Summary
כאן נתאר פרוטוקול פשוט להפקת במהירות מאות צמיחה נמטודות מדיה אגר, 96-ובכן תרבות צלחות עם מספרים עקביים של Caenorhhabditis elegans לכל טוב. תרבויות אלה שימושיים להקרנה פנוטיפי של אורגניזם שלם. אנו מתמקדים כאן באמצעות תרבויות אלה לכימיקלים מסך עבור אפקטים פרו-אריכות ימים.
Abstract
Caenorhabditis elegans הוא אורגניזם שימושי לבדיקת השפעות כימיות על הפיזיולוגיה. מסכי מולקולה קטנה מהאורגניזם מציעים יתרונות משמעותיים לזיהוי אקטיביות כימית מבנים אותם ניתן לשנות פנוטיפים מורכבים כגון תוחלת החיים. המתוארים כאן הוא פרוטוקול פשוט בהפקת מאות לוחות 96-ובכן תרבות עם מספרים עקביים למדי של C. elegans היטב בכל. בשלב הבא, אנו לציין כיצד להשתמש תרבויות אלה למסך אלפי חומרים כימיים עבור אפקטים על תוחלת החיים של תולעים נימיות C. elegans. פרוטוקול זה עושה שימוש של זנים סטרילי רגיש לטמפרטורה, תנאים צלחת אגר לטיפול כדי להקל על ייצור תפוקה מהירה וגבוהה של תרבויות החיות מסונכרן להקרנה בבעלי חיים פשוטים.
Introduction
כאן פרוטוקול המתואר שפותח להקרנה תפוקה גבוהה של תרכובות כימיות על ההשפעות על תוחלת החיים Caenorhabditis elegans . פרוטוקול עצמה ניתנת להתאמה בקלות מסכי פנוטיפי אחרים, כולל לימודי ניצול זנים של C. elegans כתב. פרוטוקול זה היה מנוצל בהצלחה לזהות תרכובת פעילים ביולוגית הרומן, NP1 (nitrophenyl-piperazine 1), זה בחריפות מאריך את תוחלת החיים של C. elegans באמצעות מנגנון הגבלת תזונתיים. NP1 אפיון של השפעתו על תוחלת החיים, כולל תיאור של המסלולים גנטי משחק, היה בעבר תיאר במקום1. דוח זה כולל גם תיאור של התוצאות של יישום בקנה מידה גדול של המסך. כאן נתאר בפירוט רב יותר הרבה את המתודולוגיה ואת ההתקנה של המסך עצמו, אשר היא מדרגית ליישומים שנינו קטן - ו large היקף.
המטרה זה הוביל ליצירתו של הפרוטוקול המתואר כאן הייתה לפתח פלטפורמה תרבות C. elegans מותר להקרנה מהירה של ספריות כימיים גדולים עבור הרומן חומרים פעילים ביולוגית. בעוד מסכי כימי בוצעו לפני הפיתוח של פרוטוקול זה, היו אלה בעיקר בקנה מידה קטן ו/או המועמד סוג מתקרב2,3. ואכן, רוב המסכים שבוצעה במעבדה על עשרות מתחמים מנוצל מתח מבחני עמידות, עם להיטים מוקרן על אריכות ימים תופעות4. מחקר זה ביקשו במקום ישירות למסך לאפקטים תוחלת החיים. למרבה הפלא, היו כמה תיאורים בספרות המדעית בזמנו של ביצוע מסכי כימיות בקנה מידה גדול עם C. elegans. אכן, לעומת סוגים אחרים של מסכי5,6,7, הקרנה כימיות בקנה מידה גדול באמצעות C. elegans נראו המועסקים תחת.
היו שני תיאורים בקנה מידה גדול כימיים המסכים של C . elegans ששימשו כבסיס לפיתוח גישה זו. הראשון היה מחקר אלגנטי מן המעבדה של פיטר רוי באמצעות מסכי כימי לזיהוי תרכובות יכול perturb את התפתחות בעלי חיים. המחקר ואז במעקב עם מסך מוטגנזה מכוונת קדימה כדי לזהות את המטרות גנטי של כימיקלים אלה8. פרוטוקול המתוארים במחקר זה נעשה שימוש פאטה 24-ובכן, אשר היה פשוט לתפעול לצרכים הספציפיים של מחקר זה (כמות מוגבלת של חומר כימי בספרייה ואני בחלל החממה זמינים מוגבל). המחקר השני היה של מייקל Petrascheck שאפתני וחדשני מולקולה קטנה מסך עבור תוחלת החיים הארכת כימיקלים9,10. המחקר הזה משמש 384-ובכן לוחיות והתרבויות נוזלי. התכונה העיקרית אחרים של מסך זה היה השימוש FUDR (5-fluorodeoxyuridine) כימית לעכב ייצור רומא. לאחר התחשבות ניכרת של פרוטוקול המתוארים במחקר זה, היו להימנע עיקור כימית והן תרבויות נוזלי של C. elegans .
למרות FUDR הוא בשימוש נרחב בניסויים תוחלת החיים C. elegans , היו חששות כי FUDR עלול לגרום תרופתיות בלתי צפויות או את FUDR עצמו יש השפעה על תוחלת החיים. לאחרונה זה הדאגה השנייה אומתה, לפחות בריכוזים מסוימים ובמיוחד בגיל 25 ° C11. כדי לעקוף את הבעיה של רומא זיהום, שימש C. elegans זן TJ1060, אשר בנמלים שתי מוטציות רגיש לטמפרטורה עצמאית (spe-9 (hc88) אני; rrf-3(b26)II) לבטל את ייצור הזרע ולא הוכחו להיות שימושי על תרבויות המונית של אוכלוסיות סינכרונית12. זן זה היה עקר לחלוטין 25 ° c, אך תייצר רומא בעת תרבותי ב 15-20 º C. מחקר זה משמש תנאי התרבות קונבנציונאלי, עם תולעים זוחל על פני השטח של אגר, כמו התוצאות המתקבלות עם נוזלי תרבויות אינן תמיד לשחזור עם פלטות אגר קונבנציונלי. בעוד תופעה זו אינה מובנת לחלוטין, זה הוכח כי תולעים תרבותי ב נוזלי להגיב ד ר (הגבלת תזונתיים) באופן שונה מאשר תולעים תרבותי על סטנדרטיים מדיה13,14. לכן סביר כי מדיה נוזלי יכול להסוות כמה מימטיקה ד ר כי אחרת להיות מזוהה עם המסך.
התיישב על אגר תרבות תנאים, אפשרויות שונות עבור הבקיע את הביצועים של בארות assay זו נחשבו. בעוד שונים האוטומטית או הדמיה המבוססת על מבחני היו זמינים, הם המתחייבות רכישה והיערכות טכנית מאתגר התקנים, אשר רובם היו לחדשו. בעוד בהתחשב באפשרויות אלה, זה היה חיוני כדי להפנות אל המסכים תוחלת החיים הקודם מכל הסוגים. בסופו של דבר, מחקר זה משמש שיטת הניקוד הותאם ממסך המעבדה סיו סילביה לי כל הגנום RNAi תוחלת החיים פנוטיפים15. באופן ספציפי, כל לוחות תוחלת חיים סידרו באופן זהה, אך רק הפקדים שלילי נוטרו. ברגע הלוחות שליטה שלילי אומתו שיש ליד התמותה השלם, בדיקת לוחות זכו בעבודת יד. במסך זה בקנה מידה גדול, תוצאות חיוביות שאושרו על-ידי בדיקה מחדש עם כימיקלים הטרי, באמצעות שהפקידים חזרות על הצד החיובי העיקרי.
Protocol
1. הכנת מאגרי
-
מרק ליברות
- להשתמש בגרגרים טרום מעורב (ראה טבלת חומרים) ופעל הפרוטוקול של היצרן עבור הכנה.
-
צמיחה נמטודות מדיה (NGM) אגר
- לערבב 23 גרם של אגר, דור 3 של NaCl, 2.5 גר' peptone מה נשארתי, ולהוסיף מים יונים אוטוקלב ל' 0.972 וקריר לתת עד 60 ° צלזיוס, 25 מ של 1 מ' אשלגן פוספט (KPO4) מאגר (pH 6.0), 1 מ"ל של 1 מ' מגנזיום גופרתי (MgSO4) , 1 מ"ל של 1 מ' סידן כלורי (2CaCl) ולאחר 1 מ"ל של 5 מ"ג/מ"ל כולסטרול (באתנול).
-
פתרון תת-כלורי
- מערבבים 5 מיליליטר 5 מ' KOH, 4 מ של נתרן תת-כלורי פתרון (6%), ויונים H2O כדי הנפח הכולל של 50 מ.
-
S הבזליים
- מערבבים 5 g של NaCl, 1 g K2HPO4, 6 גר'2פו ח'4ומים מיוננים 1 ליטר, ואז אוטוקלב.
2. הכנת מרוכז e. coli (OP50)
הערה: שלב זה מתרכזת 1 ליטר של פתרון רווי e. coli לתוך 25 מ של מאגר הבסיס S.
- לחסן מ ל LB בלוק מרק (שלב 1.1) עם מושבה בודדת של e. coli (זן OP50) ולאחר תקופת דגירה של 4-6 h ב 37 ° C עם טלטול (250 סל"ד). השתמש 0.1 מ"ל של פתרון זה לחסן 1 ליטר של LB בבקבוקון Erlenmeyer 2 ל'. דגירה 1 ליטר המבחנות בן לילה (12-16 ג) ב 37 ° C עם טלטול (250 סל"ד).
- צנטריפוגה תרבויות לילה 1 ליטר בבקבוקי 500 מ ל צנטריפוגה למשך 5 דקות ב 10,000 x g ו- 4 ° C הצניפה החיידקים, decant משם המדיה הנותרים. Resuspend צנפה ב 25 מ ל S הבזליים (שלב 1.4). חנות ב 4 º C.
3. הכנת NGM תרבות צלחות
- עבור לוחות תרבות המונים להשתמש בהם כדי לייצר מספר גדול של תולעים, לוותר על 30 מ של אגר NGM מותכת (60 ° C) (שלב 1.2) ב קבינט על גבי לוחות תרבות 10 ס מ עם מנגנון אוטומטי שחולק נוזלים או פיפטה סרולוגית זרימה שכבתית. מאפשרים לילה יבש.
- Pipet 2 מ של OP50 מרוכז על כל צלחת 10 ס מ, להתפשט לגמרי לכסות את המשטח אגר על ידי הטיה וסיבוב לצלחת, ואז אפשר צלחות להתייבש. חנות צלחות ב 4 ° C עד 2 שבועות.
- עבור תפוקה גבוהה assay תרבות לוחות בשימוש להקרנה, לנצל את מתקן 8 ערוץ אוטומטית כדי לוותר על 0.15 מ של אגר NGM מותכת לתוך כל טוב של צלחת טוב 96 בארון זרימה שכבתית. טיפול שימוש כדי להפוך בארות בטוח הם ללא בועות, כמו אלה יאפשרו ומחילות של תולעים תסכן את וזמינותו בבאר. מאפשרים לילה יבש. חנות צלחות ב 4 ° C עד 2 שבועות.
4. הכנת טמפרטורה רגיש (ts) סטרילי C. Elegans תרבויות המונית
- להתחיל תרבויות, 'תולעת איסוף' (פיפטה מזכוכית עם כבל הפלטינה מצורפת או תולעת מיוצרים לבחור) תחת מיקרוסקופ ויבתר, באמצעות העברת ביצים 20 (זן TJ1060: spe-9 (hc88) אני; rrf-3(b26)II) אל תרבות המונים plate(s) מוכן בשלב 3.1. לאחר מכן, דגירה הצלחות ב- 20 ° C ל-6 ימים (מאפשר יותר מאשר דור אחד של צמיחה, כמו אתה ממקד לאוסף צאצאים של ביצי 20 עברה).
- מבחינה ויזואלית לאשר נוכחות של מבוגרים gravid (ביצים נוכח הרחם) עם מיקרוסקופ ויבתר. לאסוף המבוגרים gravid על ידי מחלק 2-3 מ"ל של S הבזליים לצלחת באמצעות פיפטה של זכוכית. מערבולת הנוזל סביב הצלחת ביד, ואז לאסוף את הנוזל לתוך צינור 15 מ"ל באמצעות פיפטה של זכוכית.
- ספין דרך צינור (1,000 g x 1.5 דקות ב- 20 ° C) הצניפה תולעים, ואז וארוקן את תגובת שיקוע. להוסיף 10 מ ל פתרון תת-כלורי (שלב 1.3) בגדר תולעת, במהירות לנער את הצינורית ביד בכיוון מלמעלה למטה Incubate ס' 5 למשך 5 דקות, רועדת כל 2.5 דקות.
- שוב, ספין דרך צינור (1,000 x גרם 1.5 דקות); בגדר צריך להיות חום-צהבהב. תשאף את תגובת שיקוע. להוסיף 10 מ ל תת-כלורי פתרון בגדר ביצה ומנערים נמרצות את הצינור. דגירה 1-3 דקות, עם רועדת פה ושם, תוך מעקב אחר המראה עם המיקרוסקופ ויבתר. מבחינה ויזואלית לאשר רק ביצים הם שנותרו, והמשך לשלב הבא.
- ספין דרך צינור (1,000 g x 1.5 דקות), וארוקן את תגובת שיקוע. בגדר להיות לבן עם אין צבע חום.
הערה: לאחר הסרת פתרון תת-כלורי, זה קריטי להשתמש טכניקות סטרילי, מאגרים, מאז זיהום (חיידקים ופטריות, בפרט) יכול להרוס את הניסוי, לבזבז זמן יקר, ריאגנטים. מחקר זה משמש ארונית זרימה שכבתית מסוננים ועבר נוזלים באמצעות רק פיפטות סטרילי וטיפים. - פתח הצינורות בתוך חלל סטרילי. לשטוף את צניפה 3 פעמים עם S הבזליים, מסתובב למטה (x 1000 גרם 1.5 דקות) וכ רפה בעברית משם את תגובת שיקוע בכל פעם. מחדש להשעות בגדר ביצה ב- 2-3 מ ל S הבזליים. . הביצים האלה עכשיו ניתן על פתח לילה במאגר כדי לאסוף L1 פגית (שלב 5).
5. מאינקובטור C. Elegans במאגר כדי לקבל סינכרונית תרבויות (בהכנת L1 זחל C. Elegans )
- Decant את הביצה צניפה ואת מאגר לתוך צלחת פטרי זכוכית סטריליים עם כיסוי. שוטפים את הביצים הנותרות מהצינור לתוך תבשיל באמצעות פיפטה סרולוגית עם 2-3 מ"ל של S הבזליים. הוסף 5 מ של S הבסיס כדי להקל על הצפיפות, כשם זה עשוי לעודד הבקיעה, כמו אור רועד (20 סל ד עם מטרף מסלולית רקדנית בטן). דגירה בין לילה ב- 20 ° C, כדי שיהיה זמן הביצים לבקוע (16-24 שעות). כל הוולדות אעצור בשלב 1סנט זחל (L1) העדר מזון.
הערה: אנקדוטלי מציינת כי ההכנות L1 טריים (16-36 שעות לאחר אוסף ביצי) לייצר באוכלוסיות ביותר סינכרונית של תולעים בוגרות. - איסוף L1s בשפופרת 15 מ"ל עם פיפטה סרולוגית. ספין למטה L1s ומפרידה (1,000 g x 1.5 דקות), תשאף משם את תגובת שיקוע, וחזור עד L1s כל שנאסף מן הבקיעה צלחות, תוך השארת 10 מ"ל של S הבסיס עבור השלב הבא.
- ברכבת התחתית המכיל L1s micropipette החוצה 0.01 mL (מיד לאחר ערבוב), לוותר על זה אל unseeded (אין e. coli) NGM צלחת. לספור את מספר L1s על הצלחת. חזור על פי 10 ולקבל ממוצע עבור מספר L1s של כל aliquot. מצפים בדרך כלל, בין 1-3 L1s לכל µL (כאשר החל עם לוחית תרבות המונים 1 המכיל ביצים 20).
- לקבוע עם פיפטה סרולוגית הנפח של S הבזליים מחזיק את L1s. ואז לנחש עם המספר הממוצע נחושה של תולעים לכל 0.01 מ ל, להשיג בשלב הקודם, כדי להעריך את המספר הכולל של L1s. באופן כללי, מצפה בין 10,000-30,000 L1s (לכל צלחת תרבות המונים המכילים ביצים 20).
- כדי להשתמש תרבות זו assay 96-ובכן, לדלל את המתלים L1 ל-1 L1 לכל µL בבקבוק מדיה עגול סטרילי, ולאחר מכן המשך לשלב 7. אם תרבות זו היא לשמש ליצירת נוספים C. elegans המונית, תרבויות ולאחר מכן המשך לשלב 6.
6. הכנה תרבות סינכרונית בקנה מידה גדול
הערה: L1 פתרונות יכול לשמש כדי להגדיל במהירות את התולעת אוכלוסיות.
- ליצירת מספרים גדולים תולעת עם פתרון L1, לוותר על L1s עד 5,000 על כל אחד מספר צלחות תרבות המונים הרצוי. לאסוף מבוגרים gravid 2.5 ימים מאוחר יותר (20 ° C) כמתואר בצעדים 4.1-2, והמשך לשלב 4.3 כדי לאסוף את הביצים.
- כמו זה anecdotally נצפתה זה חוזר על עצמו אוסף תת-כלורי יכול להדגיש את האוכלוסייה המשועבדת, לפצל את האוכלוסיות על ידי איסוף ביצים עבור הפצת לפני העמדת האוכלוסייה שנותרה לטיפולים תת-כלורי, אז זה מספר דורות של האוכלוסייה לא נחשפים שוב ושוב לטיפול פתרון תת-כלורי.
7. התקנה של צלחות Assay 96-ובכן
- לאפשר את הצלחות assay (להכין בשלב 3.3) לטמפרטורת החדר. לאחר מכן, בזרימה שכבתית cabinet, להוסיף 5 µL של OP50 מרוכז (להכין בשלב 2.2) כל טוב. כמו קודם, השתמש מתקן אוטומטית של ערוץ 8.
- להוסיף 10 µL של השעיה L1 מכל קידוח באמצעות מתקן אוטומטית של ערוץ 8. זה תניב על ממוצע 10 תולעים לכל טוב, מכיוון שהן ההשעיה נוכח 1 L1 לכל µL. לקדם חלוקה שוויונית של L1s מ slurry, לוותר על L1s מבקבוק מדיה עגול באופן פעיל מעורב בינוני באיטיות והופך מערבבים בר.
- מכסים עם מכסה, תיבת אצוות של צלחות, צלחת, דגירה 25 ° c במשך יומיים.
8. טיפול 1 סנט יום למבוגרים C. elegans עם כימיקלים
- להסיר את הלוחות ספריית כימי מהמקפיא, ולאפשר צלחות לטמפרטורת החדר לפני שתמשיך.
הערה: צלחות ספריית כימי כפי שמתואר כאן לוחיות 96 טוב המכיל תרכובות דיסקרטית בכל טוב, כל אשר נמצאים ריכוז זהה של מומס דימתיל סולפוקסיד. ספריות אלה לא לנצל את העמודות החיצוני, אז כל צלחת יש מקסימום של 80 כימיקלים שונים. ב פרוטוקול המתוארים כאן, הריכוז הספרייה הוא 10 מ מ. חשוב לקחת בחשבון את ההשפעות ממס על פנוטיפים. ואילו מחקר זה מקרינים על ריכוז דימתיל סולפוקסיד של 0.5%, רמה זו אירעה חריגה לא מבחני תוחלת החיים האלה, מבחני תפוקה נמוכה, איפה זה נוטים יותר לקחת ריכוז פתרון מניות מתחם. פרוטוקול זה אינו עולה על 0.25%, אשר הוא רמה שבה תוחלת החיים שינויים לא יתרחשו16, לפחות המתח N2. - בעדינות לנער צלחת ב rpm 60 על מטרף microplate עבור 1 דקות מיד לפני השימוש.
- משתמש אוטומטית נוזלי 96-ובכן הנדלר, העברת 0.75 µL של המתחם (דימתיל סולפוקסיד) מהצלחת ספריית לצלחת וזמינותו. עומק פיפטה במהלך הלידה נוזל לצלחת assay נשלטת בקפידה, כך קצות פיפטה המטפל נוזלי מעבירים את העוצמה 0.75 µL µL ~ 15 של נוזל על פני השטח של אגר (עם תולעים, OP50 מרוכז מצעדי 7.1 -2) לא לנקב פני השטח אגר בבאר. אל תשתמש ידני 8 או 12 פיפטות מרובה ערוצים חוץ במסכים קטנים מאוד (< 10 צלחות), כפי שהם יכולים להגדיל את שגיאה ולגרום לעיתים קרובות כתוצאה ניקב של פני השטח אגר, אשר פוגעת וזמינותו.
- הכינו צלחות של שליטה שלילי ספריית כימי עם דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד), בהנחה הספרייה הנבדקת משתמשת דימתיל סולפוקסיד הממס. להפוך לוח בקרה שלילית 1 עבור כל 5 לבדוק הצלחות, עד 10 לוחות בקרה שלילית. במידת האפשר, גם לעשות צלחת בקרה חיובית (NP11 -20 מ מ, על ריכוז הסופית assay של 0.1 מ"מ, יעילה למטרה זו; ראה סעיף נציג תוצאות). לא להוסיף כימיקלים (מבחן או שליטה) 2 העמודות החיצוני של הלוחות, כפי שהם רגישים במיוחד לייבוש.
9. ייבוש תרבויות
- כדי להסיר את הנוזל מפני השטח של אגר, יבש הצלחות זרימה שכבתית ארון עבור 4-8 שעות. . זה קריטי כי הצלחות האלה הם יבשים לחלוטין אבל לא הופכים desiccated כמו כמה צלחות ייקח יותר זמן להתייבש יותר מאחרים, לפקח מקרוב את כל הצלחות ולהסיר ברגע שהם יבשים. לאשר ייבוש על ידי בדיקה חזותית זהיר הבארות בודדים של הצלחת.
הערה: בהתאם גורמים, הכוללים את קצב הפליטה של הקבינט, הפעם שזה לוקח מדעית להיקבע. שלב הייבוש זה יכול לקחת כ- 4-8 h עבור ארון מלא. - חותם צלחות עם סרט שקוף ולאחר מכן לשים את המכסים את הצלחת.
- לסובב את הצלחות 96-ובכן assay עבור 45 s-1,000 x g.
- חנות צלחות הפוכה ב 25 º C.
10. הבקיע את תרבויות C. Elegans לאריכות ימים
- לפקח על לוחות בקרה שלילית עד > 95% תמותה נצפית. בדוק לוחות שבועי עבור שתי שבועות ומדי יום לאחר מכן. Caenorhabditis גדודים של זן ו מינים אותו ניתן להציג לכלבים שונה באופן משמעותי על ידי משפט17.
הערה: עבור וזמינותו תוחלת החיים המתוארים כאן, עם חיות TJ1060 תרבותי 25 ° c, 95% תמותה בקרב אוכלוסיות אלה שהתרחשה בין מבוגר יום 16-20. - כאשר שליטה שלילי בארות נחשבים הגיעו > 95% מארק, ספין לאורך כל הצלחות 96-ובכן assay עבור 45 s בצנטריפוגה מלמעלה בטבלה עם microplate הותאם רוטור (250 x g עבור 45 s ב- 20 ° C).
- ציון בארות כל לוחית שליטה. הדבר נעשה על ידי ספירת והקלטה מספר החיות חיים וגם מתים כל היטב. תולעים מתים יכול להיות מבודלים מהקבצים תולעים בחיים על ידי חוסר תנועה מוחלט שלהם. לעורר תנועה בעיר וורמס בחיים על ידי הטלת את הצלחת היטב 96 מ כ- 7 ס מ על גבי המשטח מיקרוסקופ ויבתר תוך התבוננות דרך העיינית של המצלמה עבור כל תגובה עורר. תולעים מתים לא יגיבו, הסמוך מעבדה החברים אולי לא מעריך את הרעש חוזרות.
- עבור לוחות מבחן, לספור, להקליט רק בארות המכיל תולעים בשידור חי. כאשר נוצרת תולעת בשידור חי, לספור כל החיות חיים וגם מתים בתוך הבאר הזו, יחד עם מיקום טוב ו צלחת.
הערה: זה לעיתים קרובות שימושי להבקיע מחדש את הצלחות לאחר > 99% של שליטה שלילי תולעים מתים. במסכים בקנה מידה גדול, זה עשוי להיות הנקודה הכי טוב לעשות על מניה הראשונית. בכל מקרה, הציון/מחדש-score כמתואר לעיל
11. בדיקה מחדש תרכובות
- בעת בדיקת רק מספר קטן של המועמד תרכובות (< תרכובות 320), כמו בדיקה חוזרת או מסך המועמד (ראה תוצאות נציג), להגביל את וזמינותו הבארות מרכזי 32 בניסיון למזער תופעות אפשריות הצלחת. זה משאיר הבארות 2 הכי קרוב לקצה הלוח לא מטופלת אבל עדיין המכילה אגר, מזון ותולעים.
Representative Results
נתחיל על-ידי בדיקת תוצאות נציג של העסקת פרוטוקול זה עבור מבחני 96-ובכן תוחלת החיים. בדוגמה הראשונה, השיטה שימשה למסך דרך כימיקלים 30,000 בהצלחה לזהות כימיקלים להאריך את תוחלת החיים של C. elegans, וכוללת גם תוצאות המסך המשך בדיקה חוזרת של כימיקלים באמצעות הביצועים הטובים ביותר באותו פרוטוקול. תוצאות אלו היו שתואר לעיל1. הדוגמה השניה משתמשת באותו הפרוטוקול מסך מידה קטן יותר של תרכובות המועמד.
בקנה מידה גדול מסך ולבדוק מחדש: המסך בקנה מידה גדול בדיקות תרכובות 30,000 בוצעה ב מנה אחת, ב כפילויות. כל חומר כימי ולכן נבדקה ב שתי בארות עם אוכלוסיה הצפוי של בעלי חיים הכולל של 20. כדי לעשות זאת, הוקרנו שלושה סטים נפרדים של 10,000 תרכובות (כפולים) על פני תקופה של ~ 3 חודשים כדי לכסות את תרכובות 30,000 כולו. זה נעשה באופן חלקי, על מנת להבטיח כמות לניהול של ניקוד ידני בסוף וזמינותו, נדרש בסך 260 הלוחיות 96-ובכן וזמינותו בכל אחד של ערכות. בספריית מלאי הצלחות, רק 80 בארות הכיל המתחם; שכפול אחד של תרכובות 10,000 הופך 125 צלחות וזמינותו. מחקר זה להשתמש משכפל 2 עם 10 לוחות בקרה שלילית בתוך כל קבוצה. כדי להגדיל את התפוקה, צלחות זכו כאשר אוכלוסיות שליטה שלילי היו העריך חוו ~ 99% תמותה. כל מבחן בארות נבחנו ואז לתולעים בשידור חי.
כימיקלים בבארות עם תולעת חיה אחת נקראו להיטים. כימיקלים בבארות המכיל בחיים יותר 1 תולעת היו גם להיטים בשם, בנוסף את כל התולעים בבארות האלה (החיים והמתים) נספרו כדי ליצור תוצאה פשוטה (אחוז הציון חי; מספר תולעים בחיים לחלק למספר של תולעים מתים). כל כימיקל בספריה יכול לפיכך להיקרא מכה פעמיים ואת הפגיעות האלה, אבל אולי. לא, יש לי ציונים המשויכים אליהם. כימיקלים ייחודיים 512 נקראו להיטים (לפחות פעם) ממסך של תרכובות 30,000. המסך בוצעה מתוך כוונה זיהוי חזק ו/או חזקים אפקטים פרו-אריכות ימים (לשחזור). אלה שני מאפיינים שונים יכול להיות השפעות שונות. כימיקלים חזק יכול להגדיל באופן משמעותי תוחלת חיים ובמקרה היינו מצפים אחוז גבוה של תולעים בחיים של הכימיקל הזה היטב. כימיקלים חזקים, יהיה צפוי יש תולעים חיות שתי משכפל. רשימת המתנקשים דורגה בהתבסס על קריטריונים אלה. 179 של הכימיקלים הניב ציונים בחיים באחוזים גבוהים, או נפגעו במעבר משכפל שני, ולכן נבחרו לבדיקה מחדש. רוב הכימיקלים הנותרים קרא להיטים, אך לא נבחרה לבדיקה מחדש, הכילה רק תולעת יחיד חי באחת הבארות שכפל.
בדיקה מחדש של הלהיטים היה שבוצעו, בדומה למסך הראשי חוץ עם 3 משכפל (הצפוי הכולל חיה אוכלוסייה של 30), זהיר כימות לכלבים החיות לוחית שליטה ללא טיפול. שינויים אלה נוספו כדי לסייע בהשוואת הבארות בדיקה ובקרה. 179 של מכה כימי היו מחדש הורה, מדולל עד 10 מ"מ, הועבר לתוך צלחות טוב 96. רק הבארות 24 הפנימי שימשו וזמינותו בדיקה חוזרת (גירסאות נוכחיות של פרוטוקול זה הייתי משתמש הבארות 32 הפנימי כמתואר בסעיף פרוטוקול עבור מסכי בדיקה חוזרת) והיו תרכובות נבדק מחדש שהפקידים עם שש צלחות assay בקרה שלילית מטופלים עם דימתיל סולפוקסיד הממס. לוח בקרה שלילי אחד היה הבקיע מעת לעת להישרדות הכולל (איור 1א'). כ- 95% של חיות בקרת היו מתים, כל הצלחות זכו לחלוטין (התייחסו לחיות, תולעים מתים נספרו).
להתקשר להיטים מתוצאות בדיקה חוזרת, ניתוק בוצע ב הציון הממוצע חי אחוז של סטיות תקן שליטה שלילי +2 (SD). בשביל הבארות מבחן, בממוצע אחוז בחיים (בזמנו של מניה) ציונים חושבו על ידי חישוב ממוצע הציון בחיים אחוז מן משכפל שלוש במשך כל. עבור assay מסוימת זו, שליליות שליטה ממוצע הציונים וולס בחיים האחוזים חושבו כממוצע של משכפל שלושה 48-וולס (2 סטים של צלחות triplicate בקרה שלילית). הגרמנים נהגו לקרוא להיטים מסידרת כימי בדיקה חוזרת היה שהגרמנים על פני הפקד שלילי 48 בממוצע ציונים בחיים אחוז. מחקר זה באמצעות אסטרטגיה זו, למצוא להיטים 57 מהספרייה בדיקה חוזרת של תרכובות 179, הוכחת כי סכום כולל של 32% של הכימיקלים בדיקה חוזרת חיובית (איור 1B). Binning של בממוצע הציונים בחיים אחוז בשביל הבארות בקרה ובדיקה שלילי ציינו כי הבארות מבחן ביצועים טובים יותר הבארות שליטה (איור 1C).
מועמד מסך: מסכי בקנה מידה קטן יכול להתבצע באופן דומה הבחינה שתוארו לעיל. כאן, אנו מתארים את התוצאות ממסך מועמד עם תרכובות 139. מועמדים אלה רוכזו כמבני סביר לקדם את תוחלת החיים. עבור מסך זה, נוכל לבצע משכפל 5 הלוחיות מבחן במינונים שונים שני (מיקרומטר 50 ו- 100 מיקרומטר). בנוסף, השתמשנו 8 לוחות בקרה שלילית עם צלחת בקרה חיובית יחיד (NP1) המכילות מינונים שונים שני; מיקרומטר 50 ו- 100 מיקרומטר.
לוחות בקרה שלילית נוטרו עד ~ 90% של בעלי חיים מתים. באותו הזמן, וולס היו שבוים על ידי ספירה חיה ומתה תולעים בבארות שליטה כל ולאחר מבארות מבחן שהכיל תולעים בשידור חי. האחוזים חי בזמנו של הניקוד שימשו לחישוב ציונים בחיים אחוז בממוצע במשך כל. עבור הפקדים שלילי, בארות 32 היו ציונים בחיים אחוז מן משכפל 8. עבור הפקדים חיובית, היו 4 ציונים טוב בממוצע על פני משכפל 4 עבור כל מנה. להיטים נקראו וולס עם ניקוד בחיים אחוז בממוצע, זה היה גדול יותר בממוצע אחוז שליטה שלילי בחיים ציון +2 SD. הפסקת הזה עזב 14 להיטים מהמסך של המועמד, נשלל כל הבארות שליטה שלילי. את הכשל כללה גם את כל השליטה חיובי בארות שטופלו ב 100 מיקרומטר ו 50% של הפקדים חיוביים שטופלו ב 50 מיקרומטר. תוצאות אלו מוצגים כאן כפי מנופה בממוצע ציונים בחיים אחוז את 50 מיקרומטר (איור 2א) וגם את המסכים מבחן 100 מיקרומטר (איור 2B).
לבסוף, כל הצלחות היו הצליחו מחדש בנקודת זמן מאוחרת, אשר תאמו זמן כאשר יחס גדול מ- 99% של הפקד שליליים בעלי חיים מתים. תוצאות אלה יצוין כי הבארות בקרה חיובית הרבה יותר שבוצעה שלילי בדיקה ובקרה הבארות (איור 2C). בעוד הבארות הבדיקה היו מעט יותר הפקדים שלילי. תוצאה זו האחרון הוא מוטה על ידי הסימן כי רבים מן הבארות מבחן הופיע שהפגינו רעילות ביחס לטיפול שליטה (טבלה 1), ובכך משתנה מתערב פרשנות פשוטה זו. זה היה צפוי, שכן הספרייה המועמד היה מסך אמיתי של כימיקלים עם פעילות ביולוגית לא ידוע ב- C. elegans, בדיקה חוזרת של המסך היה בעיקרו ממוסך מראש עבור תרכובות שלא היו רעילים. מאז במסך הראשי זה היה עבור תרכובות מאורכים תוחלת החיים, באופן משמעותי כימיקלים רעילים צריך לא ב לבחון מחדש הוגדרו.
איור 1 : נציג נובעת גבוה מסך התפוקה ובדיקה מחדש
(א) שאירים עקומת מצלחת ייצוגית שליטה שלילי בשימוש וזמינותו בדיקה חוזרת. עקום זה נבנה מתוך הבקיע כל התולעים בשידור חי ומת ב הבארות 24 בשימוש זה וזמינותו 4 פעמים במהלך הימים 18 של וזמינותו. יום 18 של בגרות, פקדים היו העריך שיש ~ 5% הישרדות, מבחן שליטה וכל הצלחות היו אז גם כבש. (B) טבלה המסכמת את התוצאות של המסך, בדיקה חוזרת. (ג) Binning של הציונים אחוז בארות בממוצע בחיים בתנאי בקרה ובדיקה מהמסך בדיקה חוזרת. עבור פקדים, הציונים הם מבארות 48 אחד המורכב הממוצע של משכפל 3. תוצאות הבדיקה הן בארות 179 אחד המורכב הציון בממוצע של משכפל שלוש. איור 1 המופקת מן הפרסום הקודם1. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : נציג נובעת מסך המועמד
Binning (א) של תוצאות מהמסך המועמד 50 מיקרומטר. תוצאות הבדיקה-ובכן 139 לייצג את הציון בחיים אחוז בממוצע בין משכפל 5. התוצאות שליטה שלילי 32 מורכב בממוצע ציונים בחיים אחוז מן משכפל 8. התוצאות בקרה חיובית 4 מורכב בממוצע ציונים בחיים אחוז מ 4 משכפל (סה כ 16 בארות NP1 המכיל ב 50 מיקרומטר). Binning (B) של תוצאות מהמסך המועמד 100 מיקרומטר. כל הוא זהה (א), חוץ מזה מבחן בארות ופקדים חיובי טופלו בריכוזים 100 מיקרומטר. הלוחות בקרה שלילית באותו מוצגים הן (A ו- B). (ג) נציג נובעת לבדיקה חוזרת הלוחות בנקודת זמן מאוחרת יחסית קיצוני. פקדים חיובית באופן דרמטי ביצועים טובים יותר כל השאר, אם רק החשבונאי האחוזים של וולס עם תולעים חיות בנקודה זו בזמן, אשר הוא לרעת מבחן בארות כפי שמתואר הטקסט העיקרי, טבלה 1. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| Binning של בממוצע ציונים בחיים אחוז | ||||||
| ציונים מקובצת | כל המתים (0) | 1-10 | 11-20 | 21-30 | 31-40 | > 41 |
| בדיקה חוזרת | ||||||
| # של (-) שליטה | 16 | 31 | 1 | 0 | 0 | 0 |
| # של מבחן בארות (50µM) | 46 | 69 | 50 | 8 | 3 | 3 |
| המועמד מסך | ||||||
| # של (-) שליטה | 0 | 11 | 21 | 0 | 0 | 0 |
| # של (+) שליטה (50µM) | 0 | 0 | 2 | 2 | 0 | 0 |
| # של (+) שליטה (100µM) | 0 | 0 | 0 | 0 | 2 | 2 |
| # של מבחן בארות (50µM) | 94 | 22 | 21 | 2 | 0 | 0 |
| # של מבחן בארות (100µM) | 86 | 25 | 21 | 6 | 1 | 0 |
טבלה 1: נציג נובעת binning שונות
כאן אנו מציגים את binning של הציונים בחיים אחוז בממוצע של שני המסכים (בדיקה חוזרת, המועמד). במסך בדיקה חוזרת, הפסגה היא דומה אל הפקד שלילי עם מחדש בדיקות outperforming הפקד שלילי באופן דרמטי בצד הימין (מאריכים) בצד של השולחן. הדבר מעיד על הנוכחות של תרכובות פרו-אריכות ימים מרובים נוכח ערכת בדיקה חוזרת. המסך המועמד, אנו רואים כי השיא הוא בקטגוריה כל מת, אמנם יש גם אות לכאורה מצד ימין של הטבלה. זה מעיד על קיומם של אריכות פרו-ימים תרכובות בערכת המועמד, אלא גם מעיד על קיומם של רעילות משמעותיות בין המועמד קבוצת תרכובות.
Discussion
כאן תארנו שיטה פשוטה עבור culturing C. elegans ב 96-ובכן צלחות. אנו מתארים תרבויות אלה לשימוש הקרנה כימי מבחני תוחלת החיים, אך הם יכולים לשמש עבור סוגים רבים של מבחני. בזמן התנאים תרבות רב טוב לסינון כימי כבר קודם לכן דיווח8, כולל עבור תוחלת החיים ניתוח10, וזמינותו המתוארים כאן שונה במספר דרכים. וזמינותו תוחלת החיים המתוארים כאן מנצל 96-ובכן צלחות מסתמך על מוטציות סטרילי (במקום עיקור כימית), משתמשת אגר תרבות בתנאים, משתמשת נוזל פשוט טיפול להעביר תולעים, הוא הבקיע באופן ידני על נקודת הקצה. הגישות השונות בשימוש assay הזה עשוי להיות לעזר לחוקרים מחפש הקרנת שיטות הכוללות תנאים אלה.
רכיבים חיוניים כדי פרוטוקול זה מרכז בעיקר על איכות הגלופות הופק עבור וזמינותו. ראשית, בעת ביצוע צלחות זה הכרחי כי השטח אגר הינו ללא בועות, פגמים אחרים. אלה בווריאציות פני אגר כמעט תמיד להוביל ומחילות ואובדן של הבאר. שנית, פרוטוקול זה מסתמך על הניגוב נוזלים הופקדו בשלבים סימום וההתקנה. . זה קריטי כי נוזלים אלה יוסרו לחלוטין, אבל אגר לא להפוך התייבש Anecdotally, נראה כי תולעים בבארות שאינם לגמרי מיובשים (שחייה בנוזל) יחיו זמן רב יותר יבשים כראוי וולס, בזמן ייבוש יתר הלוחיות מוביל לייבוש פיצוח של אגר, מה שמוביל תולעת ומחילות ואובדן. עוד אלמנט מכריע של פרוטוקול זה הוא שמירה על תנאים סטריליים. כמו עם כל assay תוחלת החיים, יש הרבה עבודה רגשית עם הגדרת צלחת ולאחר זמן והזדמנויות רבות קיימות עבור assay הורס זיהום ליישב ולגדול על הלוחות.
בעוד וזמינותו תוחלת החיים המתוארים כאן הוא שימושי להקרנה של תרכובות C. elegans, זה מוגבל לרקע גנטי מסוים, כמו זה מסתמך על זן רגיש (ts) טמפרטורה סטרילית; השתמשנו TJ1060, שבו יש עקרות גבוהה penetrance. זה מגביל זנים הזמין להקרנה בשיטה זו. חלופה ניגש כולל חציית מוטציות סטרילי ts לתוך הרקע הרצוי או באמצעות עיקור כימי. לא ניסינו עיקור כימי עם assay הזה, אבל זה צריך להיות אפשרי. משוכות פוטנציאליים כוללים הצבת המעקר התולעים בשלב הנכון, את המינון הנכון. הפרוטוקול המתואר כאן משתמש מתקן נוזלי מהיר, אך אינו מופיע כדי לוותר על מבוגרים ביעילות. כך, תולעים אלה לפתח על הלוחות, ולכן חייבים להיות מטופלים עם עיקור כימי על הלוחות. קביעת המינון האופטימלי ואת התזמון יהיה חשוב להצלחה. אסטרטגיות אלטרנטיביות כוללים באמצעות שיטה שחולק שיכול להזיז מבוגרים. בעבר, מצאנו כי מכונות מסוגל לזהות ולמיין מבוגרים הם בדרך כלל איטית יותר מאשר המטפלים נוזל פשוט, אשר יכולים לדלג slurries הומוגנית של זחל על תנאי.
באופן כללי, אנו משתמשים בשיטה זו כדי במהירות מסך כימיקלים וטיפולים עבור גדול השפעות חיוביות על תוחלת החיים. השיטה זו יעילה במיוחד בעת שימוש במינונים מרובים, גבוהה לשכפל את המספרים, לסגור ניטור של פקדים שלילי כי הם תמיד מתוחזקים וביניהם בין הלוחות הבדיקה. פקדים חיוביים שימושיים גם בעת תכנון וביצוע המסכים המתואר בכתב היד. עם זאת, כדי להיות חיובי יעיל, הפקד יצטרך להיות חזק למדי ו/או חזקה מאוד. כאשר המסך במקור פרוס, תרכובת כראוי חזק וחזק לא היתה אפשרות לזהות. כיום, ישנם דיווחים רבים בספרות "הזדקנות" של מועמדים חיובי פקדים שימושיים במסכים המתוארים כאן. כפי שמתואר בסעיף מסך המועמד של המקטע התוצאות הצפויות של כתב יד זה, איור 2 , טבלה 1, מתחם NP1 הוא פקד חיובי יעיל עבור מסך זה. אנחנו בדרך כלל לאשר חיובי להיטים משנות את המסכים הבאים עם תוחלת חיים רגילה מבחני על צלחות תרבות 3 מ מ.
Disclosures
המחברים מצהירים כי אין ישות מימון תמיכה עבודה זו היה כל קלט על איסוף נתונים, ניתוח של תוצאות, או ההחלטה לפרסם.
Acknowledgments
אנו מודים Dipa Bhaumik, אהרון מילר, בוב יוז לקבלת סיוע טכני. זנים נמסרו על ידי CGC, אשר ממומן על ידי משרד NIH תוכניות תשתית מחקר (P40 OD010440). אנחנו אסירי תודה גאורגיה וודס ולבני לית'גו, Kapahi, Melov מעבדות לדיונים שימושי מ. ל נתמכה על ידי נבחרת מכונים לבריאות (NIH) הכשרה גרנט T32 AG000266 ואחווה אליסון רפואי קרן/אמריקאי הפדרציה של הזדקנות מחקר לפוסט. עבודה זו נתמכה על ידי מענק של מעבדות BioAge, מענק קרן Hillblom לארי ל', כמו גם מכון הבריאות הלאומי מעניק UL1024917, תומך האיחוד מחקר בינתחומי על Geroscience, ו 1R01AG029631-01A1 אל G.J.L.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB Broth Miller Granules | VWR | ||
| Unispense | Wheaton Science Products | automated fluid dispensing apparatus | |
| 96 well assay plate; COSTAR 3370 | Corning | ||
| Multidrop 384; automated 8 channel dispenser | Thermo Fisher Scientific | ||
| manufactored worm pick | Genesee Scientific | ||
| Belly Dancer Orbital Shaker | Stovall Life Science inc. | ||
| microplate shaker; MTS 2/4 Digital | IKA Works, inc. | ||
| automated 96-well liquid handler; Biomek FX Liquid Handler | Beckman Coulter | ||
| automated 96-well liquid handler; Bench Top Pipettor | Sorenson Bioscience, inc. | ||
| manual 8 or 12 multi-channel pipettes | we use rainin… | ||
| transparent 96 well film cover; TempPlate RT Optical Film | USA Scientific | ||
| table top centrifuge; Centrifuge 5810 R | Eppendorf |
References
- Lucanic, M., et al. Chemical activation of a food deprivation signal extends lifespan. Aging Cell. , (2016).
- Evason, K., Huang, C., Yamben, I., Covey, D. F., Kornfeld, K. Anticonvulsant medications extend worm life-span. Science. 307 (5707), 258-262 (2005).
- Melov, S., et al. Extension of life-span with superoxide dismutase/catalase mimetics. Science. 289 (5484), 1567-1569 (2000).
- Benedetti, M. G., et al. Compounds that confer thermal stress resistance and extended lifespan. Exp Gerontol. 43 (10), 882-891 (2008).
- Hansen, M., Hsu, A. L., Dillin, A., Kenyon, C. New Genes Tied to Endocrine, Metabolic, and Dietary Regulation of Lifespan from a Caenorhabditis elegans Genomic RNAi Screen. PLoS Genet. 1 (1), 17 (2005).
- Lee, S. S., et al. A systematic RNAi screen identifies a critical role for mitochondria in C. elegans longevity. Nat Genet. 33 (1), 40-48 (2003).
- Samuelson, A. V., Carr, C. E., Ruvkun, G. Gene activities that mediate increased life span of C. elegans insulin-like signaling mutants. Genes Dev. 21 (22), 2976-2994 (2007).
- Kwok, T. C., et al. A small-molecule screen in C. elegans yields a new calcium channel antagonist. Nature. 441 (7089), 91-95 (2006).
- Petrascheck, M., Ye, X., Buck, L. B. A high-throughput screen for chemicals that increase the lifespan of Caenorhabditis elegans. Ann N Y Acad Sci. 1170, 698-701 (2009).
- Solis, G. M., Petrascheck, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates. J Vis Exp. (49), (2011).
- Angeli, S., et al. A DNA synthesis inhibitor is protective against proteotoxic stressors via modulation of fertility pathways in Caenorhabditis elegans. Aging (Albany NY). 5 (10), 759-769 (2013).
- Fabian, T. J., Johnson, T. E. Production of age-synchronous mass cultures of Caenorhabditis elegans. J Gerontol. 49 (4), 145-156 (1994).
- Greer, E. L., Brunet, A. Different dietary restriction regimens extend lifespan by both independent and overlapping genetic pathways in C. elegans. Aging Cell. 8 (2), 113-127 (2009).
- Mair, W., Panowski, S. H., Shaw, R. J., Dillin, A. Optimizing dietary restriction for genetic epistasis analysis and gene discovery in C. elegans. PLoS One. 4 (2), 4535 (2009).
- Hamilton, B., et al. A systematic RNAi screen for longevity genes in C. elegans. Genes Dev. 19 (13), 1544-1555 (2005).
- Frankowski, H., et al. Dimethyl sulfoxide and dimethyl formamide increase lifespan of C. elegans in liquid. Mech Ageing Dev. 134 (3-4), 69-78 (2013).
- Lucanic, M., et al. Impact of genetic background and experimental reproducibility on identifying chemical compounds with robust longevity effects. Nat Commun. 8, 14256 (2017).
