوانات نمت على متجه فارغة لا تظهر إشارات التجارة والنقل في الفعل بعد صدمة الحرارة تحريض overexpression تشي-1 . ويحدد خط أبيض متقطع دودة. تغيير حجم أشرطة = 20 ميكرومتر. (ب) وعلى النقيض من الحيوانات سلالة BAT28 نمت على ناقلات فارغة الحيوانات [رني] نما في لين-53 [رني] عرض إشارات جسي-5prom::gfp في منطقة منتصف الجسم. صور المقطع منتصف الجسم مع إشارات التجارة والنقل في 63 X التكبير تكشف الخلايا بروتينات فلورية خضراء-إيجابية تظهر نتوءات (سهم أبيض-الرؤساء). هذه الميزة المورفولوجية يشير إلى أن الخلايا الجرثومية خضع لتحويل الخلايا العصبية مثل بورصة عمان. علامة النجمة البيضاء fluorescence السيارات المستمدة من الأمعاء. كافة الصور تم الحصول عليها باستخدام مجهر ابيفلوريسسينسي مع 20x التكبير والتكبير X 63. ويحدد خط أبيض متقطع الديدان. تغيير حجم أشرطة = 20 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

    Figure 3
    الشكل 3: دودة المرحلة المبكرة مع حمل خارج الرحم بروتينات فلورية خضراء- BAT28 سلالة الحيوانات نمت على البكتيريا [رني] ناقل الفارغة التي كانت صدمة الحرارة التي يسببها تشي-1 أوفيريكسبريسيون في أوائل مراحل اليرقات مثل L2 إظهار إشارات التجارة والنقل في منطقة منتصف الجسم (العلامات النجمية بيضاء). هذه الإشارات لا بسبب إعادة برمجة الخلية الجرثومية. ويحدد خط أبيض متقطع دودة. تغيير حجم أشرطة = 20 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

    Discussion

    بينما وصف البروتوكول استخدام المعدلة وراثيا C. ايليجانس سلالة BAT28 و [رني] ضد لين-53 واضحة، عددا من الخطوات الهامة في النظام لضمان النتيجة المتوقعة للخلية الجرثومية لإعادة برمجة الخلايا العصبية. من المهم أن تظل سلالة BAT28 في 15 درجة مئوية في جميع الأوقات قبل التجارب. أثناء المناولة والصيانة للسلالة، الوقت في درجات حرارة تتجاوز 15 درجة مئوية يحتاج إلى التقليل إلى أقصى حد ممكن. ظروف صدمة الحرارة المناسبة مهمة نظراً لعدم كفاية تحريض overexpression تشي-1 لن تؤدي إلى الخلية الجرثومية لتحويل الخلايا العصبية الرابطة. وهذا يمكن الكشف عن طريق قياس penetrance النمط الظاهري كما هو موضح في البروتوكول. صدمة الحرارة واسعة النطاق يمكن أن يؤدي إلى هلاك الحيوانات. على سبيل المثال، تجربة اللوحات التي وضعت قرب الجدران الداخلية أو على أرض الواقع أسفل الحاضنة الهواء ثابت الغالب المعالجة الحرارية واسعة النطاق. ولذلك، يوصي باستخدام حاضنة تنفيس حرارة. بالإضافة إلى ذلك، التوقيت لاستحثاث صدمة الحرارة أمر بالغ الأهمية منذ التعبير المفرط تشي-1 خلال مراحل اليرقات في وقت سابق ثم L3 يمكن أن يؤدي إلى حمل خارج الرحم 5prom::gfp جسي التعريفي في مناطق الجسم المختلفة مثل الفرج (الشكل 3) 9-وعلاوة على ذلك، يمكن الكشف عن صدمة الحرارة نطاق واسع من بينيترانسي النمط الظاهري في متجه فارغة [رني] الحيوانات التي لا ينبغي أن يشمل 5% وزيادة السيارات-الأسفار من الأنسجة الأخرى، إلا وهي الأمعاء.

    بشكل متقطع، يمكن أن تفقد البكتيريا [رني] نشاطهم على كفاءة إنتاج دسرنا الجينات المستهدفة. ولسوء الحظ، وهذا لا يمكن أن يكون تم الكشف عنها قبل التجربة [رني]. في مثل هذه الحالات ينبغي أن تزرع مسحه جديدة من الجلسرين كما هو موضح في المادة 2 من البروتوكول. إذا كان هناك لا يزال لا تسبب في [رني] بليوتروبيك النمط الظاهري مرئية مثل النمط الظاهري بفول الناجمة عن [رني] ناجحة ضد لين-53، ثم بلازميد عزل الحمض النووي من البكتيريا كل منها يجب أن يتم تنفيذ والبكتيريا HT115 جديدة بحاجة إلى أن تكون تحول مع بلازميد L4400 التي تحتوي على تسلسل لين-53 .

    الأهم من ذلك، لقد سلالة BAT28 النمط الظاهري الاسطوانة الناجمة عن pRF4 ماركر الحقن، التي كانت تستخدم أثناء ترانسجينيسيس للحيوانات مع hsp-16.2prom::che-1 بنية الحمض النووي. في بعض الأحيان، تفقد الحيوانات النمط الظاهري المتداول، التي يمكن أن تشير إلى إسكات hsp-16.2prom::che-1 التحوير. للحفاظ على سلالة BAT28 بشكل صحيح، انتقاء الحيوانات الرول 10 إلى لوحة جديدة ونشر اختيار المتداول الحيوانات.

    يقتصر تطبيق البروتوكول بإجراء F1 [رني]، مما يعني أن الحيوانات آباؤهم (P0 الجيل) لم يتعرضوا ل لين-53 [رني] لن تظهر الخلية الجرثومية لتحويل الخلايا العصبية نتيجة لإنقاذ الأمهات4. قد وصفت إجراء بديل لتحويل الخلايا الجرثومية إلى الخلايا العصبية التي سيوسك والزملاء15 [رني] تدق لأسفل شعبة الشؤون القانونية العامة-1 و المكسيك-3 دون الإفراط في التعبير عن عامل النسخ باستخدام. ومع ذلك، الخلايا العصبية التي تم الحصول عليها لا تنتمي إلى نوع معين من الخلايا العصبية والخلايا الجرثومية أيضا تحويل للعضلات مثل الخلايا عند استنفاد [رني] بوساطة من شعبة الشؤون القانونية العامة-1 و المكسيك-315. سابقا، وقد ثبت [رني] ضد لين-53 يسمح بتحويل الخلايا إلى الخلايا العصبية مثل جابايرجيك عند التعبير المفرط من نوع بيتكس هومويدوماين عامل النسخ UNC-3016 بدلاً من تشي-14 . لاتجاهات المستقبل، يمكن تحويل النسخ الذي يحفز مصير مختلف العوامل يمكن اختبار ما إذا كانت لين-53 استنفاد الخلايا الجرثومية إلى أنواع أخرى من خلية من الخلايا العصبية المحددة. وفي هذا السياق، يدفع أوفيريكسبريسيون عامل النسخ بهلة شذوذ هلة-1، هومولوج من دخولها الثدييات17، تحويل الخلية الجرثومية للعضلات عند 53 لين RNAi5. يمكن استخدام المنشأة إعادة برمجة الخلايا الجرثومية إلى نوع محدد من الخلايا الجسمية عند لين-53 [رني] والتعبير المفرط عن عامل النسخ الذي يحفز مصير ملائم لعدد من الشاشات الوراثية المختلفة. يمكن أن تساعد هذه الشاشات القامع أو محسن تشريح المسارات التنظيمية التي تلعب دوراً من خلال تحويل مصير الخلية.

    Disclosures

    وقد أعلن الكتاب وجود لا تضارب في المصالح.

    Acknowledgments

    ونحن نشكر إلينا الخليلي، ومارتينا هاجدوسكوفا للمساعدة التقنية. ونشكر أعضاء الفريق وتورسون للتعليقات على المخطوطة. هذا العمل برعاية منسق الإغاثة الطارئة-الجنيه الاسترليني-2014-637530 ومنسق الإغاثة الطارئة CIG PCIG12-GA-2012-333922 ويدعمه مركز ماكس ديلبرويك "الطب الجزيئي" في "رابطة هلمهولتز".

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Chemicals 
    Agar-Agar, Kobe I Roth 5210.1
    Bactopeptone  A. Hartenstein GmbH 211 677 Peptone Media 
    Yeast extract  AppliChem A1552,0100
    Amphotericin B USBiological A2220
    CaCl2 Merck Biosciences 208290
    Cholesterol Roth 8866.2
    Gelatine Roth 4275.3
    IPTG Sigma 15502-10G
    K2PO4 Roth T875.2
    KH2PO4 Roth  3904.2
    MgSO4 VWR 25,163,364
    Na2HPO4 Roth P030.1
    NaCl Roth 9265.1
    NaClO Roth 9062.3
    NaOH (5 N) Roth  KK71.1
    Tris Roth AE15.2
    Carbenicillin Roth 634412
    Tetracycline Roth 2371.2
    Incubators
    Incubator  New Brunswick Scientific C24 M1247-0052 for heat-shock
    Incubator  Sanyo MIR-5 5534210 for maintenance of worm strains at 15 °C or 25 °C
    Microscopes
    Fluorescence microscope M205 FA Leica
    Microscope (Imaging) + camera Axio Imager 2 Zeiss
    Microscope (Imaging) + camera Sensicam PCO
    Stereomicroscope SMZ745 Nikon
    Bacterial strains
    Escherichia coli HT115 F-, mcrA, mcrB, IN(rrnD-rrnE)1, rnc14::Tn10(DE3 lysogen: lavUV5
    promoter -T7 polymerase) (IPTG-inducible T7 polymerase) (RNAse
    III minus).
    Escherichia coli OP50  Uracil auxotroph E. coli strain
    Worm strains
    BAT28: otIs305 (hsp16.2prom::che-1::
    3xHA) ntIs1 (gcy-5prom::gfp) V.
    derived from OH9846 by 4x times more back crossing with N2
    RNAi Clones
    lin-53 SourceBioscience ID I-4D14 Ahringer library 16B07 ChromI, K07A1.12
    empty vetor: L4440 Addgene  #1654
    Misc.
    Worm pick  self-made using a pasteur pipette and a platinum wire

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts. Cell. 51, (6), (1987).
    2. Ebrahimi, B. Reprogramming barriers and enhancers: strategies to enhance the efficiency and kinetics of induced pluripotency. Cell Regen. 1-12 (2015).
    3. Becker, J. S., Nicetto, D., Zaret, K. S. H3K9me3-Dependent Heterochromatin: Barrier to Cell Fate Changes. Trends Gent. 32, (1), 29-41 (2016).
    4. Tursun, B., Patel, T., Kratsios, P., Hobert, O. Direct Conversion of C. elegans Germ Cells into Specific Neuron Types. Science. 331, (6015), 304-308 (2011).
    5. Patel, T., Tursun, B., Rahe, D. P., Hobert, O. Removal of Polycomb Repressive Complex 2 Makes C.elegans Germ Cells Susceptible to Direct Conversion into Specific Somatic Cell Types. Cell Rep. 1-9 (2012).
    6. Etchberger, J. F., et al. The molecular signature and cis-regulatory architecture of a C. elegans gustatory neuron. Genes Dev. 21, (13), 1653 (2007).
    7. Yu, S., Avery, L., Baude, E., Garbers, D. L. Guanylyl cyclase expression in specific sensory neurons: a new family of chemosensory receptors. Proc Nat Acad Sci. USA. 94, (7), 3384-3387 (1997).
    8. Seelk, S., et al. Increasing Notch signaling antagonizes PRC2-mediated silencing to promote reprograming of germ cells into neurons. eLife. 5, (2016).
    9. Patel, T., Hobert, O. Coordinated control of terminal differentiation and restriction of cellular plasticity. eLife. 6, e24100 (2017).
    10. Brenner, S. The Genetics of Caenorhabditis Elegans. Genetics. 77, (1), 71 (1974).
    11. Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis. J Vis Exp. (47), e2293 (2011).
    12. Ahringer, J. Reverse genetics. WormBook. (2006).
    13. Kamath, R. S., et al. Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi. Nature. 421, (6920), 231-237 (2003).
    14. Kamath, R. S., Martinez-Campos, M. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biol. 18, (1), 419357 (2000).
    15. Ciosk, R., DePalma, M., Priess, J. R. Translational regulators maintain totipotency in the Caenorhabditis elegans germline. Science. 311, (5762), 851-853 (2006).
    16. Jin, Y., Hoskins, R., Horvitz, H. R. Control of type-D GABAergic neuron differentiation by C. elegans UNC-30 homeodomain protein. Nature. 372, (6508), 780-783 (1994).
    17. Harfe, B. D., Branda, C. S., Krause, M., Stern, M. J., Fire, A. MyoD and the specification of muscle and non-muscle fates during postembryonic development of the C. elegans mesoderm. Development. 125, (13), 2479-2488 (1998).
    18. Ullrich, M., Liang, V., et al. Bio-orthogonal labeling as a tool to visualize and identify newly synthesized proteins in Caenorhabditis elegans . Nat Protoc. 9, (9), 2237-2255 (2014).
    19. Shaham, S. Methods in cell biology. WormBook. 1-75 (2006).
    تطبيق [رني] والحرارة الناجمة عن صدمة "التعبير عامل النسخ" إلى "إعادة برمجة الخلايا الجرثومية" إلى الخلايا العصبية في <em>C. ايليجانس</em>
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Kolundzic, E., Seelk, S., Tursun, B. Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans. J. Vis. Exp. (131), e56889, doi:10.3791/56889 (2018).More

    Kolundzic, E., Seelk, S., Tursun, B. Application of RNAi and Heat-shock-induced Transcription Factor Expression to Reprogram Germ Cells to Neurons in C. elegans. J. Vis. Exp. (131), e56889, doi:10.3791/56889 (2018).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter