Summary
Здесь мы опишем простой протокол для быстро производить сотни нематоды роста СМИ агар, 96-луночных культуры пластин с последовательным числом Caenorhhabditis elegans за хорошо. Эти культуры являются полезными для фенотипического скрининг всего организмов. Мы сосредоточимся на использование этих культур экрана химических веществ для про долговечность эффектов.
Abstract
Caenorhabditis elegans является полезным организма для тестирования химического воздействия на физиологии. Весь организм малые молекулы экраны предлагают значительные преимущества для выявления биологически активных химических структур, которые могут изменить сложные фенотипов, таких, как продолжительность жизни. Описанные здесь — это простой протокол для производить сотни 96-луночных культуры пластин с довольно последовательную количество C. elegans в каждой скважине. Далее мы определили как использовать эти культуры экран тысячи химических веществ для воздействия на срок службы нематоду C. elegans. Этот протокол позволяет использовать температуры чувствительных штаммов стерильные, агар пластины условий и простых животных, обработка для облегчения быстрого и высокой пропускной способности производства синхронизированных животных культур для скрининга.
Introduction
Здесь Протокол описан который был разработан для высокой пропускной способности скрининга химических соединений для воздействия на Caenorhabditis elegans продолжительность жизни. Сам протокол легко адаптируется для других фенотипические экранов, включая исследования с использованием штаммов C. elegans репортер. Этот протокол был успешно использован для выявления роман биологически активные соединения, NP1 (нитрофенил пиперазина 1), что сильно продлевает срок жизни C. elegans через механизм диетическое ограничение. NP1 и характеристика его влияние на продолжительность жизни, включая описание генетического пути в игре, было ранее описано в других разделах1. Этот отчет также включает в себя описание результатов крупномасштабного осуществления экрана. Здесь мы описываем в гораздо более подробно методология и настройки экрана, который является масштабируемой для мелко - и крупномасштабных приложений.
Цель, которая привела к созданию протокола, описанные здесь было разработать C. elegans культуры платформу, что позволило для быстрого скрининга больших химических библиотек для Роман биологически активных соединений. Хотя химические экраны проведены до разработки этого протокола, это были главным образом мелких и/или кандидат типа подходы2,3. Действительно большинство экранов, выполнена в лаборатории на десятки соединений используются стресс сопротивления анализов, с хитами, проходят проверку для долголетия эффекты4. Вместо этого это исследование стремится напрямую экран для жизни эффекты. Удивительно к моменту проведения крупномасштабных химических экраны с C. elegansбыли несколько описаний в научной литературе. Действительно по сравнению с другими типами экранов5,6,7, крупномасштабные химического скрининга с помощью C. elegans представляется неполной занятости.
Там были два описания крупномасштабных химических экранов в C. elegans , которые были использованы в качестве основы для разработки такого подхода. Первым из них был элегантный исследование из Питера Роя лаборатории с использованием химических экранов для выявления соединений, которые могут повлиять на развитие животных. Затем последовали с вперед мутагенеза экрана, чтобы выявить генетические цели этих химических веществ8исследование. Протокол, описанные в этом исследовании используется 24-ну паштетов, который был просто непригодными для этого исследования конкретных потребностей (ограниченное количество химического вещества в библиотеке и ограниченные имеющиеся инкубатор пространства). Другое исследование было Майкл Petrascheck инновационных и амбициозных мелкомолекулярных экран для жизни, расширяя химических веществ9,10. Это исследование используется 384-ну пластины и жидких культур. Другой особенностью этого экрана было использование FUDR (5-fluorodeoxyuridine) химически подавляют производство потомства. После значительного рассмотрения протокола, описанные в этом исследовании химической стерилизации и жидких культур C. elegans были избежать.
Хотя FUDR широко используется в C. elegans жизни экспериментов, существуют опасения, что FUDR может вызвать непредвиденные лекарственных взаимодействий, или что FUDR сам может иметь некоторое влияние на продолжительность жизни. Недавно этот последний вопрос был утвержден, по крайней мере в некоторых концентрации и, в частности при 25 ° C11. Обойти проблему загрязнения потомства, C. elegans штамм TJ1060 было использовано, который затаивает два независимых температуры чувствительных мутации (spe-9 (hc88) rrf-3(b26)II), ликвидировать производство спермы и показали, чтобы быть полезным; для массовой культуры синхронных населения12. Этот штамм был полностью стерильной при 25 ° C, но будет производить потомство при культивированный на 15-20 ° C. В настоящем исследовании использованы обычные культуры условий, с червями, ползать на поверхности агара, как результаты, полученные с жидким культуры не всегда воспроизводимые с обычными агар пластинами. Хотя это явление полностью не поняты, было продемонстрировано, что черви культивировали в жидком реагировать DR (диетическое ограничение) по-разному чем червей, культивируемых на стандартные носители13,14. Поэтому вполне правдоподобным, что жидких сред может маскировать некоторые д-р mimetics, который в противном случае будут определяться с экрана.
Обосновавшись на условиях культуры агара, были рассмотрены различные варианты скоринга производительности скважин в этот assay. Хотя различные автоматизированные или изображений на основе анализов были доступны, они потребовали, приобретение и развертывание систем технически сложных устройств, большинство из которых были дорогими. При рассмотрении этих вариантов, необходимо сослаться на предыдущие экраны продолжительность жизни всех типов. В конечном счете это исследование используется скоринга метод адаптировано из лаборатории ли Сиу Sylvia весь геном RNAi экрана для жизни фенотипов15. В частности все жизни пластины были созданы таким же образом, но только негативный контроль осуществлялся. После того, как отрицательный контроль пластины были подтверждены рядом полной смертности, тест пластины были забиты вручную. В этом крупномасштабные экрана срабатываний были подтверждены повторное тестирование с свежеприготовленные химических веществ, с использованием что экземплярах повторяет первичного срабатываний.
Protocol
1. Подготовка буферов
-
LB отвара
- Используйте предварительно смешанные гранулы (см. Таблицу материалов) и следуйте производителя протокол для подготовки.
-
Нематоды роста СМИ (НГМ) агар
- Смешайте 23 g агар, 3 г NaCl, 2.5 g bacto Пептон, и обессоленной воды для 0,972 L. автоклава и Остудите до 60 ° C, затем добавить 25 мл 1 М калия фосфат (4КПО) буфера (pH 6.0), 1 мл магния сульфата 1 М (4MgSO) , 1 мл хлорида кальция 1 М (2CaCl) и 1 мл холестерин 5 мг/мл (в этиловом спирте).
-
Гипохлорита раствор
- Смешайте 5 мл 5 м Кох, 4 мл раствора гипохлорита натрия (6%) и деионизированную H2O суммарный объем 50 мл.
-
S базальная
- Смешайте 5 г NaCl, 1 g K2HPO4, 6 g KH2PO4и деионизированной водой до 1 Л, затем автоклава.
2. Подготовка концентрированной E. coli (ОР50)
Примечание: Этот шаг концентрируется 1 Л раствора насыщенным E. coli в 25 мл S базальной буфера.
- Прививок 5 мл газобетона LB отвара (шаг 1.1) с одной колонии E. coli (штамм ОР50) и проинкубируйте 4-6 ч при 37 ° C при встряхивании (250 об/мин). Используйте 0,1 мл этого раствора для прививок в колбу Эрленмейера 2 Л 1 Л фунтов. Инкубируйте 1 Л колбы на ночь (12-16 ч) при 37 ° C при встряхивании (250 об/мин).
- Центрифуга на ночь 1 Л культур в 500 мл бутылки центрифуги для 5 мин на 10000 x g и 4 ° C до Пелле бактерии и сцеживаться прочь оставшихся средств массовой информации. Ресуспензируйте Пелле в 25 мл базальной S (шаг 1.4). Хранить при 4 ° C.
3. Подготовка NGM культуры пластин
- Для массовой культуры пластин, используемых для производства большого количества червей отказаться от расплавленного (60 ° C) NGM агар (шаг 1.2) в поток ламинарный кабинет на 10 см культуры пластин с автоматизированной жидкости дозирующего аппарата или Серологические Пипетки по 30 мл. Разрешить для высыхания на ночь.
- Пипетки 2 мл концентрированной ОР50 на каждую пластину 10 см, распространение полностью покрыть поверхность агара, наклона и вращения пластины, затем позволяют пластины для просушки. Хранить пластины на 4 ° C на срок до 2 недель.
- Для высокой пропускной способности пробирного культуры пластин, используемых для скрининга используют автоматизированный 8-канальный дозатор отказаться 0,15 мл расплавленный агар NGM в каждой скважине 96 хорошо пластины в Шкаф ламинарный поток. Использование уход чтобы убедиться скважин лишены пузыри, как они позволят роющих червей, которые будет компромиссом assay в этом хорошо. Разрешить для высыхания на ночь. Хранить пластины на 4 ° C на срок до 2 недель.
4. Подготовка температуры чувствительных (ts) стерильные C. Elegans массового культур
- Чтобы начать культур, используя «червь забрать» (выбрать стеклянные пипетки с прилагаемой провода платины или изготовленные червя) под микроскопом рассечения, передачи 20 яиц (штамм TJ1060: spe-9 (hc88); rrf-3(b26)II) на знаке массовой культуры, подготовленную на этапе 3.1. Затем, инкубировать пластин при 20 ° C в течение 6 дней (позволяет для более чем одного поколения роста, как вы ориентируетесь для коллекции потомства 20 яиц переехали).
- Визуально подтвердите присутствие взрослых, беременных (яйца в матке) с микроскопом рассечения. Соберите беременных взрослых дозирования 2-3 мл S базальной на пластину с помощью стеклянной пипетки. Вихрем жидкости вокруг пластины вручную, а затем собирать жидкость в 15 мл трубку с помощью стеклянной пипетки.
- Спина в трубку (1000 x g 1,5 мин при 20 ° C) пеллет червей, а затем аспирационная покинуть супернатант. Добавить 10 мл раствора гипохлорита (шаг 1.3) червь гранулы и быстро встряхните трубки вручную в направлении сверху вниз для 5 s. инкубировать на 5 мин, пожимая каждые 2,5 мин.
- Опять же спин вниз по трубе (1000 x g 1,5 мин); Гранулы должны быть желто коричневый. Аспирационная покинуть супернатант. Добавить 10 мл раствора гипохлорита Пелле яйцо и энергично встряхнуть трубки. Инкубируйте 1-3 мин, периодически встряхивая и во время наблюдения за внешний вид с рассечения микроскопа. Визуально подтвердите только яйца остаются и переходите к следующему шагу.
- Спина в трубку (1000 x g 1,5 мин) и аспирационная покинуть супернатант. Гранулы должны быть белого цвета с не коричневую окраску.
Примечание: После удаления раствора гипохлорита, важно использовать стерильные приемы и буферы, поскольку загрязнение (бактерий и грибков, в частности) может испортить эксперимент, тратить драгоценное время и реагенты. Это исследование используется Шкаф ламинарный поток отфильтрованных и переехал жидкости, используя только стерильные пипетки и советы. - Откройте трубы в стерильных пространстве. Помойте лепешка 3 раза с S базальной, спиннинг вниз (1000 x g для 1,5 мин) и аспирационных прочь супернатант каждый раз. Вновь приостановите Пелле яйцо в 2-3 мл S базальной. Эти яйца могут теперь использоваться для ночи люк в буфере для сбора L1 личинка (шаг 5).
5. инкубационного яйца C. Elegans в буфер для получения синхронных культур (подготовка L1 личиночной C. Elegans )
- Декант буфера и яйцо пеллет в стерильных стеклянных Петри блюдо с крышкой. Промойте оставшиеся яйца из трубки в блюдо с помощью Серологические Пипетки с 2-3 мл S базальной. Добавьте 5 мл S базального чтобы облегчить скученности, поскольку это может стимулировать штриховкой, как будет свет встряхивания (20 об/мин с танцами живота орбитальный шейкер). Инкубируйте на ночь при 20 ° C, чтобы позволить время яйца люк (16-24 ч). Все молодь будет арест на личиночной стадии 1st (L1) из-за отсутствия пищи.
Примечание: Анекдотических свидетельств указывает, что свежие L1 препараты (16-36 ч после сбора яиц) создать наиболее синхронных населения взрослых червей. - Соберите Л1С в 15 мл с Серологические Пипетки. Спин вниз Л1С в центрифуге (1000 x g 1,5 мин), аспирационная прочь супернатанта и повторять до тех пор, пока все Л1С были собраны от инкубационных пластины, оставляя 10 мл S базальной для следующего шага.
- Из пробирки, содержащие Л1С, микропипеткой вне 0,01 мл (сразу же после перемешивания) и распределять на unseeded (без E. coli) NGM пластины. Подсчитать количество Л1С на плите. Повторите 10 раз и получить среднее количество Л1С в каждом Алиготе. Как правило ожидаете, между 1-3 Л1С за мкл (когда начиная с 1 пластина массовой культуры, содержащие 20 яйца).
- С Серологические Пипетки Определите объем S базальной Холдинг Л1С. Затем экстраполировать с определяется среднее количество червей на 0,01 мл, полученные на предыдущем шаге, чтобы оценить общее количество Л1С. Как правило ожидаете между Л1С 10000-30000 (каждой пластины массовой культуры, содержащие 20 яйца).
- Для использования этой культуры в 96-луночных assay, разбавить L1 подвеска 1 L1 за мкл в стерильных раунда СМИ бутылку, а затем перейдите к шагу 7. Если эта культура должна использоваться для создания дополнительных C. elegans массовой культуры, а затем перейдите к шагу 6.
6. крупномасштабных синхронных культуры подготовка
Примечание: L1 решения может использоваться для быстро увеличение населения червя.
- Для создания больших червь чисел с решением L1, обойтись до 5000 Л1С на каждом из нужное количество пластин массовой культуры. Собирать беременных взрослых 2,5 дней спустя (20 ° C), как описано в шагах 4.1-2 и перейти к шагу 4.3 собирать яйца.
- Как занимательно отмечалось, что неоднократное гипохлорита коллекции можно подчеркнуть покоренных населения, разделение населения на собирание яиц для распространения до подвергая оставшееся население гипохлорита лечения, так что несколько поколений населения не подвергаются неоднократно лечение раствора гипохлорита.
7. Установка 96-луночных Assay пластин
- Позволяют достичь комнатной температуры пробирного пластины (подготовлен в шагу 3.3). Затем в поток Ламинарный шкаф, добавьте 5 мкл концентрированного ОР50 (подготовленных на шаге 2.2) для каждой скважины. Как и прежде используйте автоматизированные 8-канальный дозатор.
- Добавьте 10 мкл суспензии L1 для каждой скважины с использованием автоматизированной 8-канальный дозатор. Это даст на среднем 10 червей в колодец, поскольку они присутствуют в суспензии на 1 L1 за мкл. Для содействия равному распределению Л1С из пульпы, обойтись Л1С из бутылки круглой СМИ активно смешивается с умеренно медленно превращаясь перемешать бар.
- Крышка с крышкой, поле пакетов пластин и инкубировать при 25 ° C в течение 2 дней.
8. лечение 1 st взрослых день C. elegans с химикатами
- Удаление химических библиотека пластины из морозильника и позволяют пластины до комнатной температуры перед продолжением.
Примечание: Химическая библиотека пластины как описано здесь, 96 хорошо пластины, содержащий дискретные соединений в каждой скважине, все из которых находятся в такой же концентрации и растворенных в ДМСО. Эти библиотеки не использовать внешние столбцы, и поэтому каждая пластина имеет максимум 80 различных химических веществ. В протоколе, описанные здесь библиотека концентрация составляет 10 мм. Важно рассмотреть признаки растворителей на фенотипы. Хотя это исследование экраны в 0,5% концентрации ДМСО, этот уровень никогда не был превышен в этих анализов продолжительность жизни и низкая пропускная способность анализов, где это более вероятно выбрать соединение Стоковый раствор концентрации. Этот протокол не превышает 0,25%, который является уровнем, на котором продолжительность жизни изменения не происходят16, по крайней мере в штамм N2. - Осторожно встряхните пластины на 60 об/мин на Гонав шейкер для 1 мин непосредственно перед использованием.
- С помощью автоматизированной 96-луночных жидких обработчик, передачи 0,75 мкл, комплекса (или ДМСО) из библиотеки пластины на пластину пробирного. Глубина Дозатор жидких доставки к пластине пробирного контролируется тщательно, таким образом, что советы дозатор жидкого обработчика доставляют объем 0,75 мкл на ~ 15 мкл жидкости на поверхности агара (с червей и концентрированные ОР50 от шагов 7.1 -2) и не проколоть поверхности агара в колодец. Не используйте руководство по 8 или 12 многоканальных пипеток за исключением очень небольших экранах (< 10 пластины), как они могут увеличить ошибка и часто приводят к проколов поверхности агара, которая подрывает assay.
- Подготовка химических библиотека отрицательный контроль пластин с ДМСО (диметилсульфоксид), предполагая, что тестируется библиотека использует ДМСО в качестве растворителя. Сделайте 1 пластина отрицательный контроль за каждые 5 тест пластины, до 10 отрицательный контроль пластин. Если возможно, также сделать положительный контроль плиты (NP11 на 20 мм, для окончательного анализа концентрации 0,1 мм, эффективна для этой цели; см. раздел представитель результаты). Не добавляйте химических веществ (тест или управления) 2 внешние колонны плит, как они особенно восприимчивы к усыхания.
9. Сушка культур
- Чтобы удалить жидкость из поверхности агара, сухие пластины в Ламинарный шкаф для 4-8 ч. Важно, что эти пластины сушатся полностью, но не стать сморщившимися. Как некоторые плиты займет больше времени, чем другие сухие, тщательно контролировать все пластины и удалить, как только они сухие. Подтвердите, сушки путем тщательного осмотра отдельных скважин пластины.
Примечание: В зависимости от факторов, которые включают уровень выхлопных газов кабинета, то время, которое для этого потребуется должна эмпирически определяться. Этот сушки шаг может занять около 4-8 ч для полного кабинета министров. - Уплотнения пластин с прозрачной пленки, а затем положить на тарелку крышки.
- Спиновые 96-луночных пробирного пластины для 45 s на 1000 x g.
- Хранить пластины, перевернутая при 25 ° C.
10. Озвучивание C. Elegans культур для долголетия
- Следить за отрицательный контроль пластин до > 95% смертности наблюдается. Проверьте пластины в неделю в течение первых двух недель и ежедневно после. Caenorhabditis когорты же штамм и видов отображения продолжительности жизни значительно отличаются суда17.
Примечание: Для жизни assay, описанных здесь, с TJ1060 животными выращиваются при 25 ° C, 95% смертности в этих популяциях произошла от взрослого день 16-20. - Когда отрицательный контроль скважины считаются достигли > 95% Марк, спина вниз все 96-луночных пробирного пластины для 45 s на центрифугу столешницы с Гонав приспособленным ротора (250 x g 45 s при 20 ° C).
- Оценка всех скважин в пластинах управления. Это делается путем подсчета и записи количество живых и мертвых животных в каждой скважине. Мертвых червей могут быть продифференцированным от живых червей их полное отсутствие движения. Спровоцировать движения в живой червей, сбрасывая 96 хорошо пластины из примерно 7см на поверхность рассечения Микроскоп глядя через окуляр для любой вызвал ответ. Мертвых червей не будет отвечать, и близлежащие лаборатории товарищей не могут оценить повторяющихся шум.
- Для тестирования пластин граф и запись только скважин, содержащие живые черви. Когда наблюдается живой червь, граф всех живых и мертвых животных в этом хорошо, наряду с хорошо позиции и пластины.
Примечание: Это часто полезно повторно набрать пластины после > 99% отрицательный контроль червей мертвы. В больших масштабах экраны это может быть лучший момент сделать первоначальный скоринга. В любом случае, оценка/повторно-score как описано выше
11. повторное тестирование соединения
- При тестировании только небольшое количество кандидатов соединений (< 320 соединений), как с Re-тест или кандидат экран (см. Представитель результаты), ограничить assay 32 Центральный скважин в попытке свести к минимуму последствия возможных пластины. Это оставляет 2 скважины ближе к краю плиты, неочищенные, но все же, содержащих агар, еда и червей.
Representative Results
Мы начинаем с изучения представитель результаты нанимать этот протокол для анализов 96-луночных продолжительность жизни. В первом примере, метод был использован для экрана через 30 000 химических веществ для успешного выявления химических веществ, которые продлить срок службы C. elegans и также включает результаты от последующего повторного тестирования экрана самых эффективных химических веществ с использованием тот же протокол. Эти результаты были ранее описанных1. Во втором примере используется тот же протокол на экране меньшего масштаба кандидат соединений.
Крупномасштабные экрана и Re-тест: Крупномасштабные экрана тестирования 30 000 соединений была исполнена на разовой дозы, в двух экземплярах. Поэтому в две скважины с ожидаемого общего поголовья 20 был испытан каждого химического вещества. Для этого в течение ~ 3 месяцев для покрытия всего 30 000 соединений были показаны три отдельные наборы 10000 соединений (в двух экземплярах). Это было сделано в части, чтобы обеспечить управляемым количество ручная биговка в конце пробирного и требуется в общей сложности 260 96-луночных пробирного пластин в каждом из наборов. В библиотеке запасов пластины только 80 скважин содержится комплекса; один реплицировать 10000 соединений делает 125 пробирного пластины. Это исследование используется 2 реплицирует пластинами 10 отрицательного контроля в каждом наборе. Для увеличения пропускной способности, пластины были забил когда отрицательный контроль населения были оценены пережили ~ 99% смертности. Все испытания скважин были затем рассмотрены для живой червей.
Химических веществ в скважинах с одной живой червь называли хитов. Химических веществ в скважинах, содержащие более 1 червь живы были также называется хитов и Кроме того все черви в этих скважинах (живых и мертвых) были подсчитаны для создания простой Оценка (процент живых Оценка; количество живых червей, деленное на количество мертвых червей). Каждого химического вещества, в библиотеке можно поэтому назвать хит дважды и эти хиты может, но не могут иметь результаты, связанные с ними. 512 различных химических веществ были вызваны хитов (по крайней мере один раз) на экране 30 000 соединений. Экрана была проведена с целью выявления мощным и/или надежный (воспроизводимость) про долговечность эффектов. Эти два различных свойства могут иметь различные эффекты. Сильнодействующих химических веществ может резко увеличить продолжительность жизни, в этом случае мы бы ожидать высокий процент червей, чтобы быть живым в хорошо что химическое. Для надежной химических веществ оба реплицирует будут иметь живые черви. Хит список занял на основе этих критериев. 179 химических веществ принесли рекорды процент жив, или пострадали в обоих реплицирует и поэтому были выбраны для повторного тестирования. Большинство оставшихся химических веществ, которые были под названием хитов, но не выбран для повторного тестирования, содержал только червячные одноступенчатые жив, в одном из реплицировать скважин.
Повторное тестирование хитов был выполненных, похожие на основной экран за исключением с 3 реплицирует (ожидаемый всего поголовья 30) и тщательного количественной оценки продолжительности жизни животных в необработанной контроль пластин. Эти изменения были добавлены для оказания помощи в сопоставлении испытаний и контроля скважин. 179 химических хитов были вновь приказал, разбавляют до 10 мм и переехал в 96 хорошо пластины. Только внутренняя 24 скважины были использованы для повторного тестирования assay (текущие версии этого протокола использовали бы внутренний 32 скважин как описано в разделе протокол для Re-тест экранов) и соединений были вновь протестированы в экземплярах с шестью отрицательный контроль пробирного пластинами лечить с помощью растворителя ДМСО. Один отрицательный контроль пластины периодически забил всего выживания (рис. 1А). Когда примерно 95% контрольных животных были мертвы, полностью забили все пластины (все лечение жить и мертвых червей были подсчитаны).
Для вызова хиты из результатов повторного теста, свертывании было принято на средний процент живых балл отрицательный контроль + 2 стандартных отклонений (SD). Для испытания скважин, в среднем процент живых (в то время забил) баллы были рассчитаны путем усреднения процента живых Оценка из трех реплицирует для каждой скважины. Для этого конкретного assay отрицательный контроль скважины средний процент живых оценки были рассчитана как среднее по три реплицирует для 48 скважин (2 комплекта тройные отрицательный контроль пластин). SD, используемый для вызова хитов от повторного испытания химического набора был SD через 48 отрицательный контроль в среднем процент ноты жив. Используя эту стратегию, это исследование показало 57 хитов от повторного тестирования библиотеки 179 соединений, демонстрируют, что положительный результат в общей сложности 32% повторного испытания химических веществ (рис. 1Б). Биннинга усредненной процента живых оценки для отрицательный контроль и испытания скважин указал, что испытания скважин превысил контроля скважин (рис. 1C).
Экран кандидата: Малых масштабах экраны могут быть выполнены в аналогии с повторной проверки, описанные выше. Здесь мы описываем результаты от кандидата экран с 139 соединений. Эти кандидаты были собраны как структуры способствуют долголетию. Для данного экрана мы провели 5 реплицирует тест пластин в двух разных дозах (50 мкм и 100 мкм). Кроме того мы использовали 8 отрицательный контроль пластин, с табличкой один положительный контроль (NP1), содержащий два различных доз; 50 мкм и 100 мкм.
Отрицательный контроль пластин наблюдали до ~ 90% животных были мертвы. В то время колодцы были забиты подсчета живых и мертвых червей на всех скважинах управления и от пробных скважин, которые содержали живут черви. Процент живых, в то время забил были использованы для расчета усредненной процента живых оценки для каждой скважины. Для отрицательных элементов управления 32 скважин были процента живых баллы от 8 реплицирует. Для положительных элементов управления были 4 хорошо баллов в среднем через 4 реплицирует для каждой дозы. Ответы были вызваны для скважин с усредненной процента живых оценка, которая была больше, чем среднее отрицательный контроль % живых Оценка + 2 ур. Этот отсечки осталось 14 хитов от кандидата экрана и исключить все негативные контроля скважин. Что отсечки также включены все позитивные контроля скважин, пролеченных в 100 мкм и 50% положительных элементов управления рассматриваются в 50 мкм. Эти результаты представлены здесь как сегментирования в среднем процент живых ноты для 50 мкм(рис. 2)и 100 мкм (рис. 2B) тест экранов.
Наконец, все пластины были вновь забил в поздний момент времени, который соответствует времени когда больше чем 99% отрицательного контроля лечить животных были мертвы. Эти результаты показывают, что положительный контроль скважины далеко вне выполнена отрицательный контроль и испытания скважин (рис. 2C). Хотя испытания скважин были немного лучше, чем негативные элементы. Этот последний результат является предвзятым путем указания, что, как представляется, многие из пробных скважин токсичности по отношению к управления лечения (Таблица 1), тем самым смешанным это простое толкование. Это было ожидать, так как библиотека кандидат был правда экран химических веществ с неизвестным биологической активности в C. elegans, в то время как повторно проверить экран был по существу предварительно отобранных для соединений, которые не являются токсичными. Поскольку это основной экран для соединений, которые удлиняют продолжительность жизни, значительно токсичных химических веществ следует не в Re-тест установлены.
Рисунок 1 : Представитель результаты от высокой пропускной способности экрана и повторного тестирования
(A) выживания кривой от представителя отрицательный контроль пластины, используемые в assay повторного тестирования. Эта кривая была построена из озвучивание всех живых и мертвых червей в 24 скважины, используемые в этот assay 4 раза в течение 18 дней проба. На 18 день совершеннолетия контроля были оценены иметь ~ 5% выживания и все управления тест и пластины были также забил. (B) таблицы по итогам экрана и повторного тестирования. (C) Binning скважин в среднем процент живых баллов для контроля и тестирования условий от повторного тестирования экрана. Для элементов управления оценки от 48 скважин каждый состоящий из среднее 3 реплицирует. Результаты теста из 179 скважин каждый состоящий из усредненной Оценка из трех реплицирует. На рисунке 1 приводится от предыдущей публикации1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Представитель результаты от кандидата экрана
(A) Binning результатов из экрана кандидат 50 мкм. 139 результатов теста ну представляют усредненной процента живых Оценка от 5 реплицирует. 32 результатов негативного контроля состоят из усредненной процента живых ноты от 8 реплицирует. 4 положительный контроль результаты состоят из усредненной процент живым ноты от 4 реплицирует (16 всего скважинах содержащих NP1 при 50 µM). (B) Binning результатов из экрана кандидат 100 мкм. Все это же, как (A), за исключением того, что испытания скважин и позитивные элементы рассматривались в концентрациях 100 мкм. Же отрицательный контроль пластин указаны как (A и B). (C) представитель результаты от вновь забил пластины в относительно крайних поздний момент времени. Позитивные элементы значительно превосходит всех остальных, если просто приходится % скважин с живой червей в этот момент времени, который является предвзятым против испытания скважин, как описано в основной текст и таблицу 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Биннинга усредненной процента живых баллов | ||||||
| Сгруппированные результаты | Все мертвых (0) | 1-10 | 11-20 | 21-30 | 31-40 | > 41 |
| Re-тест | ||||||
| # (-) управления | 16 | 31 | 1 | 0 | 0 | 0 |
| # Испытания скважин (50µм) | 46 | 69 | 50 | 8 | 3 | 3 |
| Кандидат экран | ||||||
| # (-) управления | 0 | 11 | 21 | 0 | 0 | 0 |
| # (+) управления (50µм) | 0 | 0 | 2 | 2 | 0 | 0 |
| # (+) управления (100µM) | 0 | 0 | 0 | 0 | 2 | 2 |
| # Испытания скважин (50µм) | 94 | 22 | 21 | 2 | 0 | 0 |
| # Испытания скважин (100µM) | 86 | 25 | 21 | 6 | 1 | 0 |
Таблица 1: Представитель результаты от сегментирования различных экранов
Здесь мы представляем биннинга усредненной процента живых оценки от двух экранов (Re-тест и кандидат). В окне повторного тестирования, пик похож на отрицательный контроль с повторного испытания, опередив негативные управления резко на право (долгоживущих) стороне таблицы. Это указывает на присутствие нескольких про долголетие соединений, присутствующих в наборе повторного тестирования. Кандидат на экране мы видим, что пик находится в всех мертвых категории, хотя есть также очевидной сигнал из правой части таблицы. Это указывает на присутствие про долговечность соединений в наборе кандидата, но также указывает на наличие значительных токсичности среди множества кандидат соединений.
Discussion
Здесь мы описали простой метод для культивирования C. elegans в 96-луночных пластины. Мы опишем эти культуры для использования химического скрининга и продолжительность жизни анализов, но они могут быть использованы для многих видов анализов. Хотя несколько хорошо культуры условия для химического скрининга ранее сообщалось8, включая продолжительность жизни анализ10, assay, описанные здесь отличается несколькими способами. Продолжительность жизни описанных здесь использует 96-луночных пластины, опирается на стерильную мутантов (вместо химической стерилизации), использует условий культуры агара, использует простой жидкости, обработка для перемещения червей и вручную забил в конечной точке. Различные подходы, используемые в этот assay может быть помощь исследователи искали методы, которые включают эти условия фильтрации.
Важнейшими элементами настоящего протокола главным образом центр на качество плит производится для assay. Во-первых при принятии плит важно, что на поверхности агара бесплатно пузыри и другие несовершенства. Эти вариации на поверхности агара почти всегда приводят к роющих и потери скважины. Во-вторых этот протокол основывается на высыхания жидкости на хранение на этапах установки и наркотического опьянения. Важно, что эти жидкости полностью удаляются, но агар не стать высохли. Занимательно, похоже, что черви в скважинах, которые не являются полностью высушить (плавание в жидкости) живут дольше, чем надлежащим сушеные скважин, в то время как чрезмерное сушки пластин приводит к высыхания и растрескивания агар, что приводит к червей рыться и потери. Еще одним важным элементом настоящего Протокола является обеспечение стерильных условиях. Как с любой срок assay, есть много работы с установки плиты, и много возможностей и времени существуют для assay губит загрязнения урегулировать и расти на тарелках.
В то время как продолжительность жизни assay, описанные здесь полезен для проверки соединений в C. elegans, оно ограничивается частности генетических особенностей, как он полагается на Стерильные штамм температуры чувствительных (ts); Мы использовали TJ1060, который имеет высокий стерильности пенетрантностью. Это ограничивает для скрининга штаммов с помощью этого метода. Альтернативные подходы, включая пересечение ts стерильные мутации в желаемый фон или с помощью химической стерилизации. Мы не пытались химической стерилизации с этот assay, но оно должно быть возможным. Потенциальные препятствия включают в себя размещение стерилизатора на червей, на правильной стадии и в правильной дозе. Протокол, в описанный здесь использует жидкого мыла, что быстро, но как представляется, не эффективно распределять взрослых. Таким образом эти черви развивать на тарелках и поэтому должны рассматриваться с стерилизации химическим на тарелках. Определение оптимальной дозы и времени бы важное значение для успеха. Альтернативные стратегии включают в себя использование дозирования метод, который можно перемещать взрослых. В прошлом мы нашли, что машины для выявления и сортировки взрослых обычно гораздо медленнее, чем простой жидкости обработчики, которые могут обойтись однородной суспензии взвешенных личинки.
В общем мы используем этот метод быстро экран химических веществ и лечения для большое положительное влияние на продолжительность жизни. Метод особенно эффективен, когда используется с несколькими дозами, высокий реплицировать чисел и тщательный мониторинг негативных элементов управления, которые всегда поддерживали и перемежаются среди пластины теста. Позитивные элементы полезны также при разработке и осуществлении экраны, описанные в этой рукописи. Однако чтобы быть эффективным положительный, элемент управления необходимо будет достаточно мощным и/или высокую прочность. Когда экран была первоначально развернута, обладающих мощным и надежные соединения не может быть идентифицирован. В настоящее время есть много сообщений в литературе «старения» вероятными кандидатами для положительных элементов управления полезны в экраны, описанных здесь. Как описано в разделе экран кандидат секции ожидаемые результаты по этой рукописи и на рисунке 2 и в таблице 1, составные NP1 является эффективный положительный контроль для этого экрана. Мы обычно подтверждают положительные хиты из этих экранов с Стандартный срок анализов на 3 мм культуры пластин.
Disclosures
Авторы заявляют, что не финансирующий орган поддержки этой работы любой ввод на сбор данных, анализ результатов или решение опубликовать.
Acknowledgments
Мы благодарим Дипа Bhaumik, Аарон Миллер и Боб Хьюз для оказания технической помощи. Штаммы были предоставлены CGC, которая финансируется Управлением NIH инфраструктуры научно-исследовательских программ (P40 OD010440). Мы благодарны Грузии леса и членов Литгоу, Kapahi и Melov лабораторий для полезных обсуждений. Л. был поддержан национальных институтов здравоохранения (НИЗ) обучения Грант T32 AG000266 и Эллисон медицинский фонд/Американской Федерации из старения после стипендий. Эта работа была поддержана грантом от BioAge Labs, Грант Ларри л Hillblom фонда, а также национальных институтов здравоохранения предоставляет UL1024917, поддерживая Междисциплинарный исследовательский консорциум по Geroscience и 1R01AG029631-01A1 для G.J.L.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB Broth Miller Granules | VWR | ||
| Unispense | Wheaton Science Products | automated fluid dispensing apparatus | |
| 96 well assay plate; COSTAR 3370 | Corning | ||
| Multidrop 384; automated 8 channel dispenser | Thermo Fisher Scientific | ||
| manufactored worm pick | Genesee Scientific | ||
| Belly Dancer Orbital Shaker | Stovall Life Science inc. | ||
| microplate shaker; MTS 2/4 Digital | IKA Works, inc. | ||
| automated 96-well liquid handler; Biomek FX Liquid Handler | Beckman Coulter | ||
| automated 96-well liquid handler; Bench Top Pipettor | Sorenson Bioscience, inc. | ||
| manual 8 or 12 multi-channel pipettes | we use rainin… | ||
| transparent 96 well film cover; TempPlate RT Optical Film | USA Scientific | ||
| table top centrifuge; Centrifuge 5810 R | Eppendorf |
References
- Lucanic, M., et al. Chemical activation of a food deprivation signal extends lifespan. Aging Cell. , (2016).
- Evason, K., Huang, C., Yamben, I., Covey, D. F., Kornfeld, K. Anticonvulsant medications extend worm life-span. Science. 307 (5707), 258-262 (2005).
- Melov, S., et al. Extension of life-span with superoxide dismutase/catalase mimetics. Science. 289 (5484), 1567-1569 (2000).
- Benedetti, M. G., et al. Compounds that confer thermal stress resistance and extended lifespan. Exp Gerontol. 43 (10), 882-891 (2008).
- Hansen, M., Hsu, A. L., Dillin, A., Kenyon, C. New Genes Tied to Endocrine, Metabolic, and Dietary Regulation of Lifespan from a Caenorhabditis elegans Genomic RNAi Screen. PLoS Genet. 1 (1), 17 (2005).
- Lee, S. S., et al. A systematic RNAi screen identifies a critical role for mitochondria in C. elegans longevity. Nat Genet. 33 (1), 40-48 (2003).
- Samuelson, A. V., Carr, C. E., Ruvkun, G. Gene activities that mediate increased life span of C. elegans insulin-like signaling mutants. Genes Dev. 21 (22), 2976-2994 (2007).
- Kwok, T. C., et al. A small-molecule screen in C. elegans yields a new calcium channel antagonist. Nature. 441 (7089), 91-95 (2006).
- Petrascheck, M., Ye, X., Buck, L. B. A high-throughput screen for chemicals that increase the lifespan of Caenorhabditis elegans. Ann N Y Acad Sci. 1170, 698-701 (2009).
- Solis, G. M., Petrascheck, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates. J Vis Exp. (49), (2011).
- Angeli, S., et al. A DNA synthesis inhibitor is protective against proteotoxic stressors via modulation of fertility pathways in Caenorhabditis elegans. Aging (Albany NY). 5 (10), 759-769 (2013).
- Fabian, T. J., Johnson, T. E. Production of age-synchronous mass cultures of Caenorhabditis elegans. J Gerontol. 49 (4), 145-156 (1994).
- Greer, E. L., Brunet, A. Different dietary restriction regimens extend lifespan by both independent and overlapping genetic pathways in C. elegans. Aging Cell. 8 (2), 113-127 (2009).
- Mair, W., Panowski, S. H., Shaw, R. J., Dillin, A. Optimizing dietary restriction for genetic epistasis analysis and gene discovery in C. elegans. PLoS One. 4 (2), 4535 (2009).
- Hamilton, B., et al. A systematic RNAi screen for longevity genes in C. elegans. Genes Dev. 19 (13), 1544-1555 (2005).
- Frankowski, H., et al. Dimethyl sulfoxide and dimethyl formamide increase lifespan of C. elegans in liquid. Mech Ageing Dev. 134 (3-4), 69-78 (2013).
- Lucanic, M., et al. Impact of genetic background and experimental reproducibility on identifying chemical compounds with robust longevity effects. Nat Commun. 8, 14256 (2017).
