Summary
Detecção rápida e exata de patógenos no local, especialmente de solo-carregadas patógenos vegetais, é crucial para prevenir mais produção de inóculo e proliferação de doenças de plantas no campo. O método desenvolvido aqui, usando um sistema de detecção de PCR em tempo real portátil permite o diagnóstico no local em condições de campo.
Abstract
No diagnóstico de doenças de plantas pode ser uma ferramenta útil para os cultivadores de decisões oportunas, permitindo a implementação anterior de estratégias de gestão de doenças que reduzam o impacto da doença. Atualmente em muitos laboratórios de diagnóstico, a reação em cadeia do polymerase (PCR), PCR particularmente em tempo real, é considerado o método mais sensível e exato para a deteção de patógenos vegetais. No entanto, PCRs baseados em laboratório geralmente requerem equipamento caro laboratório e pessoal qualificado. Neste estudo, patógenos de solo de batata são usados para demonstrar o potencial para a deteção molecular no local. Isto foi conseguido usando um protocolo simples e rápido, constituído de extração magnética do grânulo-baseado do ácido nucleico, portátil do PCR em tempo real (fluorogenic baseada em investigação ensaio). A abordagem PCR em tempo real portátil comparado favoravelmente com um sistema baseado em laboratório, detectar apenas 100 cópias de DNA de Spongospora subterranea. O método PCR em tempo real portátil desenvolvido aqui pode servir como uma alternativa às abordagens baseadas em laboratório e uma ferramenta útil no local para o diagnóstico do agente patogénico.
Introduction
Precisa e rápida identificação de patógenos causadores afeta de forma significativa as decisões em relação à gestão de doenças de planta. Doenças transmitidas pelo solo são particularmente difíceis de diagnosticar porque o ambiente do solo é extremamente grande em relação à planta, em massa e complexa, tornando-se um desafio para compreender todos os aspectos das doenças transmitidas pelo solo. Além disso, as doenças transmitidas pelo solo podem ser assintomática durante os primeiros estágios de infecção, dependentes de estressores ambientais, e alguns têm longos períodos de latência que resultam em diagnósticos atrasado1. Muitos patógenos solo desenvolveram estruturas de sobrevivência, tais como esporos especializados ou melanized hifas, que podem sobreviver no solo por muitos anos, mesmo na ausência de seus hospedeiros. Abordagens utilizadas para o gerenciamento de doenças transmitidas pelo solo incluem: evitar áreas infestadas conhecidas, usando sementes certificadas isentos de organismos patogénicos e mudas, mantendo o equipamento sanitário e restringir o movimento do solo e da água, quando possível. Conhecimento sobre a presença do patógeno através de estratégias de deteção molecular pode também desempenhar um papel útil, informando decisões oportunas sobre tratamentos de fase inicial ou pre-planta avaliações dos campos. Testes no local fornece vantagens adicionais de fornecer um resultado rápido sem enviar a amostra para um laboratório de diagnóstico que talvez alguma distância afastado e também pode envolver o cultivador se tal um diagnóstico é interpretada 'lado do campo' em sua presença.
Para o diagnóstico no local com base em detecção molecular, sensibilidade, especificidade, robustez (repetibilidade e reprodutibilidade) e eficiência (IE., simplicidade e custo desempenho) são fatores cruciais para a consideração. Lateral dispositivos de fluxo (LFDs) como o Immunostrip e PocketDiagnostic, são populares métodos para detecção do patógeno no local por causa de sua simplicidade como um ensaio de uma etapa. No entanto, LFDs pode não ser a ferramenta de diagnóstico bem em todas as situações porque eles não têm a sensibilidade e especificidade e ocasionalmente fornece resultados ambíguos se o patógeno alvo está em baixas concentrações e pode reação cruzada com semelhante espécies ou gêneros 2. amplificação isotérmica mediada por Loop (lâmpada) também é aplicável para a deteção do patógeno no local e é particularmente barata devido à simples análise visual colorimétrico, condições de reação que permanecem constantes e reagentes de baixo custo. No entanto, ambos LFDs e lâmpada são normalmente usadas qualitativamente, embora ambas as abordagens podem ser usadas quantitativamente com mais caro equipamento3. Reação em cadeia da polimerase (PCR) oferece uma capacidade quantitativa, em comparação com os referidos métodos de detecção, alta sensibilidade e alta especificidade. No entanto, a tecnologia PCR convencional baseada em laboratório requer equipamento caro laboratório e pessoal especializado, que é uma grande desvantagem em adotar essa tecnologia como um método de detecção para fins no local.
Neste protocolo, é demonstrado um método de diagnóstico no local usando um instrumento portátil de PCR em tempo real. Tecnologia PCR em tempo real oferece vantagens sobre outros métodos em termos quantitativo precisão, sensibilidade e versatilidade e tem sido amplamente utilizada para a detecção de uma ampla gama de plantas patógenos4,5, incluindo vários patógenos de batata no solo6. Devido as recentes tendências do mercado de crescimento rápido, competitivo, equipamento necessário para a tecnologia PCR continuaram a desenvolver-se para ser mais compacto e mais barato7. O protocolo é composto das seguintes etapas: extração magnética baseada no grânulo de ácidos nucleicos, PCR em tempo real portátil (ensaio baseado em investigação de fluorogenic) e análise de dados quantitativos, que pode ser feito remotamente usando um computador portátil (Figura 1).
Usando o protocolo PCR portátil desenvolvido aqui, as amostras de solo foram analisadas para detectar o patógeno de solo-carregadas, Spongospora subterranea. Spongospora foi escolhido como é um patógeno importante batata como o agente causal da sarna pulverulenta8. Nas últimas décadas, a presença desta doença é considerada para muitas regiões onde batatas são cultivadas9,10. Sarna pulverulenta, através da presença de espinha como lesões em tubérculos pode causar perdas de rendimento qualitativo considerável aos produtores de batata. Além disso, S. subterranea pode vector batata Mop Top vírus (quotidiano), que pode causar sintomas de lesão interna em tubérculos (conhecidos como spraing)11,12. Portanto, é importante saber se S. subterranea está presente em campos antes do plantio6. Podemos também demonstrar a utilidade do presente protocolo para a detecção de Rhizoctonia solani anastomose grupo 3 (AG3) e quotidiano. Apesar de vários grupos de anastomose de Rhizoctonia solani causam de doenças em batata, AG3 é indiscutivelmente o mais importante no mundo13, causando o cancro da haste e emoção negra, resultando em perdas de rendimento negociáveis de até 30%14. Quotidiano provoca lesões necróticas dentro os tubérculos, que são comumente chamados de spraing. Este vírus tem sido relatado recentemente pela primeira vez em vários Estados do Noroeste Pacífico15,16,17e é uma preocupação crescente para os cultivadores nesta região crescente importante batata. Além de determinar a eficácia do PCR portátil para estas doenças importantes, DNA extração metodologia e solo amostra tamanho ideal também foram investigados neste estudo.
Os resultados sugerem que o método PCR portátil é versátil e aplicável para a detecção de agentes patogénicos diferentes. O método de detecção no local desenvolvemos pode permitir que os trabalhadores da linha de frente na agricultura (por exemplo, os cultivadores) para tomar decisões anteriores em relação à gestão da doença, tais como variedade seleções ou rotações e pode quantificar um patógeno vegetal na amostra durante uma pesquisa de campo, antes do plantio, para evitar potenciais focos de doença.
Protocol
1. no local deteção Molecular de patógenos, usando um sistema portátil de PCR em tempo real
Nota: Veja a Figura 1.
- Extração de DNA de grânulo-com base magnética
Nota: Um magnético baseado em grânulo DNA extração kit (por exemplo, de Primerdesign) foi usado de acordo com as instruções do fabricante. Todos os reagentes devem ser armazenados à temperatura ambiente (18-25 ° C). Uma vez que o liofilizado Proteinase K (garrafa n º 1) está suspenso (usando No.1a de garrafa), armazenar a-20 ° C.- Misture 20-50 mg da amostra de solo com 500 µ l de solução de preparação de amostra em um microtubo.
Nota: A proporção de solo: preparação da solução é importante como misturá-los em outras proporções pode causar uma falha de experimentos a jusante (por exemplo, contaminação por inibidores do PCR). - Triture o solo na parte inferior do tubo usando um pequeno pilão estéril até que a solução está nublada. Mais suspender as partículas de solo na solução, agitando o microtubo e deixá-lo ficar, tranquilamente, para deixar o solo partículas resolver completamente (normalmente entre 5 a 10 min).
- Transferência de 200 µ l do sobrenadante para um microtubo fresco e acrescentar 200 µ l de tampão de lise (frasco n º 2: solução de cloridrato guanidina) e 20 µ l de Proteinase K (garrafa no. 1).
- Homogeneizar o lisado por inversão do tubo e incubar a temperatura ambiente por 15 min.
Nota: Se o lisado encontra-se na tampa microtubo, bater os tubos ou use uma centrífuga, se disponível para remover a tampa. - Adicione 500 µ l do mix do grânulo tampão/magnético (garrafa no. 3) a vinculação à amostra lisada. Misture bem pipetando para cima e para baixo e incubar a temperatura ambiente por 5 min longe o suporte magnético.
Nota: Certifique-se de misturar a solução de grânulo bem antes do uso para garantir que as contas são aliquotadas uniformemente na garrafa de armazenamento. - Coloque o microtubo sobre o suporte magnético. Espere no mínimo 2 min ou até que todas as contas em microtubo fixar à parede magnética-lado. Em seguida, remover e descartar todos o sobrenadante por pipetagem.
Nota: Não perturbe os grânulos magnetizados enquanto removendo e aspirar o sobrenadante. DNA agora foi capturado pelas esferas magnéticas. - Remova o suporte magnético o microtubo, adicionar 500 µ l de Wash Buffer-1 (frasco n º 4: solução de etanol/perclorato de sódio) e re-suspender os grânulos de pipetagem repetidas até que os grânulos são uniformemente dispersos. Execute esta etapa de lavagem para remover o sal e a proteína da amostra. Deixe a mistura descansar por 30 s.
- Repita a etapa 1.1.6.
- Remova o suporte magnético o microtubo, adicionar 500 µ l de Wash Buffer-2 (frasco n º 5: solução de etanol/perclorato de sódio) e re-suspender os grânulos de pipetagem repetidas até que os grânulos são uniformemente dispersos. Deixe a mistura descansar por 30 s.
- Repita a etapa 1.1.6.
- Remova o suporte magnético o microtubo e adicione 500 µ l de etanol a 80% (garrafa no. 6).
Nota: Essa etapa é necessária para a remoção de sais residuais da amostra.- Re-suspenda os grânulos de pipetagem repetidas até que os grânulos são uniformemente dispersos. Deixe ficar assim durante 10 minutos com a mistura ocasionais por inversão.
- Repita a etapa 1.1.6.
- Ar seco a pelota magnética do grânulo por 10 min à temperatura ambiente com a microtubo tampa aberta.
Nota: Os grânulos devem ser livres de qualquer etanol residual visível, mas não completamente seca. - Remova o suporte magnético o microtubo, adicionar 50-200 µ l de tampão de eluição (garrafa no. 7) e re-suspender os grânulos de pipetagem repetidas até que os grânulos são uniformemente dispersos e deixá-lo ficar por 30 s.
Nota: As etapas acima, o DNA purificado é liberado a partir os grânulos magnéticos para o tampão de eluição. - Coloque o microtubo sobre o suporte magnético. Espere no mínimo 2 min ou até que todas as contas em microtubo fixar à parede magnética-lado.
- Transferi o sobrenadante que agora contém o DNA/RNA purificado para um microtubo de 0,5 mL para uso nas etapas a jusante.
- Misture 20-50 mg da amostra de solo com 500 µ l de solução de preparação de amostra em um microtubo.
- PCR em tempo real portátil
Nota: Um thermocycler portátil e o kit de ensaio PCR foram utilizados de acordo com as instruções do fabricante (ver a Tabela de materiais).- Abrir e executar o software thermocycler-associado, selecione teste de detecção de alvo e todas as informações de descrição para os campos de entrada nome & detalhes, notas, amostras, testes e dados de entrada.
Nota: Poços #1 e #2 são designados pelo software para o controlo negativo e positivo, respectivamente. - Prepare-se antes de reagentes PCR de usar. Transferi 500 µ l de buffer de re-suspensão de mistura de mestre para a mistura de mestre liofilizado contendo tubo e misture bem por inversão. Transferi a mistura inteira de mestre para o microtubo marrom rotulado cartilhas/sonda (tabela 2).
- Tampe e agite o microtubo para misturar. Mistura completa é necessária para assegurar que todos os componentes são re-suspensas completamente. Deixe esta mistura descansar por 5 min antes de usar.
Nota: Armazene a mistura de reação a-20 ° C após o uso.
- Tampe e agite o microtubo para misturar. Mistura completa é necessária para assegurar que todos os componentes são re-suspensas completamente. Deixe esta mistura descansar por 5 min antes de usar.
- Preparar um controlo negativo pela transferência de 10 µ l da mistura preparada reação da etapa anterior para um tubo PCR de 0,2 mL e adicionar 10 µ l de água deionizada livre de nuclease estéril.
- Preparar um controlo positivo pela transferência de 10 µ l da mistura preparada reação da etapa 1.2.2 para um tubo PCR de 0,2 mL e adicionar 10 µ l de modelo de controle positivo.
- Para cada amostra, transferir 10 µ l da mistura preparada reação da etapa anterior em um tubo PCR de 0,2 mL e em seguida, adicionar 10 µ l de amostra de DNA preparado a partir de passo 1.1.16.
- Carrega os poços do thermocycler com o conteúdo de seus respectivos tubos PCR conforme descrito na etapa 2.1.1.
- Uma vez que todas as informações necessárias foi inseridas e confirmadas, selecione Iniciar, executar e escolher o instrumento conectado ethernet ou uma unidade USB.
Nota: Se for selecionada a opção de unidade de USB, o execução do arquivo deve ser salvo na unidade para ser usado com o thermocycler (por exemplo, F:\genesig). A corrida vai começar imediatamente depois que a unidade é inserida a thermocycler.
- Abrir e executar o software thermocycler-associado, selecione teste de detecção de alvo e todas as informações de descrição para os campos de entrada nome & detalhes, notas, amostras, testes e dados de entrada.
- Análise de dados do portátil PCR em tempo real.
- Quando tiver terminado a execução, abra o arquivo executado (.usb) da unidade USB, usando o software thermocycler-associado ou olhar diretamente os resultados de execução no software clicando em resultados.
- Antes de analisar os resultados, salve a execução concluída para evitar perda de dados.
- Na guia resultados , exibir o status da execução, categorizados por amostras.
Nota: Dados que podem ser obtidos nesta aba são o status dos resultados e copiar o número detectado na amostra. - Clique na guia detalhes para ver as curvas de amplificação. Quando o alvo é detectado com êxito, valores de Cq (ciclo de quantificação) do alvo e de controlo interno são exibidos.
Nota: Esses valores são calculados no relatório final e são usados para determinar se uma amostra é positiva para o alvo e se há problemas com a reação ou as amostras de DNA.
2. outros protocolos
-
Alternativo em laboratório DNA de métodos de extração
-
Métodos baseados em CTAB-fenol-clorofórmio
- Execute métodos de CTAB-fenol-clorofórmio com base, seguindo o método de Doyle18 e o método de Dellaporta19 conforme descrito anteriormente.
-
Método de preparação de mini de DNA
Nota: O método de Edwards20 foi realizada da seguinte forma.- Adicione 500 mg do solo, seguido por cinco grânulos cerâmicos de 1,4 mm e 750 µ l de tampão de Edwards (200 mM Tris, pH 8.0, 200 mM NaCl, 25 mM EDTA, 0,5% SDS) para um microtubo e misture bem.
- Incube o microtubo a 65 ° C por 5 min.
- Homogeneizar a amostra com um homogeneizador de batedor de grânulo por 60 s (ou usando um almofariz e um pilão).
- Centrifugar a amostra a 14.000 x g por 5 min.
- Transferir 500 µ l do sobrenadante para um microtubo fresco e misture com 500 µ l de isopropanol gelado. Misturar por inversão do tubo 10 vezes.
- Centrifugar a amostra a 14.000 x g, durante 15 min peletizar o DNA.
- Decante o sobrenadante e deixe o ar de pellet de DNA secar à temperatura ambiente até que evapore o restante do etanol.
- Lave o sedimento de DNA com 750 µ l de etanol a 70% refrigerados.
- Ar seco a pelota antes de re-suspender em 50-100 µ l de tampão TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0 e 1 mM de EDTA).
-
Outros métodos alternativos
- Realizar a extração de DNA de silicone-base usando o kit #1 (MP BIO Fast Spin de DNA) e kit #2 (Zymo BIOMICS DNA Miniprep Kit) de acordo com as instruções dos fabricantes.
-
Métodos baseados em CTAB-fenol-clorofórmio
-
PCR em tempo real baseado em laboratório convencional.
Nota: Um thermocycler convencional foi usado com o mastermix para PCR baseada em investigação, diversos primers e pontas de prova do oligonucleotide (tabela 2).- Usando PCR com fundo transparentes tubos ou um prato PCR, preparar 20 reações µ l para todas as amostras de DNA a analisar, bem como um negativo controlar (livre de nuclease água desionizada) e um controlo positivo modelo preparado internamente.
- Para cada PCR tubo ou bem, prepare uma mistura incluindo 10 µ l do mastermix, 7 µ l de água deionizada livre de nuclease, 2 µ l de 2 µM cartilhas/sonda e 1 µ l de amostra de DNA (da etapa 1.1.16, ou 2.1) ou modelo de controle, por exemplo.
- Fechar os tubos PCR ou placa e iniciar a reação, selecionando o programa adequado de PCR.
-
Análise de dados de convencional do PCR em tempo real baseado em laboratório
- Use software thermocycler-associado para analisar os resultados da thermocycler convencional. Para começar a análise dos dados, transferir o arquivo executado do thermocycler para uma unidade USB, insira uma unidade USB e selecione Exportar.
- Abrir arquivo de dados (.pcrd) do exportado executar no software thermocycler-associado.
- Destaca o poço de uma amostra localizando seu correspondente bem no instrumento. Curvas de amplificação e curvas padrão (se aplicável) são geradas automaticamente. Se a informação da amostra não for inserida, clique em Configuração de placa ou uma função semelhante para começar a entrada de dados antes de analisar os dados.
- Exibir os dados na guia de quantificação; Isto pode ser exportado para análise de dados com um software de terceiros como leitores de arquivo CSV, XML ou HTML.
- Obter dados de Cq com base em determinados limiares e compará-lo com os controles positivos e negativos.
Nota: Se os padrões de DNA do alvo foram utilizados no ensaio, comparar os dados de Cq de exemplo para que as normas para determinar o limite de Cq
Representative Results
Comparação de métodos de extração de DNA
A compatibilidade de um método de extração de DNA baseado em grânulo magnético com PCR em tempo real foi avaliada através da detecção de quantidades de DNA de S. subterranea em uma amostra de solo de áreas infestadas com o patógeno. Como mostrado na Figura 1de suplementar, o método baseado em grânulo magnético foi comparado com os outros métodos, incluindo uma de método CTAB-fenol-clorofórmio com base18, rápida DNA mini preparação métodos19,20e outros padrão com base em sílica DNA extração kits. Amostras de DNA extraídas usando os seis métodos diferentes foram submetidas à convencional do PCR em tempo real baseado em laboratório. Os resultados sugeriram que o método magnético baseado em grânulo é comparável com outros métodos, embora baseada em sílica kit de extração de DNA mostrou o melhor desempenho entre os métodos que nós testamos. Todos os kits contêm de guanidinium ou cloridrato de guanidínio: ambos são agentes poderosos caotrópicas, que desnaturam a maioria das proteínas celulares, incluindo RNases e DNases. Portanto, usar os métodos é adequado para extração de DNA e o RNA.
Comparação entre um portátil do PCR em tempo real e uma PCR em tempo real baseado em laboratório convencional
Para comparar a sensibilidade e a especificidade de uma PCR portátil para uma PCR em laboratório convencional, quantificação absoluta do patógeno que DNA foi realizada usando diferentes quantidades do gene S. subterranea ITS, que foi realizada pelo vetor pGEM-T21 . Uma série de diluições de 10 vezes do gene ITS (106 a 100 cópias) foram analisados usando o conjunto de primers/sonda SsTQ22. Os resultados demonstraram que o método PCR portátil detectado o patógeno alvo DNA (~ 100 cópias), embora a sensibilidade foi 10 vezes menor do que que do laboratório-baseado do PCR método convencional, que detectou pelo menos 10 cópias (Figura 2).
Para validação, ainda mais, artificialmente infestadas de solos foram testados. Sporosori S. subterranea foram obtidas de galhas de raiz sarna pulverulenta de raízes de batata. Os solos estavam infestados com suspensões de sporosori em uma concentração final de 105 sporosori/g peso seco do solo. Usando o método magnético baseado em grânulo, DNA foi extraído das amostras de solo infestado, e 10 vezes diluições em série foram preparadas para obter concentrações equivalentes a 105, 104, 103102, 10 e 1001 sporosori/g peso do solo seco. As amostras de DNA foram usadas para o PCR usando o conjunto de sonda/cartilha SPO23. Os resultados mostraram que o método PCR portátil tem capacidade analítica comparável a um método PCR convencional baseada em laboratório, mas, novamente, a sensibilidade foi reduzida por um fator de ~ 10 (Figura 3).
Finalmente, testamos uma amostra de solo de um campo que foi naturalmente contaminado com S. subterranea. A extração de DNA baseado em grânulo magnética realizou-se em quantidades diferentes de solos (10, 20, 50 e 100 mg de solo por 500 µ l de solução-tampão de extração). Os resultados sugerem que o peso ideal do solo como matéria-prima para a extração de DNA foi 50-100 mg (Figura 4). Quantidades de solo fora do intervalo causaram uma falha das etapas a jusante do PCR. Este efeito pode ser porque quando quantidades excessivas de solo são utilizadas como material de partida, contaminações (por exemplo, compostos fenólicos) podem interferir com a PCR24. No caso de volumes mais baixos do solo, a quantidade de DNA extraído pode ser menor do que o limite de detecção da PCR (por exemplo, o rendimento total era variado DNA extraído do solo de 10 a 20 mg). Sensibilidade foi bastante comparável entre a PCR portátil e métodos PCR convencionais. Resultados semelhantes foram obtidos em amostras de DNA por métodos diferentes de extração (Supplemental Figura 2)
Deteção de outros patógenos pelo sistema de detecção no local usando um portátil do PCR em tempo real
Testamos o método PCR portátil para detectar outros patógenos importantes batata solo-carregadas, r. solani AG3 e quotidiano. Neste estudo, realizamos o PCR em tempo real usando o RsTq primeiras demão/RQP1 sonda conjunto25 para detecção de AG3 de r. solani com DNA de cultura pura. Também foram realizadas usando o PCR em tempo real quotidiano-D cartilha/sonda conjunto26 para detecção do quotidiano com RNA de uma amostra de tubérculo sintomático de spraing foi usado. Como mostrado na Figura 5, o método PCR portátil detectado com sucesso ambos os patógenos. Os resultados foram comparáveis entre os instrumentos portáteis e convencionais, sugerindo que o método PCR portátil é versátil e aplicável a outras detecções de patógeno se as sequências de cartilha projetadas por PCR em tempo real estão disponíveis.
Figura 1. Procedimento de um sistema portátil de PCR em tempo real para a deteção do patógeno no local. O protocolo é composto por etapas, na seguinte ordem: preparação lisada por breve homogeneização (A) extração magnética baseada no grânulo de ácidos nucleicos (B), PCR em tempo real portátil (C) e análise de dados quantitativos, usando um computador portátil (D). Observe que todas as etapas podem ser concluídas no local.
Figura 2 . Comparação de sensibilidade entre uma PCR portátil e uma PCR em laboratório convencional. Quantificação do agente patogénico DNA foi realizada usando diferentes quantidades do gene S. subterranea ITS (106 a 100 cópias) com a SsTQ primeiras demão/sonda definida. Regressão linear entre o valor de log de S. subterranea Plasmídeo e valor recíproco Log de Cq no thermocycler convencional (A) e o portátil thermocycler (B). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 . Comparação do desempenho de detecção em solos artificialmente infestados com subterranea de S.. Os solos foram artificialmente infestados (105 a 100 sporosori/g peso do solo seco) com suspensões de sporosori S. subterranea . Usando o método magnético baseado em grânulo, o DNA foi extraído as amostras de solo infestado. PCR foram realizada usando as amostras de solo com o conjunto de sonda/cartilha do SPO. Regressão linear entre o valor de log da quantidade inicial em sporosori por grama de solo e o valor de log recíproca de Cq no thermocycler convencional (A) e o portátil thermocycler (B). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 . Comparação de começando a quantidade de amostras de solo para extração de DNA. O método baseado em grânulo magnético foi usado para a extração de DNA de 10, 20, 50 e 100 mg de amostras de solo. PCR em tempo real foram realizada usando o thermocycler portátil. Curvas padrão representam a relação entre a quantidade de DNA total extraído das amostras de solo (eixo x) e as quantidades de produto PCR (eixo y) amplificadas pelo conjunto de sonda/cartilha do Sss. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 . Deteção de outros patógenos de batata, r. solani e quotidiano. PCR em tempo real foram realizada usando o thermocycler portátil e o thermocycler convencional. R. solani AG3 foi detectado no total DNA extraído de pura cultura usando RsTq primers e a sonda de RQP1 (A) quotidiano foi detectado no RNA total extraído de uma amostra de tubérculos infectados quotidiano utilizando que a cartilha do quotidiano-D/sonda definido (B). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6 . Um encanamento de diagnóstico para a phytopathogens. Fluxograma mostra um fluxo de trabalho geral para o diagnóstico do fitopatógeno. Observe que o passo tradicional, por exemplo, identificação visual, pode ser omitido se a deteção molecular no local é utilizada, o que torna todo o processo de diagnóstico simples e rápido. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| PCR em tempo real portátil | PCR em tempo real | LÂMPADA | ELISA | Fluxo lateral | |
| Custo por reação de alvo | US $0,60-$8,47 | US $0,60 | US $0,75 | US $0,60 | US $4,74 |
| Sensibilidade | 100 cópias | 10 cópias | 10 cópias | 1-10 sporosori33 1-10 ng/mL (proteína)33 |
1-10 sporosori34 5 x 105UFC/mL35 |
| Tempo gasto | 90 minutos | 80-240 minutos | 50-90 minutos32 | 3-24 horas | 10-15 minutos |
| Preparação necessária | Extração de ácido ●nucleic Projeto da primeira demão ● |
Extração de ácido ●nucleic Projeto de Primer/sonda ● |
Extração de ácido Nucelic ● Projeto da primeira demão ● |
Extração de proteínas ● ● Anticorpos |
N/A |
| Outros materiais necessários | ● Portátil thermocycler | ● Convencionais thermocycler | Mancha de colorimetria ● ● Incubadora |
Leitor de placas ● Equipamento de lavagem ● |
N/A |
Tabela 1. Gráfico comparativo de métodos de deteção molecular e serológicos para phytopathogens
| Primeira demão | Sequência (5 '-3 ')um | Alvob | |
| SsTQ-F13 | CCGGCAGACCCAAAACC | ITS1-ITS2 em S. subterranea | |
| SsTQ-R13 | CGGGCGTCACCCTTCA | ITS1-ITS2 em S. subterranea | |
| SsTQ-P13 | [FAM] CAGACAATCGCACCCAGGTTCTCATG [TAM] | ITS1-ITS2 em S. subterranea | |
| Genesig S.subterranea da primeira demão/sonda | N/A | Actina em S. subterranea | |
| SPO1014 | GGTCGGTCCATGGCTTGA | ITS em S. subterranea | |
| SPO1114 | GGCACGCCAATGGTTAGAGA | ITS em S. subterranea | |
| SPOPRO114 | [FAM] CCGGTGCGCGTCTCTGGCTT [TAM] | ITS em S. subterranea | |
| RsTqF119 | AAGAGTTTGGTTGTAGCTGGTCTATTT | ITS1-ITS2 de r. solani | |
| RsTqR119 | AATTCCCCAACTGTCTCACAAGTT | ITS1-ITS2 de r. solani | |
| RQP119 | [FAM] TTTAGGCATGTGCACACCTCCCTCTTTC [TAM] | ITS1-ITS2 de r. solani | |
| Cartilha de Genesig PMTV/sonda | N/A | CP-RT no quotidiano | |
| Quotidiano-D-F20 | AGAATTGRCATCGAAACAGCA | CP no quotidiano | |
| Quotidiano-D-R20 | GTCGCGCTCCAATTTCGTT | CP no quotidiano | |
| Quotidiano-D-P20 | [FAM] CCACAAACAGACAGGTATGGTCCGGAA [TAM] | CP no quotidiano | |
| um Iniciadores de oligo DNA foram modificados com FAM (6-carboxyfluorescein) ou TAM (5-tetrametilrodamina) | |||
| b ITS: Espaçadores internos do transcritos, CP: revestimento da proteína; CP-RT: casaco proteína ler | |||
Tabela 2. Primers utilizados neste estudo
Complementar Figura 1. Comparação de métodos de extração de DNA para detecção do patógeno sarna pulverulenta. Seis métodos diferentes de extração de DNA (A-F) foram comparados para a deteção do agente patogénico sarna pulverulenta, S. subterranea em amostras de solo. (B, D, F). DNA foi extraído usando o kit com base em sílica #1 (veja a tabela de materiais para todos os nomes do jogo), com base em sílica kit #2 e kit de grânulo-com base magnética, repsectively. PCR foi realizado usando o thermocycler PCR convencional baseada em laboratório. Curvas padrão representam a relação entre a quantidade de DNA total extraído das amostras de solo e as quantidades de produto PCR amplificados pelo conjunto de primers/sonda de SsTQ. Clique aqui para baixar esta figura.
Complementar Figura 2. Comparação entre o limite de detecção entre um PCR portátil e um PCR convencional baseada em laboratório. DNA total foi isolada a partir de uma amostra de solo usando três métodos diferentes de extração: (um, método de Doyle B), (C, D) o kit de silicone-baseado #2 e (E, F) o kit magnético do grânulo-baseado. Conjunto de gráficos mostrados à esquerda são dados usando o thermocycler portátil com o conjunto de primers/sonda Sss, enquanto os gráficos à direita representam dados gerados usando o thermocycler convencional baseados em laboratório com a primers SsTQ/sonda. Clique aqui para baixar esta figura.
Discussion
Conforme mostrado na tabela 1, recentes avanços tecnológicos na identificação molecular de agentes patogénicos aumentaram a eficácia, precisão e velocidade de diagnóstico, que contribuíram para a detecção de infecções pre-sintomáticas27. Em matéria de diagnóstico no local, lâmpada e métodos de fluxo lateral frequentemente são usados porque eles são portáteis e fornecem resultados imediatos a um custo menor. No entanto, no caso os métodos serológicos, deteção de espécie pode ser difícil de alcançar. Isso faz com que ocasionalmente misdetection dos micróbios fora do alvo como habitantes de solo comum. Por exemplo, pode haver reactividade cruzada entre os testes serológicos de Phytophthora spp. e Pythium spp. no caso de batata patógenos28, indicando que há, por vezes, dificuldades, detectando a planta alvo agentes patogénicos.
No presente estudo, nós desenvolvemos um protocolo otimizado para a deteção molecular no local de patógenos de solo-carregadas batata usando o sistema portátil de PCR em tempo real, comparando suas capacidades com o de um laboratório-baseado em tempo real do PCR sistema convencional. Achamos que o método no local especificamente detecta os patógenos de batata na amostra de solo, embora a sensibilidade é de ~ 10 vezes menor do que um equivalente do ensaio em laboratório. Também vale a pena considerar que neste caso o laboratório e campo de teste não usou um tamanho de amostra biologicamente relevantes. Tamanhos de amostra grande são necessários para o uso em solos de campo de triagem rotineiramente como descrito anteriormente29,30, onde são processadas as dimensões das amostras de entre 250 g e 1 kg, embora esses métodos exigem operadores qualificados e sofisticado equipamento para extrair o DNA. Normalmente, um solo em grande escala, extrair o DNA é retirado uma amostra representativa de solo agregado único de subamostras numerosos ao longo de 1 a 4 hectares de29,6,30. No entanto, o protocolo desenvolvido aqui é rápido, fácil de usar para usuários sem experiência prévia no diagnóstico molecular e pode ser usado fora de um laboratório. Como o método é rápido e relativamente barato comparado a extração de solo em grande escala, ele pode ser usado para muitas amostras de pequena escala, retiradas de uma área de amostragem semelhante para as amostras globais em larga escala da tela. Isto poderia superar algumas das deficiências de um pequeno tamanho da amostra e determinar informações adicionais sobre a distribuição espacial do patógeno no campo. Além disso, a portabilidade e a velocidade do método significa que ele também pode ser usado em actividades de demonstração aos produtores para educacional e fins de engajamento.
Outra consideração é que muitos ensaios PCR em tempo real já são publicados para uma ampla gama de patógenos de plantas5. Este sistema pode fazer uso destes ensaios existentes sem a necessidade para projetar primers de lâmpada novas para habilitar em testes de campo. Uma crítica frequente dos ensaios de lâmpada é que eles podem ser difíceis de projetar31. Portátil, PCR, portanto, permite a implementação relativamente fácil de uma vasta gama de testes de patógeno prontamente disponível para testes no local.
Métodos tradicionais podem ser muitas vezes caro, trabalhoso, impreciso e demorado. A simplicidade do método no local desenvolvemos permite aos produtores e trabalhadores da indústria executar a detecção de agentes patogénicos por si e talvez gerar um resultado muito mais rápido do que mandar para um laboratório de diagnóstico que pode ser um pouco longe. A rapidez e a sensibilidade do método PCR portátil podem ajudar os produtores de evitar potenciais infecções secundárias, que podem ainda aumentam a população do patógeno e propagação inadvertida (através de equipamentos ou humanos). Em conclusão, o método no local desenvolvido no presente estudo permite detecção exata e relativamente sensível de importantes patógenos solo no campo. Nossa esperança é que o método no local desenvolvido neste estudo irá contribuir em um pipeline de diagnóstico atual (Figura 6), não só por dar respostas rápidas e exatas a perguntas epidemiológicas sobre doenças de plantas no campo, mas também fornecendo maior compreensão da biologia e epidemiologia de patógenos vegetais.
Disclosures
Os autores declaram não concorrentes interesses financeiros.
Acknowledgments
Nós estamos gratos ao Dr. Neil C. Gudmestad da North Dakota State University para fornecer S. subterranea plasmídeo, Dr. Hanu Pappu na Washington State University (WSU) para fornecer o quotidiano do RNA e Dr. Debra Inglis no WSU para a prestação de r. solani AG3. Agradecimentos especiais a Dr. Jeremy Jewell no WSU para fornecer comentários sobre o manuscrito e WSU CAHNRS comunicações para videografia. Esta pesquisa foi apoiada pelo noroeste batata Research Consortium e o Washington Estado Departamento de agricultura - programa de concessão de bloco de colheita de especialidade (conceder n. K1764). PPNS n º 0741, departamento de Fitopatologia, faculdade de agricultura, Ciências de recursos humanos e naturais, centro de pesquisa agrícola, Hatch projeto n. º WNP00833, Universidade do estado de Washington, Pullman, WA, Estados Unidos da América.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| White shell PCR plate | Bio-Rad | HSP9601 | |
| CFX Manager | Bio-Rad | 1845000 | |
| SsoAdvanced Universal Probes Supermix | Bio-Rad | 1725280 | |
| CFX96 Touch qPCR instrument | Bio-Rad | 1855195 | |
| Ethylalcohol, pure 200 proof | Decon Laboratories | 04-355-222 | |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) | Fisher BioReagents | BP118-500 | |
| Phenol, Saturated | Fisher BioReagents | BP1750I-400 | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Fisher BioReagents | BP152-5 | |
| q16 real-time PCR machine | genesig | MBS486001 | |
| Ultrapure Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Invitrogen | 15525-017 | |
| 2-Propanol (Isopropanol) | JT Baker | 67-63-0 | |
| Chloroform | JT Baker | 9180-03 | |
| Hydrochloric Acid, 36.5-38.0% (HCl) | JT Baker | 9535-03 | |
| iso-Amyl Alcohol | JT Baker | 9038-01 | |
| FastDNA Spin kit | MP Biomedicals | 6560-200 | Silica-based DNA extraction kit #1 |
| Luna Universal One-Step RT-qPCR Kit | New England Biolabs | E3005S | |
| 0.1ml Low Profile Individual PCR Tubes | Phenix Research | MPC-100LP | |
| Easy DNA/RNA Extraction Kit | Primerdesign | genesigEASY-EK | |
| genesig Easy 1.5 mL tubes | Primerdesign | genesigEASY-1.5 | |
| Magnetic tube rack | Primerdesign | genesigEASY-MR | |
| Spongospora subterranea f. sp. subterranea genesig Easy Kit | Primerdesign | Path-S.subterranea-EASY | |
| Hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) | Sigma-Aldrich | H6269-100G | |
| Pellet pestles | Thermo Fisher Scientific | 12-141-364 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Thermo Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
| DNA Miniprep kit | ZymoBIOMICS | D4300 | Silica-based DNA extraction kit #2 |
References
- Malcolm, G. M., Kuldau, G. A., Gugino, B. K., Jiménez-Gasco, M. delM. Hidden Host Plant Associations of Soil-borne Fungal Pathogens: An Ecological Perspective. Phytopathology. 103 (6), 538-544 (2013).
- Posthuma-Trumpie, G. A., Korf, J., van Amerongen, A. Lateral flow (immuno)assay: its strengths, weaknesses, opportunities and threats. A literature survey. Anal Bioanal Chem. 393 (2), 569-582 (2009).
- Hill, J., et al. Loop-Mediated Isothermal Amplification Assay for Rapid Detection of Common Strains of Escherichia coli. J Clin Microbiol. 46 (8), 2800-2804 (2008).
- Mumford, R. A., Walsh, K., Barker, I., Boonham, N. Detection of Potato mop top virus and Tobacco rattle virus Using a Multiplex Real-Time Fluorescent Reverse-Transcription Polymerase Chain Reaction Assay. Phytopathology. 90 (5), 448-453 (2000).
- Schena, L., Nigro, F., Ippolito, A., Gallitelli, D. Real-time quantitative PCR: a new technology to detect and study phytopathogenic and antagonistic fungi. European Journal of Plant Pathology. 110 (9), 893-908 (2004).
- Brierley, J. L., Stewart, J. A., Lees, A. K. Quantifying potato pathogen DNA in soil. Applied Soil Ecology. 41 (2), 234-238 (2009).
- Tomlinson, J. A., Boonham, N., Hughes, K. J. D., Griffin, R. L., Barker, I. On-Site DNA Extraction and Real-Time PCR for Detection of Phytophthora ramorum in the Field. Appl Environ Microbiol. 71 (11), 6702-6710 (2005).
- Harrison, J. G., Searle, R. J., Williams, N. A. Powdery scab disease of potato - a review. Plant Pathology. 46 (1), 1-25 (1997).
- Johnson, D. A., Miliczky, E. R. Distribution and development of black dot, Verticillium wilt, and powdery scab on Russet Burbank potatoes in Washington State. Plant Disease. 77 (1), 74-79 (1993).
- Merz, U. Powdery Scab of Potato-Occurrence, Life Cycle and Epidemiology. Am J Pot Res. 85 (4), 241 (2008).
- Jones, R. aC., Harrison, B. D. The behaviour of potato mop-top virus in soil, and evidence for its transmission by Spongospora subterranea (Wallr). Lagerh. Annals of Applied Biology. 63 (1), 1-17 (1969).
- Carnegie, S. F., Davey, T., Saddler, G. S. Effect of temperature on the transmission of Potato mop-top virus from seed tuber and by its vector, Spongospora subterranea. Plant Pathology. 59 (1), 22-30 (2010).
- Woodhall, J. W., Adams, I. P., Peters, J. C., Harper, G., Boonham, N. A new quantitative real-time PCR assay for Rhizoctonia solani AG3-PT and the detection of AGs of Rhizoctonia solani associated with potato in soil and tuber samples in Great Britain. Eur J Plant Pathol. 136 (2), 273-280 (2013).
- Banville, G. J. Yield losses and damage to potato plants caused by Rhizoctonia solani Kuhn. American Potato Journal. 66 (12), 821-834 (1989).
- Crosslin, J. M. First Report of Potato mop-top virus on Potatoes in Washington State. Plant Disease. 95 (11), 1483-1483 (2011).
- Whitworth, J. L., Crosslin, J. M. Detection of Potato mop top virus (Furovirus) on potato in southeast Idaho. Plant Disease. 97 (1), 149-149 (2012).
- Kaur, N., Cating, R. A., Dung, J. K. S., Frost, K. E., Robinson, B. A., Hamm, P. B. First Report of Potato mop-top virus Infecting Potato in Oregon. Plant Disease. 100 (11), 2337 (2016).
- Doyle, J. J. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus. 12, 13-15 (1990).
- Dellaporta, S. L., Wood, J., Hicks, J. B. A plant DNA minipreparation: Version II. Plant Mol Biol Rep. 1 (4), 19-21 (1983).
- Edwards, K., Johnstone, C., Thompson, C. A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis. Nucleic Acids Research. 19 (6), 1349 (1991).
- Bittara, F. G., Secor, G. A., Gudmestad, N. C. Chloropicrin Soil Fumigation Reduces Spongospora subterranea Soil Inoculum Levels but Does Not Control Powdery Scab Disease on Roots and Tubers of Potato. Am J Potato Res. 94 (2), 129-147 (2017).
- van de Graaf, P., Lees, A. K., Cullen, D. W., Duncan, J. M. Detection and Quantification of Spongospora subterranea in Soil, Water and Plant Tissue Samples Using Real-Time PCR. European Journal of Plant Pathology. 109 (6), 589-597 (2003).
- Maldonado, H., Falloon, R. E., Butler, R. C., Conner, A. J. Spongospora subterranea root infection assessed in two potato cultivars differing in susceptibility to tuber powdery scab. Plant Pathology. 62 (5), 1089-1096 (2013).
- Braid, M. D., Daniels, L. M., Kitts, C. L. Removal of PCR inhibitors from soil DNA by chemical flocculation. Journal of Microbiological Methods. 52 (3), 389-393 (2003).
- Lees, A. K., Cullen, D. W., Sullivan, L., Nicolson, M. J. Development of conventional and quantitative real-time PCR assays for the detection and identification of Rhizoctonia solani AG-3 in potato and soil. Plant Pathology. 51 (3), 293-302 (2002).
- Davey, T., Carnegie, S. F., Saddler, G. S., Mitchell, W. J. The importance of the infected seed tuber and soil inoculum in transmitting Potato mop-top virus to potato plants. Plant Pathol. 63 (1), 88-97 (2014).
- Boonham, N., et al. Methods in virus diagnostics: From ELISA to next generation sequencing. Virus Research. 186, 20-31 (2014).
- Mohan, S. B. Cross-reactivity of antiserum raised against Phytophthora fragariae with other Phytophthora species and its evaluation as a genus-detecting antiserum. Plant Pathology. 38 (3), 352-363 (1989).
- Ophel-Keller, K., McKay, A., Hartley, D., Curran Herdina, J. Development of a routine DNA-based testing service for soil-borne diseases in Australia. Austral Plant Pathol. 37 (3), 243-253 (2008).
- Woodhall, J. W., et al. A new large-scale soil DNA extraction procedure and real-time PCR assay for the detection of Sclerotium cepivorum in soil. Eur J Plant Pathol. 134 (3), 467-473 (2012).
- Miles, T. D., Martin, F. N., Coffey, M. D. Development of Rapid Isothermal Amplification Assays for Detection of Phytophthora spp in Plant Tissue. Phytopathology. 105 (2), 265-278 (2014).
- Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 28 (12), e63-e63 (2000).
- Narayanasamy, P. Microbial Plant Pathogens: Detection and Management in Seeds and Propagules. , John Wiley & Sons. (2016).
- Braun-Kiewnick, A., Altenbach, D., Oberhänsli, T., Bitterlin, W., Duffy, B. A rapid lateral-flow immunoassay for phytosanitary detection of Erwinia amylovora and on-site fire blight diagnosis. Journal of Microbiological Methods. 87 (1), 1-9 (2011).
