Summary
الكشف السريع والدقيق لمسببات الأمراض النباتية في الموقع، ولا سيما المنقولة بالتربة مسببات، أمر حاسم لمنع المزيد من الإنتاج العدوى وانتشار الأمراض النباتية في الحقل. طريقة وضعها هنا باستخدام نظام الكشف عن PCR الوقت الحقيقي محمولة يمكن تشخيص الموقعي الظروف الميدانية.
Abstract
تشخيص الأمراض النباتية في الموقع يمكن أن يكون أداة مفيدة للمزارعين لاتخاذ قرارات في حينها التمكين من تنفيذ استراتيجيات إدارة الأمراض التي تقلل من أثر هذا المرض سابقا. حاليا في العديد من المختبرات التشخيصية، البلمرة المتسلسل (PCR)، بكر في الوقت الحقيقي وبخاصة، يعتبر الأسلوب الأكثر حساسة ودقيقة للكشف عن مسببات الأمراض النباتية. ومع ذلك، تقارير إتمام المشروعات المستندة إلى المختبر عادة ما تتطلب معدات المختبرات مكلفة والموظفين المهرة. في هذه الدراسة، ومسببات الأمراض المنقولة عن طريق التربة من البطاطا تستخدم لإثبات إمكانية الكشف الجزيئي في الموقع. وتحقق ذلك باستخدام بروتوكول سريعة وبسيطة تتألف من استخراج الحمض النووي القائم على حبة المغناطيسي، بكر المحمولة في الوقت الحقيقي (مقايسة على أساس التحقيق فلوروجينيك). مشجعا للغاية مقارنة بالنهج PCR المحمولة في الوقت الحقيقي مع نظام يستند إلى مختبر، الكشف عن عدد قليل من 100 نسخة من الحمض النووي من سوبتيرانيا سبونجوسبورا. طريقة PCR الوقت الحقيقي المحمولة المتقدمة هنا يمكن أن تخدم كبديل للنهج المستندة إلى المختبر وأداة مفيدة في الموقع لتشخيص الممرضات.
Introduction
التعريف الدقيق والسريع للعوامل الممرضة المسببة يؤثر إلى حد كبير اتخاذ القرارات المتعلقة بإدارة الأمراض النباتية. الأمراض المنقولة عن طريق التربة تتسم بصعوبة خاصة لتشخيص لأن بيئة التربة كبيرة للغاية بالنسبة إلى مصنع أسلحة، ومعقدة، مما يشكل تحديا لفهم جميع جوانب الأمراض المنقولة بالتربة. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تكون الأمراض المنقولة عن طريق التربة كالكلاميديا خلال مراحل الإصابة الأولى، تعتمد على عوامل الإجهاد البيئي، وبعض فترات طويلة كامنة تؤدي إلى تأخر تشخيص1. وقد وضعت العديد من مسببات الأمراض المنقولة عن طريق التربة هياكل البقاء على قيد الحياة، مثل جراثيم المتخصصة أو خيوط فطرية ميلانيزيد، الذي يمكن أن يعيش في التربة لسنوات عديدة حتى في غياب مضيفيهم. وتشمل النهج المستخدمة لإدارة الأمراض المنقولة عن طريق التربة: تجنب الحقول الموبوءة المعروفة واستخدام البذور المعتمدة خالية من مسببات الأمراض والشتلات وحفظ المعدات الصحية وتقييد حركة التربة والمياه عندما يكون ذلك ممكناً. المعرفة بوجود مسببات المرض من خلال استراتيجيات الكشف الجزيئي أيضا تلعب دوراً مفيداً بإبلاغ القرارات في الوقت المناسب فيما يتعلق بالعلاج في مرحلة مبكرة أو النباتات قبل تقييمات للحقول. الاختبار في الموقع توفر مزايا إضافية لتقديم نتيجة سريعة دون إرسال العينة إلى مختبر تشخيص أنه ربما بعض المسافة بعيداً وأيضا يمكن المشاركة الزارع إذا كان مثل هذا تشخيص بإجراء 'حقل--الجانب' في وجودها.
لتشخيص الموقعي استناداً إلى الكشف الجزيئي وحساسية وخصوصية، ومتانة (التكرار وإمكانية تكرار نتائج) والكفاءة (أي.، أداء البساطة والتكلفة) عوامل حاسمة للنظر فيها. الوحشي تدفق الأجهزة (Lfd) مثل إيمونوستريب وبوكيتدياجنوستيك، وأساليب شعبية للكشف عن العوامل الممرضة في الموقع بسبب بساطتها مقايسة خطوة واحدة. ومع ذلك، Lfd قد لا تكون أداة التشخيص الحق في جميع الحالات لأنها تفتقر إلى الحساسية والنوعية، ويوفر نتائج ملتبسة أحياناً إذا كان الممرض المستهدفة في تركيزات منخفضة ويمكن كروسريكت مع الأنواع المماثلة أو جنسا 2. التضخيم متحاور بوساطة حلقة (المصباح) ينطبق أيضا للكشف عن العوامل الممرضة في الموقع وغير مكلفة لا سيما سبب الكواشف منخفضة التكلفة، ورد فعل الظروف التي لا تزال مستمرة، وتحليل البصرية اللونية البسيطة. ومع ذلك، يتم عادة استخدام Lfd ومصباح على نوعيا، على الرغم من أن كلا النهجين يمكن أن تستخدم الكمية مع أكثر تكلفة المعدات3. البلمرة المتسلسل (PCR) يوفر خصوصية عالية وحساسية عالية، وقدرة على كمية بالمقارنة مع الأساليب المذكورة آنفا للكشف. مع ذلك، يتطلب تكنولوجيا PCR التقليدية المستندة إلى مختبر معدات المختبرات مكلفة والموظفين المهرة، والذي عيب رئيسي في اعتماد هذه التكنولوجيا كطريقة كشف لأغراض في الموقع.
ويتجلى في هذا البروتوكول، أسلوب تشخيص في الموقع باستخدام أداة PCR محمولة في الوقت الحقيقي. تكنولوجيا PCR الوقت الحقيقي يوفر مزايا أكثر من الأساليب الأخرى من حيث كمية الدقة والحساسية، وبراعة، وقد استخدمت على نطاق واسع للكشف عن مجموعة واسعة من النباتات المسببة للأمراض4،5، بما في ذلك مختلف البطاطا المسببة للأمراض في التربة6. بسبب الاتجاهات الأخيرة في سوق سريعة النمو والقدرة على المنافسة، واصلت المعدات المطلوبة لتقنية PCR تطويرها لتكون أكثر إيجازاً وأقل تكلفة7. البروتوكول يتكون من الخطوات التالية: استخراج الحمض النووي القائم على حبة المغناطيسية والمحمولة PCR الوقت الحقيقي (مقايسة على أساس التحقيق فلوروجينيك)، وتحليل البيانات الكمية التي يمكن أن كل شيء يتم عن بعد باستخدام كمبيوتر محمول (الشكل 1).
استخدام بروتوكول PCR المحمولة نمواً هنا، تم تحليل عينات التربة للكشف عن الممرضات المنقولة بالتربة، سوبتيرانيا سبونجوسبورا. واختير سبونجوسبورا كما ممرض بطاطا هامة كعامل سببية جرب مساحيق8. وفي العقود الأخيرة، يعتبر وجود هذا المرض قد انتشر إلى كثير من المناطق التي تزرع فيها البطاطا9،10. جرب مساحيق، من خلال وجود بثرة مثل الآفات على الدرنات يمكن أن يسبب خسائر كبيرة العائد النوعي لزارعي البطاطا. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن ناقل سوبتيرانيا س. البطاطا باتاكا أعلى الفيروسات (بمتف)، التي يمكن أن تسبب أعراض الآفة الداخلية في11،الدرنات (المعروفة باسم سبرينج)12. ولذلك، من المهم معرفة ما إذا كان حاضرا في الحقول قبل زراعة6 س. سوبتيرانيا . نحن أيضا إثبات جدوى هذا البروتوكول للكشف عن مرضى سولاني ملامسة المجموعة 3 (AG3) وبمتف. على الرغم من أن العديد من المجموعات ملامسة مرضى سولاني تسبب أمراضاً في البطاطس، AG3 هو يمكن القول أن الأكثر أهمية في العالم13، مما تسبب في وقف آفة والقشرة السوداء أسفر عن خسائر المحصول التسويقي لتصل إلى 30%14. بمتف يسبب آفات نخرية داخل الدرنات، التي تسمى عادة سبرينج. هذا الفيروس سجلت مؤخرا لأول مرة في العديد من الدول في شمال غرب المحيط الهادئ15،،من1617، وهو القلق المتزايد للمزارعين في هذه المنطقة تزايد أهمية البطاطس. بالإضافة إلى تحديد فعالية PCR المحمولة لهذه الأمراض الهامة، كما جرى التحقيق استخراج الحمض النووي الأمثل المنهجية والتربة حجم العينة في هذه الدراسة.
تشير النتائج إلى أن أسلوب PCR المحمول مرنة وقابلة للتطبيق للكشف عن مسببات الأمراض المختلفة. قمنا بتطوير طريقة الكشف في الموقع يمكن أن تسمح العاملين في خط المواجهة في الزراعة (الزراعمثلاً ) لاتخاذ القرارات السابقة المتعلقة بإدارة الأمراض، مثل تحديدات متنوعة أو التناوب، ويمكن تحديدها كمياً ممرض نبات في العينة وخلال دراسة استقصائية ميدانية، قبل الغرس، لتجنب احتمالات تفشي الأمراض.
Protocol
1. في الموقع الكشف الجزيئي لمسببات الأمراض باستخدام "نظام PCR الوقت الحقيقي المحمولة"
ملاحظة: انظر الشكل 1.
- استخراج الحمض النووي القائم على حبة المغناطيسي
ملاحظة: تم استخدام مغناطيسية على أساس حبة الحمض النووي استخراج مجموعة (مثلاً من بريميرديسيجن) وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. يجب تخزين جميع المواد الكاشفة في درجة حرارة الغرفة (18-25 درجة مئوية). وبمجرد تعليق "ك بروتيناز" المجففة بالتبريد (زجاجة No.1) (باستخدام زجاجة No.1a)، تخزين في-20 درجة مئوية.- مزيج من 20-50 مغ عينة التربة مع 500 ميليلتر من "حل الإعدادية عينة" في microtube.
ملاحظة: نسبة التربة: الإعدادية الحل مهم كالاختلاط بهم في نسب أخرى قد يؤدي إلى فشل تجارب المتلقين للمعلومات (مثلاً، تلوث بمثبطات PCR). - طحن التربة في الجزء السفلي من الأنبوب استخدام مدقة عقيمة صغيرة حتى الحل غائم. كذلك تعليق جزيئات التربة في الحل بالهز microtube، والسماح لها بالوقوف، دون عائق، للسماح للتربة جسيمات تسوية تماما (عادة ما بين 5 إلى 10 دقائق).
- نقل 200 ميليلتر من المادة طافية في microtube جديدة، وإضافة 200 ميليلتر من "تحلل المخزن المؤقت" (زجاجة رقم 2: الحل هيدروكلوريد غوانيدين) و 20 ميليلتر من "البروتيناز ك" (زجاجة No.1).
- مزيج دقة بعكس الأنبوب واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
ملاحظة: إذا تم العثور على غطاء microtube، الاستفادة من الأنبوب أو استخدام أجهزة الطرد مركزي، إذا كان متوفراً لإزالة من الغطاء. - إضافة 500 ميليلتر من مزيج حبة المخزن المؤقت/المغناطيسي ملزمة (زجاجة No.3) للعينة ليسيد. مزيج جيد من قبل بيبيتينج صعودا وهبوطاً، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق بعيداً عن رف الأنبوب المغنطيسي.
ملاحظة: تأكد من خلط الحل حبة جيدا قبل الاستعمال لضمان أن الخرز الكوتيد بالتساوي من زجاجة التخزين. - مكان microtube على الرف الأنبوب المغنطيسي. الانتظار على الأقل 2 دقيقة أو حتى جميع الخرز في microtube نعلق على الجدار الجانبي المغناطيسية. بعد ذلك، إزالة وتجاهل كل من المادة طافية بواسطة بيبيتينج.
ملاحظة: عدم الإزعاج الخرز ممغنط أثناء إزالة ويسفط المادة طافية. الآن تم التقاطه الحمض النووي بالخرز المغناطيسية. - إزالة microtube من الرف الأنبوب المغنطيسي، إضافة 500 ميليلتر من المخزن المؤقت-1 يغسل (زجاجة رقم 4: الحل الإيثانول/فوق كلورات الصوديوم) وإعادة تعليق الخرز قبل بيبيتينج المتكررة حتى الخرز موزعة على شكل موحد. تنفيذ هذه الخطوة الغسيل لإزالة البروتين والملح من العينة. واسمحوا المخلوط الجلوس لمدة 30 ثانية.
- كرر الخطوة 1.1.6.
- إزالة microtube من الرف الأنبوب المغنطيسي، إضافة 500 ميليلتر من المخزن المؤقت-2 الغسيل (الزجاجة رقم 5: الحل الإيثانول/فوق كلورات الصوديوم) وإعادة تعليق الخرز قبل بيبيتينج المتكررة حتى الخرز موزعة على شكل موحد. واسمحوا المخلوط الجلوس لمدة 30 ثانية.
- كرر الخطوة 1.1.6.
- إزالة microtube من الرف الأنبوب المغنطيسي، ثم قم بإضافة 500 ميليلتر من الإيثانول 80% (زجاجة رقم 6).
ملاحظة: هذه الخطوة ضروري لإزالة الأملاح المتبقية من العينة.- إعادة تعليق الخرز قبل بيبيتينج المتكررة حتى الخرز موزعة على شكل موحد. السماح لهذا الموقف لمدة 10 دقيقة مع خلط أحياناً بانعكاس.
- كرر الخطوة 1.1.6.
- الهواء الجاف بيليه حبة المغناطيسية لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع غطاء microtube المفتوحة.
ملاحظة: ينبغي أن تكون خالية من أي الإيثانول تبقى مرئية الخرز لكن ليس تماما جفت. - إزالة microtube من الرف الأنبوب المغنطيسي وإضافة 50-200 ميليلتر من "شطف المخزن المؤقت" (زجاجة رقم 7) وإعادة تعليق الخرز قبل بيبيتينج المتكررة حتى الخرز موزعة في شكل موحد، والسماح لها الوقوف لمدة 30 ثانية.
ملاحظة: في الخطوات المذكورة أعلاه، هو الإفراج عن الحمض النووي المنقي من الخرز المغناطيسية في المخزن المؤقت شطف. - مكان microtube على الرف الأنبوب المغنطيسي. الانتظار على الأقل 2 دقيقة أو حتى جميع الخرز في microtube نعلق على الجدار الجانبي المغناطيسية.
- نقل المادة طافية يحتوي الآن على تنقية الحمض النووي/الجيش الملكي النيبالي أن microtube 0.5 مل للاستخدام في الخطوات النهائية.
- مزيج من 20-50 مغ عينة التربة مع 500 ميليلتر من "حل الإعدادية عينة" في microtube.
- PCR الوقت الحقيقي المحمولة
ملاحظة: ثيرموسيكلير محمولة وأدوات التحليل PCR استخدمت طبقاً لإرشادات الشركة المصنعة (انظر الجدول للمواد).- فتح وتشغيل البرمجيات المرتبطة ثيرموسيكلير، حدد اختبار الكشف عن الهدف وإدخال جميع المعلومات وصف في حقول إدخال البيانات اسم والتفاصيل والملاحظات وعينات، و الاختبارات .
ملاحظة: آبار #1 و #2 يعينون ببرامج للمراقبة السلبية ومراقبة إيجابية، على التوالي. - إعداد PCR الكواشف قبل الاستخدام. نقل 500 ميليلتر من المخزن المؤقت إعادة تعليق مزيج الرئيسي في أنبوب يحتوي على مزيج الرئيسي المجففة بالتبريد والمزيج جيدا بانعكاس. تحويل المزيج سيد كامل إلى microtube براون المسمى الإشعال/مسبار (الجدول 2).
- كاب ويهز microtube المزيج. خلط شامل مطلوب للتأكد من أن جميع مكونات إعادة توقفت تماما. السماح لهذا الخليط الجلوس لمدة 5 دقائق قبل الاستعمال.
ملاحظة: تخزين ميكس رد فعل في-20 درجة مئوية بعد الاستخدام.
- كاب ويهز microtube المزيج. خلط شامل مطلوب للتأكد من أن جميع مكونات إعادة توقفت تماما. السماح لهذا الخليط الجلوس لمدة 5 دقائق قبل الاستعمال.
- إعداد عنصر تحكم سلبية عن طريق نقل 10 ميليلتر من مزيج استعداد رد فعل من الخطوة السابقة في أنبوب بكر 0.2 مل ثم قم بإضافة 10 ميليلتر ماء منزوع عقيمة خالية من نوكلاس.
- إعداد عنصر تحكم إيجابية بنقل 10 ميليلتر من مزيج استعداد رد فعل من الخطوة 1.2.2 في أنبوب بكر 0.2 مل ثم قم بإضافة 10 ميليلتر من قالب التحكم الإيجابي.
- لكل عينة، نقل 10 ميليلتر من مزيج استعداد رد فعل من الخطوة السابقة في أنبوب بكر 0.2 مل ثم قم بإضافة 10 ميكروليتر من عينة الحمض النووي أعد الخطوة 1.1.16.
- تحميل آبار ثيرموسيكلير مع المحتويات من على أنابيب PCR كل منها كما هو موضح في الخطوة 2.1.1.
- بعد إدخال كافة المعلومات الضرورية وأكدت، حدد بدء تشغيل ثم اختر أداة اتصال ethernet أو محرك أقراص USB.
ملاحظة: إذا تم تحديد خيار محرك أقراص USB، يجب حفظ الملف التشغيل على محرك الأقراص ليتم استخدامها مع ثيرموسيكلير (مثلاً، F:\genesig). وسيبدأ التشغيل فورا بعد أن يتم إدراج محرك الأقراص إلى ثيرموسيكلير.
- فتح وتشغيل البرمجيات المرتبطة ثيرموسيكلير، حدد اختبار الكشف عن الهدف وإدخال جميع المعلومات وصف في حقول إدخال البيانات اسم والتفاصيل والملاحظات وعينات، و الاختبارات .
- بيانات تحليل PCR المحمولة في الوقت الحقيقي.
- وبمجرد الانتهاء من التشغيل، افتح ملف التشغيل (.usb) من محرك أقراص USB باستخدام البرمجيات المرتبطة ثيرموسيكلير أو مباشرة عرض نتائج التشغيل في البرنامج بواسطة النقر فوق النتائج.
- قبل تحليل النتائج، حفظ تشغيل المكتملة لتجنب فقدان البيانات.
- في علامة التبويب النتائج ، عرض حالة التشغيل، مصنفة حسب العينات.
ملاحظة: البيانات التي يمكن الحصول عليها في علامة التبويب هذه هي حالة النتائج ونسخ الرقم التي اكتشفت في العينة. - انقر فوق علامة التبويب تفاصيل لعرض منحنيات التضخيم. عند الكشف عن الهدف بنجاح، يتم عرض قيم Cq (دورة القياس الكمي) لكل من الهدف والرقابة الداخلية.
ملاحظة: هذه القيم يتم حسابها في التقرير النهائي، ويتم استخدامها لتحديد ما إذا كانت عينة إيجابية بالنسبة للهدف وإذا كان هناك مشاكل مع رد فعل أو العينات من الحمض النووي.
2-غيرها من البروتوكولات
-
بديلة تستند إلى مختبر أساليب استخراج الحمض النووي
-
كتاب-الفينول-كلوروفورم استناداً إلى أساليب
- تنفيذ أساليب كتاب-الفينول-كلوروفورم على أساس، واتباع أسلوب دويل18 و الأسلوب ديلابورتا19 كما هو موضح سابقا.
-
أسلوب الإعداد المصغر الحمض النووي
ملاحظة: وأجرى في أسلوب إدواردز20 كما يلي.- إضافة 500 ملغ تربة، تليها خمس حبات السيراميك 1.4 مم وميليلتر 750 إدواردز المخزن المؤقت (200 ملم تريس، pH 8.0، 200 ملم كلوريد الصوديوم، 25 مم يدتا، الحزب الديمقراطي الصربي 0.5 ٪) إلى microtube ومزيج جيد.
- احتضان microtube عند 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- مجانسة العينة مع حبة الخافق الخالطون ل 60 ثانية (أو باستخدام مدافع الهاون والمدقة).
- الطرد المركزي العينة في 14,000 س ز لمدة 5 دقائق.
- نقل 500 ميليلتر من المادة طافية إلى microtube الطازج وثم تخلط مع 500 ميليلتر من الايزوبروبانول مبردة. مزج بعكس الأنبوب 10 مرات.
- الطرد المركزي العينة في 14,000 س ز لمدة 15 دقيقة بيليتيزي في الحمض النووي.
- صب المادة طافية والسماح للحمض النووي بيليه الهواء الجاف في درجة حرارة الغرفة حتى يتبخر الإيثانول المتبقية.
- أغسل بيليه الحمض النووي مع ميليلتر 750 مبردة الإيثانول 70%.
- الهواء الجاف بيليه قبل إعادة تعليق في 50-100 ميليلتر من المخزن المؤقت للشركة المصرية للاتصالات (10 ملم تريس-HCl، pH 8.0 و 1 مم يدتا).
-
طرق بديلة أخرى
- القيام باستخراج السليكا-قاعدة الحمض النووي باستخدام مجموعة #1 (بيو MP حمل الحمض النووي تدور) وطقم #2 (زيمو بيوميكس الحمض النووي مينيبريب Kit) وفقا لتعليمات الشركات المصنعة.
-
كتاب-الفينول-كلوروفورم استناداً إلى أساليب
-
PCR الوقت الحقيقي التقليدية المستندة إلى المعمل.
ملاحظة: وكان استخدام ثيرموسيكلير تقليدية مع mastermix بكر القائم على التحقيق ومختلف أجهزة الإشعال واليغنوكليوتيد المسابر (الجدول 2).- استخدام PCR أدنى غير شفافة أنابيب أو لوحة بكر، إعداد 20 ردود فعل ميليلتر لجميع عينات من الحمض النووي تحليلها، فضلا عن السيطرة سلبية (خالية من نوكلاس المياه) وإعداد عنصر تحكم قالب إيجابية داخل المنظمة.
- لكل بكر أنبوب أو الاستعداد جيدا، مزيج بما في ذلك 10 ميليلتر من mastermix، ميليلتر 7 من المياه خالية من نوكلاس، ميليلتر 2 2 ميكرومتر كبسولة تفجير/المسبار، و 1 ميليلتر من عينات الحمض النووي (من الخطوة 1.1.16 أو 2.1) أو قالب عنصر التحكم، كل عينة.
- إغلاق أنابيب PCR أو لوحة والبدء في رد فعل عن طريق تحديد برنامج PCR المناسب.
-
تحليل البيانات من PCR الوقت الحقيقي التقليدية المستندة إلى مختبر
- استخدام البرمجيات المرتبطة ثيرموسيكلير لتحليل النتائج من ثيرموسيكلير التقليدية. للبدء في تحليل البيانات، نقل ملف التشغيل من ثيرموسيكلير إلى محرك أقراص USB وإدراج محرك أقراص USB وحدد تصدير.
- فتح ملف البيانات (.pcrd) من تم تصديرها تشغيل البرمجيات المرتبطة ثيرموسيكلير.
- تسليط الضوء على من عينة جيدا قبل تحديد مكان المقابلة لها جيدا على الصك. يتم تلقائياً إنشاء منحنيات التضخيم والمنحنيات القياسية (إذا كان قابلاً للتطبيق). إذا لم يتم إدخال معلومات نموذج، انقر فوق إعداد لوحة أو وظيفة مماثلة للبدء في إدخال البيانات قبل تحليل البيانات.
- عرض البيانات في علامة التبويب التحديد الكمي؛ وهذا يمكن تصديرها لتحليل البيانات باستخدام برنامج طرف ثالث مثل قارئات الملف CSV أو XML أو HTML.
- الحصول على بيانات الاستبيان المفاهيمي استناداً إلى عتبات محددة ومقارنتها مع عناصر إيجابية وأخرى سلبية.
ملاحظة: إذا تم استخدام معايير الحمض النووي الهدف في المقايسة، مقارنة البيانات عينة الاستبيان المفاهيمي لتلك المعايير لتحديد وقف الاستبيان المفاهيمي
Representative Results
مقارنة بين أساليب استخراج الحمض النووي
تم تقييم مدى توافق طريقة استخراج الحمض النووي القائم على حبة المغناطيسي مع بكر في الوقت الحقيقي عن طريق الكشف عن المبالغ التي سوبتيرانيا س. الحمض النووي في عينة تربة من الحقول الموبوءة بمسببات المرض. كما هو موضح في تكميلية الشكل 1، الأسلوب القائم على حبة المغناطيسي كان مقارنة بالأساليب الأخرى بما في ذلك كتاب-الفينول-كلوروفورم على أساس أسلوب18الحمض النووي المصغر إعداد أساليب19،20وسريعة وأخرى القياسية المستندة إلى السليكا الحمض النووي استخراج مجموعات. عينات الحمض النووي المستخرج باستخدام أساليب مختلفة ستة تعرضوا للتقليدية المستندة إلى مختبر PCR الوقت الحقيقي. تشير النتائج إلى أن الأسلوب القائم على حبة المغناطيسي قابل للمقارنة مع أساليب أخرى، على الرغم من أن أدوات استخراج الحمض النووي القائم على السليكا أظهرت أفضل أداء بين الأساليب التي اختبرناها. يحتوي على كافة مجموعات ثيوسيانات جوانيدينيوم أو هيدروكلوريد جوانيدينيوم: كلاهما وكلاء تشاوتروبيك القوية، التي تؤذي معظم البروتينات الخلوية بما في ذلك رنسيس ودناسيس. ولذلك، باستخدام الأساليب مناسبة لاستخراج الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي.
مقارنة بين PCR الوقت الحقيقي محمولة و PCR الوقت الحقيقي تقليدية المستندة إلى مختبر
لمقارنة بحساسية وخصوصية بكر المحمولة إلى بكر المستندة إلى مختبر تقليدية، الكمي المطلق لمسببات المرض الحمض النووي أجرى باستخدام كميات مختلفة من الجينات للبحث عن س. سوبتيرانيا ، الذي قام بناقل تي بجيم21 . سلسلة لتخفيف إذ الجينات للبحث عن (106 إلى 100 نسخ) تم تحليلها باستخدام مجموعة الإشعال/مسبار ستك22. وأظهرت النتائج أن طريقة PCR المحمولة الكشف عن مسببات المرض المستهدف الحمض النووي (~ 100 نسخة)، على الرغم من الحساسية 10 مرات أقل من التي اكتشفت طريقة PCR المستندة إلى مختبر التقليدية، على الأقل 10 نسخ (الشكل 2).
لمزيد من التحقق من الصحة، تم اختبار التربة الموبوءة مصطنع. وتم الحصول على سوبتيرانيا س. سبوروسوري من الصفراوات جرب مسحوق جذر من جذور البطاطا. كانت تعج التربة معلقات سبوروسوري بتركيز نهائي 105 سبوروسوري/غرام وزن جاف للتربة. استخدام الأسلوب القائم على حبة المغناطيسي، تم استخراج الحمض النووي من عينات التربة الملوثة، وتخفيف المسلسل إذ أعدت للحصول على تركيزات يعادل 105104، 103، 102، 101و 100 الجاف سبوروسوري/غرام وزن تربة. واستخدمت عينات الحمض النووي لبكر استخدام مجموعة التحقيق التمهيدي/23SPO. وأظهرت النتائج أن طريقة PCR المحمولة على القدرة التحليلية المقارنة إلى أسلوب PCR تقليدية المستندة إلى المعمل ولكن مرة أخرى، تم تخفيض الحساسية بمعامل ~ 10 (الشكل 3).
وأخيراً، قمنا باختبار عينة تربة من أحد الحقول التي كانت ملوثة بطبيعة الحال مع س. سوبتيرانيا. وأجرى استخراج الحمض النووي القائم على حبة المغناطيسية على كميات مختلفة من التربة (10، 20، 50 و 100 ملغ من التربة الواحدة 500 ميليلتر لاستخراج المخزن المؤقت الحل). تشير النتائج إلى أن الوزن الأمثل للتربة كمادة انطلاق لاستخراج الحمض النووي 50-100 مغ (الشكل 4). كميات التربة خارج النطاق أدى إلى فشل الخطوات PCR المتلقين للمعلومات. قد يكون هذا الأثر لأنه عندما يتم استخدام المبالغ الزائدة من التربة كابتداء من المواد، التلوث (مثلاً، مركبات الفينولية) يمكن أن تتداخل مع بكر24. في حالة انخفاض كميات من التربة، قد تكون كمية الحمض النووي المستخرج أقل من حد الكشف لبكر (مثلاً، العائد الإجمالي قد تباينت الحمض النووي المستخرج من 10-20 ملغ التربة). وكان حساسية المقارنة تماما بين بكر المحمولة والأساليب التقليدية في PCR. تم الحصول على نتائج مماثلة في عينات من الحمض النووي من أساليب الاستخراج مختلفة (الإضافي رقم 2)
الكشف عن مسببات الأمراض الأخرى بنظام الكشف الموقعي بكر محمولة في الوقت الحقيقي باستخدام
نحن اختبار طريقة PCR المحمولة للكشف عن الأخرى المسببة للأمراض الهامة البطاطس المنقولة بالتربة، سولاني ر. AG3، وبمتف. في هذه الدراسة، أجرينا PCR الوقت الحقيقي استخدام كبسولة تفجير/RQP1 رستق مجموعة التحقيق25 لكشف AG3 R. سولاني مع الحمض النووي من ثقافة نقية. ونحن أيضا تنفيذ في الوقت الحقيقي باستخدام PCR استخدمت بمتف-د التحقيق التمهيدي/مجموعة26 للكشف عن بمتف مع الجيش الملكي النيبالي من عينة درنة أعراض سبرينج. كما هو موضح في الشكل 5، طريقة PCR المحمولة بنجاح الكشف عن العوامل الممرضة على حد سواء. وكانت النتائج المقارنة بين الأدوات المحمولة والتقليدية، مما يوحي بأن أسلوب PCR المحمولة تنوعاً وقابلة للتطبيق لاكتشافات مسببات الأمراض الأخرى إذا كانت متوفرة تسلسل التمهيدي مصممة لبكر في الوقت الحقيقي.
الشكل 1. الداخلي لنظام PCR الوقت الحقيقي المحمولة للكشف عن العوامل الممرضة في الموقع. ويتكون البروتوكول من الخطوات بالترتيب التالي: إعداد ليستي بتجانس موجزة (A)، واستخراج الحمض النووي القائم على حبة المغناطيسي (ب)، PCR الوقت الحقيقي المحمولة (ج)، وتحليل البيانات الكمية باستخدام جهاز كمبيوتر محمول (د). لاحظ أنه يمكن إكمال كافة الخطوات في الموقع.
الشكل 2 . مقارنة لحساسية بين بكر محمولة وتقليدية المستندة إلى مختبر [بكر- تم إجراء القياس الكمي لمسببات المرض الحمض النووي باستخدام كميات مختلفة من الجينات للبحث عن سوبتيرانيا س. (106 إلى 100 نسخ) مع ستك الإشعال/التحقيق تعيين. الانحدار الخطي بين قيمة السجل سوبتيرانيا S. بلازميد الحمض النووي وقيمة سجل المعاملة بالمثل من الاستبيان المفاهيمي في ثيرموسيكلير التقليدية (A) وثيرموسيكلير المحمولة (ب). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 . مقارنة الأداء الكشف في التربة الموبوءة مصطنع مع سوبتيرانيا س.. التربة شكل مصطنع التي تنتشر فيها (10 الجاف5 إلى 100 سبوروسوري/غرام وزن التربة) مع تعليق سبوروسوري س. سوبتيرانيا . استخدام الأسلوب القائم على حبة المغناطيسي، تم استخراج الحمض النووي من عينات التربة الملوثة. تقارير إتمام المشروعات أجريت باستخدام عينات التربة مع مجموعة التحقيق التمهيدي/مكتب التخطيط الاستراتيجي. الانحدار الخطي بين قيمة سجل كمية البدء في سبوروسوري كل غرام من التربة وقيمة سجل المعاملة بالمثل من الاستبيان المفاهيمي في ثيرموسيكلير التقليدية (A) وثيرموسيكلير المحمولة (ب). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 . مقارنة لبدء كمية من عينات التربة لاستخراج الحمض النووي- تم استخدام الأسلوب القائم على حبة المغناطيسي لاستخراج الحمض النووي من 10، 20، 50، و 100 مغ من عينات التربة. أجريت تقارير إتمام المشروعات في الوقت الحقيقي باستخدام ثيرموسيكلير المحمولة. المنحنيات القياسية تمثل العلاقة بين مبلغ إجمالي الحمض النووي المستخرج من عينات التربة (س) وكميات المنتج بكر المحور (ص) تضخيمه من قبل مجموعة التحقيق التمهيدي/نظام الضمان الاجتماعي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5 . الكشف عن مسببات البطاطا الأخرى، سولاني ر. وبمتف- أجريت تقارير إتمام المشروعات في الوقت الحقيقي باستخدام ثيرموسيكلير المحمولة وثيرموسيكلير التقليدية. سولاني ر. تم الكشف عن AG3 في مجموع الحمض النووي المستخرج من ثقافة نقية باستخدام كبسولة تفجير رستق والتحقيق RQP1 (A) بمتف واكتشفت في مجموع الحمض النووي الريبي المستخرج من الدرنات المصابة بمتف باستخدام نموذج تعيين التمهيدي/المسبار بمتف-د (ب). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 6 . خط أنابيب تشخيصية فيتوباثوجينس. مخطط انسيابي يبين سير عمل عامة للتشخيص فيتوباثوجين. لاحظ أن الخطوة التقليدية، مثلاً، تحديد الهوية البصرية، ويمكن إهماله إذا كان يستخدم الكشف الجزيئي في الموقع، مما يجعل العملية برمتها من تشخيص بسيطة وسريعة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| PCR الوقت الحقيقي المحمولة | بكر في الوقت الحقيقي | مصباح | أليسا | التدفق الأفقي | |
| التكلفة لكل رد فعل الهدف | 0.60 دولار-دولار 8.47 | 0.60 دولار | $0.75 | 0.60 دولار | $4.74 |
| حساسية | 100 نسخة | 10 نسخ | 10 نسخ | 1-10 سبوروسوري33 1-10 نانوغرام/مليلتر (بروتين)33 |
1-10 سبوروسوري34 5 × 105زيمبابوي/mL35 |
| حساب الوقت | 90 دقيقة | 80-240 دقيقة | 50-90 دقيقة32 | 3-24 ساعة | 10-15 دقيقة |
| الإعداد المطلوب | استخراج حمض ●Nucleic ● تصميم التمهيدي |
استخراج حمض ●Nucleic ● تصميم التمهيدي/التحقيق |
● استخراج حمض نوسيليك ● تصميم التمهيدي |
● استخراج البروتين ● الأجسام المضادة |
N/A |
| غيرها من المواد المطلوبة | ● ثيرموسيكلير المحمولة | ● ثيرموسيكلير التقليدية | ● قياس الألوان وصمة عار ● حاضنة |
● لوحة قارئ ● معدات الغسيل |
N/A |
الجدول 1. جدول مقارن لأساليب الكشف الجزيئي والمصلية فيتوباثوجينس
| التمهيدي | تسلسل (5 – 3) | الهدفب | |
| ستق إف13 | ككجكاجاكككاااكك | ITS1-ITS2 في سوبتيرانيا س. | |
| ستك-ص13 | كججكجتكاكككتكا | ITS1-ITS2 في سوبتيرانيا س. | |
| ف ستك13 | [الاتحاد الماليزي] كاجاكاتكجكاكككاجتكتكاتج [تام] | ITS1-ITS2 في سوبتيرانيا س. | |
| جينيسيج S.subterranea التمهيدي/التحقيق | N/A | أكتين في سوبتيرانيا س. | |
| SPO1014 | جتكجتككاتجكتجا | للبحث عن في سوبتيرانيا س. | |
| SPO1114 | جكاكجككاتجتاجاجا | للبحث عن في سوبتيرانيا س. | |
| SPOPRO114 | [الاتحاد الماليزي] ككجتجكجكجتكتكتجكت [تام] | للبحث عن في سوبتيرانيا س. | |
| RsTqF119 | آجاجتتجتجتاجكتجتكتاتت | ITS1-ITS2 في سولاني ر. | |
| RsTqR119 | آتككككاكتجتكتكاكاجت | ITS1-ITS2 في سولاني ر. | |
| RQP119 | [الاتحاد الماليزي] تتاجكاتجتجكاكاككتكككتكتتك [تام] | ITS1-ITS2 في سولاني ر. | |
| بمتف جينيسيج التمهيدي/التحقيق | N/A | CP-RT في بمتف | |
| بمتف-د-و20 | أجاتجركاتكجااكاجكا | CP في بمتف | |
| بمتف-د-ص20 | جتكجكجكتككاتتكجت | CP في بمتف | |
| بمتف-د-ف20 | [الاتحاد الماليزي] ككاكااكاجاكاجتاتجتككجا [تام] | CP في بمتف | |
| أ تم تعديل الإشعال "اليغو الحمض النووي" مع الاتحاد الماليزي (6-كاربوكسيفلوريسسين) أو تام (5-كاربوكسيتيتراميثيلرهوداميني) | |||
| ب للبحث عن: الفواصل يدون الداخلية، CP: معطف البروتين؛ CP-RT: معطف البروتين ريدثرو | |||
الجدول 2. الإشعال المستخدمة في هذه الدراسة
التكميلية الرقم 1. مقارنة بين أساليب استخراج الحمض النووي للكشف عن مسببات المرض جرب مساحيق. وقورنت ستة مختلف أساليب استخراج الحمض النووي (واو) للكشف عن مسببات المرض جرب مساحيق، س. سوبتيرانيا في عينات التربة. (ب، د، و). تم استخراج الحمض النووي باستخدام مجموعة المستندة إلى السليكا #1 (انظر "الجدول للمواد" لكل مجموعة أسماء)، القائم على السليكا ريبسيكتيفيلي kit #2، وطقم المستندة إلى حبة المغناطيسي،. تم إجراء PCR باستخدام ثيرموسيكلير بكر المستندة إلى مختبر التقليدية. المنحنيات القياسية تمثل العلاقة بين مبلغ إجمالي الحمض النووي المستخرج من عينات التربة وكميات المنتج بكر تضخيمه من قبل مجموعة الإشعال/مسبار ستك. اضغط هنا لتحميل هذا الرقم-
التكميلية الرقم 2. مقارنة بين حد الكشف بين بكر محمولة وبكر تقليدية المستندة إلى المعمل. "الحمض النووي المجموع" تم عزلها من عينة تربة باستخدام ثلاثة أساليب الاستخراج مختلفة: (أ، ب) دويل أسلوب، (ج، د) القائم على السليكا كيت #2، و (ه، و) طقم المستندة إلى حبة المغناطيسية. مجموعة رسومات بيانية تظهر على اليسار البيانات تستخدم ثيرموسيكلير المحمولة مع مجموعة الإشعال/التحقيق في نظام الضمان الاجتماعي، بينما تمثل الرسوم البيانية في الحق البيانات التي تم إنشاؤها باستخدام ثيرموسيكلير المستندة إلى مختبر التقليدية مع ستق الإشعال/التحقيق. اضغط هنا لتحميل هذا الرقم-
Discussion
كما هو مبين في الجدول 1، والتطورات التكنولوجية الأخيرة في تحديد العوامل المسببة للأمراض الجزيئي زادت كفاءة ودقة، وسرعة التشخيص، مما أسهم في الكشف عن الالتهابات أعراض ما قبل27. وفيما يتعلق بتشخيص الموقعي، مصباح وأساليب التدفق الأفقي تستخدم بشكل متكرر لأنها قابلة للنقل وتقديم نتائج فورية بتكلفة أقل. ومع ذلك، في حالة الطرق المصلية، يمكن أن الكشف عن إبلاغها يصعب تحقيقه. ويؤدي ذلك أحياناً ميسديتيكشن للميكروبات خارج الهدف مثل سكان التربة المشتركة. على سبيل المثال، يمكن أن يكون هناك تفاعلية عبر بين الاختبارات المصلية لفحة spp. و Pythium spp. في حالة البطاطا مسببات الأمراض28، مما يشير إلى أن هناك في بعض الأحيان صعوبات في الكشف عن المصنع المستهدف مسببات الأمراض.
في هذه الدراسة، وقد وضعنا بروتوكولا أمثل للكشف الجزيئي في الموقع من مسببات الأمراض المنقولة بالتربة البطاطس باستخدام نظام PCR الوقت الحقيقي المحمولة بمقارنة قدراته مع ذلك التقليدية نظام PCR الوقت الحقيقي على المعمل. ووجدنا أن الأسلوب في الموقع على وجه التحديد الكشف عن مسببات الأمراض البطاطا في عينة التربة، على الرغم من حساسية ~ 10 مرات أقل من تلك ما يعادل المقايسة المستندة إلى مختبر. كما أنها جديرة بالنظر فيها أن التجارب المختبرية والميدانية على حد سواء لا تستخدم في هذه الحالة حجم عينة البيولوجية ذات صلة. أحجام عينات كبيرة مطلوبة لاستخدامه في الفرز بشكل روتيني تربة الحقل كما هو موضح سابقا29،30، حيث تتم معالجة أحجام العينة من بين 250 غرام إلى 1 كغم، على الرغم من أن هذه الأساليب تتطلب المشغلين المهرة ومتطورة معدات لاستخراج الحمض النووي. عادة، تربة على نطاق واسع استخراج الحمض النووي مأخوذ من عينة تربة تجميعية واحد ممثل عنها العديد عبر هكتار 1 إلى 46،،من2930. ومع ذلك، البروتوكول وضع هنا هو سريعة وسهلة الاستخدام للمستخدمين مع عدم وجود خبرة سابقة في التشخيص الجزيئي ويمكن استخدامها خارج مختبر. كما الطريقة سريعة ورخيصة نسبيا مقارنة باستخراج التربة على نطاق واسع، ويمكن استخدامه للشاشة العديد من عينات صغيرة مأخوذة من منطقة مماثلة لأخذ عينات لعينات الكلي على نطاق واسع. هذا يمكن التغلب على بعض أوجه القصور في حجم عينة صغيرة وتحديد معلومات إضافية حول التوزيع المكاني لمسببات المرض في الحقل. وباﻹضافة إلى ذلك، قابلية وسرعة من الطريقة يعني أنه يمكن أيضا استخدامه في أنشطة البيان العملي للمزارعين للتعليم وأغراض المشاركة.
وهناك اعتبار آخر أن العديد من فحوصات PCR الوقت الحقيقي فعلا تنشر لمجموعة واسعة من مسببات أمراض النبات5. ويمكن جعل هذا النظام استخدام هذه الاختبارات الموجودة دون الحاجة لتصميم كبسولة تفجير مصباح جديد لتمكين في الاختبار الميداني. انتقادات متكررة لفحوصات مصباح أنها يمكن أن يكون من الصعب على تصميم31. ولذلك، يسمح PCR المحمولة، تنفيذ مجموعة واسعة من الاختبارات الممرض متاحة بسهولة للاختبار في الموقع سهلة نسبيا.
يمكن أن تكون الأساليب التقليدية غالباً ما مكلفة وشاقة وغير دقيقة، وتستغرق وقتاً طويلاً. بساطة الأسلوب في الموقع الذي وضعنا يسمح لمزارعي وعمال الصناعة القيام بالكشف عن العوامل الممرضة بأنفسهم وربما تولد نتيجة أسرع بكثير من إرسال إلى مختبر تشخيص التي يمكن أن تكون بعض المسافة بعيداً. سرعة وحساسية لأسلوب PCR المحمولة يمكن أن تساعد المزارعين تجنب احتمال العدوى الثانوية، التي يمكن أن تزيد زيادة السكان الممرض وانتشار غير مقصودة (عن طريق المعدات أو البشر). وفي الختام، الأسلوب في الموقع الذي وضعت في هذه الدراسة تمكن من كشف دقيقة وحساسة نسبيا هام مسببات الأمراض المنقولة بالتربة في الحقل. وأملنا أن الأسلوب في الموقع الذي وضعت في هذه الدراسة ستسهم في توجيه تشخيص الحالية (الشكل 6)، ليس فقط بتوفير إجابات سريعة ودقيقة للأسئلة الوبائية عن الأمراض النباتية في الحقل ولكن أيضا بتوفير زيادة فهم علم الأحياء وعلم الأوبئة لمسببات الأمراض النباتية.
Disclosures
الكتاب يعلن لا تضارب المصالح المالية.
Acknowledgments
نحن ممتنون لنيل الدكتور جيم جودميستاد في "جامعة ولاية داكوتا الشمالية" لتوفير سوبتيرانيا S. بلازميد الحمض النووي، الدكتور هانو Pappu في جامعة الدولة واشنطن (WSU) لتوفير "بمتف الجيش الملكي النيبالي"، والدكتورة ديبرا أنجليس في WSU لتوفير سولاني ر. AG3. شكر خاص إلى الدكتور جيريمي وجويل في WSU لتقديم تعليقات على المخطوط والاتصالات كاهنرس WSU للفيديو. هذا البحث ودعم اتحاد البحوث البطاطا شمال غرب وواشنطن الدولة وزارة الزراعة-برنامج منح كتلة المحاصيل المتخصصة (منحة لا. K1764). بنس رقم 0741، علم الأمراض قسم النبات، كلية الزراعة، وعلوم الموارد البشرية والطبيعية، ومركز البحوث الزراعية، رقم المشروع هاتش WNP00833، جامعة ولاية واشنطن، بولمان، واشنطن، الولايات المتحدة الأمريكية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| White shell PCR plate | Bio-Rad | HSP9601 | |
| CFX Manager | Bio-Rad | 1845000 | |
| SsoAdvanced Universal Probes Supermix | Bio-Rad | 1725280 | |
| CFX96 Touch qPCR instrument | Bio-Rad | 1855195 | |
| Ethylalcohol, pure 200 proof | Decon Laboratories | 04-355-222 | |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) | Fisher BioReagents | BP118-500 | |
| Phenol, Saturated | Fisher BioReagents | BP1750I-400 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Fisher BioReagents | BP152-5 | |
| q16 real-time PCR machine | genesig | MBS486001 | |
| Ultrapure Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Invitrogen | 15525-017 | |
| 2-Propanol (Isopropanol) | JT Baker | 67-63-0 | |
| Chloroform | JT Baker | 9180-03 | |
| Hydrochloric Acid, 36.5-38.0% (HCl) | JT Baker | 9535-03 | |
| iso-Amyl Alcohol | JT Baker | 9038-01 | |
| FastDNA Spin kit | MP Biomedicals | 6560-200 | Silica-based DNA extraction kit #1 |
| Luna Universal One-Step RT-qPCR Kit | New England Biolabs | E3005S | |
| 0.1ml Low Profile Individual PCR Tubes | Phenix Research | MPC-100LP | |
| Easy DNA/RNA Extraction Kit | Primerdesign | genesigEASY-EK | |
| genesig Easy 1.5 mL tubes | Primerdesign | genesigEASY-1.5 | |
| Magnetic tube rack | Primerdesign | genesigEASY-MR | |
| Spongospora subterranea f. sp. subterranea genesig Easy Kit | Primerdesign | Path-S.subterranea-EASY | |
| Hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) | Sigma-Aldrich | H6269-100G | |
| Pellet pestles | Thermo Fisher Scientific | 12-141-364 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Thermo Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| DNA Miniprep kit | ZymoBIOMICS | D4300 | Silica-based DNA extraction kit #2 |
References
- Malcolm, G. M., Kuldau, G. A., Gugino, B. K., Jiménez-Gasco, M. delM. Hidden Host Plant Associations of Soil-borne Fungal Pathogens: An Ecological Perspective. Phytopathology. 103 (6), 538-544 (2013).
- Posthuma-Trumpie, G. A., Korf, J., van Amerongen, A. Lateral flow (immuno)assay: its strengths, weaknesses, opportunities and threats. A literature survey. Anal Bioanal Chem. 393 (2), 569-582 (2009).
- Hill, J., et al. Loop-Mediated Isothermal Amplification Assay for Rapid Detection of Common Strains of Escherichia coli. J Clin Microbiol. 46 (8), 2800-2804 (2008).
- Mumford, R. A., Walsh, K., Barker, I., Boonham, N. Detection of Potato mop top virus and Tobacco rattle virus Using a Multiplex Real-Time Fluorescent Reverse-Transcription Polymerase Chain Reaction Assay. Phytopathology. 90 (5), 448-453 (2000).
- Schena, L., Nigro, F., Ippolito, A., Gallitelli, D. Real-time quantitative PCR: a new technology to detect and study phytopathogenic and antagonistic fungi. European Journal of Plant Pathology. 110 (9), 893-908 (2004).
- Brierley, J. L., Stewart, J. A., Lees, A. K. Quantifying potato pathogen DNA in soil. Applied Soil Ecology. 41 (2), 234-238 (2009).
- Tomlinson, J. A., Boonham, N., Hughes, K. J. D., Griffin, R. L., Barker, I. On-Site DNA Extraction and Real-Time PCR for Detection of Phytophthora ramorum in the Field. Appl Environ Microbiol. 71 (11), 6702-6710 (2005).
- Harrison, J. G., Searle, R. J., Williams, N. A. Powdery scab disease of potato - a review. Plant Pathology. 46 (1), 1-25 (1997).
- Johnson, D. A., Miliczky, E. R. Distribution and development of black dot, Verticillium wilt, and powdery scab on Russet Burbank potatoes in Washington State. Plant Disease. 77 (1), 74-79 (1993).
- Merz, U. Powdery Scab of Potato-Occurrence, Life Cycle and Epidemiology. Am J Pot Res. 85 (4), 241 (2008).
- Jones, R. aC., Harrison, B. D. The behaviour of potato mop-top virus in soil, and evidence for its transmission by Spongospora subterranea (Wallr). Lagerh. Annals of Applied Biology. 63 (1), 1-17 (1969).
- Carnegie, S. F., Davey, T., Saddler, G. S. Effect of temperature on the transmission of Potato mop-top virus from seed tuber and by its vector, Spongospora subterranea. Plant Pathology. 59 (1), 22-30 (2010).
- Woodhall, J. W., Adams, I. P., Peters, J. C., Harper, G., Boonham, N. A new quantitative real-time PCR assay for Rhizoctonia solani AG3-PT and the detection of AGs of Rhizoctonia solani associated with potato in soil and tuber samples in Great Britain. Eur J Plant Pathol. 136 (2), 273-280 (2013).
- Banville, G. J. Yield losses and damage to potato plants caused by Rhizoctonia solani Kuhn. American Potato Journal. 66 (12), 821-834 (1989).
- Crosslin, J. M. First Report of Potato mop-top virus on Potatoes in Washington State. Plant Disease. 95 (11), 1483-1483 (2011).
- Whitworth, J. L., Crosslin, J. M. Detection of Potato mop top virus (Furovirus) on potato in southeast Idaho. Plant Disease. 97 (1), 149-149 (2012).
- Kaur, N., Cating, R. A., Dung, J. K. S., Frost, K. E., Robinson, B. A., Hamm, P. B. First Report of Potato mop-top virus Infecting Potato in Oregon. Plant Disease. 100 (11), 2337 (2016).
- Doyle, J. J. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus. 12, 13-15 (1990).
- Dellaporta, S. L., Wood, J., Hicks, J. B. A plant DNA minipreparation: Version II. Plant Mol Biol Rep. 1 (4), 19-21 (1983).
- Edwards, K., Johnstone, C., Thompson, C. A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis. Nucleic Acids Research. 19 (6), 1349 (1991).
- Bittara, F. G., Secor, G. A., Gudmestad, N. C. Chloropicrin Soil Fumigation Reduces Spongospora subterranea Soil Inoculum Levels but Does Not Control Powdery Scab Disease on Roots and Tubers of Potato. Am J Potato Res. 94 (2), 129-147 (2017).
- van de Graaf, P., Lees, A. K., Cullen, D. W., Duncan, J. M. Detection and Quantification of Spongospora subterranea in Soil, Water and Plant Tissue Samples Using Real-Time PCR. European Journal of Plant Pathology. 109 (6), 589-597 (2003).
- Maldonado, H., Falloon, R. E., Butler, R. C., Conner, A. J. Spongospora subterranea root infection assessed in two potato cultivars differing in susceptibility to tuber powdery scab. Plant Pathology. 62 (5), 1089-1096 (2013).
- Braid, M. D., Daniels, L. M., Kitts, C. L. Removal of PCR inhibitors from soil DNA by chemical flocculation. Journal of Microbiological Methods. 52 (3), 389-393 (2003).
- Lees, A. K., Cullen, D. W., Sullivan, L., Nicolson, M. J. Development of conventional and quantitative real-time PCR assays for the detection and identification of Rhizoctonia solani AG-3 in potato and soil. Plant Pathology. 51 (3), 293-302 (2002).
- Davey, T., Carnegie, S. F., Saddler, G. S., Mitchell, W. J. The importance of the infected seed tuber and soil inoculum in transmitting Potato mop-top virus to potato plants. Plant Pathol. 63 (1), 88-97 (2014).
- Boonham, N., et al. Methods in virus diagnostics: From ELISA to next generation sequencing. Virus Research. 186, 20-31 (2014).
- Mohan, S. B. Cross-reactivity of antiserum raised against Phytophthora fragariae with other Phytophthora species and its evaluation as a genus-detecting antiserum. Plant Pathology. 38 (3), 352-363 (1989).
- Ophel-Keller, K., McKay, A., Hartley, D., Curran Herdina, J. Development of a routine DNA-based testing service for soil-borne diseases in Australia. Austral Plant Pathol. 37 (3), 243-253 (2008).
- Woodhall, J. W., et al. A new large-scale soil DNA extraction procedure and real-time PCR assay for the detection of Sclerotium cepivorum in soil. Eur J Plant Pathol. 134 (3), 467-473 (2012).
- Miles, T. D., Martin, F. N., Coffey, M. D. Development of Rapid Isothermal Amplification Assays for Detection of Phytophthora spp in Plant Tissue. Phytopathology. 105 (2), 265-278 (2014).
- Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 28 (12), e63-e63 (2000).
- Narayanasamy, P. Microbial Plant Pathogens: Detection and Management in Seeds and Propagules. , John Wiley & Sons. (2016).
- Braun-Kiewnick, A., Altenbach, D., Oberhänsli, T., Bitterlin, W., Duffy, B. A rapid lateral-flow immunoassay for phytosanitary detection of Erwinia amylovora and on-site fire blight diagnosis. Journal of Microbiological Methods. 87 (1), 1-9 (2011).
