光度法蛋白的测定

样品中的蛋白质浓度测定的是在许多不同的生化分析的基本步骤。光度法测定可以用样本量太小。越多样本含有吸光物质，少光将传送通过它。这提供了吸收物质的定量测定。这些概念是如此根本的科学的文章，介绍的两种技术是在三个最常被引用文件中的所有时间。本视频将显示背后一些最常见的光度蛋白质的概念，测定技术、 执行的方式和如何对收集的数据进行分析。

光度法蛋白测定基于浓度与光吸收能力之间的关系。这就是所谓的啤酒 — 朗伯定律，其中指出，吸光物质的浓度是成正比的吸光度。

这一原则是所有光度蛋白质测定方法的基础。

为直接吸收分析测量不变的蛋白样品的吸光度值。由于其芳香侧链，色氨酸和酪氨酸残基给高吸光度读数在波长为 280 nm。

然而，这些氨基酸 — — 这是两个最不经常发现在蛋白质--都存在于不同数量在每个蛋白，所以每个测定是独特。为了克服这一局限性，更复杂的检测方法-那些不依赖于这些氨基酸-被开发了。

一个例子是布拉德福德测定，彩色的染料对样品的添加位置。染料，考马斯亮蓝，被称为响应按比例更多蛋白质目前，更多的绑定事件与染料。

然后，测定吸光度的绑定的考马斯亮蓝染料，吸收的光，594 测定蛋白质浓度毫微米。然而，布拉德福德测定是线性作短距离的浓度，因此稀释常被要求在分析之前。

洛瑞法结合双缩脲试剂、 反应与肽键的铜离子和福林 Ciocâlteu 试剂，氧化芳香蛋白质残留的碱性溶液。由此产生的颜色变化是样品的蛋白质浓度成正比。

吸收的减少福林试剂可以确定在 750 毫微米。像直接吸收，每种蛋白质有着独特的反应，和必须为感兴趣的蛋白质进行校准。既然我们已经回顾了一些最常见的化验背后的基本原则，让我们看看如何直接进行吸收和布拉德福德测定。

若要开始直接吸收分析，分光光度计被校准与一片空白，零测定吸光度。标准的解决方案被编写用于创建校准曲线。分装的第一个标准是添加到试管中，然后放入分光光度计。

吸光度值在 280 nm 然后记录。为每个标准，每次运行使用清洁试管重复此过程。一旦完成，校准曲线被创建通过绘制浓度与吸光度。这条线的斜率是摩尔的衰减系数，它涉及到浓度的吸光度。

接下来，未知的样品添加到试管，并录得的吸光度值。随着不同的光度法测定方法的数据分析是相似的我们将介绍，之后我们看看布拉德福德测定。

在这里，与牛血清白蛋白标准 96 孔板上进行布拉德福德蛋白测定。若要开始，BSA 股票解决方案做好准备。

未知的解决方案被稀释用去离子水，以确保浓度检测的范围之内。根据试剂，考马斯亮染料可能还需要稀释。然后，校准曲线是由 96 孔板中加入牛血清白蛋白标准设置的。

加去离子的水达到所需的浓度来生成标准曲线。未知的样品应添加到一式三份，确保采取准确的测量板。考马斯亮染料下一步添加到每个井，用吸管搅拌。

去离子的水被添加到空井作为一片空白，测量吸光度。等待 5 分钟染料要绑定后, 吸光度测量板阅读器在 590 毫微米。

现在，我们已经进行了几个检测方法，让我们看看如何来分析数据。每个光度蛋白质测定方法基于啤酒 — 朗伯定律。

标准测量吸光度用于创建校准曲线，然后用来确定未知样品的浓度。这条曲线可以手动绘制，虽然新的分光光度法工具将创建校准曲线，一旦测量了所有的标准。这些系统还将计算蛋白质浓度未知的样品进行分析。

既然我们已经讨论了如何分析光度法蛋白质测定数据，让我们看看一些利用这些程序的方法。

光度法蛋白质测定的原则也可以用于直接测量核酸浓度。Nanodrop 分光光度计接受样品的光学活性的基座上体积很小。然后测定吸光度，和系统自动确定核酸浓度。因为蛋白质和其他来源可以干扰测量，样品纯度分析确定了 280 到 260 nm 和 260 到 230 nm 吸光度比值。纯核酸通常产生大约 1.8 和大约 2.0 的比率为 DNA 和 RNA，分别。

光度法蛋白质测定也可以用于生产的仿生材料的灵感来自于自然，征求特定细胞的反应。重组的表面被绑定到聚苯乙烯珠子来模拟细菌吸附到宿主细胞。布拉德福德测定用于确定珠在仿生材料的生产重组粘附的耦合效率。

替代的光度蛋白质检测可以用于检测和表征蛋白抗菌药物。雷亮蓝 R 染料是以共价键键合到热杀死细菌。抗菌蛋白是染色溶液中孵化的。然后，离心分离样品，和吸光的上清液在 595 nm 衡量使用酶标仪。增加的吸光度，释放到标记的细菌，培养上清的可溶性染料是酶活性的定量测定。

你刚看了光度蛋白质测定的朱庇特的视频。这个视频描述光度法测定的基本原则，走过去一些常见的检测方法，一般的程序，覆盖技术的一些新进展。谢谢观赏 ！