Summary
זיהוי מהיר ומדויק של פתוגנים באתר, במיוחד קרקע בתפו פתוגנים צמח, הוא חיוני כדי למנוע התפשטות של מחלות בתחום עיצוב והפקת inoculum. השיטה שפותחה כאן באמצעות מערכת זיהוי PCR נייד בזמן אמת מאפשר האבחון באתר בתנאי שדה.
Abstract
האבחון באתר של מחלות יכול להיות כלי שימושי עבור מגדלי להחלטות בזמן הפעלת היישום קודמות של אסטרטגיות ניהול המחלה להפחית את ההשפעה של המחלה. עד מהרה במעבדות רבות האבחון, תגובת שרשרת פולימראזית (PCR), במיוחד בזמן אמת PCR, נחשבת שיטה רגיש ומדויק ביותר לזיהוי צמח-פתוגן. עם זאת, מותני מבוסס המעבדה מחייבים בדרך כלל ציוד מעבדה יקר וכוח אדם מיומן. במחקר זה, משמשים נישאי של תפוח אדמה הטמון לזיהוי מולקולרי באתר. זה הושג באמצעות פרוטוקול מהירה ופשוטה הכוללת של חומצת גרעין מגנטיים מבוססי חרוז החילוץ, PCR נייד בזמן אמת (assay המבוסס על בדיקה fluorogenic). הגישה PCR בזמן אמת ניידים לעומת לטובה גילוי מערכת מבוססת-מעבדה, גם 100 עותקים של DNA בהיקף Spongospora subterranea. בשיטת PCR בזמן אמת ניידת שפותחה כאן יכול לשמש אלטרנטיבה מבוסס המעבדה הגישות ואת כלי באתר שימושי לאבחון הפתוגן.
Introduction
זיהוי מדויק ומהיר של פתוגנים סיבתי משמעותי משפיעה על ההחלטות לגבי ניהול מחלות צמחים. מחלות קרקע בתפו קשים במיוחד לאבחן כי הסביבה אדמה היא גדולה מאוד יחסית צמח המוני, ומורכב, שהופך אותו אתגר כדי להבין את כל ההיבטים של מחלות קרקע בתפו. יתר על כן, מחלות קרקע בתפו ניתן symptomless במהלך זיהום ההתחלתי, תלויים לחצים סביבתיים, ובכמה מהם יש תקופות ארוכות כמוס שתוצאתה אבחנות מושהה1. רבים נישאי פיתחו מבנים הישרדות, כגון נבגים מיוחדים או melanized hyphae, אשר יכול לשרוד בקרקע במשך שנים רבות גם בהיעדר של הפונדקאים שלהם. שימוש בגישות לניהול קרקע בתפו המחלה כוללים: הימנעות ידוע שדות שורץ, באמצעות זרעים שאושרו ללא הפתוגן ושתילים, שמירה על ציוד אינסטלציה, הגבלת התנועה של קרקע ומים במידת האפשר. הידע של נוכחות הפתוגן באמצעות אסטרטגיות זיהוי מולקולרי יכול גם לשחק תפקיד שימושי ביידוע החלטות בזמן טיפולים בשלב מוקדם או מראש לשתול הערכות של השדות. באתר בדיקה מספקת יתרונות נוספים של מתן תוצאה מהירה מבלי לשלוח דגימת מעבדה אבחון כי אולי במרחק מה משם וגם יכול לעסוק המגדל אם אבחון כזה הוא ביצע "השדה בצד" בנוכחותם.
על האבחון באתר המבוסס על זיהוי מולקולרי, רגישות, ירידה לפרטים, חוסן (הדיר ואת הפארמצבטית) ויעילות (כלומר., פשטות וביצועים עלות) הם גורמים קריטיים עבור שיקול. לרוחב התקני זרימה (LFDs) כגון Immunostrip ו PocketDiagnostic, השיטות הפופולריות לצורך זיהוי הפתוגן באתר בגלל הפשטות שלהם כמו assay צעד אחד. עם זאת, LFDs לא ייתכן כלי אבחון נכון בכל המצבים כי הם חסרים את רגישות וספציפיות, לעיתים מספק תוצאות חד משמעיים אם המחלה היעד הוא בריכוזים נמוכים, יכול cross-react עם מינים או סוגים דומים 2. בתיווך לופ הגברה איזותרמי (מנורה) הוא גם ישים לצורך זיהוי הפתוגן באתר, זולה במיוחד בעלות נמוכה ריאגנטים, תנאי ריאקציה שנותרות וכתוצאה פשוט ניתוח חזותי ערכי צבע מוחלטים. עם זאת, הן LFDs והן המנורה משמשים בדרך כלל התשובות למרות שתי הגישות יכול לשמש באופן כמותי עם ציוד יקר יותר3. תגובת שרשרת פולימראזית (PCR) מציע ירידה לפרטים גבוהה, רגישות גבוהה, ויכולת כמותית לעומת השיטות דלעיל של זיהוי. עם זאת, במעבדה מבוסס ה-PCR הטכנולוגיה המקובלת דורש ציוד מעבדה יקר וכוח אדם מיומן, וזה חיסרון גדול באימוץ טכנולוגיה זו כשיטה זיהוי למטרות באתר.
ב פרוטוקול זה, הוכח שיטת האבחון באתר באמצעות מכשיר PCR נייד בזמן אמת. טכנולוגיית ה-PCR בזמן אמת מציע יתרונות על פני שיטות אחרות מבחינת דיוק כמותית, רגישות, ואת הרב-גוניות, כבר בשימוש נרחב לאיתור מגוון רחב של צמחים פתוגנים4,5, כולל שונים פתוגנים תפוחי אדמה6. בגלל המגמות האחרונות של השוק הצומח במהירות, תחרותי, ציוד נדרש עבור טכנולוגיית ה-PCR המשיכה להתפתח להיות קומפקטי יותר ויקרים פחות7. הפרוטוקול מורכב מהשלבים הבאים: חומצת גרעין מגנטיים מבוססי חרוז מיצוי PCR נייד בזמן אמת (fluorogenic המבוסס על בדיקה assay), ניתוח נתונים כמותיים שאפשר כל מה לעשות מרחוק באמצעות מחשב נייד (איור 1).
באמצעות פרוטוקול ה-PCR ניידת שפותחה כאן, דגימות. אדמה נותחו לגילוי המחלה קרקע בתפו, Spongospora subterranea. Spongospora נבחר גם ככה פתוגן תפוחי אדמה חשוב כסוכן סיבתי של גלד אבקתי8. במהלך העשורים האחרונים, הנוכחות של מחלה זו נחשבת התפשטו לאזורים רבים שבו תפוחי אדמה גדלים9,10. שביתה אבקתי, המצאות פצעון כמו חבורות פקעות יכולים לגרום הפסדים ניכרים התשואה איכותי ל מגדלי תפוחי אדמה. בנוסף, ס' subterranea יכול וקטור תפוחי אדמה מגב העליון וירוס (PMTV), אשר יכול לגרום לסימפטומים פנימיים הנגע פקעות (המכונה spraing)11,12. לכן, חשוב לדעת אם subterranea ס קיים בתחומים לפני השתילה6. אנחנו גם להוכיח את התועלת של פרוטוקול זה איתור Rhizoctonia solani השקה קבוצה 3 (AG3) ו- PMTV. למרות מספר קבוצות השקה של Rhizoctonia solani לגרום מחלות של תפוחי אדמה, AG3 הוא ניתן לטעון החשובים ביותר ברחבי העולם13, גורם גזע כיב שיירים שחור וכתוצאה מכך ההפסדים סחירים של עד 30%14. PMTV גורם נגעים עם נמק בתוך פקעות, אשר בדרך כלל נקראים spraing. וירוס זה לאחרונה דווחה לראשונה בכמה מדינות מערב השקט16,15,, או17, הוא הדאגה הגוברת מגדלים באזור גידול זה חשוב תפוחי אדמה. בנוסף לקביעת האפקטיביות של PCR נייד למחלות אלה חשוב, אופטימום DNA החילוץ מתודולוגיה וקרקע גודל המדגם נחקרו גם במחקר זה.
התוצאות מראים כי בשיטת PCR נייד היא תכליתי ישימה עבור זיהוי פתוגנים שונים. שיטת זיהוי באתר שפיתחנו יכול לאפשר כוכי דוקטורי העובדים בחקלאות (למשל, מגדלים) לקבל החלטות קודמות לגבי ניהול המחלה, כגון מגוון בחירות או סיבובים, ולא יכולים לכמת צמח חיידק במדגם במהלך סקר שדה, לפני השתילה, כדי למנוע התפרצות מחלות פוטנציאליות.
Protocol
1. באתר זיהוי מולקולרי של פתוגנים באמצעות מערכת ה-PCR נייד בזמן אמת
הערה: ראה איור 1.
- מגנטיים מבוססי חרוז DNA החילוץ
הערה: מגנטיים מבוססי חרוז DNA ערכת חילוץ (למשל מ- Primerdesign) שימשה לפי הוראות היצרן. ריאגנטים כל לאחסן בטמפרטורת החדר (18-25 ° C). ברגע lyophilized Proteinase K (בקבוק מס ' 1) מושהה (באמצעות בקבוק No.1a), לאחסן ב-20 ° C.- מערבבים 20-50 מ"ג של דגימת האדמה עם µL 500 של מדגם הכנה פתרון ב microtube.
הערה: היחס של קרקע: הכנה פתרון חשוב כמו ערבוב של יחסי אחרים עלול לגרום כשל של ניסויים במורד הזרם (למשל, זיהום על ידי מעכבי של PCR). - לטחון את האדמה בתחתית הצינורית באמצעות כבעלי סטרילי קטן עד הפתרון הוא מעונן. בהמשך להשעות את חלקיקי הקרקע בפתרון ע י ניעור של microtube ומניחים לה לעמוד, באין מפריע, לתת הקרקע חלקיקים ליישב לחלוטין (בדרך כלל בין 5-10 דקות).
- להעביר µL 200 של תגובת שיקוע לתוך microtube טריים ולהוסיף µL 200 פירוק מאגר (בקבוק מס ' 2: הפתרון Guanidine הידרוכלוריד) ו 20 µL של Proteinase K (בקבוק מס ' 1).
- לערבב את lysate באופן יסודי על-ידי היפוך הצינור, דגירה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
הערה: אם lysate נמצא על המכסה microtube, הקש על הצינור או להשתמש צנטריפוגה, אם הוא זמין כדי להסיר המכסה. - להוסיף 500 µL של איגוד לערבב חרוז מאגר/מגנטי (בקבוק מס ' 3) מדגם lysed. לערבב היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה, דגירה בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות מן המדף צינור מגנטי.
הערה: ודא לערבב את הפתרון חרוז היטב לפני השימוש כדי להבטיח כי החרוזים aliquoted אחיד מהבקבוק אחסון. - מניחים את microtube על המדף צינור מגנטי. המתן לפחות 2 דקות או עד כל החרוזים ב microtube לצרף אל הקיר בצד מגנטי. לאחר מכן, להסיר, למחוק כל תגובת שיקוע על-ידי pipetting.
הערה: נא לא להפריע את החרוזים magnetized בעת הסרת וכ רפה בעברית את תגובת שיקוע. ה-DNA עכשיו נתפס ע י החרוזים מגנטי. - להסיר את microtube מן המדף צינור מגנטי, להוסיף 500 µL של שטיפת מאגר-1 (בקבוק מס ' 4: פתרון פרכלורט/אתנול נתרן) ו מחדש להשעות את החרוזים לפי pipetting חוזרות ונשנות עד החרוזים מפוזרים בצורה אחידה. לבצע שלב זה כביסה כדי להסיר חלבונים ומלח המדגם. שהתערובת לשבת במשך 30 s.
- חזור על שלב 1.1.6.
- להסיר את microtube מן המדף צינור מגנטי, להוסיף 500 µL של שטיפת מאגר-2 (בקבוק מס ' 5: פתרון פרכלורט/אתנול נתרן) ו מחדש להשעות את החרוזים לפי pipetting חוזרות ונשנות עד החרוזים מפוזרים בצורה אחידה. שהתערובת לשבת במשך 30 s.
- חזור על שלב 1.1.6.
- להסיר את microtube מן המדף צינור מגנטי ולאחר מכן להוסיף 500 µL של 80% אתנול (בקבוק no.6).
הערה: שלב זה נחוץ להסרת משקעי מלחים מדגם.- מחדש להשעות את החרוזים לפי pipetting חוזרות ונשנות עד החרוזים מפוזרים בצורה אחידה. לתת לזה לעבור 10 דקות עם ערבוב מדי פעם על-ידי היפוך.
- חזור על שלב 1.1.6.
- האוויר יבש בגדר חרוז מגנטי 10 דקות בטמפרטורת החדר עם המכסה microtube פתוח.
הערה: החרוזים צריך להיות חופשי אתנול שיורית לעין כל, אך לא לגמרי התייבש. - להסיר את microtube מן המדף צינור מגנטי, להוסיף 50-200 µL • תנאי מאגר (בקבוק מס ' 7), מחדש להשעות את החרוזים לפי pipetting חוזרות ונשנות עד החרוזים מפוזרים בצורה אחידה, ומשהים 30 s.
הערה: בשלבים לעיל, ה-DNA מזוכך הוא שוחרר מן החרוזים מגנטי למאגר • תנאי. - מניחים את microtube על המדף צינור מגנטי. המתן לפחות 2 דקות או עד כל החרוזים ב microtube לצרף אל הקיר בצד מגנטי.
- להעביר את תגובת שיקוע המכיל עכשיו DNA/RNA מטוהרים עד microtube 0.5 מ לשימוש בשלבים במורד הזרם.
- מערבבים 20-50 מ"ג של דגימת האדמה עם µL 500 של מדגם הכנה פתרון ב microtube.
- נייד PCR בזמן אמת
הערה: Thermocycler נייד של ערכת assay PCR שימשו לפי הוראות היצרן (ראה את הטבלה של חומרים).- לפתוח, להפעיל את תוכנת thermocycler-הקשורים, בחר מבחן זיהוי המטרה ולהזין כל תיאור של המידע לתוך שדות הזנת הנתונים שם & פרטים, הערות, דגימות, ולאחר בדיקות .
הערה: וולס #1 ו #2 הן מוגדרות על ידי תוכנת שליטה שלילי ו בקרה חיובית, בהתאמה. - להכין PCR ריאגנטים לפני השימוש. העברת µL 500 המאגר re-השעיה מיקס מאסטר לתוך שפופרת המכילה lyophilized מיקס מאסטר לערבב היטב על ידי היפוך. להעביר את תערובת הבסיס כולו לתוך microtube חום עם התווית תחל/בדיקה (טבלה 2).
- קאפ ומנערים את microtube לערבב. ערבוב יסודי נדרש כדי להבטיח כי כל הרכיבים מחדש מושעה לחלוטין. תן תערובת זו לשבת במשך 5 דקות לפני השימוש.
הערה: אחסן את תערובת התגובה ב-20 ° C לאחר השימוש.
- קאפ ומנערים את microtube לערבב. ערבוב יסודי נדרש כדי להבטיח כי כל הרכיבים מחדש מושעה לחלוטין. תן תערובת זו לשבת במשך 5 דקות לפני השימוש.
- להכין פקד שליליים על ידי העברת 10 µL של המיקס התגובה מוכן מהשלב הקודם לתוך צינור PCR 0.2 מ"ל ולאחר מכן להוסיף 10 µL של מים יונים נטולת נוקלאז סטרילי.
- להכין פקד חיובי על-ידי העברת 10 µL של המיקס התגובה מוכן מהשלב 1.2.2 לתוך צינור PCR 0.2 מ"ל ולאחר מכן להוסיף 10 µL של תבנית בקרה חיובית.
- עבור כל דגימה, להעביר µL 10 של המיקס התגובה מוכן מהשלב הקודם לתוך צינור PCR 0.2 מ"ל, ולאחר מכן להוסיף 10 µL של דגימת DNA מקריסטלים של שלב 1.1.16.
- לטעון את הבארות של thermocycler עם התוכן מן המבחנות בהתאמה שלהם כפי שמתואר בשלב 2.1.1.
- פעם אחת כל המידע הדרוש כבר נכנסו, אישר, בחר להתחיל לרוץ ובחר את המכשיר המחובר ethernet או כונן USB.
הערה: אם נבחרה האפשרות כונן USB, יש לשמור את קובץ ריצה על הכונן כדי לשמש את thermocycler (למשל, F:\genesig). הפעל יתחיל מיד לאחר הכונן מוכנס לתוך thermocycler.
- לפתוח, להפעיל את תוכנת thermocycler-הקשורים, בחר מבחן זיהוי המטרה ולהזין כל תיאור של המידע לתוך שדות הזנת הנתונים שם & פרטים, הערות, דגימות, ולאחר בדיקות .
- ניתוח הנתונים של ה-PCR נייד בזמן אמת.
- לאחר סיום ההפעלה, פתח את קובץ הפעלה (.usb) מכונן USB באמצעות תוכנה הקשורים thermocycler או ישירות להציג את תוצאות הריצה בתוכנה על ידי לחיצה על תוצאות.
- לפני ניתוח תוצאות, שמור במנוסה שהושלמו כדי למנוע איבוד נתונים.
- בכרטיסייה ' תוצאות ', הצג את המצב של נסים, מסווגות על-ידי דגימות.
הערה: נתונים שניתן להשיג בכרטיסיה זו המצב של תוצאות, להעתיק מספר זוהה במדגם. - לחץ על הכרטיסיה פרטי כדי להציג את עקומות הגברה. כאשר היעד הוא זוהה בהצלחה, בו מוצגים הערכים סי (כימות מחזור) של היעד והן בקרה פנימית.
הערה: ערכים אלה מחושבים בדו ח הסופי ומשמשים כדי לקבוע אם דגימה חיובית עבור היעד אם יש בעיות עם התגובה או דגימות ה-DNA.
2. פרוטוקולים אחרים
-
במעבדה מבוסס שיטות החילוץ של ה-DNA אלטרנטיביות
-
CTAB-פנול-כלורופורם המבוסס על שיטות
- מבצע CTAB-פנול-כלורופורם המבוסס על שיטות, בעקבות שיטת דויל18 של שיטת Dellaporta19 כפי שתואר לעיל.
-
שיטת הכנה מיני דנ א
הערה: השיטה של אדוארדס20 בוצע כדלקמן.- להוסיף 500 מ ג של הקרקע, ואחריו חמש חרוזי קרמיקה 1.4 מ מ 750 µL אדוארדס מאגר (200 מ מ טריס, pH 8.0, 200 מ"מ NaCl, 25 מ מ EDTA, 0.5% מרחביות) microtube, לערבב היטב.
- דגירה של microtube ב 65 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
- Homogenize הדגימה עם מהמגן מקצף ביצים חרוז 60 s (או על-ידי שימוש ומכתש).
- Centrifuge הדגימה ב g x 14,000 במשך 5 דקות.
- להעביר µL 500 של תגובת שיקוע microtube טריים, ואז מערבבים עם 500 µL של אלכוהול איזופרופיל צוננת. מערבבים על-ידי היפוך הצינור 10 פעמים.
- Centrifuge הדגימה ב g x 14,000 למשך 15 דקות pelletize את ה-DNA.
- Decant את תגובת שיקוע, תנו לאוויר צניפה DNA יבש בטמפרטורת החדר עד האתנול הנותרים התאדו.
- רחץ בגדר DNA עם 750 µL של אתנול 70% צוננת.
- האוויר יבש בגדר לפני השעיית מחדש ב- 50-100 µL טה מאגר (10 מ"מ טריס-HCl, pH 8.0 ו- 1 מ מ EDTA).
-
שיטות אלטרנטיביות אחרות
- לבצע הפקת דנ א. בסיס סיליקה באמצעות ערכת #1 (MP ביו מהר DNA ספין) וערכת #2 (דנ א BIOMICS Zymo Miniprep קיט) בהתאם להנחיות היצרן.
-
CTAB-פנול-כלורופורם המבוסס על שיטות
-
PCR בזמן אמת במעבדה מבוסס קונבנציונלי.
הערה: Thermocycler המקובלת שימש עם mastermix המבוסס על בדיקה PCR, שונים תחל וזונדים oligonucleotide (טבלה 2).- באמצעות PCR bottomed שאינם שקופים צינורות או צלחת PCR, להכין 20 תגובות µL עבור כל דגימות דנ א להיות מנותח, כמו גם שלילי לשלוט (ללא נוקלאז מים יונים), פקד בתבנית חיובית מוכן בתוך הבית.
- עבור כל ה-PCR צינור או. להכין תערובת כולל 10 µL של mastermix, µL 7 של נוקלאז ללא מים יונים, 2 µL של 2 מיקרומטר תחל/בדיקה, µL 1 דנ א (מתוך שלב 1.1.16, או 2.1) או פקד בתבנית עבור דגימה.
- לסגור את המבחנות או צלחת ולהתחיל את התגובה על-ידי בחירת התוכנית PCR המתאימה.
-
ניתוח נתונים של PCR בזמן אמת במעבדה מבוסס קונבנציונלי
- השתמש בתוכנת thermocycler-הקשורים כדי לנתח את תוצאות thermocycler המקובלת. כדי להתחיל ניתוח נתונים, להעביר את קובץ ריצה thermocycler כונן USB, הכנס כונן USB, בחר ייצוא.
- פתח קובץ הנתונים (.pcrd) מ מיוצא להפעיל את התוכנה thermocycler-הקשורים.
- הדגש הבאר של מדגם באמצעות איתור ובתמונה התואמת היטב על המכשיר. הגברה עקומות ועיקולים סטנדרטי (אם ישים) נוצרות באופן אוטומטי. אם המידע מדגם אינה מוזנת, לחץ על הגדרת צלחת או פונקציה דומה כדי להתחיל נתונים קלט לפני ניתוח נתונים.
- הצגת הנתונים בכרטיסיה כמת; זה ניתן לייצא לניתוח נתונים עם תוכנת צד שלישי כגון קוראי קובץ CSV, XML או HTML.
- לקבל נתונים סי המבוססת על הסף שנקבע ולהשוות אותם עם הפקדים חיוביים ושליליים.
הערה: אם הסטנדרטים הדנ א של היעד שימשו וזמינותו, להשוות את הנתונים לדוגמה סי לזה של המידה לקביעת שרשם סי
Representative Results
השוואה בין שיטות הפקת דנ א
התאימות של מגנטיים מבוססי חרוז DNA החילוץ שיטה עם ה-PCR בזמן אמת הוערך על ידי גילוי הכמויות של ה-DNA subterranea ס בדגימת אדמה משדות שורץ את הפתוגן. כפי שמוצג משלימה איור 1, השיטה מבוססת על חרוז מגנטי היה בהשוואה לשיטות אחרות כולל של CTAB-פנול-כלורופורם המבוסס על שיטת18, מהיר DNA הכנה מיני שיטות19,20השני תקן מבוסס-סיליקה DNA ערכות חילוץ. דגימות די אן איי חילוץ באמצעות השיטות השונות שש היו נענשים PCR בזמן אמת במעבדה מבוסס קונבנציונלי. התוצאות הציע שיטת מגנטיים מבוססי חרוז משולה עם השיטות האחרות, למרות מבוסס-סיליקה ערכת חילוץ DNA הראתה את הביצועים הטובים ביותר בין השיטות בדקנו. כל ערכות מכילים guanidinium thiocyanate או guanidinium הידרוכלוריד: שניהם סוכנים chaotropic רב עוצמה, אשר denature רוב החלבונים התאית כולל RNases ו- DNases. לכן, שימוש בשיטות מתאים עקירות הן DNA ו- RNA.
השוואה בין ה-PCR בזמן אמת נייד קונבנציונאלי במעבדה מבוסס בזמן אמת PCR
כדי להשוות את רגישות וסגוליות של ה-PCR נייד קונבנציונאלי במעבדה מבוסס PCR, כימות מוחלטת של המחלה ש-DNA התבצע בעזרת כמויות שונות של הגן ITS subterranea ס , אשר בוצעה על ידי וקטור pGEM-T21 . סדרת דילולים 10-fold של הגן ITS (106 עותקים0 10) נותחו באמצעות ערכת צבעי יסוד/בדיקה22את SsTQ. התוצאות הדגימו כי בשיטת PCR נייד זיהה את הפתוגן יעד ה-DNA (~ 100 עותקים), למרות הרגישות היה 10 פעמים נמוכה יותר במעבדה מבוסס ה-PCR השיטה המקובלת, אשר זוהה לפחות 10 עותקים (איור 2).
עבור אימות נוסף, נבדקו קרקעות באופן מלאכותי שורץ. Sporosori ס subterranea , התקבלו גלד אבקתי עפצים שורש מהשורשים תפוחי אדמה. קרקעות היו שורץ sporosori המתלים-ריכוז סופי של 105 sporosori/g משקל יבש של אדמה. שימוש בשיטת מגנטיים מבוססי-חרוז, דנ א היה שחולצו מן הדגימות. אדמה שורץ, דילולים טורי 10-fold היו מוכנים לקבל ריכוזים שקול ל- 105, 104, 103, 102, 101ו- 100 sporosori/g יבש משקל של אדמה. דגימות ה-DNA שימשו PCR באמצעות SPO פריימר/בדיקה קבע23. התוצאות הראו כי בשיטת PCR נייד יש יכולת אנליטית דומות במעבדה מבוסס ה-PCR שיטה המקובלת אבל, שוב, הרגישות צומצם לפי פקטור של ~ 10 (איור 3).
לבסוף, בדקנו מדגם קרקע מתוך שדה היה מזוהם באופן טבעי עם ס subterranea. החילוץ DNA מגנטיים מבוססי חרוז בוצעה על כמויות שונות של קרקעות (10, 20, 50, 100 מ"ג של הקרקע לכל 500 µL של מיצוי בופר). התוצאות הציע כי המשקל האופטימלי של אדמת כחומר מוצא להפקת DNA היה 50-100 מ"ג (איור 4). כמויות קרקע מחוץ לטווח גרמה לכשל של המדרגות PCR במורד הזרם. אפקט זה יכול להיות כי כאשר כמויות עודפות של אדמת משמשים כמתחילה חומר, מציג (למשל, תרכובות בעל תאים פנוליים) יכולה להפריע ה-PCR24. במקרה של כרכים התחתון של אדמה, כמות ה-DNA שחולץ עשוי להיות נמוך יותר ממגבלת זיהוי של ה-PCR (למשל, את התשואה של סך ה-DNA שחולצו מן הקרקע 10-20 מ"ג היו מגוונים). רגישות היה די דומות בין PCR נייד לבין שיטות PCR קונבנציונליות. תוצאות דומות התקבלו בדגימות ה-DNA על ידי בשיטות חילוץ שונות (משלימה איור 2)
זיהוי של פתוגנים אחרים על-ידי מערכת זיהוי באתר באמצעות ה-PCR בזמן אמת נייד
בדקנו את שיטת ה-PCR נייד כדי לזהות פתוגנים אחרים חשוב קרקע בתפו תפוחי-אדמה, solani ר AG3 ו- PMTV. במחקר זה, נוכל לבצע PCR בזמן אמת באמצעות RsTq תחל/RQP1 בדיקה קבע25 לצורך זיהוי AG3 solani רבי עם ה-DNA מתרבות טהור. אנחנו גם לבצע PCR בזמן אמת באמצעות PMTV-D פריימר/בדיקה קבע26 לגילוי PMTV עם ה-RNA מתוך מדגם פקעת סימפטומטי spraing היה בשימוש. כמוצג באיור5, בשיטת PCR נייד זוהה בהצלחה בשני פתוגנים. התוצאות היו דומות בין הכלים רגיל ויבילים, רומז בשיטת PCR נייד הוא תכליתי וישימים גילויים אחרים הפתוגן אם רצפי פריימר מיועד PCR בזמן אמת זמינים.
איור 1. נוהל של מערכת ה-PCR נייד בזמן אמת לגילוי הפתוגן באתר. הפרוטוקול מורכב מהשלבים לפי הסדר הבא: הכנת lysate על ידי המגון קצרה (א), חומצת גרעין מגנטיים מבוססי חרוז החילוץ (B), PCR בזמן אמת נייד (ג) ניתוח נתונים כמותיים באמצעות מחשב נייד (D). שימו לב כי ניתן להשלים כל השלבים באתר.
איור 2 . השוואה של רגישות בין של PCR נייד של PCR במעבדה מבוסס קונבנציונאלי. כימות לנגיף ה-DNA התבצע בעזרת כמויות שונות של הגן ITS subterranea ס (106 עותקים0 10) עם תחל/החללית SsTQ להגדיר. רגרסיה ליניארית בין ערך יומן של דנ א פלסמיד ס subterranea הדדיים ערך יומן של סי-את thermocycler קונבנציונלי (א) ו את thermocycler נייד (B). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 . השוואה של ביצועי זיהוי בקרקעות באופן מלאכותי שורץ עם ס subterranea. קרקעות היו באופן מלאכותי שורץ (105 כדי 100 sporosori/g יבש משקל של אדמה) עם המתלים sporosori ס subterranea . שימוש בשיטת מגנטיים מבוססי-חרוז, דנ א היה מופק הדגימות. אדמה שורץ. מותני בוצעו באמצעות הדגימות. אדמה עם ערכת בוב ספוג מכנסי פריימר/בדיקה. רגרסיה ליניארית בין יומן כמות ההתחלה ב- sporosori לגרם של אדמת והערך יומן הדדיים של סי-את thermocycler קונבנציונלי (א) ו את thermocycler נייד (B). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 . השוואה של החל כמות דגימות. אדמה להפקת DNA- השיטה מבוססת על חרוז מגנטי שימש להפקת DNA של 10, 20, 50, 100 מ ג של דגימות. אדמה. מותני בזמן אמת בוצעו באמצעות את thermocycler ניידים. עקומות סטנדרטי מייצגים את הקשר בין כמות הדנ א הכולל מופק הדגימות. אדמה (ציר x) את הכמויות של מוצר ה-PCR (ציר y) מוגבר על ידי ערכת פריימר/בדיקה בועז. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5 . זיהוי של פתוגנים אחרים-תפוח אדמה, solani ר , PMTV. מותני בזמן אמת בוצעו באמצעות את thermocycler נייד, את thermocycler קונבנציונלי. Solani ר AG3 התגלה ב- DNA הכולל שחולצו מן התרבות טהור באמצעות תחל RsTq והחללית RQP1 ש-PMTV (א) התגלה ב- RNA הכולל מופק באמצעות דגימה פקעת נגועה PMTV שפריימר PMTV-D/רכב הגישוש להגדיר (ב). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6 . צינור אבחון עבור phytopathogens. תרשים זרימה מראה כללי זרימת עבודה לאבחון phytopathogen. שימו לב כי השלב מסורתיים, כגוןזיהוי חזותי, ניתן להשמיט אם זיהוי מולקולרי באתר מנוצל, מה שהופך את כל התהליך של אבחנה פשוטה ומהירה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| נייד PCR בזמן אמת | PCR בזמן אמת | המנורה | אליסה | זרימה לרוחב | |
| עלות כל יעד התגובה | $0.60-$8.47 | $0.60 | $0.75 | $0.60 | $4.74 |
| רגישות | 100 עותקים | 10 עותקים | 10 עותקים | sporosori 1-1033 1-10 ng/mL (חלבון)33 |
1-10 sporosori34 5 x 10-5-CFU/mL-35 |
| זמן הוצאה | 90 דקות | 80-240 דקות | 50-90 דקות32 | 3-24 שעות | 10-15 דקות |
| צורך בהכנה | מיצוי חומצה ●Nucleic ● עיצוב פריימר |
מיצוי חומצה ●Nucleic ● עיצוב פריימר/בדיקה |
● הפקת חומצה Nucelic ● עיצוב פריימר |
● חלבון החילוץ ● נוגדנים |
N/A |
| חומרים אחרים הנדרשים | ● thermocycler נייד | Thermocycler המקובלת ● | ● Colormetric הכתם ● חממה |
● צלחת קורא ● ציוד כביסה |
N/A |
טבלה 1. תרשים השוואתית של שיטות זיהוי מולקולרי, סרולוגית phytopathogens
| פריימר | רצף (יונקות – 3′) | היעדb | |
| SsTQ-F13 | CCGGCAGACCCAAAACC | ITS1-ITS2 ב subterranea ס | |
| SsTQ-R13 | CGGGCGTCACCCTTCA | ITS1-ITS2 ב subterranea ס | |
| SsTQ-P13 | [FAM] CAGACAATCGCACCCAGGTTCTCATG [TAM] | ITS1-ITS2 ב subterranea ס | |
| Genesig S.subterranea תחל/רכב הגישוש... | N/A | אקטין ב ס subterranea | |
| SPO1014 | GGTCGGTCCATGGCTTGA | ITS ב ס subterranea | |
| SPO1114 | GGCACGCCAATGGTTAGAGA | ITS ב ס subterranea | |
| SPOPRO114 | [FAM] CCGGTGCGCGTCTCTGGCTT [TAM] | ITS ב ס subterranea | |
| RsTqF119 | AAGAGTTTGGTTGTAGCTGGTCTATTT | ITS1-ITS2 ב solani רבי | |
| RsTqR119 | AATTCCCCAACTGTCTCACAAGTT | ITS1-ITS2 ב solani רבי | |
| RQP119 | [FAM] TTTAGGCATGTGCACACCTCCCTCTTTC [TAM] | ITS1-ITS2 ב solani רבי | |
| פריימר Genesig PMTV/בדיקה | N/A | CP-RT ב- PMTV | |
| PMTV-D-F20 | AGAATTGRCATCGAAACAGCA | CP ב- PMTV | |
| PMTV-D-R20 | GTCGCGCTCCAATTTCGTT | CP ב- PMTV | |
| PMTV-D-P20 | [FAM] CCACAAACAGACAGGTATGGTCCGGAA [TAM] | CP ב- PMTV | |
| . Oligo DNA תחל שונו עם המשפחה (6-carboxyfluorescein) או טאם (5-carboxytetramethylrhodamine) | |||
| b ITS: מפרידי משועתקים פנימי, CP: מעיל חלבון; CP-RT: המעיל חלבון readthrough | |||
בטבלה 2. תחל השתמשו במחקר זה
משלים איור 1. השוואה בין שיטות הפקת דנ א לאיתור המחלה גלד אבקתי. שישה DNA החילוץ שיטות שונות (A-F) הושוו איתור המחלה גלד אבקתי, ס subterranea דגימות קרקע. (B, D, F). ה-DNA שהופק באמצעות ערכת מבוסס-סיליקה #1 (ראה טבלה של החומרים עבור כל ערכת שמות), מבוסס-סיליקה ערכת #2, וערכת מגנטיים מבוססי-חרוז, repsectively. PCR בוצעה באמצעות thermocycler PCR קונבנציונאלי המבוסס על המעבדה. עקומות סטנדרטי מייצגים את הקשר בין כמות הדנ א הכולל מופק הדגימות. אדמה וכמויות של מוצר ה-PCR מוגבר על ידי ערכת צבעי יסוד/בדיקה SsTQ. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הדמות הזו.
משלים באיור 2. השוואה של המגבלה של זיהוי בין של PCR נייד קונבנציונאלי במעבדה מבוסס ה-PCR. DNA הכולל הופרדה מרשת דגימת אדמה בשיטות חילוץ שונות שלושה: (A, B) דויל שיטה, (C, D) ערכת מבוסס-סיליקה #2, ו- (E, F) ערכת מגנטיים מבוססי חרוז. גרפים המוצג בצד השמאל הם נתונים באמצעות את thermocycler נייד עם ערכת צבעי יסוד/בדיקה Sss, בעוד הגרפים על הזכות לייצג נתונים שנוצר באמצעות את thermocycler במעבדה מבוסס קונבנציונאלי עם תחל/החללית SsTQ להגדיר. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הדמות הזו.
Discussion
כפי שמוצג בטבלה 1, ההתקדמות הטכנולוגית האחרונות בזיהוי מולקולרית של סוכני פתוגניים הגדילו את יעילות, דיוק ומהירות של אבחון, אשר תרמו הגילוי של זיהומים מראש סימפטומטי27. לגבי האבחון באתר, המנורה ושיטות זרימת לרוחב משמשים לעתים קרובות כי הם ניידים, מספקים תוצאות מיידיות במחיר נמוך יותר. עם זאת, במקרה של שיטות סרולוגית, תלויי מין הזיהוי יהיה קשה להשיג. זה לפעמים גורם misdetection של חופש-יעד חיידקים כגון תושבים קרקע משותפת. לדוגמה, יכול להיות תגובתיות לחצות בין הבדיקות סרולוגית של כימשון spp. Pythium spp. במקרה של תפוחי אדמה פתוגנים28, המציין כי לפעמים ישנם קשיים בזיהוי הצמח יישוב פתוגנים.
במחקר הנוכחי, פיתחנו פרוטוקול ממוטבת לזיהוי מולקולרי באתר של פתוגנים קרקע בתפו תפוחי אדמה באמצעות מערכת ה-PCR נייד בזמן אמת על-ידי השוואת היכולות שלה עם זה של קונבנציונאלי המעבדה בזמן אמת PCR מערכת מבוססת. מצאנו כי השיטה באתר מזהה במיוחד פתוגנים תפוחי האדמה בדוגמת אדמה, אמנם רגישות ~ פי 10 יותר נמוך מזה של assay המקבילה במעבדה מבוסס. זה גם שווה לשקול כי במקרה זה מבחן מעבדה והן שדה לא השתמש גודל דגימה ביולוגית רלוונטית. מדגמים גדולים נדרשים לשימוש שגרתי הקרנת קרקעות השדה כפי שתואר לעיל29,30, שבו גודל מדגם של בין 250 גרם עד 1 ק ג מעובדים, אף על פי שיטות אלו דורשות מפעילים מיומנים, מתוחכם ציוד כדי לחלץ את הדנ א. בדרך כלל, קרקע בקנה מידה גדול DNA לחלץ נלקח נציג דגימת קרקע צבירה אחת של subsamples רבים על דונם 1 עד 4-6,-29,-30. עם זאת, פרוטוקול פותח כאן היא מהירה, קלה לשימוש עבור משתמשים ללא ניסיון קודם באבחון מולקולרי והוא יכול לשמש מחוץ למעבדה. כמו השיטה הוא מהיר וזול יחסית בהשוואה החילוץ אדמה בקנה מידה גדול, זה יכול לשמש למסך הרבה דוגמאות בקנה מידה קטן מאזור דגימה דומה לקחת דגימות צבירה בקנה מידה גדול. זה יכול להתגבר על חלק מן הליקויים של גודל מדגם קטן, לברר פרטים נוספים על התפלגות מרחבית של המחלה בשטח. בנוסף, ניידות ואת המהירות של השיטה אומר כי זה יכול לשמש גם בפעילות הדגמה כדי מגדלי עבור חינוך ומטרות האירוסין.
שיקול נוסף הוא כי מבחני ה-PCR בזמן אמת רבות מתפרסמות כבר למגוון רחב של פתוגנים צמח5. מערכת זו יכולים לעשות שימוש אלה מבחני קיימת ללא הצורך לעצב תחל מנורה חדשה כדי לאפשר בבדיקת שדה. ביקורת בתדירות גבוהה על מבחני המנורה היא כי הם יכולים להיות קשה לעצב31. PCR נייד, לכן, מאפשר מימוש מגוון רחב של בדיקות הפתוגן זמינים באתר בדיקה קלה יחסית.
שיטות מסורתיות ניתן לעיתים קרובות יקר, מפרך, לא מדויק, וארוך. הפשטות של השיטה באתר שפיתחנו מאפשרת למגדלי ועובדי התעשייה לבצע זיהוי הפתוגן בכוחות עצמם ולהפיק אולי תוצאה הרבה יותר מהיר מאשר לשלוח למעבדה אבחון זה יכול להיות במרחק. Promptness של הרגישות של שיטת ה-PCR נייד יכול לעזור למגדלי להימנע פוטנציאל זיהומים משניים, אשר יכול לקדם הגדל של האוכלוסייה הפתוגן, מכוונת (דרך ציוד או בני אדם). לסיכום, שיטת באתר שפותחו במחקר הנוכחי מאפשר זיהוי מדויק ורגיש יחסית חשוב נישאי בשטח. תקוותנו היא כי השיטה באתר שפותחו במחקר זה יתרום בצבר אבחון הנוכחי (איור 6), לא רק על-ידי מתן מהיר ומדויק של תשובות לשאלות אפידמיולוגיים אודות מחלות בשטח, אלא גם על ידי מתן הבנה מוגברת של ביולוגיה, אפידמיולוגיה של פתוגנים צמח.
Disclosures
המחברים מצהירים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
אנו מודים על ד ר ניל Gudmestad ג באוניברסיטת צפון דקוטה על מתן subterranea ס פלסמיד ה-DNA, ד ר Hanu פופו ב אוניברסיטת מדינת וושינגטון (WSU) למתן PMTV RNA, ד ר Inglis דברה-WSU למתן solani ר AG3. תודה ד ר ג'רמי ג'ול-WSU מיוחדת על מתן הערות על היד ועל WSU CAHNRS תקשורת עבור צילום וידאו. מחקר זה נתמך על ידי האיחוד מחקר תפוחי אדמה מערב וושינגטון המדינה משרד החקלאות - המומחיות חיתוך בלוק גרנט תוכנית (מענק. לא. K1764). המכללה PPNS מס 0741, המחלקה לפתולוגיה של צמחים, החקלאות, משאב אנושי וטבעי למדעים, מרכז המחקר החקלאי, פתח פרוייקט מס WNP00833, וושינגטון סטייט, פולמן, WA, ארצות הברית.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| White shell PCR plate | Bio-Rad | HSP9601 | |
| CFX Manager | Bio-Rad | 1845000 | |
| SsoAdvanced Universal Probes Supermix | Bio-Rad | 1725280 | |
| CFX96 Touch qPCR instrument | Bio-Rad | 1855195 | |
| Ethylalcohol, pure 200 proof | Decon Laboratories | 04-355-222 | |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) | Fisher BioReagents | BP118-500 | |
| Phenol, Saturated | Fisher BioReagents | BP1750I-400 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Fisher BioReagents | BP152-5 | |
| q16 real-time PCR machine | genesig | MBS486001 | |
| Ultrapure Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Invitrogen | 15525-017 | |
| 2-Propanol (Isopropanol) | JT Baker | 67-63-0 | |
| Chloroform | JT Baker | 9180-03 | |
| Hydrochloric Acid, 36.5-38.0% (HCl) | JT Baker | 9535-03 | |
| iso-Amyl Alcohol | JT Baker | 9038-01 | |
| FastDNA Spin kit | MP Biomedicals | 6560-200 | Silica-based DNA extraction kit #1 |
| Luna Universal One-Step RT-qPCR Kit | New England Biolabs | E3005S | |
| 0.1ml Low Profile Individual PCR Tubes | Phenix Research | MPC-100LP | |
| Easy DNA/RNA Extraction Kit | Primerdesign | genesigEASY-EK | |
| genesig Easy 1.5 mL tubes | Primerdesign | genesigEASY-1.5 | |
| Magnetic tube rack | Primerdesign | genesigEASY-MR | |
| Spongospora subterranea f. sp. subterranea genesig Easy Kit | Primerdesign | Path-S.subterranea-EASY | |
| Hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) | Sigma-Aldrich | H6269-100G | |
| Pellet pestles | Thermo Fisher Scientific | 12-141-364 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Thermo Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| DNA Miniprep kit | ZymoBIOMICS | D4300 | Silica-based DNA extraction kit #2 |
References
- Malcolm, G. M., Kuldau, G. A., Gugino, B. K., Jiménez-Gasco, M. delM. Hidden Host Plant Associations of Soil-borne Fungal Pathogens: An Ecological Perspective. Phytopathology. 103 (6), 538-544 (2013).
- Posthuma-Trumpie, G. A., Korf, J., van Amerongen, A. Lateral flow (immuno)assay: its strengths, weaknesses, opportunities and threats. A literature survey. Anal Bioanal Chem. 393 (2), 569-582 (2009).
- Hill, J., et al. Loop-Mediated Isothermal Amplification Assay for Rapid Detection of Common Strains of Escherichia coli. J Clin Microbiol. 46 (8), 2800-2804 (2008).
- Mumford, R. A., Walsh, K., Barker, I., Boonham, N. Detection of Potato mop top virus and Tobacco rattle virus Using a Multiplex Real-Time Fluorescent Reverse-Transcription Polymerase Chain Reaction Assay. Phytopathology. 90 (5), 448-453 (2000).
- Schena, L., Nigro, F., Ippolito, A., Gallitelli, D. Real-time quantitative PCR: a new technology to detect and study phytopathogenic and antagonistic fungi. European Journal of Plant Pathology. 110 (9), 893-908 (2004).
- Brierley, J. L., Stewart, J. A., Lees, A. K. Quantifying potato pathogen DNA in soil. Applied Soil Ecology. 41 (2), 234-238 (2009).
- Tomlinson, J. A., Boonham, N., Hughes, K. J. D., Griffin, R. L., Barker, I. On-Site DNA Extraction and Real-Time PCR for Detection of Phytophthora ramorum in the Field. Appl Environ Microbiol. 71 (11), 6702-6710 (2005).
- Harrison, J. G., Searle, R. J., Williams, N. A. Powdery scab disease of potato - a review. Plant Pathology. 46 (1), 1-25 (1997).
- Johnson, D. A., Miliczky, E. R. Distribution and development of black dot, Verticillium wilt, and powdery scab on Russet Burbank potatoes in Washington State. Plant Disease. 77 (1), 74-79 (1993).
- Merz, U. Powdery Scab of Potato-Occurrence, Life Cycle and Epidemiology. Am J Pot Res. 85 (4), 241 (2008).
- Jones, R. aC., Harrison, B. D. The behaviour of potato mop-top virus in soil, and evidence for its transmission by Spongospora subterranea (Wallr). Lagerh. Annals of Applied Biology. 63 (1), 1-17 (1969).
- Carnegie, S. F., Davey, T., Saddler, G. S. Effect of temperature on the transmission of Potato mop-top virus from seed tuber and by its vector, Spongospora subterranea. Plant Pathology. 59 (1), 22-30 (2010).
- Woodhall, J. W., Adams, I. P., Peters, J. C., Harper, G., Boonham, N. A new quantitative real-time PCR assay for Rhizoctonia solani AG3-PT and the detection of AGs of Rhizoctonia solani associated with potato in soil and tuber samples in Great Britain. Eur J Plant Pathol. 136 (2), 273-280 (2013).
- Banville, G. J. Yield losses and damage to potato plants caused by Rhizoctonia solani Kuhn. American Potato Journal. 66 (12), 821-834 (1989).
- Crosslin, J. M. First Report of Potato mop-top virus on Potatoes in Washington State. Plant Disease. 95 (11), 1483-1483 (2011).
- Whitworth, J. L., Crosslin, J. M. Detection of Potato mop top virus (Furovirus) on potato in southeast Idaho. Plant Disease. 97 (1), 149-149 (2012).
- Kaur, N., Cating, R. A., Dung, J. K. S., Frost, K. E., Robinson, B. A., Hamm, P. B. First Report of Potato mop-top virus Infecting Potato in Oregon. Plant Disease. 100 (11), 2337 (2016).
- Doyle, J. J. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus. 12, 13-15 (1990).
- Dellaporta, S. L., Wood, J., Hicks, J. B. A plant DNA minipreparation: Version II. Plant Mol Biol Rep. 1 (4), 19-21 (1983).
- Edwards, K., Johnstone, C., Thompson, C. A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis. Nucleic Acids Research. 19 (6), 1349 (1991).
- Bittara, F. G., Secor, G. A., Gudmestad, N. C. Chloropicrin Soil Fumigation Reduces Spongospora subterranea Soil Inoculum Levels but Does Not Control Powdery Scab Disease on Roots and Tubers of Potato. Am J Potato Res. 94 (2), 129-147 (2017).
- van de Graaf, P., Lees, A. K., Cullen, D. W., Duncan, J. M. Detection and Quantification of Spongospora subterranea in Soil, Water and Plant Tissue Samples Using Real-Time PCR. European Journal of Plant Pathology. 109 (6), 589-597 (2003).
- Maldonado, H., Falloon, R. E., Butler, R. C., Conner, A. J. Spongospora subterranea root infection assessed in two potato cultivars differing in susceptibility to tuber powdery scab. Plant Pathology. 62 (5), 1089-1096 (2013).
- Braid, M. D., Daniels, L. M., Kitts, C. L. Removal of PCR inhibitors from soil DNA by chemical flocculation. Journal of Microbiological Methods. 52 (3), 389-393 (2003).
- Lees, A. K., Cullen, D. W., Sullivan, L., Nicolson, M. J. Development of conventional and quantitative real-time PCR assays for the detection and identification of Rhizoctonia solani AG-3 in potato and soil. Plant Pathology. 51 (3), 293-302 (2002).
- Davey, T., Carnegie, S. F., Saddler, G. S., Mitchell, W. J. The importance of the infected seed tuber and soil inoculum in transmitting Potato mop-top virus to potato plants. Plant Pathol. 63 (1), 88-97 (2014).
- Boonham, N., et al. Methods in virus diagnostics: From ELISA to next generation sequencing. Virus Research. 186, 20-31 (2014).
- Mohan, S. B. Cross-reactivity of antiserum raised against Phytophthora fragariae with other Phytophthora species and its evaluation as a genus-detecting antiserum. Plant Pathology. 38 (3), 352-363 (1989).
- Ophel-Keller, K., McKay, A., Hartley, D., Curran Herdina, J. Development of a routine DNA-based testing service for soil-borne diseases in Australia. Austral Plant Pathol. 37 (3), 243-253 (2008).
- Woodhall, J. W., et al. A new large-scale soil DNA extraction procedure and real-time PCR assay for the detection of Sclerotium cepivorum in soil. Eur J Plant Pathol. 134 (3), 467-473 (2012).
- Miles, T. D., Martin, F. N., Coffey, M. D. Development of Rapid Isothermal Amplification Assays for Detection of Phytophthora spp in Plant Tissue. Phytopathology. 105 (2), 265-278 (2014).
- Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 28 (12), e63-e63 (2000).
- Narayanasamy, P. Microbial Plant Pathogens: Detection and Management in Seeds and Propagules. , John Wiley & Sons. (2016).
- Braun-Kiewnick, A., Altenbach, D., Oberhänsli, T., Bitterlin, W., Duffy, B. A rapid lateral-flow immunoassay for phytosanitary detection of Erwinia amylovora and on-site fire blight diagnosis. Journal of Microbiological Methods. 87 (1), 1-9 (2011).
