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ऑन-साइट एक पोर्टेबल रीयल-टाइम पीसीआर सिस्टम का उपयोग करके मिट्टी जनित Phytopathogens का आणविक पता लगाना

Published: February 23, 2018 doi: 10.3791/56891
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 1, 1
1Department of Plant Pathology, Washington State University, 2Parma Research and Extension Center, University of Idaho

Summary

तेजी से और सही पता लगाने के संयंत्र के रोगजनकों पर साइट, विशेष रूप से मिट्टी जनित रोगजनकों, आगे इनोक्युलम उत्पादन और क्षेत्र में संयंत्र रोगों के प्रसार को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है । एक पोर्टेबल वास्तविक समय पीसीआर का पता लगाने प्रणाली का उपयोग कर यहां विकसित विधि क्षेत्र की स्थितियों के तहत साइट निदान पर सक्षम बनाता है ।

Abstract

पर-संयंत्र रोगों के निदान रोग प्रबंधन रणनीतियों है कि रोग के प्रभाव को कम करने के पहले कार्यांवयन को सक्षम करने के लिए समय पर निर्णय के लिए उत्पादकों के लिए एक उपयोगी उपकरण हो सकता है । वर्तमान में कई नैदानिक प्रयोगशालाओं में, पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर), विशेष रूप से वास्तविक समय पीसीआर, संयंत्र रोगज़नक़ का पता लगाने के लिए सबसे अधिक संवेदनशील और सटीक तरीका माना जाता है । हालांकि, प्रयोगशाला आधारित पीसीआर आम तौर पर महंगी प्रयोगशाला उपकरण और कुशल कर्मियों की आवश्यकता है । इस अध्ययन में, आलू की मिट्टी जनित रोगजनकों पर साइट आणविक पता लगाने के लिए क्षमता का प्रदर्शन किया जाता है । यह चुंबकीय मनका आधारित न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण, पोर्टेबल वास्तविक समय पीसीआर (fluorogenic जांच आधारित परख) के शामिल एक तेजी से और सरल प्रोटोकॉल का उपयोग कर हासिल किया गया था । पोर्टेबल वास्तविक समय पीसीआर दृष्टिकोण एक प्रयोगशाला आधारित प्रणाली, के रूप में कुछ के रूप में Spongospora subterranea से डीएनए की १०० प्रतियां का पता लगाने के साथ तुलना में । पोर्टेबल रीयल-टाइम पीसीआर विधि यहां विकसित प्रयोगशाला आधारित दृष्टिकोण के लिए एक विकल्प के रूप में सेवा कर सकते है और एक उपयोगी पर रोगज़नक़ निदान के लिए साइट उपकरण ।

Introduction

रोगज़नक़ों की सटीक और तेजी से पहचान काफी प्रभाव संयंत्र रोग प्रबंधन के बारे में निर्णय । मृदा जनित रोगों का निदान करना विशेष रूप से कठिन होता है क्योंकि मिट्टी का वातावरण पौधा द्रव्यमान के सापेक्ष अत्यंत बड़ा होता है, और जटिल होता है, जिससे मृदा जनित रोगों के सभी पहलुओं को समझने की चुनौती प्राप्त होती है । इसके अलावा, मिट्टी जनित रोग प्रारंभिक संक्रमण चरणों के दौरान, पर्यावरणीय तनावों पर निर्भर हो सकता है, और कुछ लंबे समय तक अव्यक्त है कि देरी निदान में परिणाम है1। कई मिट्टी जनित रोगजनकों ने जीवित संरचनाओं को विकसित किया है, जैसे कि विशेष बीजाणु या melanized hyphae, जो कई वर्षों तक मिट्टी में भी अपने मेजबानों के अभाव में जीवित रह सकते हैं । मिट्टी जनित रोग प्रबंधन के लिए उपयोग किए गए तरीकों में शामिल हैं: ज्ञात संक्रमित खेतों से परहेज, रोगज़नक़ मुक्त प्रमाणित बीज और अंकुर का उपयोग, उपकरण सैनिटरी रखने, और मिट्टी और पानी की आवाजाही को प्रतिबंधित जब संभव हो । आणविक खोज रणनीतियों के माध्यम से रोगज़नक़ उपस्थिति का ज्ञान भी समय पर जल्दी चरण उपचार या खेतों के पूर्व संयंत्र आकलन के बारे में निर्णय सूचित करके एक उपयोगी भूमिका निभा सकते हैं । पर साइट परीक्षण एक नैदानिक प्रयोगशाला है कि शायद कुछ दूर दूरी के लिए नमूना भेजने के बिना एक तेजी से परिणाम प्रदान करने के अतिरिक्त लाभ प्रदान करता है और भी अगर इस तरह के एक नैदानिक प्रदर्शन किया जाता है ' क्षेत्र की ओर ' उनकी उपस्थिति में शामिल कर सकते हैं ।

आणविक पता लगाने, संवेदनशीलता, विशिष्टता, मजबूती (दोहराव और reproducibility) के आधार पर साइट निदान के लिए, और दक्षता (यानी, सादगी और लागत प्रदर्शन) विचार के लिए महत्वपूर्ण कारक हैं । पार्श्व प्रवाह उपकरणों (LFDs) ऐसे Immunostrip और PocketDiagnostic के रूप में, पर साइट के लिए लोकप्रिय तरीके है क्योंकि उनकी सादगी के एक कदम परख के रूप में रोगज़नक़ का पता लगाने । हालांकि, LFDs सभी स्थितियों में सही निदान उपकरण नहीं हो सकता है क्योंकि वे संवेदनशीलता और विशिष्टता की कमी है, और कभी कभार अस्पष्ट परिणाम प्रदान करता है अगर लक्ष्य रोगज़नक़ कम सांद्रता में है और समान प्रजातियों या पीढ़ी के साथ परस्पर प्रतिक्रिया कर सकते हैं 2. लूप मध्यस्थता इज़ोटेर्माल प्रवर्धन (लैंप) भी पर साइट रोगज़नक़ का पता लगाने के लिए लागू है और विशेष रूप से कम लागत वाले रिएजेंट, प्रतिक्रिया शर्तों है कि लगातार रहने के कारण सस्ती है, और सरल वर्णमिति दृश्य विश्लेषण । हालांकि, दोनों LFDs और दीपक आम तौर पर गुणात्मक उपयोग किया जाता है, हालांकि दोनों दृष्टिकोण मात्रात्मक अधिक महंगा उपकरण3के साथ उपयोग किया जा सकता है । पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) उच्च विशिष्टता, उच्च संवेदनशीलता, और पता लगाने के aforementioned तरीकों की तुलना में एक मात्रात्मक क्षमता प्रदान करता है । हालांकि, पारंपरिक प्रयोगशाला आधारित पीसीआर प्रौद्योगिकी महंगी प्रयोगशाला उपकरण और कुशल कर्मियों की आवश्यकता है, जो इस प्रौद्योगिकी को साइट के प्रयोजनों के लिए एक पहचान पद्धति के रूप में अपनाने में एक प्रमुख नुकसान है ।

इस प्रोटोकॉल में, एक पोर्टेबल रीयल-टाइम पीसीआर इंस्ट्रूमेंट का उपयोग करके साइट पर नैदानिक विधि प्रदर्शित की जाती है । वास्तविक समय पीसीआर प्रौद्योगिकी मात्रात्मक सटीकता, संवेदनशीलता, और बहुमुखी प्रतिभा के मामले में अंय तरीकों से अधिक लाभ प्रदान करता है, और व्यापक रूप से संयंत्र की एक व्यापक रेंज का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया है रोगजनकों4,5, सहित विभिंन 6मिट्टी में आलू रोगजनकों । तेजी से बढ़ रहा है, प्रतिस्पर्धी बाजार के हाल के रुझान के कारण, पीसीआर प्रौद्योगिकी के लिए आवश्यक उपकरणों के लिए और अधिक कॉंपैक्ट और कम महंगा7विकसित करने के लिए जारी रखा है । प्रोटोकॉल निम्नलिखित चरणों से बना है: चुंबकीय मनका-आधारित न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण, पोर्टेबल वास्तविक समय पीसीआर (fluorogenic जांच आधारित परख), और मात्रात्मक डेटा विश्लेषण है कि सब कुछ दूर से किया जा सकता है एक लैपटॉप कंप्यूटर का उपयोग कर (चित्रा 1) ।

यहां विकसित पोर्टेबल पीसीआर प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, मिट्टी जनित रोगज़नक़, Spongospora subterraneaका पता लगाने के लिए मिट्टी के नमूनों का विश्लेषण किया गया । Spongospora के रूप में यह पाउडर पपड़ी8के कारण एजेंट के रूप में एक महत्वपूर्ण आलू रोगज़नक़ है चुना गया था । हाल के दशकों में, इस रोग की उपस्थिति कई क्षेत्रों में फैल गया है, जहां आलू9,10उगाया जाता है माना जाता है । कंद पर घावों की तरह दाना की उपस्थिति के माध्यम से पाउडर पपड़ी, आलू उत्पादकों के लिए काफी गुणात्मक उपज नुकसान हो सकता है । इसके अलावा, एस subterranea वेक्टर आलू रिटॉप वायरस (सॐवा), जो कंद (spraing के रूप में जाना जाता है) में आंतरिक घावों के लक्षण पैदा कर सकता है11,12। इसलिए, यदि S. subterranea 6रोपण से पहले खेतों में मौजूद है पता करने के लिए महत्वपूर्ण है । हम भी Rhizoctonia सोलानी सम्मिलन समूह 3 (AG3) और सॐवा का पता लगाने के लिए इस प्रोटोकॉल की उपयोगिता प्रदर्शित करते हैं । हालांकि Rhizoctonia सोलानी के कई सम्मिलन समूहों आलू में रोगों के कारण, AG3 यकीनन सबसे महत्वपूर्ण दुनिया भर में13है, जिससे स्टेम नासूर और काले स्कर्फ़ के लिए 30%14तक की विपणन उपज घाटे में जिसके परिणामस्वरूप । सॐवा कंद के भीतर गल घावों का कारण बनता है, जिसे सामान्यतः spraing कहा जाता है । यह वायरस हाल ही में प्रशांत पश्चिमोत्तर15,16,17में कई राज्यों में पहली बार के लिए रिपोर्ट किया गया है, और इस महत्वपूर्ण आलू उगाने वाले क्षेत्र में उत्पादकों के लिए बढ़ती चिंता का विषय है । इन महत्वपूर्ण रोगों के लिए पोर्टेबल पीसीआर की प्रभावशीलता का निर्धारण करने के अलावा, इष्टतम डीएनए निष्कर्षण पद्धति और मृदा नमूना आकार भी इस अध्ययन में जांच की गई ।

परिणाम सुझाव है कि पोर्टेबल पीसीआर विधि बहुमुखी और अलग रोगजनकों का पता लगाने के लिए लागू है । हम विकसित पर साइट का पता लगाने की विधि कृषि में सीमावर्ती श्रमिकों (जैसे, उत्पादकों) रोग प्रबंधन के बारे में पहले निर्णय लेने के लिए अनुमति दे सकते हैं, इस तरह के प्रकार चयन या घुमाव के रूप में, और नमूने में एक संयंत्र रोगज़नक़ मात्रा कर सकते हैं एक क्षेत्र सर्वेक्षण के दौरान, रोपण से पहले, संभावित बीमारी फैलने से बचने के लिए ।

Protocol

1. पर साइट एक पोर्टेबल वास्तविक समय पीसीआर प्रणाली का उपयोग रोगजनकों के आणविक पता लगाने

नोट: चित्र 1देखें ।

  1. चुंबकीय मनका आधारित डीएनए निष्कर्षण
    नोट: एक चुंबकीय मनका आधारित डीएनए निष्कर्षण किट (जैसे Primerdesign से) निर्माता के निर्देशों के अनुसार इस्तेमाल किया गया था । सभी एजेंट कमरे के तापमान (18-25 डिग्री सेल्सियस) पर संग्रहित किया जाना चाहिए । एक बार lyophilized Proteinase K (बोतल नंबर 1) निलंबित कर दिया है (बोतल no. 1a का उपयोग), पर स्टोर-20 ° c.
    1. मिश्रण 20-50 एक microtube में नमूना तैयारी समाधान के ५०० µ एल के साथ मिट्टी के नमूने के मिलीग्राम ।
      नोट: मिट्टी का अनुपात: प्रस्तुत समाधान अन्य अनुपात में उन्हें मिश्रण के रूप में महत्वपूर्ण है बहाव प्रयोगों की विफलता का कारण हो सकता है (जैसे, पीसीआर के अवरोधकों द्वारा संक्रमण).
    2. एक छोटे से बाँझ खल का उपयोग कर ट्यूब के तल पर मिट्टी पीस जब तक समाधान बादल है । इसके अलावा microtube मिलाते हुए समाधान में मिट्टी के कणों को निलंबित और इसे खड़े हो जाओ, परेशान, जाने के लिए मिट्टी के कणों को पूरी तरह से व्यवस्थित (आमतौर पर 5 से 10 मिनट के बीच).
    3. एक ताजा microtube में supernatant के २०० µ एल स्थानांतरण और Lysis बफर के २०० µ एल जोड़ें (बोतल नंबर 2: Guanidine हाइडरोक्लॉराइड समाधान) और µ कश्मीर के 20 Proteinase एल (बोतल नंबर 1) ।
    4. 15 मिनट के लिए परिवेश के तापमान पर ट्यूब और मशीन औंधा द्वारा अच्छी तरह से lysate मिश्रण ।
      नोट: यदि lysate microtube ढक्कन पर पाया जाता है, ट्यूब नल या एक केंद्रापसारक का उपयोग करें, अगर ढक्कन से हटाने के लिए उपलब्ध है ।
    5. जोड़ें ५०० µ बाइंडिंग बफर के एल/चुंबकीय मनका मिश्रण (बोतल No .3) लीजड ड नमूना है । pipetting ऊपर और नीचे और चुंबकीय ट्यूब रैक से 5 मिनट दूर के लिए परिवेश के तापमान पर गर्मी से अच्छी तरह से मिश्रण ।
      नोट: सुनिश्चित करें कि मोतियों का भंडारण बोतल से समान रूप से aliquoted रहे है उपयोग करने से पहले मनका समाधान अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए सुनिश्चित कर लें ।
    6. चुंबकीय ट्यूब रैक पर microtube प्लेस । microtube में सभी मोतियों को चुंबकीय पक्ष की दीवार करने के लिए देते हैं जब तक कम से कम 2 मिनट या रुको । फिर, निकालें और supernatant के सभी pipetting द्वारा त्यागें ।
      नोट: जबकि हटाने और supernatant aspirating चुंबकीय मोती परेशान मत करो । डीएनए अब चुंबकीय मोतियों से कब्जा कर लिया गया है ।
    7. चुंबकीय ट्यूब रैक से microtube निकालें, धोने बफर के ५०० µ एल जोड़-1 (बोतल No .4: सोडियम perchlorate/इथेनॉल समाधान) और फिर से दोहराया pipetting द्वारा मोतियों को फिर से निलंबित जब तक मोती समान रूप से फैलाया जाता है । इस धुलाई कदम के नमूने से प्रोटीन और नमक हटाने के लिए प्रदर्शन करते हैं । मिश्रण 30 एस के लिए बैठते हैं ।
    8. दोहराएँ चरण 1.1.6.
    9. चुंबकीय ट्यूब रैक से microtube निकालें, धोने बफर के ५०० µ एल जोड़-2 (बोतल No .5: सोडियम perchlorate/इथेनॉल समाधान) और फिर से दोहराया pipetting द्वारा मोतियों को स्थगित जब तक मोती समान रूप से फैला रहे हैं । मिश्रण 30 एस के लिए बैठते हैं ।
    10. दोहराएँ चरण 1.1.6.
    11. चुंबकीय ट्यूब रैक से microtube निकालें और फिर ८०% इथेनॉल (बोतल नंबर 6) के ५०० µ एल जोड़ें ।
      नोट: यह कदम नमूने से अवशिष्ट लवण को हटाने के लिए आवश्यक है ।
      1. फिर से दोहराया pipetting द्वारा मोतियों को निलंबित जब तक मोती समान रूप से फैलाया जाता है । कभी उलटा द्वारा मिश्रण के साथ 10 मिनट के लिए इस खड़े चलो ।
    12. दोहराएँ चरण 1.1.6.
    13. हवा microtube ढक्कन खुला के साथ परिवेश के तापमान पर 10 मिनट के लिए चुंबकीय मनका गोली सूखी ।
      नोट: मोती किसी भी दिखाई अवशिष्ट इथेनॉल से मुक्त होना चाहिए, लेकिन बाहर पूरी तरह से सूख नहीं ।
    14. चुंबकीय ट्यूब रैक से microtube निकालें, 50-200 µ के रेफरेंस बफर के एल जोड़ें (बोतल No .7) और फिर से दोहराया pipetting द्वारा मोतियों को स्थगित जब तक मोती समान रूप से फैलाया जाता है और इसे 30 एस के लिए खड़े हो जाओ ।
      नोट: उपरोक्त चरणों में शुद्ध डीएनए को चुंबकीय मोतियों से रेफरेंस बफर में जारी किया जाता है ।
    15. चुंबकीय ट्यूब रैक पर microtube प्लेस । microtube में सभी मोतियों को चुंबकीय पक्ष की दीवार करने के लिए देते हैं जब तक कम से कम 2 मिनट या रुको ।
    16. supernatant कि अब बहाव चरणों में उपयोग के लिए एक ०.५ मिलीलीटर microtube के लिए शुद्ध डीएनए/
  2. पोर्टेबल वास्तविक समय पीसीआर
    नोट: एक पोर्टेबल thermocycler और पीसीआर परख किट निर्माता के निर्देशों के अनुसार इस्तेमाल किया गया ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
    1. thermocycler-संबद्ध सॉफ़्टवेयर खोलें और चलाएं, लक्ष्य डिटेक्शन परीक्षण और इनपुट सभी विवरण जानकारी को नाम & विवरण, नोट्स, नमूने, और परीक्षण डेटा प्रविष्टि फ़ील्ड में चुनें ।
      नोट: वेल्स #1 और #2 नकारात्मक नियंत्रण और सकारात्मक नियंत्रण के लिए सॉफ्टवेयर द्वारा क्रमशः नामित कर रहे हैं ।
    2. प्रयोग करने से पूर्व पीसीआर रिएजेंट तैयार करें । स्थानांतरण ५०० µ के एल मास्टर मिक्स पुनः निलंबन बफर ट्यूब में lyophilized मास्टर मिश्रण युक्त है और उलटा द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण । पूरे मास्टर मिश्रण को ब्राउन microtube में ट्रांसफर कर लें लेबल प्राइमरों/जांच (तालिका 2) ।
      1. टोपी और मिश्रण करने के लिए microtube हिला । पूरी तरह से सभी घटकों फिर से निलंबित कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए पूरी तरह से मिश्रण की आवश्यकता है. इस मिश्रण का उपयोग करने से पहले 5 मिनट के लिए बैठते हैं ।
        नोट: उपयोग के बाद-20 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया मिश्रण स्टोर.
    3. ०.२ मिलीलीटर पीसीआर ट्यूब में पिछले कदम से तैयार प्रतिक्रिया मिश्रण के 10 µ एल स्थानांतरित करके एक नकारात्मक नियंत्रण तैयार करने और फिर बाँझ nuclease मुक्त जल के 10 µ एल जोड़ें ।
    4. एक ०.२ एमएल पीसीआर ट्यूब में 1.2.2 कदम से तैयार प्रतिक्रिया मिश्रण के 10 µ एल स्थानांतरित करके एक सकारात्मक नियंत्रण तैयार करने और फिर सकारात्मक नियंत्रण टेम्पलेट के 10 µ एल जोड़ें ।
    5. प्रत्येक नमूने के लिए, ०.२ मिलीलीटर पीसीआर ट्यूब में पिछले कदम से तैयार प्रतिक्रिया मिश्रण के 10 µ एल हस्तांतरण, और फिर कदम 1.1.16 से तैयार नमूना डीएनए के 10 µ एल जोड़ें ।
    6. अपने संबंधित पीसीआर ट्यूबों से सामग्री के साथ thermocycler के कुओं लोड के रूप में 2.1.1 कदम में वर्णित है ।
    7. एक बार सभी आवश्यक जानकारी दर्ज की गई और पुष्टि की गई है, प्रारंभ चलाएं चुनें और या तो ईथरनेट से कनेक्टेड उपकरण या USB ड्राइव चुनें ।
      नोट: USB ड्राइव विकल्प चयनित है, तो चलाएँ फ़ाइल thermocycler (, F:\genesig) के साथ उपयोग करने के लिए ड्राइव पर सहेजा जाना चाहिए । thermocycler में ड्राइव डालने के तुरंत बाद रन शुरू हो जाएंगे ।
  3. पोर्टेबल रीयल-टाइम पीसीआर का डेटा विश्लेषण ।
    1. एक बार चलाने के समाप्त हो जाने पर, thermocycler-संबद्ध सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके usb ड्राइव से चलाएं फ़ाइल (. usb) खोलें या सीधे परिणामक्लिक करके सॉफ़्टवेयर में चलाएं परिणामों को देखें ।
    2. परिणाम का विश्लेषण करने से पहले, डेटा खोने से बचने के लिए पूर्ण रन सहेजें ।
    3. परिणाम टैब में, नमूनों द्वारा वर्गीकृत की गई रन की स्थिति देखें ।
      नोट: इस टैब में प्राप्त किया जा सकने वाला डेटा नमूने में पाए जाने वाले परिणामों और प्रतिलिपि संख्या की स्थिति होती है.
    4. प्रवर्धन घटता देखने के लिए विवरण टैब पर क्लिक करें । लक्ष्य सफलतापूर्वक पता लगाया है, जब सीक्यू (ठहराव सायकल) मान लक्ष्य और आंतरिक नियंत्रण के प्रदर्शित होते हैं ।
      नोट: ये मान अंतिम रिपोर्ट में परिकलित किए जाते हैं और यह निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाता है कि क्या नमूना लक्ष्य के लिए धनात्मक है और यदि प्रतिक्रिया या डीएनए नमूनों में समस्याएँ हैं.

2. अंय प्रोटोकॉल

  1. वैकल्पिक प्रयोगशाला आधारित डीएनए निष्कर्षण तरीकों
    1. CTAB-phenol-क्लोरोफॉर्म आधारित विधियाँ
      1. CTAB-phenol-क्लोरोफॉर्म आधारित विधियों, के बाद डॉयल विधि18 और Dellaporta विधि19 पहले बताए अनुसार निष्पादित करें ।
    2. डीएनए मिनी तैयारी विधि
      नोट: एडवर्ड्स विधि20 इस प्रकार के रूप में किया गया था ।
      1. जोड़ें ५०० मिट्टी की मिलीग्राम, पांच १.४ मिमी सिरेमिक मोती और एडवर्ड्स बफर के ७५० µ एल के बाद (२०० mm Tris, पीएच ८.०, २०० mm NaCl, 25 mm EDTA, ०.५% एसडीएस) एक microtube और मिश्रण अच्छी तरह से ।
      2. 5 मिनट के लिए ६५ ° c पर microtube की मशीन ।
      3. ६० s के लिए एक मनका डिब्बा homogenizer के साथ नमूना Homogenize (या एक मोर्टार और मूसल का उपयोग करके) ।
      4. 5 मिनट के लिए १४,००० x g पर नमूना केंद्रापसारक ।
      5. एक ताजा microtube के लिए supernatant के ५०० µ एल स्थानांतरण और फिर ठंडा isopropanol के ५०० µ एल के साथ मिश्रण । ट्यूब को पलटने से 10 बार मिश्रण.
      6. 15 मिनट के लिए १४,००० x g पर नमूना केंद्रापसारक pelletize करने के लिए डीएनए ।
      7. supernatant के लिए खिचड़ी भाषा और दो डीएनए गोली हवा शुष्क कमरे के तापमान पर जब तक शेष इथेनॉल काफूर हो गया है ।
      8. धो ठंडा ७०% इथेनॉल के ७५० µ एल के साथ डीएनए गोली ।
      9. एयर ड्राई गोली फिर से पहले से 50-100 µ एल ते बफर (10 मिमी Tris-एचसीएल, पीएच ८.० और 1 मिमी EDTA) में सस्पैंड ।
    3. अन्य वैकल्पिक तरीकों
      1. ' निर्माताओं के निर्देश के अनुसार सिलिका आधार डीएनए निष्कर्षण किट #1 (एमपी बायो फास्ट डीएनए स्पिन) और किट #2 (Zymo mics डीएनए Miniprep किट) का उपयोग कर प्रदर्शन करते हैं ।
  2. पारंपरिक प्रयोगशाला आधारित वास्तविक समय पीसीआर ।
    नोट: जांच के लिए mastermix-आधारित पीसीआर, विभिन्न प्राइमरों और oligonucleotide जांचों (टेबल 2) के साथ पारंपरिक thermocycler का इस्तेमाल किया गया ।
    1. गैर पारदर्शी तली हुई पीसीआर ट्यूब या एक पीसीआर प्लेट का उपयोग करना, सभी डीएनए नमूनों के लिए 20 µ एल प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण किया जा करने के लिए तैयार, साथ ही एक नकारात्मक नियंत्रण (nuclease मुक्त जल) और एक सकारात्मक टेम्पलेट नियंत्रण में तैयार घर.
    2. प्रत्येक पीसीआर ट्यूब या अच्छी तरह के लिए, mastermix के 10 µ l सहित एक मिश्रण तैयार करें, nuclease के 7 µ एल-नि: शुल्क जल, 2 µ एम प्राइमरों के 2 µ एल/जांच, और डीएनए नमूने के 1 µ l (चरण 1.1.16, या २.१ से) या नियंत्रण टेंपलेट, प्रति नमूना ।
    3. पीसीआर ट्यूब या प्लेट बंद करें और उपयुक्त पीसीआर प्रोग्राम का चयन करके प्रतिक्रिया शुरू करते हैं ।
  3. पारंपरिक प्रयोगशाला के डेटा विश्लेषण-वास्तविक समय पीसीआर आधारित
    1. पारंपरिक thermocycler से परिणामों का विश्लेषण करने के लिए thermocycler-संबद्ध सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें । डेटा विश्लेषण आरंभ करने के लिए, चलाएं फ़ाइल को thermocycler से usb ड्राइव में स्थानांतरित करें, usb ड्राइव डालें और निर्यातकरें चुनें ।
    2. thermocycler-संबद्ध सॉफ़्टवेयर में निर्यात किए गए रन से डेटा फ़ाइल (. pcrd) खोलें ।
    3. साधन पर अपनी संगत अच्छी तरह से पता लगाने के द्वारा एक नमूना के कुआं पर प्रकाश डाला । प्रवर्धन घटता है और मानक curves (यदि लागू हो) स्वचालित रूप से उत्पंन कर रहे हैं । यदि नमूना जानकारी दर्ज नहीं की गई है, तो डेटा का विश्लेषण करने से पहले डेटा इनपुट आरंभ करने के लिए प्लेट सेटअप या समान फ़ंक्शन क्लिक करें ।
    4. ठहराव टैब पर डेटा देखें; यह एक तृतीय-पक्ष सॉफ़्टवेयर जैसे CSV, XML, या HTML फ़ाइल रीडर्स के साथ डेटा विश्लेषण के लिए निर्यात किया जा सकता है ।
    5. निर्धारित थ्रेशोल्ड के आधार पर सीक्यू डेटा प्राप्त करें और इसे धनात्मक और ऋणात्मक नियंत्रणों से तुलना करें.
      नोट: यदि लक्ष्य के डीएनए मानकों परख में इस्तेमाल किया गया, सीक्यू कट-ऑफ निर्धारित करने के लिए मानकों की है कि नमूना सीक्यू डेटा की तुलना

Representative Results

डीएनए निष्कर्षण तरीकों की तुलना

वास्तविक समय पीसीआर के साथ एक चुंबकीय मनका आधारित डीएनए निष्कर्षण विधि की अनुकूलता रोगज़नक़ के साथ पीड़ित खेतों से एक मिट्टी के नमूने में subterranea डीएनए की मात्रा का पता लगाने के द्वारा मूल्यांकन किया गया था । के रूप में पूरक चित्रा 1में दिखाया गया है, चुंबकीय मनका आधारित विधि एक CTAB-phenol-क्लोरोफॉर्म आधारित विधि18, त्वरित डीएनए मिनी तैयारी तरीकों19,20, और अंय सहित अंय तरीकों के साथ तुलना में था मानक सिलिका आधारित डीएनए निष्कर्षण किट । डीएनए नमूने निकाले गए छह विभिंन तरीकों का उपयोग पारंपरिक प्रयोगशाला के अधीन थे वास्तविक समय पीसीआर आधारित है । परिणाम का सुझाव दिया है कि चुंबकीय मनका आधारित विधि अंय तरीकों के साथ तुलनीय है, हालांकि सिलिका आधारित डीएनए निष्कर्षण किट तरीकों हम परीक्षण के बीच सबसे अच्छा प्रदर्शन दिखाया । सभी किट guanidinium thiocyanate या guanidinium हाइडरोक्लॉराइड होते हैं: दोनों शक्तिशाली chaotropic एजेंट हैं, जो RNases और DNases सहित सेलुलर प्रोटीन के अधिकांश स्वभाव । इसलिए, तरीकों का उपयोग दोनों डीएनए और आरएनए निकालने के लिए उपयुक्त है ।

एक पोर्टेबल वास्तविक समय पीसीआर और एक पारंपरिक प्रयोगशाला आधारित वास्तविक समय पीसीआर के बीच तुलना

एक पारंपरिक प्रयोगशाला के लिए एक पोर्टेबल पीसीआर की संवेदनशीलता और विशिष्टता की तुलना करने के लिए-पीसीआर आधारित, रोगज़नक़ डीएनए के निरपेक्ष ठहराव की अलग मात्रा का उपयोग किया गया था subterranea अपनी जीन है , जो pGEM-T वेक्टर द्वारा किए गए21 . अपनी जीन (106 से 100 प्रतियां) के 10 गुना कमजोर पड़ने की एक श्रृंखला SsTQ प्राइमरों का उपयोग कर विश्लेषण किया गया/ परिणामों का प्रदर्शन किया है कि पोर्टेबल पीसीआर विधि लक्ष्य रोगज़नक़ डीएनए का पता चला (~ १०० प्रतियां), हालांकि संवेदनशीलता था 10 बार पारंपरिक प्रयोगशाला की तुलना में कम-पीसीआर पद्धति पर आधारित है, जो पता चला कम से 10 प्रतियां (चित्रा 2) ।

आगे की मांयता के लिए कृत्रिम रूप से संक्रमित मिट्टी का परीक्षण किया गया । एस subterranea sporosori आलू की जड़ों से पाउडर पपड़ी जड़ पित्त से प्राप्त किया गया । मिट्टी के 105 sporosori की एक अंतिम एकाग्रता में sporosori निलंबन के साथ प्रभावित किया गया था/ चुंबकीय मनका आधारित विधि का प्रयोग, डीएनए संक्रमित मिट्टी के नमूनों से निकाला गया था, और 10 गुना सीरियल कमजोर पड़ने से 10 के बराबर सांद्रता प्राप्त करने के लिए तैयार थे5, 104, 103, 102, 101, और 100 sporosori/जी सूखी मिट्टी का वजन । डीएनए नमूनों का इस्तेमाल पीसीआर के लिए किया गया एसपीओ प्राइमरी/23सेट जांच/ परिणाम से पता चला कि पोर्टेबल पीसीआर विधि एक पारंपरिक प्रयोगशाला के लिए तुलना विश्लेषणात्मक क्षमता है-पीसीआर विधि पर आधारित है, लेकिन फिर से, संवेदनशीलता ~ 10 के एक पहलू से कम किया गया था (चित्रा 3) ।

अंत में, हम एक क्षेत्र है कि प्राकृतिक रूप से एस subterraneaके साथ दूषित था से एक मिट्टी के नमूने का परीक्षण किया । चुंबकीय मनका आधारित डीएनए निष्कर्षण मिट्टी के विभिंन मात्रा पर प्रदर्शन किया गया था (10, 20, ५० और १०० निष्कर्षण बफर समाधान के ५०० µ एल प्रति मिलीग्राम) । परिणामों का सुझाव दिया है कि डीएनए निष्कर्षण के लिए एक प्रारंभिक सामग्री के रूप में मिट्टी के इष्टतम वजन 50-100 मिलीग्राम (चित्रा 4) था । सीमा के बाहर मिट्टी मात्रा बहाव पीसीआर कदम की विफलता का कारण बना । यह प्रभाव हो सकता है क्योंकि जब मिट्टी की अतिरिक्त मात्रा शुरू सामग्री के रूप में उपयोग किया जाता है, संदूषण (जैसे, phenolic यौगिकों) पीसीआर24के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं । मिट्टी की कम मात्रा के मामले में, निकाले गए डीएनए की मात्रा पीसीआर की पता लगाने की सीमा से कम हो सकता है (उदा., 10-20 मिलीग्राम मिट्टी से निकाले गए कुल डीएनए की पैदावार विविध थी) । संवेदनशीलता पोर्टेबल पीसीआर और पारंपरिक पीसीआर तरीकों के बीच काफी तुलनीय था । इसी तरह के परिणाम अलग निष्कर्षण तरीकों (पूरक चित्रा 2) द्वारा डीएनए नमूनों में प्राप्त किया गया

एक पोर्टेबल रीयल-टाइम पीसीआर का उपयोग करके ऑन-साइट डिटेक्शन सिस्टम द्वारा अन्य रोगजनकों का पता लगाना

हम अंय महत्वपूर्ण मिट्टी जनित आलू रोगजनकों, आर सोलानी AG3 और सॐवा का पता लगाने के लिए पोर्टेबल पीसीआर विधि का परीक्षण किया । इस अध्ययन में, हम रीयल-टाइम पीसीआर RsTq प्राइमरों/RQP1 जांच का उपयोग कर आर सोलानी AG3 शुद्ध संस्कृति से डीएनए के साथ पता लगाने के लिए25 निर्धारित किया है । हम भी वास्तविक समय पीसीआर का उपयोग कर सॐवा-डी प्राइमर/जांच सेट26 एक spraing रोगसूचक कंद नमूने से आरएनए के साथ सॐवा डिटेक्शन के लिए उपयोग किया गया था । जैसा कि चित्र 5में दिखाया गया है, पोर्टेबल पीसीआर पद्धति ने दोनों रोगजनकों का सफलतापूर्वक पता लगाया । परिणाम पोर्टेबल और पारंपरिक उपकरणों के बीच तुलना कर रहे थे, सुझाव है कि पोर्टेबल पीसीआर विधि बहुमुखी और अंय रोगज़नक़ का पता लगाने के लिए लागू है अगर प्राइमर अनुक्रम वास्तविक समय पीसीआर के लिए डिजाइन उपलब्ध हैं ।

Figure 1
चित्र 1। ऑन-साइट रोगज़नक़ का पता लगाने के लिए एक पोर्टेबल रीयल-टाइम पीसीआर प्रणाली की प्रक्रिया । प्रोटोकॉल निंनलिखित क्रम में कदम से बना है: संक्षिप्त homogenization द्वारा lysate तैयारी (क), चुंबकीय मनका-आधारित न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण (ख), पोर्टेबल वास्तविक समय पीसीआर (सी), और मात्रात्मक डेटा एक लैपटॉप कंप्यूटर का उपयोग कर विश्लेषण (डी) । ध्यान दें कि सभी चरणों साइट पर पूरा किया जा सकता है ।

Figure 2
चित्र 2 . एक पोर्टेबल पीसीआर और एक पारंपरिक प्रयोगशाला के बीच संवेदनशीलता की तुलना पीसीआर आधारित है । रोगजनक डीएनए के ठहराव एस subterranea की अलग मात्रा का उपयोग किया गया था इसके जीन (106 से 100 प्रतियां) के साथ SsTQ प्राइमरों/ subterranea प्लाज्मिड डीएनए और पारंपरिक thermocycler (A) और पोर्टेबल thermocycler (B) पर सीक्यू के पारस्परिक लॉग मान का लॉग मान के बीच रेखीय प्रतीपगमन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 . एस. subterranea के साथ कृत्रिम रूप से संक्रमित मिट्टी में पता लगाने के प्रदर्शन की तुलना । मिट्टी के कृत्रिम रूप से प्रभावित थे (10 से 10 0 sporosori/ subterranea sporosori सस्पेंशन के साथ जी शुष्क वजन) । चुंबकीय मनका आधारित विधि का प्रयोग, डीएनए पीड़ित मिट्टी के नमूनों से निकाला गया था । पीसीआर ने एसपीओ प्राइमरी/जांच सेट के साथ मिट्टी के नमूनों का प्रयोग कर प्रदर्शन किया गया । sporosori प्रति ग्राम मिट्टी और पारंपरिक thermocycler (A) और पोर्टेबल thermocycler (B) पर सीक्यू के पारस्परिक लॉग मान में प्रारंभिक मात्रा के लॉग मान के बीच रेखीय प्रतीपगमन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 . डीएनए निष्कर्षण के लिए मिट्टी के नमूनों की शुरूआती राशि की तुलना । चुंबकीय मनका आधारित विधि 10, 20, ५०, और मिट्टी के नमूनों की १०० मिलीग्राम से डीएनए निष्कर्षण के लिए इस्तेमाल किया गया था । रीयल-टाइम पीसीआर को पोर्टेबल thermocycler का उपयोग करके किया गया था । मानक curves मिट्टी के नमूनों से निकाले गए कुल डीएनए की मात्रा के बीच संबंधों का प्रतिनिधित्व (एक्स-एक्सिस) और पीसीआर उत्पाद की मात्रा (y-अक्ष) एसएसएस प्राइमर/जांच सेट द्वारा परिवर्धित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5 . अन्य आलू रोगजनकों, आर. सोलानी और सॐवा का पता लगाना । वास्तविक समय पीसीआर पोर्टेबल thermocycler और पारंपरिक thermocycler का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया । आर. सोलानी AG3 कुल RsTq प्राइमर का उपयोग कर संस्कृति से निकाले गए डीएनए में पाया गया था और RQP1 जांच (ए) सॐवा कुल आरएनए में पता लगाया गया था एक सॐवा-संक्रमित कंद नमूना सॐवा-डी प्राइमर/जांच सेट (ख) का उपयोग कर से निकाली गई । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्र 6 . phytopathogens के लिए एक नैदानिक पाइपलाइन । फ़्लोचार्ट phytopathogen निदान के लिए एक सामांय कार्यप्रवाह दिखाता है । ध्यान दें कि पारंपरिक कदम, उदा, दृश्य पहचान, यदि ऑन-साइट आणविक पहचान का उपयोग किया जाता है, जो निदान की पूरी प्रक्रिया को सरल और तेज बनाता है, छोड़ा जा सकता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

पोर्टेबल वास्तविक समय पीसीआर रीयल टाइम पीसीआर दीपक एलिसा पार्श्व-प्रवाह
मूल्य प्रति लक्ष्य प्रतिक्रिया $०.६०-$ 8.47 $०.६० $०.७५ $०.६० $४.७४
संवेदनशीलता १०० प्रतियां 10 प्रतियां 10 प्रतियां 1-10 sporosori३३
1-10 एनजी/एमएल (प्रोटीन)३३ 		1-10 sporosori३४
5x105CFU/एमएल३५
समय व्यय ९० मिनट 80-240 मिनट 50-90 मिनट३२ 3-24 घंटे 10-15 मिनट
तयारी आवश्यक ● न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण
● प्राइमर डिजाइन		 ● न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण
● प्राइमर/		 ● Nucelic एसिड निष्कर्षण
● प्राइमर डिजाइन		 ● प्रोटीन निष्कर्षण
● एंटीबॉडी		 न/
अन्य आवश्यक सामग्री ● पोर्टेबल thermocycler ● परम्परागत thermocycler ● Colormetric दाग
● मशीन		 ● प्लेट रीडर
● वाशिंग उपकरण		 न/

तालिका 1. phytopathogens के लिए आणविक और सीरम वैज्ञानिक डिटेक्शन तरीकों का तुलनात्मक चार्ट

प्राइमरी अनुक्रम (5 '-3 ′)a लक्ष्यb
SsTQ-च१३ CCGGCAGACCCAAAACC ITS1-ITS2 में एस. subterranea
SsTQ-R13 CGGGCGTCACCCTTCA ITS1-ITS2 में एस. subterranea
SsTQ-पी13 fam] CAGACAATCGCACCCAGGTTCTCATG [ताम] ITS1-ITS2 में एस. subterranea
Genesig एस subterranea प्राइमरी/ N/A Actin में एस. subterranea
SPO1014 GGTCGGTCCATGGCTTGA इसके एस. subterranea में
SPO1114 GGCACGCCAATGGTTAGAGA इसके एस. subterranea में
SPOPRO114 fam] CCGGTGCGCGTCTCTGGCTT [ताम] इसके एस. subterranea में
RsTqF119 AAGAGTTTGGTTGTAGCTGGTCTATTT ITS1-ITS2 में आर. सोलानी
RsTqR119 AATTCCCCAACTGTCTCACAAGTT ITS1-ITS2 में आर. सोलानी
RQP119 fam] TTTAGGCATGTGCACACCTCCCTCTTTC [ताम] ITS1-ITS2 में आर. सोलानी
Genesig सॐवा प्राइमरी/ N/A सॐवा में सीपी-आरटी
सॐवा-डी-एफ20 AGAATTGRCATCGAAACAGCA सॐवा में सीपी
सॐवा-डी-आर20 GTCGCGCTCCAATTTCGTT सॐवा में सीपी
सॐवा-डी-पी20 fam] CCACAAACAGACAGGTATGGTCCGGAA [ताम] सॐवा में सीपी
एक Oligo डीएनए प्राइमरों FAM (6-carboxyfluorescein) या टैम (5-carboxytetramethylrhodamine) के साथ संशोधित किया गया
ख इसके: आंतरिक लिखित स्पेसर्स, सीपी: कोट प्रोटीन; CP-RT: कोट प्रोटीन readthrough

तालिका 2. इस अध्ययन में प्रयुक्त प्राइमर

अनुपूरक आंकड़ा 1. पाउडर पपड़ी रोगज़नक़ का पता लगाने के लिए डीएनए निष्कर्षण तरीकों की तुलना. छह अलग डीएनए निष्कर्षण तरीकों (एक एफ) पाउडर पपड़ी रोगज़नक़ का पता लगाने के लिए तुलना की गई, मिट्टी के नमूनों में एस subterranea । (B, D, F). डीएनए #1 सिलिका आधारित किट का उपयोग कर निकाला गया था (सभी किट नामों के लिए सामग्री की तालिका देखें), सिलिका आधारित किट #2, और चुंबकीय मनका-आधारित किट, repsectively । पीसीआर ने पारंपरिक लैब स्थित पीसीआर thermocycler का इस्तेमाल कर प्रदर्शन किया था । मानक curves कुल डीएनए की मात्रा मिट्टी के नमूनों से निकाली गई और पीसीआर उत्पाद की मात्रा SsTQ प्राइमरों/जांच सेट द्वारा परिवर्धित के बीच संबंध का प्रतिनिधित्व करते हैं । इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

अनुपूरक आंकड़ा 2. एक पोर्टेबल पीसीआर और एक पारंपरिक प्रयोगशाला आधारित पीसीआर के बीच पता लगाने की सीमा की तुलना । कुल डीएनए तीन अलग निष्कर्षण तरीकों का उपयोग कर एक मिट्टी के नमूने से अलग किया गया था: (a, B) डॉयल विधि, (सी, डी) सिलिका आधारित किट #2, और (ई, एफ) चुंबकीय मनका आधारित किट । बाईं ओर दिखाया रेखांकन एसएसएस प्राइमरों/जांच सेट के साथ पोर्टेबल thermocycler का उपयोग कर डेटा रहे हैं, जबकि सही पर रेखांकन पारंपरिक प्रयोगशाला का उपयोग कर उत्पंन आंकड़ों का प्रतिनिधित्व SsTQ प्राइमरों के साथ thermocycler आधारित/ इस आंकड़े को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Discussion

के रूप में 1 तालिकामें दिखाया गया है, रोगजनक एजेंटों की आणविक पहचान में हाल ही में तकनीकी विकास प्रभावकारिता, सटीकता, और निदान की गति, जो पूर्व रोगसूचक संक्रमण27का पता लगाने के लिए योगदान दिया है वृद्धि हुई है । के बारे में साइट निदान, दीपक और पार्श्व प्रवाह तरीकों अक्सर इस्तेमाल किया क्योंकि वे पोर्टेबल है और एक कम कीमत पर तत्काल परिणाम प्रदान कर रहे हैं । हालांकि, सीरम वैज्ञानिक तरीकों के मामले में, प्रजातियों विशेष का पता लगाने के लिए मुश्किल हो सकता है । इस तरह के आम मिट्टी के निवासियों के रूप में बंद लक्ष्य रोगाणुओं का कभी-कभार पता लगाने का कारण बनता है । उदाहरण के लिए, वहाँ के सीरम वैज्ञानिक परीक्षणों के बीच क्रॉस जेट हो सकता है फाईटोप्थोरा एसपीपी. and Pythium एसपीपी. आलू रोगजनकों के मामले में 28, यह दर्शाता है कि वहां कभी कभार लक्षित संयंत्र का पता लगाने कठिनाइयों कर रहे है रोगजनकों.

वर्तमान अध्ययन में, हमने एक पारंपरिक प्रयोगशाला आधारित रीयल-टाइम पीसीआर सिस्टम के साथ अपनी क्षमताओं की तुलना करके पोर्टेबल रीयल-टाइम पीसीआर सिस्टम का उपयोग करते हुए मिट्टी जनित आलू के रोगजनकों के आणविक पता लगाने के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल विकसित किया है । हमने पाया है कि साइट पर विधि विशेष रूप से मिट्टी के नमूने में आलू रोगजनकों का पता लगाता है, हालांकि संवेदनशीलता ~ 10 बार एक समकक्ष प्रयोगशाला की तुलना में कम परख आधारित है । यह भी विचार है कि इस मामले में दोनों प्रयोगशाला और क्षेत्र परीक्षण एक जैविक रूप से प्रासंगिक नमूना आकार का उपयोग नहीं किया लायक है । बड़े नमूना आकार नियमित रूप से जांच क्षेत्र मिट्टी में उपयोग के लिए आवश्यक है के रूप में पहले से वर्णित29,30, जहां २५० g के बीच 1 किलो के लिए नमूना आकार संसाधित कर रहे हैं, हालांकि इन तरीकों कुशल ऑपरेटरों और परिष्कृत की आवश्यकता उपकरण डीएनए निकालने के लिए । आम तौर पर, एक बड़े पैमाने पर मिट्टी डीएनए निकालने कई उपनमूना के एक समग्र मिट्टी नमूना प्रतिनिधि से 1 से 4 हेक्टेयर6,29,30पर लिया जाता है । हालांकि, यहां विकसित प्रोटोकॉल जल्दी है, आसानी से आणविक निदान में कोई पूर्व अनुभव के साथ उपयोगकर्ताओं के लिए उपयोग करने के लिए और एक प्रयोगशाला के बाहर इस्तेमाल किया जा सकता है । के रूप में विधि तेजी से और अपेक्षाकृत सस्ते बड़े पैमाने पर मिट्टी निष्कर्षण की तुलना में है, यह कई छोटे पैमाने पर एक समान नमूना क्षेत्र से बड़े पैमाने पर कुल नमूनों के लिए ले जाया नमूनों स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । यह एक छोटे से नमूना आकार की कमियों में से कुछ पर काबू पाने और क्षेत्र में रोगज़नक़ के स्थानिक वितरण पर अतिरिक्त जानकारी का निर्धारण कर सकता है । इसके अलावा, पोर्टेबिलिटी और विधि की गति का मतलब है कि यह भी प्रदर्शन गतिविधियों में शैक्षिक और सगाई प्रयोजनों के लिए उत्पादकों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

एक और विचार है कि कई वास्तविक समय पीसीआर परख पहले से ही संयंत्र रोगजनकों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए प्रकाशित कर रहे है5। इस प्रणाली के लिए नए लैंप प्राइमरों के डिजाइन की आवश्यकता के बिना इन मौजूदा परख का उपयोग कर सकते है क्षेत्र परीक्षण में सक्षम है । दीपक परख की एक लगातार आलोचना है कि वे31डिजाइन मुश्किल हो सकता है । पोर्टेबल पीसीआर, इसलिए, पर साइट परीक्षण के लिए आसानी से उपलब्ध रोगज़नक़ परीक्षणों की एक विस्तृत श्रृंखला के अपेक्षाकृत आसान कार्यांवयन की अनुमति देता है ।

पारंपरिक तरीकों अक्सर महंगा हो सकता है, श्रमसाध्य, गलत, और समय लेने वाली । पर साइट की सादगी हम विकसित की अनुमति देता है उत्पादकों और उद्योग श्रमिकों को स्वयं द्वारा रोगजनक पता लगाने के प्रदर्शन और शायद एक बहुत जल्दी एक नैदानिक प्रयोगशाला है कि कुछ दूर हो सकता है के लिए भेजने से परिणाम उत्पंन । मुस्तैदी और पोर्टेबल पीसीआर विधि की संवेदनशीलता में मदद कर सकते हैं उत्पादकों संभावित द्वितीयक संक्रमण से बचने, जो रोगज़नक़ आबादी और अनजाने प्रसार की वृद्धि कर सकते हैं (उपकरण या मनुष्यों के माध्यम से). अंत में, साइट वर्तमान अध्ययन में विकसित की विधि क्षेत्र में महत्वपूर्ण मिट्टी जनित रोगजनकों के सटीक और अपेक्षाकृत संवेदनशील पता लगाने में सक्षम बनाता है । हमारी आशा है कि इस अध्ययन में विकसित साइट पर एक वर्तमान नैदानिक पाइपलाइन में योगदान (चित्रा 6), न केवल क्षेत्र में पौधों की बीमारियों के बारे में महामारी विज्ञान के सवालों के त्वरित और सटीक जवाब प्रदान करने के द्वारा, लेकिन यह भी प्रदान करके जीव विज्ञान और संयंत्र रोगजनकों के जानपदिक रोग विज्ञान की वृद्धि हुई समझ ।

Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा ।

Acknowledgments

हम उत्तर डकोटा राज्य विश्वविद्यालय में डॉ नील सी Gudmestad के लिए आभारी है एस subterranea प्लाज्मिड डीएनए प्रदान करने के लिए, वाशिंगटन राज्य विश्वविद्यालय (Pappu) में डॉ हनु WSU सॐवा आरएनए प्रदान करने के लिए, और डेबरा में डॉ इङलिस WSU आर सोलानी AG3 प्रदान करने के लिए । वीडियोग्राफी के लिए पांडुलिपि और WSU CAHNRS संचार पर टिप्पणी प्रदान करने के लिए WSU में डॉ जेरेमी ज्वैलर्स को विशेष धन्यवाद । इस शोध को पश्चिमोत्तर आलू अनुसंधान कंसोर्टियम और वाशिंगटन राज्य कृषि विभाग द्वारा समर्थित किया गया था-विशेषता फसल ब्लॉक अनुदान कार्यक्रम (अनुदान सं. K1764) । PPNS no. ०७४१, प्लांट पैथोलॉजी विभाग, कृषि महाविद्यालय, मानव एवं प्राकृतिक संसाधन विज्ञान, कृषि अनुसंधान केंद्र, हैच परियोजना नं. WNP00833, वाशिंगटन राज्य विश्वविद्यालय, पुलमैन, WA, संयुक्त राज्य अमरीका ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
White shell PCR plate Bio-Rad HSP9601
CFX Manager Bio-Rad 1845000
SsoAdvanced Universal Probes Supermix  Bio-Rad 1725280
CFX96 Touch qPCR instrument Bio-Rad  1855195
Ethylalcohol, pure 200 proof Decon Laboratories 04-355-222
Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) Fisher BioReagents BP118-500
Phenol, Saturated  Fisher BioReagents BP1750I-400
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) Fisher BioReagents BP152-5
q16 real-time PCR machine genesig MBS486001
Ultrapure Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Invitrogen 15525-017
2-Propanol (Isopropanol) JT Baker 67-63-0
Chloroform JT Baker 9180-03
Hydrochloric Acid, 36.5-38.0% (HCl) JT Baker 9535-03
iso-Amyl Alcohol JT Baker 9038-01
FastDNA Spin kit  MP Biomedicals 6560-200 Silica-based DNA extraction kit #1
Luna Universal One-Step RT-qPCR Kit New England Biolabs E3005S
0.1ml Low Profile Individual PCR Tubes Phenix Research MPC-100LP
Easy DNA/RNA Extraction Kit  Primerdesign genesigEASY-EK
genesig Easy 1.5 mL tubes Primerdesign genesigEASY-1.5
Magnetic tube rack Primerdesign genesigEASY-MR
Spongospora subterranea f. sp. subterranea genesig Easy Kit Primerdesign Path-S.subterranea-EASY
Hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) Sigma-Aldrich H6269-100G
Pellet pestles Thermo Fisher Scientific 12-141-364
Sodium chloride (NaCl) Thermo Fisher Scientific 7647-14-5
DNA Miniprep kit  ZymoBIOMICS D4300 Silica-based DNA extraction kit #2

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पर्यावरण विज्ञान मुद्दा १३२ पर साइट निदान पोर्टेबल रीयल-टाइम पीसीआर मिट्टी जनित phytopathogens पाउडरी पपड़ी रोग Spongospora subterranea आलू के ऊपर की ओर चेहरे की ऊपरी वायरस Rhizoctonia सोलानी
ऑन-साइट एक पोर्टेबल रीयल-टाइम पीसीआर सिस्टम का उपयोग करके मिट्टी जनित Phytopathogens का आणविक पता लगाना
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DeShields, J. B., Bomberger, R. A.,… More

DeShields, J. B., Bomberger, R. A., Woodhall, J. W., Wheeler, D. L., Moroz, N., Johnson, D. A., Tanaka, K. On-Site Molecular Detection of Soil-Borne Phytopathogens Using a Portable Real-Time PCR System. J. Vis. Exp. (132), e56891, doi:10.3791/56891 (2018).

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