Summary
Snabb och noggrann identifiering av anläggningen patogener på plats, särskilt jordburna patogener, är avgörande för att förhindra ytterligare inokulum tillverkningen och spridningen av växtsjukdomar i fältet. Den metod som utvecklats här med en bärbar realtidssystem för PCR-detektion möjliggör Hotellets diagnos under fältförhållanden.
Abstract
Egen diagnos av växtsjukdomar kan vara ett användbart verktyg för odlare för beslut i rätt tid gör det möjligt för tidigare genomförandet av strategier för hantering av sjukdomen att minskar konsekvenserna av sjukdomen. Närvarande i många diagnostiska laboratorier, polymeras-kedjereaktion (PCR), särskilt realtids-PCR, anses vara den mest känsliga och noggrann metod för upptäckt av växt patogen. Laboratoriebaserade primärvården kräver dock vanligtvis dyra laboratorieutrustning och kompetent personal. I denna studie används jordburna patogener av potatis kan påvisa att för hotellets molekylär identifiering. Detta uppnås med hjälp av en snabb och enkel protokoll bestående av magnetiska pärla-baserade nukleinsyra utvinning, bärbara realtids-PCR (fluorogenic probe-baserade assay). Den bärbara realtidsdata PCR metoden jämfört gynnsamt med en laboratoriebaserade system, upptäcker så få som 100 kopior av DNA från Spongospora subterranea. Den bärbara realtidsdata PCR-metod som utvecklats här kan fungera som ett alternativ till laboratoriet tillvägagångssätt och ett användbart Hotellets verktyg för patogen diagnos.
Introduction
Korrekt och snabb identifiering av orsakande patogener avsevärt påverkar beslut om sjukdomen fabriksledningen. Jordburna sjukdomar är särskilt svåra att diagnostisera eftersom marken miljön är extremt stora i förhållande till växt massa och komplex, vilket gör det en utmaning att förstå alla aspekter av jordburna sjukdomar. Dessutom jordburna sjukdomar kan vara symtomfria under tidig infektion stadier, beroende av miljöfaktorer, och vissa har lång latent perioder som resultera i försenade diagnoser1. Många jordburna patogener har utvecklat överlevnadsstrukturer, som specialiserade sporer eller melanized hyfer, som kan överleva i jorden under många år även i avsaknad av sina värdar. Utnyttjade strategier för hantering av jordburna sjukdomar inkluderar: undvika kända angripet fält, med hjälp av patogenfria certifierat utsäde och plantor, att hålla utrustning sanitära och begränsa förflyttning av jord och vatten när det är möjligt. Kunskap om patogen närvaro genom molekylär identifiering strategier kan också spela en värdefull roll genom att meddela beslut i rätt tid när det gäller nystartade behandlingar eller pre plantera bedömningar av fälten. På plats tester ger ytterligare fördelar som ger ett snabbt resultat utan att skicka provet till ett laboratorium för veterinärdiagnostik att kanske en bit bort och också kan engagera odlaren om sådan en diagnostik är utfört 'fält-side' i deras närvaro.
För hotellets diagnos baserat på molekylära identifiering, känslighet, specificitet, robusthet (repeterbarhet och reproducerbarhet) och effektivitet (dvs., enkelhet och kostnadseffektivitet prestanda) är avgörande faktorer för övervägande. Laterala flöde enheter (LFDs) som Immunostrip och PocketDiagnostic, populära metoder för upptäckt av hotellets patogen på grund av sin enkelhet som en one-step-analysen. LFDs kan dock inte just diagnostikverktyget i alla situationer eftersom de saknar känslighet och specificitet, och ibland ger tvetydiga resultat om målet patogenen är i låga koncentrationer och kan korsreagerar med liknande arter och släkten 2. Loop-medierad isotermiska amplifiering (lampa) gäller också för upptäckt av hotellets patogen och är särskilt billigt på grund av låg kostnad reagenser, reaktion villkor förblir konstanta och enkel kolorimetriska visuell analys. Dock både LFDs och lampa används vanligen kvalitativt, även om båda metoderna kan användas kvantitativt med dyrare utrustning3. Polymeras-kedjereaktion (PCR) erbjuder hög specificitet, hög känslighet och en kvantitativ kapacitet jämfört med de tidigare nämnda metoderna för upptäckt. Den konventionella lab-baserad PCR-tekniken kräver dock dyra laboratorieutrustning och kompetent personal, vilket är en stor nackdel att anta denna teknik som en detektionsmetod för hotellets ändamål.
I detta protokoll demonstreras en egen diagnostisk metod som använder en bärbar realtids PCR-instrumentet. Realtids PCR-teknik erbjuder fördelar jämfört med andra metoder när det gäller kvantitativ noggrannhet, känslighet och mångsidighet och har använts för detektion av ett brett spektrum av växten patogener4,5, inklusive olika potatis patogener i mark6. På grund av de senaste trenderna snabbt växande, konkurrenskraftig marknad, har utrustning som krävs för PCR-teknik fortsatt att utvecklas för att vara mer kompakt och billigare7. Protokollet består av följande steg: magnetiska pärla-baserade nukleinsyra utvinning, bärbara realtids-PCR (fluorogenic probe-baserad analys) och analys av kvantitativa data som kan göras alla distans med en bärbar dator (figur 1).
Med hjälp av bärbara PCR-protokollet framkallat här, jordprover analyserades för att upptäcka jordburna patogener, Spongospora subterranea. Spongospora valdes eftersom det är en viktig potatis patogen som kausala agenten av pudrig skorv8. Under de senaste decennierna anses förekomsten av denna sjukdom ha spridits till många regioner där potatis odlas9,10. Pudrig skorv, genom närvaron av finne som lesioner på knölarna kan orsaka betydande kvalitativa skördeförluster potatisodlare. Dessutom kan S. subterranea vektor potatis Mop toppen Virus (PMTV), vilket kan orsaka inre lesion symtom i knölar (känd som spraing)11,12. Därför är det viktigt att veta om S. subterranea är närvarande i fält före plantering6. Vi visar också nyttan av detta protokoll för detektion av Rhizoctonia solani anastomos grupp 3 (AG3) och PMTV. Även om flera anastomos grupper av Rhizoctonia solani orsakar sjukdomar i potatis, AG3 är utan tvekan den viktigaste i hela världsvida13, orsakar stem kräfta och svart skorv resulterar i marknadsmässig avkastning förluster på upp till 30%14. PMTV orsakar nekrotiska lesioner inom knölarna, som vanligen kallas spraing. Detta virus har nyligen rapporterats för första gången i flera stater i Pacific Northwest15,16,17, och ökande berör odlare i denna viktiga potatis växande region. Förutom att bestämma effektiviteten av bärbara PCR för dessa viktiga sjukdomar, optimal DNA extraktion metodik och jord provstorlek undersöktes också i denna studie.
Resultaten tyder på att den bärbara PCR metoden är mångsidig och tillämpliga för olika patogener. Hotellets detektionsmetod som vi utvecklat kan tillåta frontline arbetarna inom jordbruket (t.ex. odlare) för att göra tidigare beslut angående hantering av sjukdomar, såsom olika val eller rotationer, och kan kvantifiera en växt patogen i provet under en fältundersökning, före plantering, för att undvika potentiella sjukdomsutbrott.
Protocol
1. Hotellets molekylär identifiering av patogener med hjälp av en bärbar Real-Time PCR System
Obs: Se figur 1.
- Magnetiska pärla-baserade DNA-extraktion
Obs: En magnetisk pärla-baserad DNA extraktion kit (t.ex. från Primerdesign) användes enligt tillverkarens anvisningar. Alla reagenser ska förvaras i rumstemperatur (18-25 ° C). När den frystorkade proteinas K (flaska No.1) avbryts (med flaska No.1a), förvaras vid-20 ° C.- Blanda 20-50 mg av jordprov med 500 µL prov Prep lösning i ett mikrorör.
Obs: Förhållandet mellan jord: Prep lösning är viktigt som blanda dem i andra nyckeltal kan orsaka ett fel av nedströms experiment (t.ex. förorening av inhibitorer av PCR). - Mala jorden på botten av röret med en liten steril mortel tills lösningen är grumlig. Ytterligare avbryta jordpartiklar i lösningen genom att skaka mikroröret och låt det stå, ostörd, att låta marken partiklar bosätta sig helt (normalt mellan 5-10 min).
- Överför 200 µL av supernatanten till en färsk mikrorör och tillsätt 200 µL lyseringsbuffert (flaska nr 2: guanidin hydroklorid lösning) och 20 µL av proteinas K (flaska No.1).
- Blanda den lysate noggrant genom att vända tuben och inkubera vid rumstemperatur i 15 min.
Obs: Om den lysate hittas på mikrorör locket, tryck röret eller använda en centrifug, om maskarna från locket. - Tillsätt 500 µL av den bindande buffer/magnetiska pärla mix (flaska nr.3) lyserat. Blanda väl genom pipettering upp och ner och inkubera vid omgivande temperatur under 5 minuter från magnetic tube racket.
Obs: Se till att blanda pärla lösningen väl före användning så att pärlorna är aliquoted jämnt från flaskan med lagring. - Placera mikroröret på magnetiska tube racket. Vänta i minst 2 minuter eller tills alla pärlorna i mikroröret fästa på magnetiska sida väggen. Ta sedan bort och kasta alla supernatanten genom pipettering.
Obs: Stör inte magnetiserade pärlorna samtidigt bort och Aspirera supernatanten. DNA har nu fångats av de magnetiska pärlorna. - Ta bort mikroröret från magnetic tube rack, tillsätt 500 µL av Wash Buffer-1 (flaska nr 4: natrium perklorat/etanol lösning) och slamma pärlorna av upprepad pipettering tills pärlorna är jämnt spridda. Utföra denna tvätt steg för att ta bort protein och salt från provet. Låt blandningen stå i 30 s.
- Upprepa steg 1.1.6.
- Ta bort mikroröret från magnetic tube rack, tillsätt 500 µL av Wash Buffer-2 (flaska nr 5: natrium perklorat/etanol lösning) och slamma pärlorna av upprepad pipettering tills pärlorna är jämnt spridda. Låt blandningen stå i 30 s.
- Upprepa steg 1.1.6.
- Ta bort mikroröret från magnetic tube rack och sedan tillsätt 500 µL av 80% etanol (flaska No.6).
Obs: Detta steg är nödvändigt för avlägsnande av kvarvarande salter från provet.- Återsuspendering pärlorna av upprepad pipettering tills pärlorna är jämnt spridda. Låt detta stå i 10 min med enstaka blanda genom inversion.
- Upprepa steg 1.1.6.
- Luften torr magnetiska pärla pelleten i 10 minuter vid rumstemperatur med mikrorör locket öppet.
Obs: Pärlorna ska vara fri från någon synlig kvarstående etanol men inte helt torkat ut. - Ta bort mikroröret från magnetic tube rack, tillsätt 50-200 µL eluering buffert (flaska No.7) och återsuspendering pärlorna av upprepad pipettering tills pärlorna är jämnt spridda och låt den stå för 30 s.
Obs: I ovanstående steg släpps renade DNA ut från de magnetiska pärlorna i eluering bufferten. - Placera mikroröret på magnetiska tube racket. Vänta i minst 2 minuter eller tills alla pärlorna i mikroröret fästa på magnetiska sida väggen.
- Överför supernatanten som nu innehåller den renade DNA/RNA till en 0,5 mL mikrorör för användning i de efterföljande stegen.
- Blanda 20-50 mg av jordprov med 500 µL prov Prep lösning i ett mikrorör.
- Bärbar realtids-PCR
Obs: En bärbar termocykler och PCR test kit användes enligt tillverkarens anvisningar (se Tabell för material).- Öppna och köra programvaran termocyklern-associerade, Välj Target detection test och mata in all beskrivning information i fälten namn & detaljer, anteckningar, prover och tester data entry.
Obs: Wells #1 och #2 designeras av programvara för den negativa kontrollen och positiv kontroll, respektive. - Förbered PCR reagens före användning. Överföra 500 µL av master mix resuspension bufferten in i röret som innehåller frystorkade huvudmixen och blanda väl genom inversion. Över hela huvudmixen till den bruna mikrorör märkt primers/sond (tabell 2).
- Mössa och skaka mikroröret att blanda. Omsorgsfull blandning krävs för att säkerställa att alla komponenter igen avbryts helt. Låt blandningen stå i 5 min innan användning.
Obs: Lagra reaktionsblandning vid-20 ° C efter användning.
- Mössa och skaka mikroröret att blanda. Omsorgsfull blandning krävs för att säkerställa att alla komponenter igen avbryts helt. Låt blandningen stå i 5 min innan användning.
- Förbereda en negativ kontroll genom att överföra 10 µL av den beredda reaktionsblandning från föregående steg i en 0,2 mL PCR-rör och sedan tillsätt 10 µL sterilt nuclease-fri avjoniserat vatten.
- Förbereda en positiv kontroll genom att överföra 10 µL av den beredda reaktionsblandning från steg 1.2.2 i en 0,2 mL PCR-rör och Lägg sedan till 10 µL av positiv kontroll mallen.
- För varje prov, överföra 10 µL av den beredda reaktionsblandning från föregående steg i en 0,2 mL PCR-rör, och Lägg sedan till 10 µL prov DNA beredd från steg 1.1.16.
- Fyll brunnarna av termocyklern med innehållet från deras respektive PCR-rören som beskrivs i steg 2.1.1.
- När all nödvändig information har angetts och bekräftade, Välj Start Kör och välj antingen ethernet-anslutna instrumentet eller en USB-enhet.
Obs: Om USB-enheten alternativet väljs, måste köra filen sparas på hårddisken för att användas med termocyklern (t.ex., F:\genesig). Körningen börjar omedelbart efter disken sätts in i termocykler.
- Öppna och köra programvaran termocyklern-associerade, Välj Target detection test och mata in all beskrivning information i fälten namn & detaljer, anteckningar, prover och tester data entry.
- Dataanalys av bärbara realtids-PCR.
- När körningen är klar, öppna kör filen (.usb) från USB-enheten med hjälp av termocyklern-associerade programvara eller direkt Visa kör resultaten i programvaran genom att klicka på resultat.
- Innan analysera resultaten, spara ifyllda körningen för att undvika att förlora data.
- I fliken resultat , Visa status för flykt, kategoriserade efter prover.
Obs: Data som kan erhållas i den här fliken är status för resultat och kopiera nummer påvisas i provet. - Klicka på fliken Detaljer för att Visa förstärkning kurvorna. När målet upptäcks framgångsrikt, visas Cq (kvantifiering cykel) värden av både målet och intern kontroll.
Obs: Dessa värden beräknas i slutrapporten och används för att bestämma om ett prov är positivt för målet och om det finns problem med reaktionen eller de DNA-proverna.
2. andra protokoll
-
Alternativa lab-baserad DNA extraktionsmetoder
-
CTAB-fenol-kloroform baserade metoder
- Utföra CTAB-fenol-kloroform baserade metoder, efter de Doyle metod18 och Dellaporta metod19 som tidigare beskrivits.
-
DNA mini förberedelse metod
Obs: Edwards metod20 utfördes enligt följande.- Lägga till 500 mg av jord, följt av fem 1.4 mm keramiska pärlor och 750 µL av Edwards buffert (200 mM Tris, pH 8,0, 200 mM NaCl, 25 mM EDTA, 0,5% SDS) ett mikrorör och blanda väl.
- Inkubera i mikrorör vid 65 ° C i 5 min.
- Homogenisera provet med en pärla drevkarlen Homogenisatorer för 60 s (eller med hjälp av en mortel och stöt).
- Centrifugera provet vid 14 000 x g i 5 min.
- Överföra 500 µL av supernatanten till en färsk mikrorör och sedan blanda med 500 µL kylda isopropanol. Blanda genom att vända tuben 10 gånger.
- Centrifugera provet vid 14 000 x g i 15 min till pelletize DNA.
- Dekantera supernatanten och låt DNA pelleten lufttorka i rumstemperatur tills återstående etanolen har avdunstat.
- Tvätta DNA pelleten med 750 µL av kylda 70% etanol.
- Luften torr pelleten innan vi åter avbryter i 50-100 µL TE buffert (10 mM Tris-HCl, pH 8,0 och 1 mM EDTA).
-
Andra alternativa metoder
- Utföra Silica-base DNA-extraktion med kit #1 (MP BIO snabbt DNA Spin) och kit #2 (Zymo BIOMICS DNA Miniprep Kit) enligt tillverkarens instruktioner.
-
CTAB-fenol-kloroform baserade metoder
-
Konventionella lab-baserad realtids-PCR.
Obs: En konventionell termocykler användes med mastermix för sonden-baserade PCR, olika primers och oligonukleotiden sonder (tabell 2).- Med icke-transparenta bottnat PCR rör eller en PCR-plattan, förbereda 20 µL reaktioner för alla DNA-prover som ska analyseras, och en negativ kontroll (nuclease-fri avjoniserat vatten) samt en positiv mall kontroll beredd internt.
- För varje PCR-rör eller brunn, förbereda en blandning inklusive 10 µL av mastermix, 7 µL nuclease-fri avjoniserat vatten, 2 µL av 2 µM grundfärg/sond och 1 µL av DNA-prov (från steg 1.1.16 eller 2.1) eller kontrollmall, per prov.
- Stänga den PCR-rör eller plattan och starta reaktionen genom att välja lämpligt PCR-program.
-
Dataanalys av konventionella lab-baserad realtids-PCR
- Använda termocyklern-associerade programvara för att analysera resultaten från den konventionella termocyklern. Påbörja dataanalys, överföra köra filen från termocyklern till en USB-enhet, Anslut en USB-enhet och välj Exportera.
- Öppna filen (.pcrd) från den exporterade kör i programvaran termocyklern-associerade.
- Markera väl av ett prov genom att lokalisera dess motsvarande väl på instrumentet. Förstärkning kurvor och standard kurvor (i tillämpliga fall) genereras automatiskt. Klicka på Plattan Setup eller en liknande funktion för att påbörja indata innan analysera data om prov informationen inte anges.
- Visa informationen på fliken kvantifiering. Detta kan exporteras för dataanalys med en tredje part programvara såsom CSV, XML eller HTML fil läsare.
- Erhålla Cq data baserat på de fastställda tröskelvärdena och jämför det med positiva och negativa kontroller.
Obs: Om DNA normerna i målet användes i analysen, jämför Cq exempeldata som standarder att bestämma Cq cut-off
Representative Results
Jämförelse av DNA extraktionsmetoder
En magnetisk pärla-baserad DNA extraktion metod förenlighet med realtids-PCR utvärderades genom att identifiera belopp av S. subterranea DNA i ett jordprov från fält angripet av patogenen. I kompletterande figur 1visas den magnetiska pärla-baserade metoden jämfördes med andra metoder inklusive en CTAB-fenol-kloroform baserat metod18, snabb DNA mini förberedelse metoder19,20och andra standard kiseldioxid-baserade DNA extraktion kit. DNA-prover som utvinns med hjälp av sex olika metoder utsattes för konventionella lab-baserad realtids-PCR. Resultaten föreslås att den magnetiska pärla-baserade metoden är jämförbara med andra metoder, även om kisel-baserade DNA extraktion kit visade de bästa prestandan bland de metoder som vi testat. Alla satser innehåller guanidinium kaliumtiocyanat eller guanidinium hydroklorid: båda är kraftfulla chaotropic agenter, som denaturera de flesta av cellulära proteiner inklusive RNaser och DNases. Därför, med hjälp av metoder är lämplig för både DNA och RNA extraktioner.
Jämförelse mellan en bärbar realtids-PCR och en konventionell lab-baserad realtids-PCR
Att jämföra sensitivitet och specificitet av en bärbar PCR till en konventionell lab-baserad PCR, absolut kvantifiering av patogenen DNA utfördes med hjälp av olika mängder av genen S. subterranea ITS, som bars av pGEM-T vektorn21 . En serie av 10-faldig utspädningar av ITS-genen (106 100 kopior) analyserades med hjälp av den SsTQ primers/probe set22. Resultaten visade att den bärbara PCR-metoden upptäckt mål patogenen DNA (~ 100 exemplar), även om känsligheten var 10 gånger lägre än att konventionella lab-baserad PCR-metoden, som upptäckt minst 10 exemplar (figur 2).
För ytterligare validering testades artificiellt hemsök jordar. S. subterranea sporosori erhölls från pudrig skorv rot galls från potatis rötter. Smutsar var angripen av sporosori suspensioner med en slutlig koncentration av 105 sporosori/g torrvikt jord. Med magnetiska pärla-baserade metod, DNA extraherades från angripna jordproverna och 10-faldig seriespädningar var beredda att få koncentrationer motsvarande 105, 104, 103, 102, 101och 100 sporosori/g torrvikt jord. De DNA-proverna användes för PCR använder SPO primer/probe set23. Resultaten visade att den bärbara PCR-metoden har jämförbara analytisk förmåga till en konventionell lab-baserad PCR metod men, igen, känsligheten minskades med en faktor på ~ 10 (figur 3).
Slutligen testade vi ett jordprov från ett fält som var naturligt förorenade med S. subterranea. Den magnetiska pärla-baserade DNA-extraktionen utfördes på olika mängder av jordar (10, 20, 50 och 100 mg jord per 500 µL utvinning buffertlösning). Resultaten antydde att den optimala vikten av jord som utgångsmaterial för de DNA-extraktionen var 50-100 mg (figur 4). Jord belopp utanför intervallet orsakade ett fel av nedströms PCR-steg. Denna effekt kan vara att när överskjutande belopp av jord används som utgångsmaterial, föroreningar (t.ex., fenolföreningar) kan störa den PCR-24. Vid lägre volymer av jord, kan av extraherat DNA vara lägre än detektionsgränsen för PCR (t.ex., avkastningen av totala DNA extraheras från 10-20 mg jord varierades). Känsligheten var ganska jämförbar mellan bärbara PCR och konventionella PCR-metoder. Liknande resultat erhölls i DNA-prover av olika extraktionsmetoder (kompletterande figur 2)
Andra patogener av hotellets detektionssystemet med en bärbar real-time PCR
Vi testade den bärbara PCR-metoden för att upptäcka andra viktiga jordburna potatis patogener, R. solani VT3 och PMTV. I denna studie genomfört vi realtids-PCR med RsTq primers/RQP1 probe set25 för R. solani AG3 detektion med DNA från ren kultur. Vi har även genomfört realtids PCR använder den PMTV-D primer/probe set26 för PMTV detektion med RNA från ett spraing symtomatisk tuber prov användes. I figur 5visas upptäckt bärbara PCR metoden framgångsrikt både patogener. Resultaten var jämförbara mellan bärbara och konventionella instrument, tyder på att den bärbara PCR-metoden är mångsidig och gäller för andra patogener upptäckter om primer sekvenser utformad för realtids-PCR är tillgängliga.
Figur 1. Förfarandet för ett bärbart realtids PCR system för upptäckt av hotellets patogen. Protokollet består av stegen i följande ordning: lysate beredning av kort homogenisering (A), magnetisk pärla-baserade nukleinsyra extraktion (B), bärbara realtids PCR (C) och analys av kvantitativa data använder en bärbar dator (D). Observera att alla åtgärder kan utföras på plats.
Figur 2 . Jämförelse av känslighet mellan en bärbar PCR och en konventionell lab-baserad PCR. Kvantifiering av patogenen DNA utfördes med hjälp av olika mängder S. subterranea ITS genen (106 100 kopior) med SsTQ primers/sonden. Linjär regression mellan logg av S. subterranea plasmid DNA och ömsesidiga Log värde Cq på den konventionella termocyklern (A) och den bärbara termocyklern (B). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 . Jämförelse av detekteringsprestanda i artificiellt hemsök jordar med S. subterranea. Smutsar var artificiellt angripet (105 till 100 sporosori/g torrvikt jord) med S. subterranea sporosori suspensioner. DNA, som var med magnetiska pärla-baserade metod, ur de angripna jordproverna. Primärvården utfördes med jordproverna med SPO primer/probe set. Linjär regression mellan log start mängden i sporosori per gram av jord och det ömsesidiga log värdet av Cq på den konventionella termocyklern (A) och den bärbara termocyklern (B). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 . Jämförelse av utgångsbeloppet av jordprover för DNA-extraktion. Den magnetiska pärla-baserade metoden användes för DNA-extraktion från 10, 20, 50 och 100 mg av jordprover. Realtid primärvården utfördes med den bärbara termocyklern. Standard kurvor representerar förhållandet mellan mängden totala DNA extraheras från jordproverna (x-axeln) och mängden PCR-produkten (y-axeln) förstärks av Sss primer/sond uppsättningen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 . Andra potatis patogener, R. Stemphylium och PMTV. Realtid primärvården utfördes med den bärbara termocyklern och den konventionella termocyklern. R. solani AG3 upptäcktes i totala DNA extraheras från ren kultur med RsTq primers och RQP1 sonden (A) PMTV upptäcktes i total-RNA extraherade från ett PMTV-infekterade tuber prov använder PMTV-D primer/sonden inställd (B). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 . En diagnostisk rörledning för phytopathogens. Flödesschemat visar en allmänna arbetsflödet för phytopathogen diagnos. Observera att det traditionella steget, t.ex., visuell identifiering, kan utelämnas om hotellets molekylär identifiering utnyttjas, vilket gör hela processen för diagnos enkel och snabb. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Bärbar realtids-PCR | Realtids-PCR | LAMPAN | ELISA | Lateral-flöde | |
| Kostnad per mål reaktion | $0,60-$8,47 | $0,60 | $0,75 | $0,60 | $4,74 |
| Känslighet | 100 exemplar | 10 kopior | 10 kopior | 1-10 sporosori33 1-10 ng/mL (protein)33 |
1-10 sporosori34 5 x 105CFU/mL35 |
| Tid kostnad | 90 minuter | 80-240 minuter | 50-90 minuter32 | 3-24 timmar | 10-15 minuter |
| Förberedelse krävs | ●Nucleic acid utvinning ● Primer design |
●Nucleic acid utvinning ● Primer/sond design |
● Nucelic syra utvinning ● Primer design |
● Protein utvinning ● Antikroppar |
EJ TILLÄMPLIGT |
| Andra material som krävs | ● Bärbar termocyklern | ● Konventionella termocyklern | ● Colormetric fläcken ● Inkubator |
● Plattläsare ● Tvätt utrustning |
EJ TILLÄMPLIGT |
Tabell 1. Jämförande diagram av molekylära och serologiska detektionsmetoder för phytopathogens
| Primer | Sekvens (5′ – 3′)en | Måletb | |
| SsTQ-F13 | CCGGCAGACCCAAAACC | ITS1-ITS2 i S. subterranea | |
| SsTQ-R13 | CGGGCGTCACCCTTCA | ITS1-ITS2 i S. subterranea | |
| SsTQ-P13 | [FAM] CAGACAATCGCACCCAGGTTCTCATG [TAM] | ITS1-ITS2 i S. subterranea | |
| Genesig S.subterranea primer/sond | EJ TILLÄMPLIGT | Aktin i S. subterranea | |
| SPO1014 | GGTCGGTCCATGGCTTGA | ITS i S. subterranea | |
| SPO1114 | GGCACGCCAATGGTTAGAGA | ITS i S. subterranea | |
| SPOPRO114 | [FAM] CCGGTGCGCGTCTCTGGCTT [TAM] | ITS i S. subterranea | |
| RsTqF119 | AAGAGTTTGGTTGTAGCTGGTCTATTT | ITS1-ITS2 i R. solani | |
| RsTqR119 | AATTCCCCAACTGTCTCACAAGTT | ITS1-ITS2 i R. solani | |
| RQP119 | [FAM] TTTAGGCATGTGCACACCTCCCTCTTTC [TAM] | ITS1-ITS2 i R. solani | |
| Genesig PMTV primer/sond | EJ TILLÄMPLIGT | CP-RT i PMTV | |
| PMTV-D-F20 | AGAATTGRCATCGAAACAGCA | CP i PMTV | |
| PMTV-D-R20 | GTCGCGCTCCAATTTCGTT | CP i PMTV | |
| PMTV-D-P20 | [FAM] CCACAAACAGACAGGTATGGTCCGGAA [TAM] | CP i PMTV | |
| en Oligo DNA primers ändrades med FAM (6-carboxyfluorescein) eller TAM (5-carboxytetramethylrhodamine) | |||
| b ITS: Inre transkriberas distanser, CP: coat protein; CP-RT: coat protein genomläsning | |||
Tabell 2. Primer som används i denna studie
Kompletterande figur 1. Jämförelse av DNA extraktionsmetoder för detektion av pudrig skorv patogenen. Sex olika DNA extraktionsmetoder (A-F) jämfördes för detektion av pudrig skorv patogener, S. subterranea i jordprover. (B, D, F). DNA extraherades med silica-baserade kit #1 (se tabell av material för alla kit namn), kiseldioxid-baserade kit #2 och magnetiska pärla-baserade kit, repsectively. PCR utfördes med hjälp av den konventionella lab-baserad PCR termocyklern. Standard kurvor representerar förhållandet mellan mängden totala DNA extraheras från jordproverna och mängden av PCR-produkten förstärks av SsTQ primers/sond uppsättningen. Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Kompletterande figur 2. Jämförelse av detektionsgränsen mellan en bärbar PCR och en konventionell lab-baserad PCR. Totala DNA isolerades från ett jordprov som använder tre olika extraktionsmetoder: (A, B) Doyle metod, (C, D) den kiselbaserade kit #2, och (E, F) i magnetiska pärla-baserade kit. Grafer visas till vänster data använder den bärbara termocyklern med Sss primers/probe set, medan diagrammen till höger representerar data som genereras med hjälp av den konventionella lab-baserad termocyklern med SsTQ primers/sond in. Vänligen klicka här för att ladda ner denna siffra.
Discussion
I tabell 1visas senaste teknologiska framstegen inom molekylär identifiering av patogena agens har ökat effekt, noggrannhet och hastighet av diagnos, vilket har bidragit till upptäckten av pre-symtomatiska infektioner27. Angående Hotellets diagnos, lampa och lateralt flöde metoder används ofta eftersom de är portabla och ger omedelbara resultat till en lägre kostnad. Men när det gäller serologiska metoder, kan artspecifika upptäckt vara svårt att uppnå. Detta orsakar ibland misdetection av off-target mikrober som gemensam mark invånare. Det kan exempelvis vara arg reactivity mellan serologiska tester av Phytophthora spp. och Pythium spp. När det gäller potatis patogener28, som anger att det finns ibland svårigheter att upptäcka riktade anläggningen patogener.
I den aktuella studien, har vi utvecklat ett optimerat protokoll för hotellets molekylär identifiering av jordburna potatis patogener använder bärbara realtids PCR systemet genom att jämföra dess kapacitet med en konventionell lab-baserad realtids PCR system. Vi hittade att metoden på plats särskilt upptäcker potatis patogener i jordprov, även om känsligheten är ~ 10 gånger lägre än för en motsvarande lab-baserad analys. Det är också värt att överväga att i detta fall både laboratorium och fält test inte använde en biologiskt relevanta provstorlek. Stort urvalsstorlekar krävs för användning i rutinmässigt screening fältet jordar som tidigare beskrivits29,30, där urvalsstorlekar av mellan 250 g till 1 kg behandlas, även om dessa metoder kräver skickliga operatörer och sofistikerade utrustning för att extrahera DNA. Vanligtvis tas en storskalig jord DNA extrahera från en enda samlade jord för representativt prov många delprover över 1 till 4 hektar6,29,30. Men de protokoll som utvecklats här är snabb, lätt att använda för användare med ingen tidigare erfarenhet av molekylär diagnostik och kan användas utanför ett labb. Eftersom metoden är snabb och relativt billigt jämfört med storskaliga jordextraktion, kunde det användas till skärmen många småskaliga prover från en liknande provtagningsområdet att storskaliga samlingsprover. Detta kunde övervinna några av bristerna i en liten provstorlek och fastställa ytterligare information om den rumsliga fördelningen av patogenet i fältet. Dessutom den portabilitet och hastighet av metoden innebär att den också kan användas i demonstrationsverksamhet till odlare för utbildning och engagemang ändamål.
En annan faktor är att många realtids PCR-analyser är redan publicerad för ett brett utbud av växt patogener5. Detta system kan göra använda av dessa befintliga analyser utan behovet av för att utforma nya lampa primers aktivera i fältprovning. En ofta förekommande kritik av lampa analyser är att de kan vara svåra att utforma31. Bärbar PCR, tillåter därför relativt lätt genomförandet av ett brett utbud av lättillgängliga patogen tester för på plats tester.
Traditionella metoder kan vara ofta kostsamma, mödosam, felaktig och tidskrävande. Enkelheten i den Hotellets metod vi utvecklat gör det möjligt för odlare och anställda att utföra upptäckt av patogen själva och kanske generera ett resultat mycket snabbare än att skicka till ett laboratorium för veterinärdiagnostik som skulle kunna vara en bit bort. Den snabbhet och känslighet för bärbara PCR-metoden kan hjälpa odlare undvika sekundära infektioner, som ytterligare kan öka patogen befolkningen och oavsiktlig spridning (via utrustning eller människor). Sammanfattningsvis, möjliggör den Hotellets metod som utvecklats i den aktuella studien korrekt och relativt känslig detektion av viktiga jordburna patogener i fältet. Vår förhoppning är att den på plats metod som utvecklats i denna studie kommer att bidra i en nuvarande diagnostiska pipeline (figur 6), inte bara genom att ge snabba och korrekta svar på epidemiologiska frågor om växtsjukdomar i fältet, men också genom att tillhandahålla ökad förståelse av biologi och växt patogenernas epidemiologi.
Disclosures
Författarna förklarar inget konkurrerande finansiella intressen.
Acknowledgments
Vi är tacksamma mot Dr. Neil C. Gudmestad vid North Dakota State University för att tillhandahålla S. subterranea plasmid DNA, Dr Hanu Pappu på Washington State University (WSU) för att tillhandahålla PMTV RNA och Dr Debra Inglis vid WSU för att tillhandahålla R. solani AG3. Speciellt tack till Dr Jeremy Jewell på WSU för att lämna synpunkter på manuskriptet och WSU CAHNRS kommunikation för videography. Denna forskning stöddes av konsortiet Northwest potatis forskning och Washington State Department of Agriculture - specialitet gröda Block Grant Program (bevilja nr. K1764). PPNS nr 0741, Institutionen för växt patologi, College of Agriculture, mänskliga och naturliga resurs vetenskaper, jordbruks Research Center, Hatch projekt nr. WNP00833, Washington State University, Pullman, WA, USA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| White shell PCR plate | Bio-Rad | HSP9601 | |
| CFX Manager | Bio-Rad | 1845000 | |
| SsoAdvanced Universal Probes Supermix | Bio-Rad | 1725280 | |
| CFX96 Touch qPCR instrument | Bio-Rad | 1855195 | |
| Ethylalcohol, pure 200 proof | Decon Laboratories | 04-355-222 | |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) | Fisher BioReagents | BP118-500 | |
| Phenol, Saturated | Fisher BioReagents | BP1750I-400 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Fisher BioReagents | BP152-5 | |
| q16 real-time PCR machine | genesig | MBS486001 | |
| Ultrapure Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Invitrogen | 15525-017 | |
| 2-Propanol (Isopropanol) | JT Baker | 67-63-0 | |
| Chloroform | JT Baker | 9180-03 | |
| Hydrochloric Acid, 36.5-38.0% (HCl) | JT Baker | 9535-03 | |
| iso-Amyl Alcohol | JT Baker | 9038-01 | |
| FastDNA Spin kit | MP Biomedicals | 6560-200 | Silica-based DNA extraction kit #1 |
| Luna Universal One-Step RT-qPCR Kit | New England Biolabs | E3005S | |
| 0.1ml Low Profile Individual PCR Tubes | Phenix Research | MPC-100LP | |
| Easy DNA/RNA Extraction Kit | Primerdesign | genesigEASY-EK | |
| genesig Easy 1.5 mL tubes | Primerdesign | genesigEASY-1.5 | |
| Magnetic tube rack | Primerdesign | genesigEASY-MR | |
| Spongospora subterranea f. sp. subterranea genesig Easy Kit | Primerdesign | Path-S.subterranea-EASY | |
| Hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) | Sigma-Aldrich | H6269-100G | |
| Pellet pestles | Thermo Fisher Scientific | 12-141-364 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Thermo Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| DNA Miniprep kit | ZymoBIOMICS | D4300 | Silica-based DNA extraction kit #2 |
References
- Malcolm, G. M., Kuldau, G. A., Gugino, B. K., Jiménez-Gasco, M. delM. Hidden Host Plant Associations of Soil-borne Fungal Pathogens: An Ecological Perspective. Phytopathology. 103 (6), 538-544 (2013).
- Posthuma-Trumpie, G. A., Korf, J., van Amerongen, A. Lateral flow (immuno)assay: its strengths, weaknesses, opportunities and threats. A literature survey. Anal Bioanal Chem. 393 (2), 569-582 (2009).
- Hill, J., et al. Loop-Mediated Isothermal Amplification Assay for Rapid Detection of Common Strains of Escherichia coli. J Clin Microbiol. 46 (8), 2800-2804 (2008).
- Mumford, R. A., Walsh, K., Barker, I., Boonham, N. Detection of Potato mop top virus and Tobacco rattle virus Using a Multiplex Real-Time Fluorescent Reverse-Transcription Polymerase Chain Reaction Assay. Phytopathology. 90 (5), 448-453 (2000).
- Schena, L., Nigro, F., Ippolito, A., Gallitelli, D. Real-time quantitative PCR: a new technology to detect and study phytopathogenic and antagonistic fungi. European Journal of Plant Pathology. 110 (9), 893-908 (2004).
- Brierley, J. L., Stewart, J. A., Lees, A. K. Quantifying potato pathogen DNA in soil. Applied Soil Ecology. 41 (2), 234-238 (2009).
- Tomlinson, J. A., Boonham, N., Hughes, K. J. D., Griffin, R. L., Barker, I. On-Site DNA Extraction and Real-Time PCR for Detection of Phytophthora ramorum in the Field. Appl Environ Microbiol. 71 (11), 6702-6710 (2005).
- Harrison, J. G., Searle, R. J., Williams, N. A. Powdery scab disease of potato - a review. Plant Pathology. 46 (1), 1-25 (1997).
- Johnson, D. A., Miliczky, E. R. Distribution and development of black dot, Verticillium wilt, and powdery scab on Russet Burbank potatoes in Washington State. Plant Disease. 77 (1), 74-79 (1993).
- Merz, U. Powdery Scab of Potato-Occurrence, Life Cycle and Epidemiology. Am J Pot Res. 85 (4), 241 (2008).
- Jones, R. aC., Harrison, B. D. The behaviour of potato mop-top virus in soil, and evidence for its transmission by Spongospora subterranea (Wallr). Lagerh. Annals of Applied Biology. 63 (1), 1-17 (1969).
- Carnegie, S. F., Davey, T., Saddler, G. S. Effect of temperature on the transmission of Potato mop-top virus from seed tuber and by its vector, Spongospora subterranea. Plant Pathology. 59 (1), 22-30 (2010).
- Woodhall, J. W., Adams, I. P., Peters, J. C., Harper, G., Boonham, N. A new quantitative real-time PCR assay for Rhizoctonia solani AG3-PT and the detection of AGs of Rhizoctonia solani associated with potato in soil and tuber samples in Great Britain. Eur J Plant Pathol. 136 (2), 273-280 (2013).
- Banville, G. J. Yield losses and damage to potato plants caused by Rhizoctonia solani Kuhn. American Potato Journal. 66 (12), 821-834 (1989).
- Crosslin, J. M. First Report of Potato mop-top virus on Potatoes in Washington State. Plant Disease. 95 (11), 1483-1483 (2011).
- Whitworth, J. L., Crosslin, J. M. Detection of Potato mop top virus (Furovirus) on potato in southeast Idaho. Plant Disease. 97 (1), 149-149 (2012).
- Kaur, N., Cating, R. A., Dung, J. K. S., Frost, K. E., Robinson, B. A., Hamm, P. B. First Report of Potato mop-top virus Infecting Potato in Oregon. Plant Disease. 100 (11), 2337 (2016).
- Doyle, J. J. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus. 12, 13-15 (1990).
- Dellaporta, S. L., Wood, J., Hicks, J. B. A plant DNA minipreparation: Version II. Plant Mol Biol Rep. 1 (4), 19-21 (1983).
- Edwards, K., Johnstone, C., Thompson, C. A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis. Nucleic Acids Research. 19 (6), 1349 (1991).
- Bittara, F. G., Secor, G. A., Gudmestad, N. C. Chloropicrin Soil Fumigation Reduces Spongospora subterranea Soil Inoculum Levels but Does Not Control Powdery Scab Disease on Roots and Tubers of Potato. Am J Potato Res. 94 (2), 129-147 (2017).
- van de Graaf, P., Lees, A. K., Cullen, D. W., Duncan, J. M. Detection and Quantification of Spongospora subterranea in Soil, Water and Plant Tissue Samples Using Real-Time PCR. European Journal of Plant Pathology. 109 (6), 589-597 (2003).
- Maldonado, H., Falloon, R. E., Butler, R. C., Conner, A. J. Spongospora subterranea root infection assessed in two potato cultivars differing in susceptibility to tuber powdery scab. Plant Pathology. 62 (5), 1089-1096 (2013).
- Braid, M. D., Daniels, L. M., Kitts, C. L. Removal of PCR inhibitors from soil DNA by chemical flocculation. Journal of Microbiological Methods. 52 (3), 389-393 (2003).
- Lees, A. K., Cullen, D. W., Sullivan, L., Nicolson, M. J. Development of conventional and quantitative real-time PCR assays for the detection and identification of Rhizoctonia solani AG-3 in potato and soil. Plant Pathology. 51 (3), 293-302 (2002).
- Davey, T., Carnegie, S. F., Saddler, G. S., Mitchell, W. J. The importance of the infected seed tuber and soil inoculum in transmitting Potato mop-top virus to potato plants. Plant Pathol. 63 (1), 88-97 (2014).
- Boonham, N., et al. Methods in virus diagnostics: From ELISA to next generation sequencing. Virus Research. 186, 20-31 (2014).
- Mohan, S. B. Cross-reactivity of antiserum raised against Phytophthora fragariae with other Phytophthora species and its evaluation as a genus-detecting antiserum. Plant Pathology. 38 (3), 352-363 (1989).
- Ophel-Keller, K., McKay, A., Hartley, D., Curran Herdina, J. Development of a routine DNA-based testing service for soil-borne diseases in Australia. Austral Plant Pathol. 37 (3), 243-253 (2008).
- Woodhall, J. W., et al. A new large-scale soil DNA extraction procedure and real-time PCR assay for the detection of Sclerotium cepivorum in soil. Eur J Plant Pathol. 134 (3), 467-473 (2012).
- Miles, T. D., Martin, F. N., Coffey, M. D. Development of Rapid Isothermal Amplification Assays for Detection of Phytophthora spp in Plant Tissue. Phytopathology. 105 (2), 265-278 (2014).
- Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 28 (12), e63-e63 (2000).
- Narayanasamy, P. Microbial Plant Pathogens: Detection and Management in Seeds and Propagules. , John Wiley & Sons. (2016).
- Braun-Kiewnick, A., Altenbach, D., Oberhänsli, T., Bitterlin, W., Duffy, B. A rapid lateral-flow immunoassay for phytosanitary detection of Erwinia amylovora and on-site fire blight diagnosis. Journal of Microbiological Methods. 87 (1), 1-9 (2011).
