Summary
Snelle en nauwkeurige detectie van plant ziekteverwekkers on-site, met name bodem overgedragen ziekteverwekkers, is van cruciaal belang om te voorkomen dat verdere entmateriaal productie en verspreiding van plantenziekten in het veld. De methode ontwikkeld die hier met behulp van een draagbaar real-time PCR detectiesysteem kunt on-site diagnose onder veldomstandigheden.
Abstract
On-site diagnose van plantenziekten kan hierbij een nuttig instrument voor de telers voor tijdig beslissingen waardoor de eerdere uitvoering van strategieën voor het beheer van ziekte die vermindering van de impact van de ziekte. Momenteel in vele diagnostische laboratoria, de polymerase-kettingreactie (PCR), met name real-time PCR, wordt beschouwd als de meest gevoelige en nauwkeurige methode voor de detectie van plant pathogeen. Laboratorium gebaseerde PCRs vergen echter doorgaans dure laboratoriumapparatuur en ervaren personeel. In deze studie, bodem overgedragen ziekteverwekkers van aardappel gebruikt om aan te tonen van het potentieel voor on-site moleculaire detectie. Dit werd bereikt met behulp van een snelle en eenvoudige protocol met magnetische kraal gebaseerde nucleïnezuur extractie, draagbare PCR in real time (fluorogenic sonde gebaseerde assay). De draagbare real-time PCR aanpak gunstig in vergelijking met een laboratorium gebaseerde systeem, opsporen van slechts 100 exemplaren van DNA van Spongospora subterranea. De draagbare real-time PCR-methode ontwikkelde hier kan dienen als een alternatief voor laboratorium-gebaseerde benaderingen en een handige on-site tool voor pathogen diagnose.
Introduction
Nauwkeurige en snelle identificatie van de causatieve pathogenen gevolgen aanzienlijk besluiten met betrekking tot het beheer van de ziekte van de plant. Bodem-overgebrachte ziekten zijn bijzonder moeilijk te diagnosticeren omdat de bodem omgeving zeer groot ten opzichte van de plant massa en complex is, waardoor het een uitdaging om te begrijpen van alle aspecten van de bodem-overgedragen ziekten. Bovendien, bodem-overgebrachte ziekten kunnen symptomless tijdens infectie beginfases afhankelijk milieustressoren, en sommige hebben lange latente perioden die leiden tot een vertraagde diagnoses1. Vele bodem overgedragen ziekteverwekkers hebben overleving structuren, zoals gespecialiseerde sporen of melanized schimmeldraden, die in de bodem voor vele jaren, zelfs in de afwezigheid van hun gastheren overleven kunnen ontwikkeld. Benutte benaderingen voor het beheer van de bodem overgedragen ziekte omvatten: het vermijden van bekende besmette velden, met behulp van pathogenen vrije gecertificeerde zaden en zaailingen houden apparatuur sanitaire en beperking van het verkeer van bodem en water indien mogelijk. Kennis van de aanwezigheid van pathogenen via moleculaire detectie strategieën kan ook een nuttige rol spelen door te informeren tijdig beslissingen met betrekking tot beginnende behandelingen of vooraf plant evaluaties van de velden. On-site testen biedt extra voordelen van het verstrekken van een snelle resultaat zonder het verzenden van het monster naar een diagnostisch laboratorium dat misschien enige afstand weg en ook om de teler aanspannen kan als deze een diagnose uitgevoerd 'veld-kant' in hun aanwezigheid.
On-site diagnose op basis van moleculaire detectie, gevoeligheid, specificiteit, robuustheid (herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid) en efficiëntie (dwz., eenvoud en kosten prestaties) zijn cruciale factoren voor de behandeling. Lateraal stroom apparaten (LFDs) zoals de Immunostrip en PocketDiagnostic, zijn populaire methoden voor de detectie van de on-site pathogen omwille van hun eenvoud als een one-step-assay. LFDs kan niet echter de juiste diagnostische tool in alle situaties omdat ze gebrek aan de gevoeligheid en specificiteit, en af en toe biedt dubbelzinnige resultaten als de target-pathogen in lage concentraties en met vergelijkbare soorten of geslachten cross-react kunt 2. Loop-gemedieerde isotherme amplificatie (LAMP) is ook van toepassing voor on-site pathogen detectie en is vooral goedkoop te wijten aan goedkope reagentia, omstandigheden die constant blijven, en eenvoudige colorimetrische visuele analyse. Echter, zowel de LFDs als de LAMP worden doorgaans gebruikt kwalitatief, hoewel beide benaderingen kwantitatief kunnen worden gebruikt met duurdere apparatuur3. De polymerase-kettingreactie (PCR) biedt hoge specificiteit, hoge gevoeligheid en een kwantitatieve vermogen in vergelijking met de eerder genoemde methoden voor de detectie. Echter, de conventionele lab gebaseerde PCR technologie vereist dure laboratoriumapparatuur en geschoold personeel, dat is een groot nadeel bij de vaststelling van deze technologie als een detectiemethode voor on-site toepassing.
In dit protocol wordt een on-site diagnostische methode met behulp van een draagbare instrument voor real-time PCR aangetoond. Real-time PCR-technologie biedt voordelen ten opzichte van andere methoden op het gebied van kwantitatieve nauwkeurigheid, gevoeligheid en veelzijdigheid, en is wijd verbeid gebruikt voor het opsporen van een breed scala van plant ziekteverwekkers4,5, met inbegrip van verschillende aardappel ziekteverwekkers in bodem6. Vanwege de recente trends voor de snel groeiende en concurrerende markt, is nodige materiaal voor PCR technologie blijven ontwikkelen om compacter en minder dure7. Het protocol bestaat uit de volgende stappen uit: magnetische kraal gebaseerde nucleïnezuur extractie, draagbare PCR in real time (fluorogenic sonde gebaseerde assay) en de analyse van de kwantitatieve gegevens die kan worden uitgevoerd op afstand met behulp van een laptopcomputer (Figuur 1).
Hier via het draagbare PCR protocol ontwikkeld, bodemmonsters werden geanalyseerd om te detecteren het bodem-gedragen pathogeen, Spongospora subterranea. Spongospora werd gekozen omdat het een belangrijk aardappel pathogen als het oorzakelijke agens van poederachtige schurft8. In de afgelopen decennia is de aanwezigheid van deze ziekte gezien hebben verspreid naar veel regio's waar aardappelen worden geteeld9,10. Poederachtige schurft, door de aanwezigheid van puistje zoals laesies op de knollen kan leiden tot aanzienlijke kwalitatieve opbrengst verliezen aan telers van aardappelen. Daarnaast kan S. subterranea vector aardappel Mop Top Virus (PMTV), die leiden interne laesie symptomen in knollen (ook wel spraing genoemd)11,12 tot kan. Het is daarom belangrijk om te weten als S. subterranea in velden vóór6planten aanwezig is. We tonen ook het nut van dit protocol voor de detectie van Rhizoctonia solani Anastomosis groep 3 (AG3) en PMTV. Hoewel verscheidene wapendrager groepen Rhizoctonia solani ziekten in aardappelen veroorzaken, AG3 is aantoonbaar de belangrijkste wereldwijde13, waardoor stam kanker en zwarte scurf resulterend in verhandelbare opbrengst verliezen van maximaal 30%14. PMTV veroorzaakt necrotische laesies in de knollen, die spraing worden genoemd. Dit virus heeft onlangs gemeld voor de eerste keer in verschillende staten in de Pacific Northwest15,16,17, en is van toenemende bezorgdheid aan telers in deze groeiende regio van belangrijke aardappel. Naast het bepalen van de effectiviteit van draagbare PCR voor deze belangrijke ziekten, optimale DNA extractie methodologie en bodem steekproefgrootte werden ook onderzocht in deze studie.
De resultaten suggereren dat de draagbare PCR-methode veelzijdig en die van toepassing zijn voor de detectie van verschillende ziekteverwekkers is. De on-site detectiemethode we ontwikkelden kan de frontlinie werknemers in de landbouw (bijvoorbeeld telers) eerdere beslissingen met betrekking tot het beheer van de ziekte, zoals verschillende selecties of rotaties, en kan het kwantificeren van een ziekteverwekker van de plant in de steekproef tijdens een veldonderzoek, voorafgaand aan planten, om te voorkomen dat potentiële ziekte-uitbraken.
Protocol
1. ter plaatse moleculaire opsporing van ziekteverwekkers met behulp van een draagbaar systeem van Real-Time PCR
Opmerking: Zie Figuur 1.
- Magnetische kraal-gebaseerde DNA-extractie
Opmerking: Een magnetische kraal-gebaseerde DNA extractie kit (bijvoorbeeld van Primerdesign) werd gebruikt volgens de instructies van de fabrikant. Alle gebruikte reagentia moeten worden bewaard bij kamertemperatuur (18-25 ° C). Zodra de gelyofiliseerd proteïnase K (fles No.1) is opgehangen (met fles No.1a), opgeslagen bij-20 ° C.- Meng 20-50 mg van bodemmonster met 500 µL van monsteroplossing Prep in een microtube.
Opmerking: De verhouding van de bodem: Prep oplossing is belangrijk als ze mengen in andere verhoudingen kan leiden tot een gebrek aan downstream experimenten (bijvoorbeeld verontreiniging door remmers van PCR). - Het malen van de bodem aan de onderkant van de buis met behulp van een kleine steriele stamper tot de oplossing troebel is. Verder schorten gronddeeltjes in de oplossing door de microtube schudden en laat het staan, ongestoord, te laten van de bodem deeltjes volledig regelen (meestal tussen de 5 tot 10 min).
- Breng 200 µL van de bovendrijvende substantie in een verse microtube en voeg 200 µL van Lysis Buffer (fles No. 2: Guanidine Hydrochloride oplossing) en 20 µL van proteïnase K (fles No.1).
- Meng grondig de lysate door het omkeren van de buis en laat bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten inwerken.
Opmerking: Als de lysate wordt gevonden op het deksel microtube, tik op de buis of gebruik een centrifuge, als beschikbaar voor het verwijderen van het deksel. - Voeg 500 µL van de bindende buffer/magnetische kraal mix (fles No.3) aan het lysed monster. Meng goed door omhoog en omlaag pipetteren en Incubeer bij omgevingstemperatuur voor 5 min away from het magnetische buis rek.
Opmerking: Zorg ervoor dat Meng de oplossing van de kraal goed vóór gebruik om ervoor te zorgen dat de kralen aliquoted gelijkmatig uit de fles opslag. - Plaats de microtube op het rek magnetische buis. Wachten op ten minste 2 min of totdat alle de kralen in de microtube aan de magnetische-zijwand hechten. Verwijder vervolgens, en alle van het supernatans dat door pipetteren annuleren.
Opmerking: De gemagnetiseerde kralen niet storen tijdens het verwijderen en aspirating het supernatant. DNA is nu veroverd door de magnetische kralen. - Haal de microtube uit het rek magnetische buis, voeg 500 µL van Wash Buffer-1 (fles nr.4: natriumperchloraat/ethanol oplossing) en resuspendeer de kralen door herhaalde pipetteren totdat de kralen zijn gelijkmatig verspreid. Voer deze stap wassen als u wilt verwijderen van eiwit en zout uit het monster. Laat het mengsel zitten voor 30 s.
- Herhaal stap 1.1.6.
- Haal de microtube uit het rek magnetische buis, voeg 500 µL van Wash Buffer-2 (fles nr. 5: natriumperchloraat/ethanol oplossing) en resuspendeer de kralen door herhaalde pipetteren totdat de kralen zijn gelijkmatig verspreid. Laat het mengsel zitten voor 30 s.
- Herhaal stap 1.1.6.
- Verwijder de microtube uit het rek magnetische buis en voeg vervolgens 500 µL van 80% ethanol (fles No.6).
Opmerking: Deze stap is noodzakelijk voor de verwijdering van residuele zouten uit het monster.- Resuspendeer de kralen door herhaalde pipetteren totdat de kralen zijn gelijkmatig verspreid. Laat dit staan voor 10 minuten onder af en toe omzwenken door inversie.
- Herhaal stap 1.1.6.
- Lucht drogen de magnetische kraal pellet gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur met de microtube deksel open.
Opmerking: De kralen moeten vrij zijn van enige zichtbare residuele ethanol maar niet helemaal uitgedroogd. - Verwijder de microtube uit het rek magnetische buis, voeg 50-200 µL van elutie Buffer (fles No.7) en resuspendeer de kralen door herhaalde pipetteren totdat de kralen zijn gelijkmatig verspreid en laat het staan voor 30 s.
Opmerking: In de bovenstaande stappen, wordt de gezuiverde DNA gestort van de magnetische kralen op de elutie buffer. - Plaats de microtube op het rek magnetische buis. Wachten op ten minste 2 min of totdat alle de kralen in de microtube aan de magnetische-zijwand hechten.
- Overdracht van het supernatans dat nu de gezuiverde DNA/RNA aan een 0,5 mL microtube voor gebruik in de stroomafwaartse stappen bevat.
- Meng 20-50 mg van bodemmonster met 500 µL van monsteroplossing Prep in een microtube.
- Draagbare PCR in real time
Opmerking: Een draagbare thermocycler en de PCR assay kit werden gebruikt volgens de instructies van de fabrikant (Zie de Tabel van de materialen).- Open en stormloop naar de software thermocycler-geassocieerde, selecteer doel detectie test en input alle informatie van de beschrijving in de gegevensinvoervelden naam & Details, nota's, monsters, en proeven .
Opmerking: Wells #1 en #2 zijn aangewezen door de software voor de negatieve controle en de positieve controle, respectievelijk. - Bereiden van PCR Reagentia vóór gebruik. Pipetteer 500 µL van de master mix resuspensie buffer in de buis met gelyofiliseerd master mix en meng goed door inversie. Breng de hele master mix in de bruine microtube label inleidingen/sonde (tabel 2).
- Cap en schud de microtube te mengen. Homogenisatie van het mengsel is vereist om ervoor te zorgen dat alle componenten opnieuw volledig zijn geschorst. Laat dit mengsel zitten voor 5 minuten vóór gebruik.
Opmerking: De mix van de reactie op-20 ° C na gebruik worden opgeslagen.
- Cap en schud de microtube te mengen. Homogenisatie van het mengsel is vereist om ervoor te zorgen dat alle componenten opnieuw volledig zijn geschorst. Laat dit mengsel zitten voor 5 minuten vóór gebruik.
- Bereiden van een negatieve controle door overdracht van 10 µL van het mengsel bereid reactie van de vorige stap in een tube van de PCR 0,2 mL en voeg vervolgens 10 µL van steriele nuclease-vrije gedeïoniseerd water.
- Bereiden van een positieve controle door overdracht van 10 µL van het mengsel bereid reactie van de stap 1.2.2 in een tube van de PCR 0,2 mL en voeg vervolgens 10 µL van positieve controle sjabloon.
- Pipetteer 10 µL van het mengsel bereid reactie uit de vorige stap in een tube van 0,2 mL PCR voor elk monster, en voegt u 10 µL van monster DNA bereid uit stap 1.1.16.
- De putten van de thermocycler met de inhoud van hun respectieve PCR buizen laden, zoals beschreven in stap 2.1.1.
- Zodra alle benodigde informatie is ingevoerd en bevestigd, selecteer Looppas van het begin en kies het instrument ethernet-verbinding of een USB-drive.
Opmerking: Als het USB-station is ingeschakeld, moet het beheerde bestand worden opgeslagen op het station met de thermocycler (bijvoorbeeldF:\genesig) moet worden gebruikt. De run zal beginnen onmiddellijk na het station de thermocycler wordt ingevoegd.
- Open en stormloop naar de software thermocycler-geassocieerde, selecteer doel detectie test en input alle informatie van de beschrijving in de gegevensinvoervelden naam & Details, nota's, monsters, en proeven .
- Data-analyse van draagbare PCR in real time.
- Zodra de run is voltooid, open het run bestand (.usb) vanaf de USB drive using naar de software thermocycler-geassocieerde of rechtstreeks in de software de uitvoering resultaten bekijken door te klikken op resultaten.
- Opslaan voor het analyseren van resultaten, het voltooide uitvoeren om te voorkomen dat gegevens verloren gaan.
- De status van de vlucht, op het tabblad resultaten bekijken gecategoriseerd door monsters.
Opmerking: Gegevens die kan worden verkregen op dit tabblad worden de status van resultaten en kopieer nummer gedetecteerd in de steekproef. - Klik op het tabblad Details te bekijken van de curven versterking. Wanneer het doel met succes wordt gedetecteerd, worden Cq (kwantificering cyclus) waarden van zowel de doelgroep en de interne controle weergegeven.
Opmerking: Deze waarden worden berekend in het eindverslag en worden gebruikt om te bepalen of een monster positief voor de doelgroep is en als er problemen met de reactie of de DNA-monsters zijn.
2. andere protocollen
-
Alternatieve lab-gebaseerde DNA extractiemethoden
-
Methoden op basis van CTAB-fenol-chloroform
- Uitvoeren CTAB-fenol-chloroform gebaseerde methoden, na de Doyle methode18 en de Dellaporta methode19 zoals eerder is beschreven.
-
DNA mini-voorbereiding methode
Opmerking: De Edwards methode20 werd als volgt uitgevoerd.- Voeg 500 mg van de bodem, gevolgd door vijf 1.4 mm keramische kralen en 750 µL van Edwards buffer (200 mM Tris, pH 8.0, 200 mM NaCl, 25 mM EDTA, 0,5% SDS) aan een microtube en meng goed.
- Incubeer de microtube bij 65 ° C gedurende 5 min.
- Meng het monster met een kraal klopper homogenizer voor 60 s (of met behulp van een mortier en een stamper).
- Centrifugeer het monster bij 14.000 x g gedurende 5 min.
- 500 µL van supernatans overbrengen in een verse microtube en meng met 500 µL van gekoeld isopropanol. Meng door de buis 10 keer omkeren.
- Centrifugeer het monster bij 14.000 x g gedurende 15 minuten naar het pelletize van het DNA.
- De bovendrijvende vloeistof decanteren en laat de DNA pellet lucht drogen bij kamertemperatuur totdat de resterende ethanol is verdampt.
- Wassen van de DNA-pellet met 750 µL van gekoeld 70% ethanol.
- Lucht drogen de pellet voordat opnieuw wordt verbroken in 50-100 µL van TE buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0 en 1 mM EDTA).
-
Andere alternatieve methoden
- Het uitvoeren van Silica-base DNA-extractie met behulp van kit #1 (MP BIO snel DNA Spin) en kit #2 (Zymo BIOMICS DNA Miniprep Kit) volgens de instructies van de fabrikant.
-
Methoden op basis van CTAB-fenol-chloroform
-
Conventionele lab gebaseerde PCR in real time.
Opmerking: Een conventionele thermocycler werd gebruikt met mastermix sonde gebaseerde PCR, verschillende primers en oligonucleotide sondes (tabel 2).- Met behulp van niet-transparante bottomed PCR buizen of een PCR-plaat, bereiden 20 µL reacties voor alle DNA monsters worden geanalyseerd, evenals een negatieve controle (nuclease-vrije gedeïoniseerd water) en een positieve sjabloon controle in eigen huis bereid.
- Voor elke PCR buis of een mengsel met inbegrip van 10 µL van de mastermix, 7 µL van nuclease-vrije gedeïoniseerd water, 2 µL van 2 µM inleidingen/sonde en 1 µL van DNA-monster (uit stap 1.1.16 of 2.1) of besturingselement sjabloon, per monster goed, voor te bereiden.
- Sluit de PCR buizen of plaat en begint de reactie door de juiste PCR-programma te selecteren.
-
Data-analyse van conventionele lab gebaseerde PCR in real time
- Thermocycler-geassocieerde software gebruiken voor het analyseren van de resultaten van de conventionele thermocycler. Om te beginnen van data-analyse, de run bestand van de thermocycler overbrengen naar een USB-drive, sluit een USB-stick en selecteer exporteren.
- Open het gegevensbestand (.pcrd) van de geëxporteerde uitvoeren in de thermocycler-geassocieerde software.
- Markeer de waterput van een steekproef door het lokaliseren van de overeenkomstige goed op het instrument. Versterking curven en standaard curven (indien van toepassing) worden automatisch gegenereerd. Als het monster informatie niet is ingevoerd, klikt u op Plaat Setup of een vergelijkbare functie om te beginnen met gegevensinvoer voor het analyseren van gegevens.
- De gegevens bekijken op het tabblad kwantificering; Dit kan worden geëxporteerd voor data-analyse met een derde-partij software zoals CSV, XML of HTML-bestand lezers.
- Verkrijgen van Cq gegevens op basis van de vastgestelde drempels en vergelijk deze met de positieve en negatieve controles.
Opmerking: Als de normen van de DNA van het doel werden gebruikt in de analyse, het monster Cq gegevens vergelijken met die van de normen te bepalen van de licht-donkerscheiding Cq
Representative Results
Vergelijking van DNA-extractiemethoden
De verenigbaarheid van een magnetische kraal-gebaseerde DNA extractiemethode met real-time PCR werd geëvalueerd door het detecteren van de bedragen van S. subterranea DNA in een bodemmonster van velden die zijn besmet met het pathogene agens oplevert. Zoals blijkt uit aanvullende Figuur 1, werd de magnetische kraal gebaseerde methode vergeleken met de andere methoden, met inbegrip van een CTAB-fenol-chloroform gebaseerd methode18, snelle DNA mini voorbereiding methoden19,20, en andere standaard silica-gebaseerde DNA extractie kits. DNA-monsters geëxtraheerd met behulp van de zes verschillende methoden werden onderworpen aan conventionele lab gebaseerde PCR in real time. De resultaten voorgesteld dat de magnetische kraal gebaseerde methode vergelijkbaar met de andere methoden, is hoewel silica gebaseerde DNA extractie kit bleek de beste prestaties onder de methoden die we getest. Alle kits bevatten guanidinium kaliumthiocyanaat of guanidinium hydrochloride: beide zijn krachtige chaotropic agenten, die denatureren allermeest cellulaire eiwitten met inbegrip van RNases en DNases. Dus, met behulp van de methoden is geschikt voor zowel DNA en RNA extracties.
Vergelijking tussen een draagbare PCR in real time en een conventionele lab gebaseerde PCR in real time
Om te vergelijken van de gevoeligheid en specificiteit van een draagbare PCR aan een conventionele lab gebaseerde PCR, absolute kwantificering van het pathogene agens dat DNA werd uitgevoerd met behulp van verschillende hoeveelheden van het S. subterranea ITS gen, dat werd uitgevoerd door de pGEM-T vector21 . Een aantal 10-fold verdunningen van het ITS-gen (106 tot 100 exemplaren) zijn geanalyseerd met behulp van de SsTQ primers/sonde instellen22. De resultaten laten zien dat de draagbare PCR methode het doel pathogen DNA ontdekt (~ 100 exemplaren), hoewel de gevoeligheid was 10 keer lager dan dat van de conventionele lab gebaseerde PCR methode, welke gedetecteerde ten minste 10 exemplaren (Figuur 2).
Voor verdere validatie, werden kunstmatig aangetaste bodems getest. S. subterranea sporosori werden verkregen poederachtige schurft wortel kurkachtig van aardappel wortels. De bodems waren besmet met sporosori suspensies op een eindconcentratie van 105 sporosori/g droog gewicht van de bodem. Met de magnetische kraal gebaseerde methode DNA werd gewonnen uit de besmette bodemmonsters, en 10-fold seriële verdunningen bereid waren om te verkrijgen van concentraties gelijk aan 105, 104, 103, 102, 101en 100 sporosori/g droog gewicht van de bodem. De DNA-monsters werden gebruikt voor PCR met behulp van de SPO primer/sonde set23. De resultaten toonden aan dat de draagbare PCR-methode vergelijkbare analytische vermogen om een conventionele lab gebaseerde PCR methode heeft, maar, nogmaals, de gevoeligheid is verminderd met een factor ~ 10 (Figuur 3).
Tot slot testten wij een bodemmonster van een veld dat natuurlijk was besmet met S. subterranea. De magnetische kraal-gebaseerde DNA-extractie werd uitgevoerd op verschillende hoeveelheden van de bodem (10, 20, 50 en 100 mg van de bodem per 500 µL van extractieoplossing buffer). De resultaten voorgesteld dat het optimale gewicht van de bodem als grondstof voor de extractie van DNA 50-100 mg (Figuur 4 was). Bodem bedragen buiten het bereik veroorzaakt een falen van de stroomafwaartse PCR stappen. Dit effect zou kunnen zijn omdat wanneer overtollige hoeveelheid bodem als grondstof worden gebruikt, vormen van verontreiniging (b.v., fenolische verbindingen) met de PCR-24 interfereren kunnen. In het geval van lagere volumes van de bodem, kan het bedrag van de geëxtraheerde DNA lager zijn dan de detectiegrens van PCR (b.v., het rendement van totale DNA geëxtraheerd uit 10-20 mg bodem was gevarieerd). Gevoeligheid was heel vergelijkbaar tussen de draagbare PCR en conventionele PCR methodes. Vergelijkbare resultaten werden verkregen in DNA-monsters door verschillende extractiemethoden (aanvullende figuur 2)
Detectie van andere ziekteverwekkers door het detectiesysteem van de on-site met behulp van een draagbare PCR in real time
We testten de draagbare PCR-methode voor het detecteren van andere belangrijke bodem overgedragen aardappel ziekteverwekkers, R. solani AG3 en PMTV. In deze studie, we uitgevoerd met behulp van de set van RsTq primers/RQP1 sonde25 voor R. solani AG3 detectie met DNA van reincultuur PCR in real time. We uitgevoerd ook real-time PCR met behulp van de PMTV-D primer/sonde instellen26 voor de detectie van de PMTV met RNA van een steekproef van de symptomatische Knol spraing werd gebruikt. Zoals afgebeeld in Figuur 5, ontdekt de draagbare PCR-methode met succes beide ziekteverwekkers. De resultaten waren vergelijkbaar tussen de draagbare en conventionele instrumenten, suggereert dat de draagbare PCR-methode is veelzijdig en van toepassing op andere pathogen detecties als de sequenties van de primer ontworpen voor PCR in real time beschikbaar zijn.
Figuur 1. Procedure van een draagbaar systeem voor real-time PCR voor detectie van on-site pathogeen. Het protocol bestaat uit stappen in de volgende volgorde: lysate voorbereiding door korte homogenisering, sub a, magnetische kraal gebaseerde nucleïnezuur extractie (B), draagbare real-time PCR (C) en kwantitatieve data-analyse met behulp van een laptopcomputer (D). Merk op dat alle stappen kunnen worden voltooid op de site.
Figuur 2 . Vergelijking van de gevoeligheid tussen een draagbare PCR en een conventionele lab gebaseerde PCR. Kwantificering van het pathogene agens DNA werd uitgevoerd met behulp van verschillende hoeveelheden van de S. subterranea ITS gen (106 tot 100 exemplaren) met de SsTQ primers/sonde instellen. Lineaire regressie tussen log-waarde van S. subterranea plasmide DNA en wederzijdse logboek waarde van Cq op de conventionele thermocycler (A) en de draagbare thermocycler (B). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 . Vergelijking van de prestaties van de detectie in kunstmatig aangetaste bodems met S. subterranea. De bodems waren kunstmatig besmet (105 tot 100 sporosori/g droog gewicht van de bodem) met S. subterranea sporosori schorsingen. Met de magnetische kraal gebaseerde methode werd DNA geëxtraheerd uit de besmette bodemmonsters. PCRs werden uitgevoerd met behulp van de bodemmonsters met de SPO primer/sonde set. Lineaire regressie tussen log-waarde van de startende hoeveelheid in sporosori per gram van de bodem en de waarde van de wederzijdse log van Cq op de conventionele thermocycler (A) en de draagbare thermocycler (B). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 . Vergelijking van het bedrag van bodemmonsters voor DNA-extractie starten. De magnetische kraal gebaseerde methode werd gebruikt voor DNA-extractie van 10, 20, 50 en 100 mg van bodemmonsters. Real-time PCRs werden uitgevoerd met behulp van de draagbare thermocycler. Standaard curven vertegenwoordigen de relatie tussen het bedrag van de totale DNA geëxtraheerd uit de bodemmonsters (x-as) en de hoeveelheid PCR product (y-as) versterkt door de Sss primer/sonde set. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 . Detectie van andere aardappel pathogenen, R. solani en PMTV. Real-time PCRs werden uitgevoerd met behulp van de draagbare thermocycler en de conventionele thermocycler. R. solani AG3 werd ontdekt in totale DNA geëxtraheerd uit puur cultuur met behulp van primers van de RsTq en de RQP1-sonde (A) PMTV werd ontdekt in totaal RNA geëxtraheerd uit een PMTV-geïnfecteerde knollen monster met behulp van dat de PMTV-D primer/sonde ingesteld (B). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6 . Een diagnostische pijpleiding voor planteziekteverwekkers. Stroomdiagram ziet u een algemene workflow voor het phytopathogen diagnose. Merk op dat de traditionele stap, bijvoorbeeldvisuele identificatie, kan worden weggelaten als on-site moleculaire detectie wordt gebruikt, waardoor het hele proces van diagnose eenvoudig en snel. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Draagbare PCR in real time | PCR in real time | LAMP | ELISA | Laterale-flow | |
| Kosten per doelgroep reactie | $0,60-$8,47 | $0,60 | $0,75 | $0,60 | $4,74 |
| Gevoeligheid | 100 exemplaren | 10 exemplaren | 10 exemplaren | 1-10 sporosori33 1-10 ng/mL (eiwit)33 |
1-10 sporosori34 5 x 105CFU/mL35 |
| Tijd kosten | 90 minuten | 80-240 minuten | 50-90 minuten32 | 3-24 uur | 10-15 minuten |
| Voorbereiding vereist | ●Nucleic zuur extractie ● Primer ontwerp |
●Nucleic zuur extractie ● Primer/sonde ontwerp |
● Nucelic zuur extractie ● Primer ontwerp |
● Eiwit extractie ● Antilichamen |
N/B |
| Andere benodigde materialen | ● Draagbare thermocycler | ● Conventionele thermocycler | ● Kleurmetrisch vlek ● Incubator |
● afleesapparaat ● Wassen apparatuur |
N/B |
Tabel 1. Vergelijkende grafiek van moleculaire en serologische detectiemethoden voor planteziekteverwekkers
| Primer | Volgnummer (5 '-3 ')een | Doelb | |
| SsTQ-F13 | CCGGCAGACCCAAAACC | ITS1-ITS2 in S. subterranea | |
| SsTQ-R13 | CGGGCGTCACCCTTCA | ITS1-ITS2 in S. subterranea | |
| SsTQ-P13 | [FAM] CAGACAATCGCACCCAGGTTCTCATG [TAM] | ITS1-ITS2 in S. subterranea | |
| Genesig S.subterranea primer/sonde | N/B | Actin in S. subterranea | |
| SPO1014 | GGTCGGTCCATGGCTTGA | ITS in S. subterranea | |
| SPO1114 | GGCACGCCAATGGTTAGAGA | ITS in S. subterranea | |
| SPOPRO114 | [FAM] CCGGTGCGCGTCTCTGGCTT [TAM] | ITS in S. subterranea | |
| RsTqF119 | AAGAGTTTGGTTGTAGCTGGTCTATTT | ITS1-ITS2 in R. solani | |
| RsTqR119 | AATTCCCCAACTGTCTCACAAGTT | ITS1-ITS2 in R. solani | |
| RQP119 | [FAM] TTTAGGCATGTGCACACCTCCCTCTTTC [TAM] | ITS1-ITS2 in R. solani | |
| Genesig PMTV primer/sonde | N/B | CP-RT in PMTV | |
| PMTV-D-F20 | AGAATTGRCATCGAAACAGCA | CP in PMTV | |
| PMTV-D-R20 | GTCGCGCTCCAATTTCGTT | CP in PMTV | |
| PMTV-D-P20 | [FAM] CCACAAACAGACAGGTATGGTCCGGAA [TAM] | CP in PMTV | |
| een DNA van oligo inleidingen werden gewijzigd met FAM (6-carboxyfluorescein) of TAM (5-carboxytetramethylrhodamine) | |||
| b ITS: Interne getranscribeerde afstandhouders, CP: jas van eiwitten; CP-RT: jas eiwit readthrough | |||
Tabel 2. Inleidingen gebruikt in deze studie
Aanvullende figuur 1. Vergelijking van de DNA-extractie-methoden voor het opsporen van het pathogene agens van poederachtige schurft. Zes verschillende DNA extractiemethoden (A-F) werden vergeleken voor de detectie van het poederachtige schurft pathogeen, S. subterranea in bodemmonsters. (B, D, F). DNA is geëxtraheerd met behulp van silica gebaseerde kit #1 (Zie de tabel van materialen voor alle kit namen), siliciumdioxide gebaseerde kit #2, en magnetische kraal gebaseerde kit, repsectively. PCR werd uitgevoerd met behulp van de conventionele lab gebaseerde PCR thermocycler. Standaard curven vertegenwoordigen de relatie tussen het bedrag van totale DNA geëxtraheerd uit de bodemmonsters en de hoeveelheid PCR product versterkt door de SsTQ primers/sonde set. Klik hier voor het downloaden van dit cijfer.
Aanvullende figuur 2. Vergelijking van de limiet van detectie tussen een draagbare PCR en een conventionele lab gebaseerde PCR. Totale DNA werd geïsoleerd uit een steekproef van de bodem met behulp van drie verschillende extractiemethoden: (A, B) Doyle methode (C, D) de silica gebaseerde kit #2, (E en F) de magnetische kraal gebaseerde kit. Grafieken getoond aan de linkerkant zijn gegevens met behulp van de draagbare thermocycler de Sss inleidingen/sonde ingesteld, terwijl de grafieken hiernaast vertegenwoordigen gegevens gegenereerd met behulp van de conventionele lab gebaseerde thermocycler met de SsTQ primers/sonde instellen. Klik hier voor het downloaden van dit cijfer.
Discussion
Zoals blijkt uit tabel 1, zijn recente technologische vooruitgang in de moleculaire identificatie van ziekteverwekkers toegenomen de werkzaamheid, nauwkeurigheid en snelheid van diagnose, die hebben bijgedragen tot de opsporing van vooraf symptomatische infecties27. Met betrekking tot on-site diagnose, LAMP en laterale-flow methoden worden vaak gebruikt omdat ze draagbaar zijn en onmiddellijke resultaten tegen een lagere kostprijs bieden. In het geval van serologische methoden, kan soortspecifieke detectie echter moeilijk te bereiken. Hierdoor kunnen af en toe maken van off-target microben zoals gemeenschappelijk bodem inwoners. Bijvoorbeeld, kan er cross reactiviteit tussen de serologische tests van Phytophthora spp. en Pythium spp. in het geval van aardappel ziekteverwekkers28, waaruit blijkt dat er soms problemen opsporen van de gerichte fabriek ziekteverwekkers.
In de huidige studie, hebben we een geoptimaliseerde protocol voor on-site moleculaire detectie van aardappel bodem overgedragen ziekteverwekkers met behulp van de draagbare real-time PCR-systeem door het vergelijken van haar vermogens met die van een conventionele lab gebaseerde real-time PCR-systeem ontwikkeld. We vonden dat de on-site methode specifiek de aardappel ziekteverwekkers in het bodemmonster detecteert, hoewel gevoeligheid ~ 10 keer lager dan die van een gelijkwaardige lab gebaseerde bepaling is. Het is ook overwogen dat in dit geval zowel het laboratorium als het veld test niet een biologisch relevante steekproefgrootte gebruikten. Grote steekproeven zijn vereist voor gebruik bij routinematig bevolkingsonderzoek veld bodems als eerder beschreven29,30, waar de omvang van de steekproeven van tussen de 250 g tot 1 kg zijn verwerkt, hoewel deze methodes bekwame operatoren vereisen en geavanceerde apparatuur om uit te pakken van DNA. Typisch, een grootschalige bodem DNA-extract is overgenomen van een representatief monster getrokken enkele statistische bodem van talrijke deelmonsters 1 tot en met 4 hectare6,29,30. Echter het protocol hier ontwikkeld is snel, vlot-voor-toepassing voor gebruikers met geen voorafgaande ervaring in moleculaire diagnostiek en bruikbaar zijn buiten een lab. Als de methode is snel en relatief goedkoop in vergelijking met de grootschalige bodem aardgaswinning, kan worden gebruikt om vele kleinschalige monsters uit een soortgelijk gebied aan grootschalige verzamelmonsters scherm. Dit kon overwinnen van de tekortkomingen van de grootte van een kleine steekproef en bepalen van extra informatie over de ruimtelijke verspreiding van het pathogene agens in het veld. Bovendien, de portabiliteit en snelheid van de methode betekent dat het kan ook worden gebruikt in de demonstratie aan telers voor educatieve en betrokkenheid doeleinden.
Een andere overweging is dat vele real-time PCR-testen zijn al gepubliceerd voor een breed scala van plant ziekteverwekkers5. Dit systeem kan maken gebruik van deze bestaande testen zonder de behoefte aan ontwerp nieuwe inleidingen van de LAMP om in veldproeven. Een frequente kritiek van LAMP testen is dat ze moeilijk kunnen te ontwerpen van31. Draagbare PCR, staat dan ook toe de relatief eenvoudige implementatie van een breed scala van beschikbaar pathogen tests voor on-site testen.
Traditionele methoden kunnen vaak kostbare, moeizaam, onjuist en tijdrovend. De eenvoud van de on-site methode die we ontwikkeld kan telers en arbeiders detectieproces van de ziekteverwekker zelf en veel sneller dan het verzenden naar een diagnostisch laboratorium dat kan sommige afstand gevolg misschien te genereren. De promptheid en de gevoeligheid van de draagbare PCR-methode kunnen helpen telers te voorkomen dat potentieel secundaire infecties, die verder kunnen van de ziekteverwekker bevolking en onopzettelijk worden verspreid (via apparatuur of mensen verhogen). Kortom, kunt de on-site methode ontwikkeld in de huidige studie nauwkeurig en relatief gevoelig detectie van belangrijke bodem overgedragen ziekteverwekkers in het veld. Onze hoop is dat de on-site methode ontwikkeld in deze studie zal bijdragen in een huidige diagnostische pijpleiding (Figuur 6), niet alleen door middel van snelle en nauwkeurige antwoorden op epidemiologische vragen over plantenziekten in het veld, maar ook door het verstrekken van meer inzicht in de biologie en epidemiologie van ziekteverwekkers van de plant.
Disclosures
De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Wij zijn dankbaar aan Dr. Neil C. Gudmestad aan de Staatsuniversiteit van North Dakota voor het verstrekken van S. subterranea plasmide DNA, Dr. Hanu Pappu bij Washington State University (WSU) voor het verstrekken van PMTV RNA, en Dr. Debra Inglis op WSU voor het verstrekken van R. solani AG3. Speciale dank aan Dr Jeremy Jewell op WSU voor het verstrekken van opmerkingen over het manuscript en de WSU CAHNRS communicatie voor videografie. Dit onderzoek werd gesteund door de Northwest aardappel onderzoek Consortium en de Washington State Department of Agriculture - specialiteit gewas blok Grant programma (verlenen neen. K1764). PPNS No. 0741, departement van fytopathologie, College van landbouw, Wetenschappen van de menselijke en natuurlijke hulpbronnen, landbouw Research Center, Hatch Project nr. WNP00833, de Universiteit van de staat van Washington, Pullman, WA, USA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| White shell PCR plate | Bio-Rad | HSP9601 | |
| CFX Manager | Bio-Rad | 1845000 | |
| SsoAdvanced Universal Probes Supermix | Bio-Rad | 1725280 | |
| CFX96 Touch qPCR instrument | Bio-Rad | 1855195 | |
| Ethylalcohol, pure 200 proof | Decon Laboratories | 04-355-222 | |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) | Fisher BioReagents | BP118-500 | |
| Phenol, Saturated | Fisher BioReagents | BP1750I-400 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Fisher BioReagents | BP152-5 | |
| q16 real-time PCR machine | genesig | MBS486001 | |
| Ultrapure Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Invitrogen | 15525-017 | |
| 2-Propanol (Isopropanol) | JT Baker | 67-63-0 | |
| Chloroform | JT Baker | 9180-03 | |
| Hydrochloric Acid, 36.5-38.0% (HCl) | JT Baker | 9535-03 | |
| iso-Amyl Alcohol | JT Baker | 9038-01 | |
| FastDNA Spin kit | MP Biomedicals | 6560-200 | Silica-based DNA extraction kit #1 |
| Luna Universal One-Step RT-qPCR Kit | New England Biolabs | E3005S | |
| 0.1ml Low Profile Individual PCR Tubes | Phenix Research | MPC-100LP | |
| Easy DNA/RNA Extraction Kit | Primerdesign | genesigEASY-EK | |
| genesig Easy 1.5 mL tubes | Primerdesign | genesigEASY-1.5 | |
| Magnetic tube rack | Primerdesign | genesigEASY-MR | |
| Spongospora subterranea f. sp. subterranea genesig Easy Kit | Primerdesign | Path-S.subterranea-EASY | |
| Hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) | Sigma-Aldrich | H6269-100G | |
| Pellet pestles | Thermo Fisher Scientific | 12-141-364 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Thermo Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| DNA Miniprep kit | ZymoBIOMICS | D4300 | Silica-based DNA extraction kit #2 |
References
- Malcolm, G. M., Kuldau, G. A., Gugino, B. K., Jiménez-Gasco, M. delM. Hidden Host Plant Associations of Soil-borne Fungal Pathogens: An Ecological Perspective. Phytopathology. 103 (6), 538-544 (2013).
- Posthuma-Trumpie, G. A., Korf, J., van Amerongen, A. Lateral flow (immuno)assay: its strengths, weaknesses, opportunities and threats. A literature survey. Anal Bioanal Chem. 393 (2), 569-582 (2009).
- Hill, J., et al. Loop-Mediated Isothermal Amplification Assay for Rapid Detection of Common Strains of Escherichia coli. J Clin Microbiol. 46 (8), 2800-2804 (2008).
- Mumford, R. A., Walsh, K., Barker, I., Boonham, N. Detection of Potato mop top virus and Tobacco rattle virus Using a Multiplex Real-Time Fluorescent Reverse-Transcription Polymerase Chain Reaction Assay. Phytopathology. 90 (5), 448-453 (2000).
- Schena, L., Nigro, F., Ippolito, A., Gallitelli, D. Real-time quantitative PCR: a new technology to detect and study phytopathogenic and antagonistic fungi. European Journal of Plant Pathology. 110 (9), 893-908 (2004).
- Brierley, J. L., Stewart, J. A., Lees, A. K. Quantifying potato pathogen DNA in soil. Applied Soil Ecology. 41 (2), 234-238 (2009).
- Tomlinson, J. A., Boonham, N., Hughes, K. J. D., Griffin, R. L., Barker, I. On-Site DNA Extraction and Real-Time PCR for Detection of Phytophthora ramorum in the Field. Appl Environ Microbiol. 71 (11), 6702-6710 (2005).
- Harrison, J. G., Searle, R. J., Williams, N. A. Powdery scab disease of potato - a review. Plant Pathology. 46 (1), 1-25 (1997).
- Johnson, D. A., Miliczky, E. R. Distribution and development of black dot, Verticillium wilt, and powdery scab on Russet Burbank potatoes in Washington State. Plant Disease. 77 (1), 74-79 (1993).
- Merz, U. Powdery Scab of Potato-Occurrence, Life Cycle and Epidemiology. Am J Pot Res. 85 (4), 241 (2008).
- Jones, R. aC., Harrison, B. D. The behaviour of potato mop-top virus in soil, and evidence for its transmission by Spongospora subterranea (Wallr). Lagerh. Annals of Applied Biology. 63 (1), 1-17 (1969).
- Carnegie, S. F., Davey, T., Saddler, G. S. Effect of temperature on the transmission of Potato mop-top virus from seed tuber and by its vector, Spongospora subterranea. Plant Pathology. 59 (1), 22-30 (2010).
- Woodhall, J. W., Adams, I. P., Peters, J. C., Harper, G., Boonham, N. A new quantitative real-time PCR assay for Rhizoctonia solani AG3-PT and the detection of AGs of Rhizoctonia solani associated with potato in soil and tuber samples in Great Britain. Eur J Plant Pathol. 136 (2), 273-280 (2013).
- Banville, G. J. Yield losses and damage to potato plants caused by Rhizoctonia solani Kuhn. American Potato Journal. 66 (12), 821-834 (1989).
- Crosslin, J. M. First Report of Potato mop-top virus on Potatoes in Washington State. Plant Disease. 95 (11), 1483-1483 (2011).
- Whitworth, J. L., Crosslin, J. M. Detection of Potato mop top virus (Furovirus) on potato in southeast Idaho. Plant Disease. 97 (1), 149-149 (2012).
- Kaur, N., Cating, R. A., Dung, J. K. S., Frost, K. E., Robinson, B. A., Hamm, P. B. First Report of Potato mop-top virus Infecting Potato in Oregon. Plant Disease. 100 (11), 2337 (2016).
- Doyle, J. J. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus. 12, 13-15 (1990).
- Dellaporta, S. L., Wood, J., Hicks, J. B. A plant DNA minipreparation: Version II. Plant Mol Biol Rep. 1 (4), 19-21 (1983).
- Edwards, K., Johnstone, C., Thompson, C. A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis. Nucleic Acids Research. 19 (6), 1349 (1991).
- Bittara, F. G., Secor, G. A., Gudmestad, N. C. Chloropicrin Soil Fumigation Reduces Spongospora subterranea Soil Inoculum Levels but Does Not Control Powdery Scab Disease on Roots and Tubers of Potato. Am J Potato Res. 94 (2), 129-147 (2017).
- van de Graaf, P., Lees, A. K., Cullen, D. W., Duncan, J. M. Detection and Quantification of Spongospora subterranea in Soil, Water and Plant Tissue Samples Using Real-Time PCR. European Journal of Plant Pathology. 109 (6), 589-597 (2003).
- Maldonado, H., Falloon, R. E., Butler, R. C., Conner, A. J. Spongospora subterranea root infection assessed in two potato cultivars differing in susceptibility to tuber powdery scab. Plant Pathology. 62 (5), 1089-1096 (2013).
- Braid, M. D., Daniels, L. M., Kitts, C. L. Removal of PCR inhibitors from soil DNA by chemical flocculation. Journal of Microbiological Methods. 52 (3), 389-393 (2003).
- Lees, A. K., Cullen, D. W., Sullivan, L., Nicolson, M. J. Development of conventional and quantitative real-time PCR assays for the detection and identification of Rhizoctonia solani AG-3 in potato and soil. Plant Pathology. 51 (3), 293-302 (2002).
- Davey, T., Carnegie, S. F., Saddler, G. S., Mitchell, W. J. The importance of the infected seed tuber and soil inoculum in transmitting Potato mop-top virus to potato plants. Plant Pathol. 63 (1), 88-97 (2014).
- Boonham, N., et al. Methods in virus diagnostics: From ELISA to next generation sequencing. Virus Research. 186, 20-31 (2014).
- Mohan, S. B. Cross-reactivity of antiserum raised against Phytophthora fragariae with other Phytophthora species and its evaluation as a genus-detecting antiserum. Plant Pathology. 38 (3), 352-363 (1989).
- Ophel-Keller, K., McKay, A., Hartley, D., Curran Herdina, J. Development of a routine DNA-based testing service for soil-borne diseases in Australia. Austral Plant Pathol. 37 (3), 243-253 (2008).
- Woodhall, J. W., et al. A new large-scale soil DNA extraction procedure and real-time PCR assay for the detection of Sclerotium cepivorum in soil. Eur J Plant Pathol. 134 (3), 467-473 (2012).
- Miles, T. D., Martin, F. N., Coffey, M. D. Development of Rapid Isothermal Amplification Assays for Detection of Phytophthora spp in Plant Tissue. Phytopathology. 105 (2), 265-278 (2014).
- Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 28 (12), e63-e63 (2000).
- Narayanasamy, P. Microbial Plant Pathogens: Detection and Management in Seeds and Propagules. , John Wiley & Sons. (2016).
- Braun-Kiewnick, A., Altenbach, D., Oberhänsli, T., Bitterlin, W., Duffy, B. A rapid lateral-flow immunoassay for phytosanitary detection of Erwinia amylovora and on-site fire blight diagnosis. Journal of Microbiological Methods. 87 (1), 1-9 (2011).
