Summary
Här beskriver vi ett enkelt protokoll för att snabbt producera hundratals nematoder tillväxt medier agar, 96 brunnar kultur plattor med konsekvent antal Caenorhhabditis elegans per brunn. Dessa kulturer är användbara för fenotypisk screening av hela organismer. Här fokuserar vi på att använda dessa kulturer till skärmen kemikalier för Pro livslängd effekter.
Abstract
Caenorhabditis elegans är en användbar organism för att testa kemiska effekter på fysiologi. Hela organismen småmolekylära skärmar erbjuder betydande fördelar för att identifiera biologiskt aktiva kemiska strukturer som kan ändra komplexa fenotyper som livslängd. Beskrivs här är ett enkelt protokoll för att producera hundratals 96 brunnar kultur plattor med ganska konsekvent antal C. elegans i varje brunn. Nästa, vi specificerat hur man använder dessa kulturer till skärmen tusentals kemikalier för effekter på livslängd av Nematoden C. elegans. Detta protokoll använder sig av temperatur känslig sterila stammar, agar plattan villkor och enkel djurhantering för att underlätta snabb och hög genomströmning produktion av synkroniserade djur kulturer för screening.
Introduction
Här beskrivs ett protokoll som utvecklats för hög genomströmning screening av kemiska föreningar för effekter på Caenorhabditis elegans livslängd. Själva protokollet kan lätt anpassas till andra fenotypiska skärmar, inklusive studier utnyttjar reporter C. elegans stammar. Detta protokoll var framgångsrikt utnyttjas för att identifiera en roman biologiskt aktiva förening, NP1 (nitrofenyl-piperazin 1), som starkt förlänger livslängden på C. elegans genom en mekanism som dietrestriktioner. NP1 och en karakterisering av dess effekt på livslängden, inklusive en beskrivning av de genetiska vägarna på lek, var tidigare beskrivs på annan plats1. Rapporten innehåller också en beskrivning av resultaten från en storskalig implementering av skärmen. Här beskriver vi i mycket större detalj metod och installationen av själva skärmen, som är skalbar för såväl små - och storskaliga tillämpningar.
Målet som ledde till skapandet av det protokoll som beskrivs här var att utveckla en plattform för kultur av C. elegans som tillåts för snabb screening av stora kemiska bibliotek för nya biologiskt aktiva föreningar. Medan kemiska skärmar har utförts före utvecklingen av detta protokoll, dessa var främst småskaliga eller kandidat typ närmar sig2,3. Faktiskt, de flesta av de skärmar som utförs i labbet på tiotals föreningar utnyttjas stress motstånd analyser, med hits som screenas för livslängd effekter4. Denna studie försökte istället direkt skärmen för livslängd effekter. Anmärkningsvärt, fanns det några beskrivningar i den vetenskapliga litteraturen vid tidpunkten för utför storskaliga kemiska skärmar med C. elegans. Ja, jämfört med andra typer av skärmar5,6,7, storskalig kemisk undersökning med C. elegans tycktes vara undersysselsatta.
Det fanns två beskrivningar av storskaliga kemiska skärmar i C. elegans som användes som underlag för att utveckla detta tillvägagångssätt. Först av dessa var en elegant studie från Peter Roys laboratoriet använder kemiska skärmar för att identifiera ämnen som kan störa utvecklingen av djur. Studien följde sedan upp med en framåt mutagenes skärm att identifiera de genetiska målen för dessa kemikalier8. Protokollet beskrivs i denna studie används 24-väl pastejer, vilket var helt enkelt omöjligt för denna studiens specifika behov (begränsade mängder av kemikalien i biblioteket och begränsade tillgängliga inkubator utrymme). Den andra studien var Michael Petraschecks innovativa och ambitiösa småmolekylär skärm för livslängd som sträcker sig kemikalier9,10. Denna studie använde 384 brunnar och flytande kulturer. Den andra viktigaste funktionen på den här skärmen var användningen av FUDR (5-fluorodeoxyuridine) kemiskt hämma avkomma produktion. Efter stort övervägande av protokollet beskrivs i studien, undveks både kemisk sterilisering och flytande kulturer av C. elegans .
Även om FUDR används ofta i C. elegans livslängd experiment, fanns det farhågor att FUDR kan orsaka oförutsedda läkemedelsinteraktioner eller att FUDR själv kan ha viss effekt på livslängden. Nyligen har denna sistnämnda oro validerats, åtminstone på vissa koncentrationer och i synnerhet vid 25 ° C11. För att kringgå problemet med avkomma föroreningen, C. elegans stam TJ1060 användes, som hamnar två oberoende temperatur känslig mutationer (spe-9 (hc88) I; rrf-3(b26)II) att avskaffa spermieproduktionen och har visat sig vara användbart för massa kulturer av synkron populationer12. Denna stam var helt steril vid 25 ° C, men kommer att producera avkomma när odlade på 15-20 ° C. Denna studie använde konventionell odlingsbetingelser, med maskar kryper på ytan av agar, som resultat av flytande kulturer inte är alltid reproducerbar med konventionella agarplattor. Medan detta fenomen inte är helt klarlagda, har det visats att maskar odlade i flytande svara på DR (dietrestriktioner) på ett annat sätt än maskar odlade på standardmedia13,14. Det är därför rimligt att flytande media kunde dölja vissa DR mimetika som annars skulle identifieras med skärmen.
Efter att ha avgjort på agar odlingsbetingelser, ansågs olika alternativ för poängsättning prestanda för brunnar i denna analys. Medan olika automatiserade eller imaging baserade analyser var tillgängliga, krävde de förvärv och distribution av tekniskt utmanande enheter, varav de flesta var oöverkomligt dyra. Samtidigt överväger dessa alternativ, var det nödvändigt att hänvisa till tidigare livslängd skärmar av alla typer. Slutligen, denna studie användes en poängsättningsmetod anpassad från Siu Sylvia Lee Labbets hela genomet RNAi skärmen för livslängd fenotyper15. Specifikt, alla livslängd plattor sattes upp på samma sätt, men endast de negativa kontrollerna övervakades. När de negativa kontrollplattor bekräftades för att ha nära komplett dödlighet, var testplattorna gjorde för hand. I denna storskaliga skärm bekräftades positiva åter testa med nylagade kemikalier, använder tre exemplar repetitioner av de primära positiva.
Protocol
1. förbereda buffertar
-
LB buljong
- Använd färdigblandat granulat (se Material tabell) och följ tillverkarens protokoll för beredning.
-
Nematoder tillväxt medier (NGM) Agar
- Blanda 23 g agar, 3 g NaCl, 2,5 g bacto pepton och avjoniserat vatten till 0.972 L. autoklav och låt svalna till 60 ° C, tillsätt därefter 25 mL 1 M kalium (KPO4) fosfatbuffert (pH 6.0), 1 mL 1 M magnesiumsulfat (MgSO4) , 1 mL 1 M kalciumklorid (CaCl2) och 1 mL av 5 mg/mL kolesterol (i etanol).
-
Hypokloritlösning
- Blanda 5 mL 5 M KOH, 4 mL natriumhypokloritlösning (6%) och avjoniserat H2O till en total volym om 50 mL.
-
S basala
- Blanda 5 g NaCl, 1 g K2HPO4, 6 g KH2PO4och avjoniserat vatten till 1 L, sedan autoklav.
2. beredning av koncentrerad E. coli (OP50)
Obs: Detta steg koncentrat 1 L av en mättad E. coli lösning till 25 mL S basala buffert.
- Inokulera 5 mL Ånghärdad LB buljong (steg 1.1) med en enda koloni av E. coli (stam OP50) och inkubera i 4-6 h vid 37 ° C under skakning (250 rpm). Använda 0,1 mL av denna lösning för att Inokulera 1 L av LB i en 2 L Erlenmeyerkolv. Inkubera i 1 L flaskor över natten (12-16 h) vid 37 ° C under skakning (250 rpm).
- Centrifugera 1 L övernattning kulturer i 500 mL centrifug flaskor för 5 min på 10.000 x g och 4 ° C till pellet bakterierna och Dekantera bort återstående media. Återsuspendera pelleten i 25 mL S Basal (steg 1.4). Förvaras vid 4 ° C.
3. beredning av NGM kultur plattor
- För masskultur plattor används för att producera ett stort antal maskar, fördela 30 mL av smält (60 ° C) NGM agar (steg 1.2) i ett skåp på 10 cm kultur plattor med en automatiserad vätska tubens apparat eller serologiska pipett laminär. Låt torka över natten.
- Överför med pipett 2 mL koncentrerad OP50 på varje 10 cm tallrik, sprida för att helt täcka agar ytan genom att luta och vrida plattan, sedan låta plattorna torka. Förvara tallrikar vid 4 ° C i upp till 2 veckor.
- För hög genomströmning assay kultur plattor används för screening, använda en automatiserad 8 kanal dispenser för att fördela 0,15 mL av smält NGM agar i varje brunn 96 väl platta i ett skåp med laminärt flöde. Använd försiktighet att göra säker på brunnar saknar bubblor, eftersom dessa kommer att aktivera grävande av maskar som kommer att äventyra analysen i det väl. Låt torka över natten. Förvara tallrikar vid 4 ° C i upp till 2 veckor.
4. beredning av temperatur känslig (ts) steril C. Elegans massa kulturer
- För att starta kulturerna, med en 'mask plocka' (glas pipett med en bifogad platina tråd eller en tillverkade mask plocka) i dissekera Mikroskop, överföra 20 ägg (stam TJ1060: spe-9 (hc88) I; rrf-3(b26)II) på masskultur skylt(ar) bereddes i steg 3.1. Sedan, inkubera plattorna vid 20 ° C i 6 dagar (tillåter mer än en generation av tillväxt, som du riktar dig för insamling av avkomman av de 20 ägg flyttade).
- Visuellt bekräfta närvaron av dräktig vuxna (ägg i livmodern) med dissekera Mikroskop. Samla de dräktiga vuxna genom att fördela 2-3 mL S basal på plattan med glas pipett. Swirl vätskan runt plattan för hand och sedan samla in vätskan i en 15 mL tub med glas pipett.
- Snurra ner röret (1 000 x g för 1,5 min vid 20 ° C) till pellet maskar, då aspirera av supernatanten. Tillsätt 10 mL hypokloritlösning (steg 1.3) till mask pelleten och snabbt skaka röret för hand i en topp-till-botten riktning för 5 s. Inkubera i 5 min, skaka varje 2,5 minuter.
- Igen, snurra ner röret (1 000 x g för 1,5 min); pelleten bör gulbruna. Aspirera av supernatanten. Tillsätt 10 mL hypokloritlösning till ägg pelleten och skaka röret. Inkubera i 1-3 min, med enstaka skakar, och samtidigt övervaka utseende med mikroskopet dissekera. Visuellt bekräfta endast ägg finns kvar och fortsätta till nästa steg.
- Snurra ner röret (1 000 x g för 1,5 min) och aspirera av supernatanten. Pelleten bör vara vit med ingen brunfärgning.
Obs: Efter avlägsnande av hypoklorit lösningen, är det viktigt att använda sterila tekniker och buffertar, sedan kontaminering (bakterie- och svampinfektioner, i synnerhet) kan förstöra experimentet, slösa värdefull tid och reagenser. Denna studie använde en filtrerad laminär skåp och flyttade vätskor med endast sterila pipetter och tips. - Öppna rören i en steril utrymme. Tvätta pelleten 3 gånger med S basala, spinning ner (1000 x g för 1,5 min) och aspirera bort supernatanten varje gång. Re centrifugerade ägget i 2-3 mL S basala. Dessa ägg kan nu användas för en övernattning hatch i buffert för att samla L1 larv (steg 5).
5. kläckägg för C. Elegans i buffert att få synkron kulturer (förbereda L1 larver C. Elegans )
- Häll upp de ägg pellet och buffert i en steril glas petriskål med kåpa. Skölj de resterande äggen från röret i en skål med serologiska pipett med 2-3 mL S basala. Tillsätt 5 mL S basala att lindra trängsel, eftersom detta kan uppmuntra kläckningen som lyser skakar (20 rpm med en magdansös orbital shaker). Inkubera över natten vid 20 ° C, ägg att hinna till lucka (16-24 h). Alla ungar kommer att arrestera på den 1st larvstadium (L1) på grund av avsaknad av mat.
Obs: Anekdotiska bevis indikerar att färska L1 preparat (16-36 h efter insamling av ägg) genererar mest synkron populationerna av vuxna maskar. - Samla L1s i en 15 mL tub med serologiska pipett. Snurra ner L1s i en centrifug (1 000 x g för 1,5 min), aspirera bort supernatanten och upprepa tills alla L1s har samlats in från kläckning plattor, samtidigt som den lämnar 10 mL S basala för nästa steg.
- Från röret som innehåller L1s, mikropipett ut 0,01 mL (omedelbart efter blandning) och fördela det på en unseeded (ingen E. coli) NGM plattan. Räkna antalet L1s på plattan. Upprepa 10 gånger och få ett genomsnitt för antalet L1s i varje delprov. I allmänhet räkna med mellan 1-3 L1s per µL (när start med 1 masskultur platta innehållande 20 ägg).
- Bestäm med serologiska pipett volymen av S basala holding L1s. Sedan extrapolera med beslutsamma Genomsnittligt antal maskar per 0,01 mL, erhållits i föregående steg, att uppskatta det totala antalet L1s. I allmänhet räkna med mellan 10 000-30 000 L1s (per masskultur platta innehållande 20 ägg).
- För att använda denna kultur i 96 brunnar assay, späd L1 suspensionen till 1 L1 per µL i en steril runda media flaska, sedan gå vidare till steg 7. Om denna kultur är att användas för att generera ytterligare C. elegans samlas kulturer, sedan gå vidare till steg 6.
6. stor skala synkron kultur förberedelse
Obs: L1 lösningar kan användas för att snabbt öka mask populationer.
- För att generera stora mask nummer med en L1 lösning, dosera upp till 5.000 L1s på varje önskat antal masskultur plattor. Samla dräktig vuxna 2,5 dagar senare (20 ° C) som beskrivs i steg 4.1-2, och fortsätt till steg 4.3 att samla ägg.
- Som det anekdotiskt har observerats att upprepade hypoklorit samling kan betona underkuvade befolkningen, split populationer av ägg plocka för förökning före att utsätta den resterande befolkningen till hypoklorit behandlingar, så att flera generationer av befolkningen utsätts inte upprepade gånger för hypoklorit lösning behandling.
7. inställning av 96 brunnar Assay plattor
- Tillåta assay plattorna (bereddes i steg 3.3) nå rumstemperatur. Sedan, i ett laminärt flöde skåp, tillsätt 5 µL av koncentrerad OP50 (bereddes i steg 2.2) till varje brunn. Som tidigare, använda en automatiserad 8 kanal-dispenser.
- Tillsätt 10 µL av L1 suspensionen till varje brunn med hjälp av en automatiserad 8 kanal-dispenser. Detta kommer att ge på genomsnittet 10 maskar per brunn, eftersom de är närvarande i avstängning vid 1 L1 per µL. För att främja lika fördelning av L1s från slam, fördela L1s från en runda media flaska aktivt blandat med en måttligt långsamt stänga uppståndelse bar.
- Täckplatta med lock, box partier av tallrikar, och inkubera vid 25 ° C i 2 dagar.
8. behandling av 1 st dag vuxen C. elegans med kemikalier
- Ta bort kemiska bibliotek plattor från frysen, och låta plåtar nå rumstemperatur innan du fortsätter.
Obs: Kemiska bibliotek plattorna som beskrivs här är 96 plattor som innehåller diskret föreningar i varje brunn, varav alla är på samma koncentration och upplöst i DMSO. Dessa bibliotek utnyttja inte yttre kolumnerna, och så varje platta har högst 80 olika kemikalier. I protokollet som beskrivs här, är bibliotek koncentrationen 10 mM. Det är viktigt att överväga lösningsmedel effekter på fenotyper. Medan denna studie-skärmar på en DMSO koncentration av 0,5% överskreds aldrig denna nivå i dessa livslängd analyser och låg genomströmning analyser, där det är mer sannolikt att plocka en sammansatta stamlösningens koncentration. Detta protokoll överstiger inte 0,25%, vilket är en nivå vid vilken livslängd ändringar inte förekommer16, åtminstone i N2 stam. - Skaka försiktigt plattan vid 60 rpm på en mikroplattan shaker för 1 min omedelbart före användning.
- Använda en automatiserad 96 brunnar flytande handler, överföring 0,75 µL av förening (eller DMSO) från biblioteket plattan till assay plattan. Djupet av pipetten under flytande leverans till assay plattan styrs noggrant, så att pipettspetsarna av flytande hanteraren levererar 0,75 µL volymen till de ~ 15 µL vätska på ytan av agar (med maskar och koncentrerad OP50 från steg 7,1 -2) och inte hål i agar ytan i brunnen. Använd inte Handbok 8 eller 12 Multi-Channel pipetter utom i mycket små skärmar (< 10 plattor), eftersom de kan öka fel och leder ofta punktering av agar ytan, vilket äventyrar analysen.
- Förbereda kemiska bibliotek negativa kontrollplattor med DMSO (dimetyl sulfoxid), förutsatt att biblioteket som testas använder DMSO som lösningsmedel. Gör 1 negativ kontroll platta för varje 5 testa plattor, upp till 10 negativa kontrollplattor. Om möjligt också göra en positiv kontroll platta (NP11 på 20 mM, för en sista analys koncentration av 0,1 mM, är effektiv för detta ändamål, se representativa resultat). Lägg inte till kemikalier (provning eller kontroll) till 2 exteriör kolumner av pläterar, som de är särskilt känsliga för uttorkning.
9. torkning kulturer
- Ta bort vätska från ytan av agar, torka plattorna i laminärt flöde skåp för 4-8 h. Det är viktigt att dessa plåtar torkas helt men inte blir uttorkad. Eftersom vissa plattor kommer att ta längre tid att torka än andra, noga övervaka alla plattor och ta bort så fort de är torra. Bekräfta torkning av visuell inspektion av de enskilda brunnarna i plattan.
Obs: Beroende på faktorer som inkluderar andelen avgaser på skåpet, den tid detta tar empiriskt bestämmas. Detta snabbtorkande steg kan ta ca 4-8 h för en full skåp. - Seal-plattor med genomskinlig film, sedan lägga på plattan locken.
- Snurra 96 brunnar assay plattorna för 45 s vid 1 000 x g.
- Förvara tallrikar inverterad vid 25 ° C.
10. scoring C. Elegans kulturer för livslängd
- Övervaka negativa kontrollplattor tills > 95% dödlighet observeras. Kontrollera plattor per vecka för de första två veckorna och dagligen därefter. Caenorhabditis kohorter av samma stam och arter kan visa betydligt olika livslängder genom rättegång17.
Obs: För livslängd analysen beskrivs här, med TJ1060 djur odlade vid 25 ° C, 95% dödlighet i dessa populationer har uppstått från vuxen dag 16-20. - När negativa kontrollbrunnar anses ha nått den > 95% mark, snurra ner alla 96 brunnar assay plattor för 45 s på en bordsskiva centrifug med en mikroplattan anpassade rotor (250 x g för 45 s vid 20 ° C).
- Poäng alla brunnar i kontroll tallrikar. Detta görs genom att räkna och registrera antalet levande och döda djur i varje brunn. Döda maskar kan skiljas från levande maskar genom fullständig avsaknad av rörelse. Provocera rörelse i levande maskar genom att släppa 96 väl plattan från ca 7 cm på dissekera Mikroskop yta medan du tittar genom okularet för någon evoked response. Döda maskar svarar inte och närliggande lab kompisar kanske inte uppskattar det repetitiva bullret.
- För testplattorna, räkna och anteckna endast brunnar innehållande levande maskar. När en levande mask observeras, räknas alla levande och döda djur i det väl, tillsammans med väl position och plattan.
Obs: Det är ofta användbart att åter Poäng plattorna efter > 99% av negativ kontroll maskar är döda. I stor skala skärmar, kan detta vara den bästa punkten att göra inledande scoring. I båda fallen Poäng/re-score enligt ovan
11. åter testa föreningar
- När du testar endast ett litet antal kandidat föreningar (< 320 föreningar), som med ett nytt test eller en kandidat skärm (se representativa resultat), begränsa analysen till 32 centrala brunnarna i ett försök att minimera möjliga plattan effekter. Detta lämnar 2 brunnarna närmast kanten av plattan obehandlad men fortfarande innehållande agar, mat och maskar.
Representative Results
Vi börjar med att undersöka representativa resultat från att anlita detta protokoll för 96 brunnar livslängd analyser. I det första exemplet användes metoden att sålla igenom 30 000 kemikalier för att framgångsrikt identifiera kemikalier som utökar livslängden på C. elegans, och innehåller också resultat från uppföljning testa skärmen av de bäst presterande kemikalier använder den samma protokoll. Dessa resultat var tidigare beskrivna1. Det andra exemplet använder samma protokoll i en mindre skala skärm av kandidat föreningar.
Storskaliga skärmen och testa: Skärmen storskalig testning 30.000 föreningar utfördes i en dos, i två exemplar. Varje kemikalie testades därför i två brunnar med en beräknade totala djurpopulation 20. För att åstadkomma detta, screenades tre diskreta uppsättningar av 10 000 föreningar (i dubblett) över ~ 3 månader att täcka hela 30 000 föreningar. Detta skedde delvis, för att säkerställa en hanterbar mängd manuella räknandet i slutet av analysen och krävs sammanlagt 260 i 96 brunnar assay plattorna i set. I biblioteket lager plattor, endast 80 brunnar innehöll förening; en testmetod för 10.000 föreningar gör 125 assay plattor. Denna studie använde 2 replikat med 10 negativa kontrollplattor i varje set. För att öka dataflödet, var tallrikar gjorde när negativa kontrollen populationer bedömdes att ha upplevt ~ 99% dödlighet. Alla test brunnar undersöktes sedan för levande maskar.
Kemikalier i brunnar med en levande mask kallades träffar. Kemikalier i brunnar som innehåller mer än 1 mask vid liv var också kallas hits, och dessutom alla maskar i dessa brunnar (levande och döda) räknades för att generera en enkel Poäng (procent levande poäng, antalet levande maskar dividerat med antalet döda maskar). Varje kemikalie i biblioteket skulle därför kunna kallas en hit två gånger och de träffar kunde, men kanske inte, har noter som är associerade med dem. 512 distinkta kemikalier kallades träffar (minst en gång) från skärmen på 30.000 föreningar. Skärmen utfördes med avsikt att identifiera potent och/eller robust (reproducerbara) Pro livslängd effekter. Dessa två olika egenskaper kan ha olika effekter. Potenta kemikalier kan dramatiskt öka livslängd, i vilket fall vi förväntar oss en hög procent av maskar att vara vid liv i det kemiska ämnets väl. För robust kemikalier förväntas båda replikat ha levande maskar. Träfflistan rankades baserat på dessa kriterier. 179 av kemikalierna som gett höga procent levande poäng, eller drabbades i båda replikat och valdes därför för åter testa. De flesta av de återstående kemikalier som kallas träffar, men som inte valts för att åter testa, hade bara innehållit en enda mask som lever i en av replikera brunnarna.
Åter testa av träffarna var utfört, liknar den primära skärmen utom med 3 replikat (beräknade totala djurpopulation 30) och försiktig kvantifiering av livslängder av djuren i kontrollgrupp plattorna. Dessa ändringar har lagts till stöd i jämförelse test- och brunnarna. 179 av de kemiska hitsna var åter beställas, utspädd till 10 mM och flyttade in i plattor med 96. Endast inre 24 brunnarna användes för re-test analysen (nuvarande versioner av detta protokoll skulle ha använt inre 32 brunnarna som beskrivs i avsnittet protokoll för re-test skärmar) och föreningar var åter testade i tre exemplar med sex negativa kontrollen assay plattor behandlas med DMSO lösningsmedel. En negativ kontroll platta var gjorde regelbundet för total överlevnad (figur 1A). När cirka 95% av djuren i kontrollgruppen var döda, alla plåtar var helt gjorde (alla behandlade levande och döda maskar räknades).
För att ringa träffar från testa resultaten, gjordes en cut-off på procent levande medelpoängen av de negativa kontrollen + 2 standardavvikelserna (SD). I genomsnitt procent vid liv (vid tiden för scoring) för test brunnar, score beräknades som genomsnittet i procent levande Poäng från tre replikat för varje brunn. För denna särskilda analys, negativ kontroll wells genomsnittlig procent levande noter beräknades som genomsnittet av tre replikat för 48 brunnar (2 uppsättningar av tre exemplar negativa kontrollplattor). SD brukade kalla träffar från testa kemiska uppsättningen var SD över 48 negativa kontrollen i genomsnitt procent levande noter. Använder denna strategi, denna studie gav 57 träffar från testa biblioteket av 179 föreningar, visar att totalt 32 procent av de testa kemikalierna testade positivt (figur 1B). Binning av de i genomsnitt procent levande noter för negativ kontroll och test brunnarna anges att test brunnarna överträffade kontrollbrunnarna (figur 1C).
Kandidat skärmen: Liten skala skärmar kan utföras på ett sätt som liknar den omtest som beskrivs ovan. Här beskriver vi resultaten från en kandidat skärm med 139 föreningar. Dessa kandidater monterades som strukturer kan främja livslängd. För denna skärm utfört vi 5 replikat av testplattorna vid två olika doser (50 µM och 100 µM). Dessutom använde vi 8 negativ kontrollplattor, med en enda positiv kontroll (NP1) platta som innehåller två olika doser; 50 µM och 100 µM.
Negativ kontrollplattor övervakades tills ~ 90% av djur var döda. På den tiden var brunnar gjorde genom att räkna levande och döda maskar i alla kontrollbrunnarna och från test brunnar som innehöll levande maskar. Procent som är vid liv vid tidpunkten av scoring användes för att beräkna genomsnitt procent levande noter för varje brunn. För de negativa kontrollerna hade 32 brunnar procent levande noter från 8 replikat. För de positiva kontrollerna fanns det 4 väl noter i genomsnitt över 4 replikat för varje dos. Träffar kallades för brunnar med en genomsnitt procent levande poäng som var större än den genomsnittliga negativa kontrollen procent levande poäng + 2 SD. Detta cutoff lämnade 14 träffar från skärmen kandidat och undantagna alla de negativa kontrollbrunnarna. Den cutoff ingår också alla den positiva kontrollen brunnar behandlas vid 100 µM och 50% av de positiva kontrollerna behandlas vid 50 µM. Dessa resultat presenteras här som kastas i papperskorgen i genomsnitt procent levande noter för både den 50 µM (figur 2A) och 100 µM (figur 2B) test skärmarna.
Slutligen, alla plåtar var åter gjorde en sen tidpunkt, som motsvarade till en tid när större än 99% av den negativa kontrollen behandlade djur var döda. Dessa resultat visade att de positiva kontrollbrunnarna långt ut utförs negativ kontroll och test brunnarna (figur 2C). Medan testet brunnarna var något bättre än de negativa kontrollerna. Detta sistnämnda resultat är partisk av en uppgift som att många av test brunnarna föreföll uppvisar toxicitet i förhållande till kontroll behandling (tabell 1), därmed confounding denna enkel tolkning. Detta var väntat, eftersom kandidat biblioteket var en sann skärm av kemikalier med okända biologiska aktivitet i C. elegans, medan skärmen testa var i huvudsak pre-screening för föreningar som inte var giftiga. Eftersom denna primära skärmen var för föreningar som förlängt livslängden, bör betydligt giftiga kemikalier inte har varit i test in.
Figur 1 : Representativa resultat från en hög genomströmning skärm och åter testa
(A) Survivorship kurvan från en representativ negativ kontroll platta används i nytt test analysen. Denna kurva konstruerades från scoring alla levande och döda maskar i 24 brunnarna används i denna analys 4 gånger under de 18 dagarna i analysen. På dag 18 av vuxenlivet, gjordes kontroller bedömdes ha ~ 5% överlevnad och alla kontrolltest och plattor då också. (B) tabell sammanfattar resultaten av skärmen och testa. (C) Binning av brunnar i genomsnitt procent levande poängen för både kontroll och test förhållanden testa på skärmen. För kontroller, noter från 48 brunnar varje bestående av genomsnittet av 3 replikat. Testresultaten från 179 wells varje bestående av den genomsnittliga poängen från tre replikat. Figur 1 återges från en tidigare publikation1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Representativa resultat från en kandidat skärm
(A) Binning av resultaten från skärmen 50 µM kandidat. 139 test-väl resultaten representerar i genomsnitt procent levande Poäng från 5 replikat. 32 negativ kontrollresultaten består av i genomsnitt procent levande noter från 8 replikat. 4 positiva kontrollresultaten består av i genomsnitt procent levande noter från 4 replikat (16 totalt brunnar innehållande NP1 vid 50 µM). (B) Binning av resultaten från skärmen 100 µM kandidat. Allt är samma som i (A), förutom att de test brunnar och positiva kontroller behandlades vid 100 µM koncentrationer. Samma negativa kontrollen plattorna visas i både (A och B). (C) representant resultat från nytt scoring plattorna en relativt extrem sen tidpunkt. Positiva kontroller dramatiskt bättre än alla andra, om bara står för en procent av brunnarna med levande maskar vid denna tidpunkt, som är partisk mot test brunnar som beskrivs i huvudtexten och tabell 1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Binning av i genomsnitt procent levande noter | ||||||
| Grupperade noter | Alla döda (0) | 1-10 | 11-20 | 21-30 | 31-40 | > 41 |
| Nytt test | ||||||
| # av (-) kontroll | 16 | 31 | 1 | 0 | 0 | 0 |
| # Test brunnar (50µM) | 46 | 69 | 50 | 8 | 3 | 3 |
| Kandidaten skärmen | ||||||
| # av (-) kontroll | 0 | 11 | 21 | 0 | 0 | 0 |
| # av (+) styra (50µM) | 0 | 0 | 2 | 2 | 0 | 0 |
| # av (+) styra (100µM) | 0 | 0 | 0 | 0 | 2 | 2 |
| # Test brunnar (50µM) | 94 | 22 | 21 | 2 | 0 | 0 |
| # Test brunnar (100µM) | 86 | 25 | 21 | 6 | 1 | 0 |
Tabell 1: Representativa resultat från binning olika skärmar
Här presenterar vi de binning av i genomsnitt procent levande poängen från de två skärmarna (testa och kandidat). I fönstret Testa toppen är liknande till den negativa kontrollen med de åter testar överträffar den negativa kontrollen dramatiskt på höger (långlivad) sida av bordet. Detta indikerar närvaron av flera Pro livslängd föreningar som finns i den testa uppsättningen. I skärmen kandidat ser vi att toppen är alla döda i kategorin medan det finns också en uppenbar signal från höger sida av bordet. Detta indikerar förekomst av Pro livslängd föreningar i kandidat uppsättningen, men också anger förekomsten av signifikant toxicitet bland den kandidat uppsättningen föreningar.
Discussion
Här har vi beskrivit en enkel metod för odling av C. elegans i 96 brunnar. Vi beskriver dessa kulturer för användning i kemisk screening och livslängd analyser, men de kan användas för många typer av analyser. Medan flera odlingsbetingelser för kemisk screening har tidigare varit rapporterade8, inklusive för livslängd analys10, analysen beskrivs här skiljer sig på flera sätt. Livslängd analysen beskrivs här använder tredjeparts 96 brunnar, förlitar sig på sterila mutanter (i stället för kemisk sterilisering), använder agar odlingsbetingelser, använder enkel vätskehantering flytta maskar och görs manuellt på slutpunkten. De olika metoder som använts i denna analys kan vara till hjälp för forskare som söker screeningmetoder som omfattar dessa förutsättningar.
Är av avgörande betydelse att detta protokoll centrera huvudsakligen på kvaliteten på plattorna produceras för analysen. Först, när du gör plattor är det absolut nödvändigt att agar ytan är fri från bubblor och andra ojämnheter. Dessa variationer i agar ytan leder nästan alltid till grävande och förlust av brunnen. Det andra bygger protokollet på torkning av vätskor som deponeras under installationen och neddrogning stadier. Det är viktigt att dessa vätskor är helt bort, men ägarn inte blir uttorkad. Anekdotiskt, det verkar att maskar i brunnar som inte är helt torkat (simning i vätska) lever längre än ordentligt torkade brunnar, medan uttorkning av plattorna leder till uttorkning och sprickbildning av agar, vilket leder till mask grävande och förlust. En annan avgörande faktor i detta protokoll är att upprätthålla sterila förhållanden. Som med någon livslängd test, finns det en hel del arbete involverade med plattan setup, och många möjligheter och tid finns för analys förstör föroreningar för att bosätta sig och växa på plattorna.
Medan den livslängd-analysen som beskrivs här är användbar för screening av föreningar i C. elegans, är det begränsat till särskilda genetiska bakgrunder, eftersom det bygger på en temperatur känslig (ts) steril stam; Vi använde TJ1060, som har hög sterilitet penetrans. Detta begränsar stammarna som är tillgängliga för screening med denna metod. Alternativa metoder inklusive korsa ts sterila mutationer in i önskad bakgrunden eller använda kemisk sterilisering. Vi har inte försökt kemisk sterilisering med denna analys, men det bör vara möjligt. Potentiella hinder inkluderar att placera autoklaven på maskar i rätt skede och i rätt dos. Protokollet beskrivs använder här en flytande dispenser som är snabb, men verkar inte avstå från vuxna effektivt. Så dessa maskar utvecklas på plattorna och därför måste behandlas med sterilisering kemiska på plattorna. Att bestämma den optimala dosen och timing är viktigt för framgång. Alternativa strategier inkluderar en tubens metoden som kan flytta vuxna. Tidigare, har vi funnit att maskinerna kan identifiera och sortera vuxna är generellt mycket långsammare än de enkla flytande hanterare, som kan undvara homogen uppslamningar av suspenderade larv.
I allmänhet, använder vi denna metod för att snabbt skärmen kemikalier och behandlingar för stora positiva effekter på livslängd. Metoden är särskilt effektiva när de används med multipla doser, hög replikera nummer, och noggrann övervakning av negativa kontroller som alltid upprätthålls och insprängda bland testplattorna. Positiva kontroller är också användbara vid utformningen och genomförandet av de skärmar som beskrivs i detta manuskript. Men för att vara en effektiv positivt, skulle kontrollen behöver vara ganska potent och mycket robust. När skärmen distribuerades ursprungligen, kunde en passande potent och robust förening inte identifieras. För närvarande finns det många rapporter i 'åldrande' litteraturen av troligaste kandidaterna för positiva kontroller användbar på skärmarna som beskrivs här. Som beskrivs i avsnittet kandidat skärmen i avsnittet förväntade resultat av detta manuskript och i figur 2 och tabell 1, är de sammansatta NP1 en effektiv positiv kontroll för denna skärm. Vi bekräftar generellt positiva träffar från dessa skärmar med standard livslängd analyser på 3 mm kultur plattor.
Disclosures
Författarna förklarar att ingen finansiering enhet som stödjer detta arbete hade synpunkter på insamling av data, analys av resultat eller beslutet att publicera.
Acknowledgments
Vi tackar Dipa Bhaumik, Aaron Miller och Bob Hughes för tekniskt bistånd. Stammar tillhandahölls av CGC, som finansieras av NIH Office infrastruktur forskningsprogram (P40 OD010440). Vi är tacksamma till Georgien skogen och medlemmar av Lithgow, Kallisti och Melov Labs för användbar diskussioner. M.L. stöddes av National Institutes of Health (NIH) utbildning Grant T32 AG000266 och en Ellison medicinska stiftelsen/amerikanska federationen av åldrande forskning Post-Doctoral Fellowship. Detta arbete stöddes av ett bidrag från BioAge Labs, beviljar Larry L. Hillblom Foundation bidrag, liksom National Institutes of Health UL1024917, stödja tvärvetenskaplig forskningskonsortiet på Geroscience och 1R01AG029631-01A1 till G.J.L.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB Broth Miller Granules | VWR | ||
| Unispense | Wheaton Science Products | automated fluid dispensing apparatus | |
| 96 well assay plate; COSTAR 3370 | Corning | ||
| Multidrop 384; automated 8 channel dispenser | Thermo Fisher Scientific | ||
| manufactored worm pick | Genesee Scientific | ||
| Belly Dancer Orbital Shaker | Stovall Life Science inc. | ||
| microplate shaker; MTS 2/4 Digital | IKA Works, inc. | ||
| automated 96-well liquid handler; Biomek FX Liquid Handler | Beckman Coulter | ||
| automated 96-well liquid handler; Bench Top Pipettor | Sorenson Bioscience, inc. | ||
| manual 8 or 12 multi-channel pipettes | we use rainin… | ||
| transparent 96 well film cover; TempPlate RT Optical Film | USA Scientific | ||
| table top centrifuge; Centrifuge 5810 R | Eppendorf |
References
- Lucanic, M., et al. Chemical activation of a food deprivation signal extends lifespan. Aging Cell. , (2016).
- Evason, K., Huang, C., Yamben, I., Covey, D. F., Kornfeld, K. Anticonvulsant medications extend worm life-span. Science. 307 (5707), 258-262 (2005).
- Melov, S., et al. Extension of life-span with superoxide dismutase/catalase mimetics. Science. 289 (5484), 1567-1569 (2000).
- Benedetti, M. G., et al. Compounds that confer thermal stress resistance and extended lifespan. Exp Gerontol. 43 (10), 882-891 (2008).
- Hansen, M., Hsu, A. L., Dillin, A., Kenyon, C. New Genes Tied to Endocrine, Metabolic, and Dietary Regulation of Lifespan from a Caenorhabditis elegans Genomic RNAi Screen. PLoS Genet. 1 (1), 17 (2005).
- Lee, S. S., et al. A systematic RNAi screen identifies a critical role for mitochondria in C. elegans longevity. Nat Genet. 33 (1), 40-48 (2003).
- Samuelson, A. V., Carr, C. E., Ruvkun, G. Gene activities that mediate increased life span of C. elegans insulin-like signaling mutants. Genes Dev. 21 (22), 2976-2994 (2007).
- Kwok, T. C., et al. A small-molecule screen in C. elegans yields a new calcium channel antagonist. Nature. 441 (7089), 91-95 (2006).
- Petrascheck, M., Ye, X., Buck, L. B. A high-throughput screen for chemicals that increase the lifespan of Caenorhabditis elegans. Ann N Y Acad Sci. 1170, 698-701 (2009).
- Solis, G. M., Petrascheck, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates. J Vis Exp. (49), (2011).
- Angeli, S., et al. A DNA synthesis inhibitor is protective against proteotoxic stressors via modulation of fertility pathways in Caenorhabditis elegans. Aging (Albany NY). 5 (10), 759-769 (2013).
- Fabian, T. J., Johnson, T. E. Production of age-synchronous mass cultures of Caenorhabditis elegans. J Gerontol. 49 (4), 145-156 (1994).
- Greer, E. L., Brunet, A. Different dietary restriction regimens extend lifespan by both independent and overlapping genetic pathways in C. elegans. Aging Cell. 8 (2), 113-127 (2009).
- Mair, W., Panowski, S. H., Shaw, R. J., Dillin, A. Optimizing dietary restriction for genetic epistasis analysis and gene discovery in C. elegans. PLoS One. 4 (2), 4535 (2009).
- Hamilton, B., et al. A systematic RNAi screen for longevity genes in C. elegans. Genes Dev. 19 (13), 1544-1555 (2005).
- Frankowski, H., et al. Dimethyl sulfoxide and dimethyl formamide increase lifespan of C. elegans in liquid. Mech Ageing Dev. 134 (3-4), 69-78 (2013).
- Lucanic, M., et al. Impact of genetic background and experimental reproducibility on identifying chemical compounds with robust longevity effects. Nat Commun. 8, 14256 (2017).
