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Biochemistry

Caenorhabditis एलिगेंस में उच्च प्रवाह रासायनिक स्क्रीनिंग के लिए एक सरल तरीका

doi: 10.3791/56892 Published: March 20, 2018

Summary

यहां हम तेजी से निमेटोड विकास मीडिया आगार के सैकड़ों उत्पादन के लिए एक सरल प्रोटोकॉल का वर्णन, 96-अच्छी तरह से प्रति अच्छी तरह से Caenorhhabditis एलिगेंस के अनुरूप संख्या के साथ संस्कृति प्लेटों. ये संस्कृतियां संपूर्ण जीवों की phenotypic स्क्रीनिंग के लिए उपयोगी हैं । हम इन संस्कृतियों का उपयोग कर समर्थक दीर्घायु प्रभाव के लिए रसायन स्क्रीन पर यहां ध्यान केंद्रित ।

Abstract

Caenorhabditis एलिगेंस शरीर क्रिया विज्ञान पर रासायनिक प्रभाव के परीक्षण के लिए एक उपयोगी जीव है । पूरे जीव छोटे अणु स्क्रीन जैविक रूप से सक्रिय रासायनिक संरचनाओं कि ऐसी उम्र के रूप में जटिल phenotypes को संशोधित कर सकते हैं की पहचान के लिए महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करते हैं । यहां वर्णित 96 के सैकड़ों के उत्पादन के लिए एक सरल प्रोटोकॉल अच्छी तरह से एक अच्छी तरह से सी एलिगेंस के काफी सुसंगत संख्या के साथ संस्कृति प्लेट है । अगले, हम निर्दिष्ट कैसे इन संस्कृतियों का उपयोग करने के लिए निमेटोड सी एलिगेंसकी उंर पर प्रभाव के लिए रसायनों के हजारों स्क्रीन । इस प्रोटोकॉल तापमान संवेदनशील बाँझ उपभेदों, आगर प्लेट शर्तों का उपयोग करता है, और सरल पशु हैंडलिंग स्क्रीनिंग के लिए सिंक्रनाइज़ पशु संस्कृतियों के तेजी से और उच्च प्रवाह उत्पादन की सुविधा के लिए ।

Introduction

यहाँ एक प्रोटोकॉल वर्णित है कि Caenorhabditis एलिगेंस उम्र पर प्रभाव के लिए रासायनिक यौगिकों के उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग के लिए विकसित किया गया था । प्रोटोकॉल ही आसानी से अंय phenotypic स्क्रीन के लिए अनुकूल है, अध्ययन के उपयोग रिपोर्टर सी एलिगेंस उपभेदों सहित । इस प्रोटोकॉल को सफलतापूर्वक एक उपंयास जैविक रूप से सक्रिय यौगिक की पहचान करने के लिए उपयोग किया गया था, NP1 (nitrophenyl-पिपेराजीन 1), कि दृढ़ता से एक आहार प्रतिबंध तंत्र के माध्यम से सी. एलिगेंस की उंर का विस्तार । NP1 और जीवन पर इसके प्रभाव का एक लक्षण वर्णन, खेल में आनुवंशिक रास्ते का विवरण सहित, पहले कहीं1बताया गया था । उस रिपोर्ट में स्क्रीन के बड़े पैमाने पर कार्यांवयन से परिणामों का वर्णन भी शामिल है । यहां हम बहुत अधिक विस्तार में वर्णन पद्धति और स्क्रीन ही है, जो दोनों छोटे और बड़े पैमाने पर अनुप्रयोगों के लिए स्केलेबल है की स्थापना ।

लक्ष्य है कि यहां वर्णित प्रोटोकॉल के निर्माण के लिए नेतृत्व के लिए एक C. एलिगेंस संस्कृति मंच है कि उपंयास के लिए बड़े रासायनिक पुस्तकालयों के तेजी से जांच के लिए अनुमति दी जैविक रूप से सक्रिय यौगिकों विकसित किया गया था. जबकि रासायनिक स्क्रीन इस प्रोटोकॉल के विकास से पहले किया गया है, ये मुख्य रूप से छोटे पैमाने पर थे और/या उंमीदवार प्रकार2,3दृष्टिकोण । वास्तव में, स्क्रीन के अधिकांश यौगिकों का उपयोग तनाव प्रतिरोध परख के दसियों पर प्रयोगशाला में प्रदर्शन किया, लंबी उंर के प्रभाव के लिए जांच की जा रही है4। इस अध्ययन के बजाय सीधे उंर के प्रभाव के लिए स्क्रीन की मांग की । उल्लेखनीय है कि सी. एलिगेंसके साथ बड़े पैमाने पर रासायनिक स्क्रीन के प्रदर्शन के समय वैज्ञानिक साहित्य में कुछ वर्णन थे. दरअसल, स्क्रीन के अंय प्रकारों की तुलना में5,6,7, बड़े पैमाने पर रासायनिक स्क्रीनिंग का उपयोग कर एलिगेंस के अधीन होने लग रहा था ।

इस दृष्टिकोण को विकसित करने के लिए एक आधार के रूप में इस्तेमाल किया गया था कि सी. एलिगेंस में बड़े पैमाने पर रासायनिक स्क्रीन के दो विवरण थे । इनमें से पहले पीटर रॉय की प्रयोगशाला से एक सुरुचिपूर्ण अध्ययन के लिए रासायनिक स्क्रीन का उपयोग करने यौगिकों कि पशुओं के विकास perturb सकता है की पहचान । अध्ययन तो एक आगे mutagenesis स्क्रीन के साथ पीछा करने के लिए इन रसायनों के आनुवंशिक लक्ष्य8की पहचान । प्रोटोकॉल है कि अध्ययन में वर्णित 24 अच्छी तरह से खोपड़ी है, जो इस अध्ययन के विशिष्ट जरूरतों (पुस्तकालय और सीमित उपलब्ध मशीन अंतरिक्ष में रासायनिक की सीमित मात्रा) के लिए बस के लिए काम कर रहा था इस्तेमाल किया । अंय अध्ययन था माइकल Petrascheck अभिनव और महत्वाकांक्षी छोटे-अणु के लिए स्क्रीन रसायन9विस्तार,10। कि अध्ययन 384-अच्छी तरह से प्लेटें और तरल संस्कृतियों का इस्तेमाल किया । संतति उत्पादन को बाधित करने के लिए इस स्क्रीन की अन्य मुख्य विशेषता FUDR (5-fluorodeoxyuridine) का प्रयोग था । उस अध्ययन में वर्णित प्रोटोकॉल के काफी विचार के बाद, दोनों रासायनिक नसबंदी और सी. एलिगेंस की तरल संस्कृतियों को टाल दिया गया.

हालांकि FUDR व्यापक रूप से ग. एलिगेंस उंर के प्रयोगों में प्रयोग किया जाता है, वहां चिंता है कि FUDR अप्रत्याशित दवा बातचीत का कारण हो सकता है, या कि FUDR ही उंर पर कुछ असर हो सकता है । हाल ही में इस बाद चिंता का विषय मांय किया गया है, कम से कम कुछ सांद्रता पर और विशेष रूप से 25 डिग्री सेल्सियस में11। संतान संदूषण की समस्या को दरकिनार करने के लिए, C. एलिगेंस तनाव TJ1060 इस्तेमाल किया गया था, जो दो स्वतंत्र तापमान संवेदनशील उत्परिवर्तनों बंदरगाह (एसपीई-9 (hc88) मैं; rrf-3 (b26) द्वितीय) कि शुक्राणु उत्पादन को समाप्त करने और करने के लिए उपयोगी हो प्रदर्शन किया गया है तुल्यकालिक आबादी12की जन संस्कृतियों के लिए । यह तनाव 25 डिग्री सेल्सियस पर पूरी तरह से बाँझ था, लेकिन जब 15-20 डिग्री सेल्सियस पर कल्चरित संतति पैदा करेगा । इस अध्ययन के साथ पारंपरिक संस्कृति की स्थिति का इस्तेमाल किया, आगर की सतह पर रेंगने कीड़े, के रूप में तरल संस्कृतियों के साथ प्राप्त परिणाम हमेशा पारंपरिक आगार प्लेटों के साथ reproducible नहीं कर रहे हैं । हालांकि इस घटना को पूरी तरह समझ नहीं है, यह दिखा दिया गया है कि तरल में प्रसंस्कृत कीड़े डॉ (आहार प्रतिबंध) मानक मीडिया13,14पर संस्कृतिकेकीड़े से एक अलग तरीके से जवाब । इसलिए यह प्रशंसनीय है कि तरल मीडिया कुछ DR mimetics कि अंयथा स्क्रीन के साथ की पहचान की जाएगी मुखौटा सकता है ।

आगर संस्कृति की स्थिति पर बसे होने के लिए, इस परख में कुओं के प्रदर्शन को स्कोरिंग के लिए विभिंन विकल्पों पर विचार किया गया । जबकि विभिंन स्वचालित या इमेजिंग आधारित परख उपलब्ध थे, वे अधिग्रहण आवँयक और तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण उपकरणों की तैनाती, जिनमें से ज्यादातर नकारात्मक स्तर तक महंगे थे । इन विकल्पों पर विचार Whilst, यह सभी प्रकार के पिछले जीवन स्क्रीन का उल्लेख आवश्यक था । अंत में, इस अध्ययन के एक स्कोरिंग विधि सिउ सिल्विया ली है लैब पूरे जीनोम RNAi स्क्रीन phenotypes15के लिए से अनुकूलित करने के लिए इस्तेमाल किया । विशेष रूप से, सभी आयु प्लेट एक ही तरीके से स्थापित किया गया था, लेकिन केवल नकारात्मक नियंत्रण पर नजर रखी गई । एक बार जब नकारात्मक नियंत्रण प्लेटें पूर्ण मृत्यु दर के पास होने की पुष्टि की थी, परीक्षण प्लेट हाथ से बनाए गए थे । इस बड़े पैमाने पर स्क्रीन में, सकारात्मक नए सिरे से तैयार रसायनों के साथ पुनः परीक्षण द्वारा पुष्टि की गई, प्राथमिक सकारात्मक के तपसिल दोहराता का उपयोग कर ।

Protocol

1. बफ़र्स तैयार कर रहा है

  1. पौंड शोरबा
    1. पूर्व मिश्रित granules का प्रयोग करें ( सामग्री तालिकादेखें) और तैयार करने के लिए निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करें ।
  2. निमेटोड ग्रोथ मीडिया (NGM) आगर
    1. इसमें आगर के 23 माम, NaCl के 3 जी, bacto peptone के 2.5 ग्राम, और ०.९७२ एल आटोक्लेव के लिए पानी और 60 ° c करने के लिए शांत करते हैं, तो 1 एम पोटेशियम फॉस्फेट (केपीओ4) बफर (पीएच 6.0) के 25 मिलीलीटर जोड़ने, 1 एम मैग्नीशियम सल्फेट की 1 मिलीलीटर (MgSO4) , 1 एम कैल्शियम क्लोराइड (CaCl2) के 1 मिलीलीटर, और 5 मिलीग्राम/एमएल कोलेस्ट्रॉल (इथेनॉल में) की 1 मिलीलीटर ।
  3. हाइपोक्लोराइट समाधान
    1. 5 एम KOH के 5 मिलीलीटर, सोडियम हाइपोक्लोराइट के 4 मिलीलीटर समाधान (6%), और 50 मिलीलीटर की कुल मात्रा के लिए H2हे ।
  4. एस बसाल
    1. NaCl के 5 माम, कश्मीर के2HPO4, 6 ग्राम के KH2पीओ4, और de-जल 1 L के लिए, तो आटोक्लेव.

2. केंद्रित ई. कोलाई (OP50) की तैयारी

नोट: यह कदम एस बेसल बफर के 25 मिलीलीटर में एक संतृप्त ई. कोलाई समाधान के 1 एल ध्यान केंद्रित ।

  1. Inoculate autoclaved पौंड शोरबा के 5 मिलीलीटर (चरण 1.1) ई. कोलाई (तनाव OP50), और 37 डिग्री सेल्सियस पर 4-6 एच के लिए गर्मी मिलाते के साथ (250 rpm) की एक कॉलोनी के साथ । एक 2 एल Erlenmeyer कुप्पी में पौंड के inoculate 1 एल के लिए इस समाधान के 0.1 मिलीलीटर का उपयोग करें । 1 एल कुप्पी (250 rpm) मिलाते हुए 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर (12-16 ज) मशीन ।
  2. 1 एल के लिए 500 मिलीलीटर में रातोंरात संस्कृतियों 5 मिनट के लिए 10,000 x g और 4 डिग्री सेल्सियस पर जीवाणुओं गोली और दूर शेष मीडिया खिचड़ी भाषा । एस बेसल (1.4 कदम) के 25 मिलीलीटर में गोली reसस्पेंड । 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।

3. NGM कल्चर प्लेट्स की तैयारी

  1. बड़े पैमाने पर संस्कृति के लिए कीड़े की बड़ी संख्या का उत्पादन करने के लिए इस्तेमाल किया प्लेटों के लिए, एक स्वचालित द्रव वितरण तंत्र या एक सीरम वैज्ञानिक पिपेट के साथ 10 सेमी संस्कृति प्लेटों पर एक लामिना प्रवाह कैबिनेट में पिघला हुआ (60 डिग्री सेल्सियस) NGM आगर (कदम 1.2) के 30 मिलीलीटर वितरण । रात भर सूखने की अनुमति दें ।
  2. प्लास्टिक प्रत्येक 10 सेमी प्लेट पर केंद्रित OP50 के 2 मिलीलीटर, पूरी तरह से झुकने और प्लेट घूर्णन द्वारा आगर सतह को कवर करने के लिए फैला है, तो प्लेटों को सुखाने के लिए अनुमति देते हैं । 2 सप्ताह तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट्स स्टोर ।
  3. उच्च प्रवाह परख संस्कृति स्क्रीनिंग के लिए इस्तेमाल किया प्लेटों के लिए, एक स्वचालित 8 चैनल मशीन का उपयोग एक लामिना फ्लो कैबिनेट में एक अच्छी तरह से एक 96 प्लेट के प्रत्येक कुआं में पिघला हुआ NGM आगार के 0.15 मिलीलीटर वितरण । देखभाल का प्रयोग करें यकीन है कि कुओं बुलबुले से रहित है बनाने के लिए, के रूप में इन कीड़ों की burrowing है कि अच्छी तरह से उस में परख समझौता होगा सक्षम हो जाएगा । रात भर सूखने की अनुमति दें । 2 सप्ताह तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर प्लेट्स स्टोर ।

4. तापमान संवेदनशील (टीएस) बाँझ C. एलिगेंस जन संस्कृतियों की तैयारी

  1. संस्कृतियों शुरू करने के लिए, एक ' कीड़ा उठाओ ' (एक संलग्न प्लैटिनम तार या एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत एक निर्मित कीड़ा लेने के साथ एक गिलास पिपेट) का उपयोग कर, 20 अंडे हस्तांतरण (तनाव TJ1060: एसपीई-9 (hc88) I; rrf-3 (b26) द्वितीय) जन संस्कृति प्लेट (ओं) पर कदम 3.1 में तैयार । फिर, 6 दिनों के लिए 20 ° c पर प्लेट्स मशीन (वृद्धि की एक से अधिक पीढ़ी के लिए अनुमति देता है, के रूप में आप ले जाया 20 अंडे की संतति के संग्रह के लिए लक्षित कर रहे हैं) ।
  2. नेत्रहीन एक विदारक माइक्रोस्कोप के साथ gravid वयस्कों (गर्भाशय में मौजूद अंडे) की उपस्थिति की पुष्टि करें । एक गिलास पिपेट का उपयोग कर प्लेट पर एस बेसल के 2-3 मिलीलीटर वितरण द्वारा gravid वयस्कों लीजिए । हाथ से प्लेट के आसपास तरल घूमता है, तो एक गिलास पिपेट का उपयोग कर एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में तरल इकट्ठा ।
  3. ट्यूब नीचे स्पिन (20 डिग्री सेल्सियस पर 1.5 मिनट के लिए 1,000 x जी) को गोली कीड़े, तो supernatant बंद महाप्राण । 10 मिलीलीटर हाइपोक्लोराइट समाधान (चरण 1.3) कीड़ा गोली करने के लिए जोड़ें और तेजी से 5 के लिए एक शीर्ष-से-नीचे दिशा में हाथ से ट्यूब हिला 5 मिनट के लिए मशीन, हर 2.5 मिनट मिलाते हुए ।
  4. फिर, ट्यूब नीचे स्पिन (1.5 मिनट के लिए 1,000 x g); गोली पीले-भूरे रंग की होनी चाहिए । महाप्राण बंद supernatant. अंडे की गोली के लिए 10 मिलीलीटर हाइपोक्लोराइट समाधान जोड़ें और जोरदार ट्यूब हिला । सामयिक मिलाते के साथ 1-3 मिनट की गर्मी, और, जबकि विदारक माइक्रोस्कोप के साथ उपस्थिति की निगरानी । नेत्रहीन की पुष्टि केवल अंडे शेष हैं, और अगले कदम के लिए आगे बढ़ना ।
  5. ट्यूब नीचे स्पिन (1.5 मिनट के लिए 1,000 x g) और supernatant बंद महाप्राण । गोली कोई भूरा रंगाई के साथ सफेद होना चाहिए ।
    नोट: हाइपोक्लोराइट समाधान को हटाने के बाद, यह बाँझ तकनीक और बफ़र्स का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है, के बाद से संक्रमण (बैक्टीरियल और कवक, विशेष रूप से), बहुमूल्य समय और reagents बर्बाद कर प्रयोग को बर्बाद कर सकते हैं । इस अध्ययन के एक फ़िल्टर्ड लामिना प्रवाह कैबिनेट का इस्तेमाल किया और केवल बाँझ पिपेट और सुझावों का उपयोग कर तरल पदार्थ ले जाया गया.
  6. एक बाँझ अंतरिक्ष में ट्यूबों खोलें. गोली धो एस बेसल के साथ 3 बार, नीचे कताई (1.5 मिनट के लिए 1,000 x जी) और aspirating दूर supernatant हर बार । फिर से 2-3 मिलीलीटर एस बेसल में अंडे की गोली को सस्पेंड । इन अंडे अब बफर में एक रात हैच के लिए इस्तेमाल किया जा सकता L1 लार्वा (चरण 5) इकट्ठा ।

5. बफर में सेने C. एलिगेंस अंडे तुल्यकालिक संस्कृतियों पाने के लिए (L1 लार्वा सी. एलिगेंस की तैयारी)

  1. एक कवर के साथ एक बाँझ गिलास पेट्री डिश में अंडा गोली और बफर खिचड़ी भाषा । एक सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग कर एक डिश में ट्यूब से बचे हुए अंडे कुल्ला एस बेसल के 2-3 मिलीलीटर । एस बेसल के 5 मिलीलीटर जोड़ें भीड़ को कम करने के लिए, के रूप में इस सेने को प्रोत्साहित कर सकते हैं, के रूप में मिलाते प्रकाश (20 एक बेली नर्तकी कक्षीय शेखर के साथ rpm) होगा । 20 डिग्री सेल्सियस पर रात भर गर्मी, अंडे (16-24 ज) हैच करने के लिए समय की अनुमति है । सभी hatchlings भोजन के अभाव के कारण 1सेंट लार्वा स्टेज (L1) पर गिरफ्तारी करेंगे ।
    नोट: वास्तविक सबूत इंगित करता है कि ताजा L1 तैयारी (अंडे संग्रह के बाद 16-36 ज) वयस्क कीड़े के सबसे तुल्यकालिक आबादी उत्पंन करते हैं ।
  2. एक सीरम वैज्ञानिक पिपेट के साथ एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में L1s लीजिए । एक केंद्रापसारक में L1s नीचे स्पिन (1.5 मिनट के लिए 1,000 x जी), महाप्राण दूर supernatant, और दोहराने जब तक सभी L1s के लिए प्लेटें सेने से एकत्र किया गया है, जबकि अगले कदम के लिए एस बेसल के 10 मिलीलीटर जा ।
  3. L1s युक्त ट्यूब से, 0.01 एमएल बाहर micropipette (तुरंत मिश्रण के बाद) और यह एक unसीडिंग (कोई ई. कोलाई) NGM प्लेट पर बांटना. प्लेट पर L1s की संख्या गिनती । दोहराएं 10 बार और प्रत्येक aliquot में L1s की संख्या के लिए एक औसत प्राप्त करते हैं । आम तौर पर, µ एल प्रति 1-3 L1s के बीच की उंमीद (जब 1 मास संस्कृति 20 अंडे युक्त प्लेट के साथ शुरू) ।
  4. एस बेसल होल्डिंग L1s की मात्रा पिपेट सीरम वैज्ञानिक के साथ निर्धारित करें । उसके बाद 0.01 मिलीलीटर प्रति वर्म की निर्धारित औसत संख्या के साथ एक्सट्रपलेशन, पिछले चरण में प्राप्त, L1s की कुल संख्या का अनुमान है । आम तौर पर, 10000-30000 L1s (प्रति मास संस्कृति 20 अंडे युक्त प्लेट के बीच की उंमीद) ।
  5. 96 में इस संस्कृति का उपयोग करें-अच्छी तरह से परख, एक बाँझ दौर मीडिया बोतल में µ एल प्रति 1 L1 को L1 निलंबन पतला है, तो 7 कदम के लिए आगे बढ़ना । यदि इस संस्कृति को अतिरिक्त ग. एलिगेंस जन संस्कृतियों को उत्पंन करने के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है, तो 6 कदम के लिए आगे बढ़ना ।

6. बड़े पैमाने पर तुल्यकालिक संस्कृति की तैयारी

नोट: L1 समाधान जल्दी कीड़ा आबादी बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

  1. एक L1 समाधान के साथ बड़ी कीड़ा संख्या उत्पंन करने के लिए, जन संस्कृति प्लेटों की वांछित संख्या में से प्रत्येक पर 5,000 L1s को बांटना । लीजिए gravid वयस्कों 2.5 दिन बाद (20 डिग्री सेल्सियस) के रूप में कदम 4.1-2 में वर्णित है, और 4.3 कदम के लिए अंडे इकट्ठा करने के लिए आगे बढ़ना ।
  2. के रूप में यह anecdotally किया गया है कि दोहराया हाइपोक्लोराइट संग्रह कुचले जनसंख्या तनाव कर सकते हैं, प्रचार के लिए अंडे उठा द्वारा विभाजित आबादी हाइपोक्लोराइट उपचार के लिए शेष आबादी subjecting से पहले, ताकि कई पीढ़ियों से जनसंख्या का हाइपोक्लोराइट समाधान उपचार के अधीन नहीं है ।

7.96 के सेटअप-अच्छी तरह से परख प्लेट्स

  1. अनुमति दें परख प्लेटें (3.3 कदम में तैयार) कमरे के तापमान तक पहुंचने के लिए । फिर, एक लामिना प्रवाह कैबिनेट में, केंद्रित OP50 के 5 µ एल जोड़ें (2.2 कदम में तैयार) एक अच्छी तरह से । पहले के रूप में, एक स्वचालित 8 चैनल मशीन का उपयोग करें ।
  2. प्रत्येक अच्छी तरह से एक स्वचालित 8 चैनल मशीन का उपयोग करने के लिए L1 निलंबन के 10 µ एल जोड़ें । यह प्रति अच्छी तरह से औसतन 10 वर्म पर निकलेगा, क्योंकि ये 1 L1 प्रति µ एल पर सस्पेंशन में मौजूद हैं । घोल से L1s के समान वितरण को बढ़ावा देने के लिए, एक दौर मीडिया बोतल सक्रिय रूप से एक मामूली धीरे बार हलचल मोड़ के साथ मिश्रित से L1s वितरण ।
  3. ढक्कन, प्लेटों के बॉक्स बैचों के साथ कवर प्लेट, और 2 दिनों के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी ।

8. उपचार 1 st दिन वयस्क C. एलिगेंस रसायनों के साथ

  1. फ्रीजर से रासायनिक पुस्तकालय प्लेटें निकालें, और आगे बढ़ने से पहले कमरे के तापमान तक पहुंचने के लिए प्लेट की अनुमति दें ।
    नोट: रासायनिक पुस्तकालय प्लेटें के रूप में यहां वर्णित 96 अच्छी तरह से प्रत्येक में अच्छी तरह से असतत यौगिकों युक्त प्लेटें हैं, जिनमें से सभी एक ही एकाग्रता में है और DMSO में घुल । इन पुस्तकालयों बाहरी स्तंभों का उपयोग नहीं है, और इसलिए प्रत्येक थाली 80 विशिष्ट रसायनों की एक अधिकतम है । यहां वर्णित प्रोटोकॉल में, पुस्तकालय एकाग्रता 10 मिमी है । यह phenotypes पर विलायक प्रभाव पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है । हालांकि इस अध्ययन 0.5% की एकाग्रता DMSO पर स्क्रीन, इस स्तर पर इन उंर परख में और कम प्रवाह परख में कभी नहीं था, जहां यह अधिक एक यौगिक शेयर समाधान एकाग्रता लेने की संभावना है । इस प्रोटोकॉल 0.25% से अधिक नहीं है, जो एक स्तर है जिस पर उंर में संशोधन नहीं होती है16, कम से N2 तनाव में ।
  2. धीरे से 1 मिनट के लिए एक microplate शेखर पर 60 rpm पर प्लेट शेक तुरंत प्रयोग करने से पहले ।
  3. एक स्वचालित 96-अच्छी तरह से तरल हेंडलर का उपयोग करना, (या DMSO) यौगिक के 0.75 µ एल हस्तांतरण परख थाली को पुस्तकालय की थाली से । परख प्लेट को तरल प्रसव के दौरान पिपेट की गहराई ध्यान से नियंत्रित किया जाता है, ऐसी है कि तरल हेंडलर के पिपेट युक्तियां 0.75 µ एल मात्रा के लिए वितरित कर रहे है ~ 15 µ एल की सतह पर तरल की (कीड़े और केंद्रित OP50 से कदम 7.1 -2) और अच्छी तरह से में आगर सतह पियर्स नहीं है । बहुत छोटी स्क्रीन (< 10 प्लेट) को छोड़कर मैन्युअल 8 या 12 मल्टी चैनल पिपेट का उपयोग न करें, क्योंकि वे त्रुटि बढ़ा सकते हैं और अक्सर आगर की सतह के puncturing में परिणाम देते हैं, जो कि परख से समझौता करता है.
  4. DMSO के साथ रासायनिक पुस्तकालय नकारात्मक नियंत्रण प्लेटें तैयार (dimethyl sulfoxide), संभालने के पुस्तकालय परीक्षण किया जा रहा विलायक के रूप में DMSO का उपयोग करता है । हर 5 टेस्ट प्लेट्स के लिए 1 नेगेटिव कंट्रोल प्लेट, 10 निगेटिव कंट्रोल प्लेट्स तक बनाएं । यदि संभव हो तो, यह भी एक सकारात्मक नियंत्रण प्लेट (NP11 20 मिमी में, 0.1 mm की एक अंतिम परख एकाग्रता के लिए, इस प्रयोजन के लिए प्रभावी है; प्रतिनिधि परिणाम अनुभाग देखें) । रसायनों (परीक्षण या नियंत्रण) प्लेटों के 2 बाहरी स्तंभों के लिए मत जोड़ें, के रूप में वे विशेष रूप से सुखाना के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं ।

9. सुखाने संस्कृतियों

  1. आगर की सतह से तरल निकालने के लिए, लामिना फ्लो कैबिनेट में ड्राई प्लेट्स 4-8 ज के लिए । विचारणीय है कि ये प्लेटें पूरी तरह सूख गई हैं लेकिन शुष्क नहीं बन पाती हैं. कुछ प्लेटें दूसरों की तुलना में शुष्क करने के लिए अब ले जाएगा के रूप में, सभी प्लेट बारीकी से निगरानी और जैसे ही वे शुष्क हैं हटा दें । थाली के व्यक्तिगत कुओं के सावधान दृश्य निरीक्षण द्वारा सुखाने की पुष्टि करें ।
    नोट: कारकों पर निर्भर करता है कि कैबिनेट की निकास दर शामिल है, इस समय लेता है empirically निर्धारित किया जाना चाहिए । इस सुखाने कदम के बारे में एक पूर्ण कैबिनेट के लिए 4-8 ज ले जा सकते हैं ।
  2. पारदर्शी फिल्म के साथ सील प्लेटें, तो प्लेट ढक्कन पर डाल दिया ।
  3. 96 स्पिन-अच्छी तरह से 45 के लिए परख प्लेट 1,000 x जी पर ।
  4. स्टोर प्लेट 25 डिग्री सेल्सियस पर औंधा ।

10. स्कोरिंग C. एलिगेंस संस्कृतियों लंबी उंर के लिए

  1. मॉनिटर नकारात्मक नियंत्रण प्लेटें जब तक > 95% मृत्यु दर मनाया जाता है । जांच पहले दो हफ्तों के लिए साप्ताहिक और उसके बाद दैनिक । एक ही तनाव और प्रजातियों के Caenorhabditis साथियों परीक्षण17द्वारा काफी अलग जीवन प्रदर्शित कर सकते हैं ।
    नोट: उंर परख के लिए यहां वर्णित है, TJ1060 25 डिग्री सेल्सियस, इन आबादियों में 95% मृत्यु दर में संस्कृति के साथ वयस्क दिवस 16-20 से हुई है ।
  2. जब नकारात्मक नियंत्रण कुओं माना जाता है करने के लिए पहुंच गए है > 95% मार्क, नीचे स्पिन सभी 96-अच्छी तरह से परख प्लेटें 45 के लिए एक मेज के ऊपर एक microplate अनुकूलित रोटर के साथ केंद्रापसारक (45 एस के लिए 250 x जी 20 डिग्री सेल्सियस) ।
  3. नियंत्रण प्लेटों में सभी कुओं स्कोर । यह गिनती और प्रत्येक कुआं में जिंदा और मृत पशुओं की संख्या रिकॉर्डिंग द्वारा किया जाता है । मृत कीड़े अपने आंदोलन की पूरी कमी के द्वारा जिंदा कीड़ों से विभेदित किया जा सकता है । किसी भी पैदा की प्रतिक्रिया के लिए ऐपिस के माध्यम से देख रहे हैं, जबकि विदारक माइक्रोस्कोप सतह पर लगभग 7 सेमी से 96 अच्छी तरह से थाली छोड़ने के द्वारा जिंदा कीड़े में आंदोलन भड़काने । मृत कीड़े जवाब नहीं होगा, और आसपास के लैब साथियों दोहराव शोर की सराहना नहीं कर सकते हैं ।
  4. परीक्षण प्लेटों के लिए, गिनती और रिकॉर्ड केवल जीवित कीड़े युक्त कुओं । जब एक जीवित कीड़ा मनाया जाता है, अच्छी तरह से स्थिति और थाली के साथ है कि अच्छी तरह से में सभी जीवित और मृत जानवरों की गणना ।
    नोट: यह अक्सर करने के लिए उपयोगी है फिर से स्कोर प्लेटें > नकारात्मक नियंत्रण कीड़े के 99% मर चुके हैं । बड़े पैमाने पर स्क्रीन में, यह सबसे अच्छा अंक के लिए प्रारंभिक स्कोरिंग करना हो सकता है । या तो मामले में ऊपर वर्णित के रूप में स्कोर/

11. पुनः परीक्षण यौगिकों

  1. जब एक पुनः परीक्षण या एक उंमीदवार स्क्रीन (प्रतिनिधि परिणाम देखें) के साथ के रूप में उंमीदवार यौगिकों की एक छोटी संख्या (< 320 यौगिकों), परीक्षण, एक संभव प्लेट प्रभाव को कम करने के प्रयास में 32 केंद्रीय कुओं को परख सीमित । इस प्लेट के किनारे के करीब 2 कुओं अनुपचारित छोड़ देता है, लेकिन अभी भी आगर, भोजन, और कीड़े युक्त ।

Representative Results

हम 96 के लिए इस प्रोटोकॉल रोजगार से प्रतिनिधि परिणामों की जांच से शुरू अच्छी तरह से उंर परख । पहले उदाहरण में, विधि 30,000 रसायनों के माध्यम से स्क्रीन के लिए सफलतापूर्वक रसायन है कि सी. एलिगेंस की उंर बढ़ाने की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, और भी अनुवर्ती पुनः से परिणाम शामिल है सबसे अच्छा प्रदर्शन रसायनों का परीक्षण स्क्रीन का उपयोग एक ही प्रोटोकॉल । ये परिणाम पहले1बताए गए थे । दूसरा उदाहरण उंमीदवार यौगिकों के एक छोटे पैमाने स्क्रीन में एक ही प्रोटोकॉल का उपयोग करता है ।

बड़े पैमाने पर स्क्रीन और पुनः परीक्षण: बड़े पैमाने पर स्क्रीन परीक्षण 30,000 यौगिकों एक खुराक पर किया गया था, डुप्लिकेट में. प्रत्येक रसायन इसलिए 20 की एक उंमीद कुल पशु आबादी के साथ दो कुओं में परीक्षण किया गया । यह पूरा करने के लिए, 10,000 यौगिकों (डुप्लिकेट में) के तीन असतत सेट पूरे 30,000 यौगिकों को कवर करने के लिए ~ 3 महीने की अवधि में जांच की गई । यह भाग में किया गया था, परख के अंत में मैनुअल स्कोरिंग के एक प्रबंधनीय राशि सुनिश्चित करने के लिए और 96 की कुल 260-अच्छी तरह से प्रत्येक सेट में परख प्लेट की आवश्यकता है । पुस्तकालय स्टॉक प्लेट्स में, केवल 80 कुओं यौगिक निहित; 10,000 यौगिकों के एक दोहराने 125 परख प्लेटें बनाता है । इस अध्ययन का इस्तेमाल किया 2 प्रत्येक सेट में 10 नकारात्मक नियंत्रण प्लेटों के साथ प्रतिकृति । का प्रवाह बढ़ाने के लिए, प्लेटें जब नकारात्मक नियंत्रण आबादी अनुभव किया है ~ 99% मृत्यु दर का आकलन कर रहे थे बनाए गए थे । इसके बाद सभी टेस्ट कुओं को लाइव वॉर्म की जांच की गई ।

एक जीवित कीड़ा के साथ कुओं में रसायन हिट कहा जाता था । 1 से अधिक जीवित कीड़ों से युक्त कुओं में रसायनों को भी हिट कहा जाता है, और इसके अतिरिक्त उन कुओं में सभी कीड़े (जिंदा और मृत) एक साधारण स्कोर (प्रतिशत जिंदा स्कोर उत्पन्न करने के लिए गिने थे; मृत कीड़े की संख्या से विभाजित जिंदा कीड़े की संख्या) । पुस्तकालय में प्रत्येक रसायन इसलिए एक हिट दो बार कहा जा सकता है और उन हिट सकता है, लेकिन नहीं हो सकता है, उनके साथ जुड़े स्कोर है. 512 विशिष्ट रसायनों 30,000 यौगिकों की स्क्रीन से हिट (कम एक बार) कहा जाता था । स्क्रीन शक्तिशाली और/या मजबूत (reproducible) समर्थक दीर्घायु प्रभाव की पहचान करने के इरादे से किया गया था । इन दो भिन्न गुणों का विशिष्ट प्रभाव हो सकता है. शक्तिशाली रसायनों नाटकीय रूप से उंर में वृद्धि, जो मामले में हम कीड़े की एक उच्च प्रतिशत की उंमीद है कि रासायनिक अच्छी तरह से जीवित हो सकता है । मजबूत रसायनों के लिए, दोनों प्रतिकृति जीने के कीड़े की उंमीद होगी । इन मानदंडों के आधार पर हिट सूची को स्थान दिया गया । रसायनों के 179 उच्च प्रतिशत जीवित स्कोर उपज, या दोनों प्रतिकृति में मारा गया और इसलिए पुनः के लिए चुना परीक्षण कर रहे थे । शेष रसायनों कि हिट कहा जाता था की अधिकांश, लेकिन फिर से परीक्षण के लिए चयनित नहीं है, केवल एक ही कीड़ा दोहराने कुओं में से एक में जिंदा निहित था ।

हिट का पुनः परीक्षण किया गया था, के साथ ही प्राथमिक स्क्रीन के समान 3 प्रतिकृतियां (30 की कुल पशु आबादी की उंमीद), और सावधान ठहराव अनुपचारित नियंत्रण प्लेटों में पशुओं की उंर के । इन परिवर्तनों को परीक्षण और नियंत्रण कुओं की तुलना में सहायता के लिए जोड़ा गया । रासायनिक हिट के 179 फिर से आदेश दिया गया था, 10 मिमी को पतला, और 96 अच्छी तरह से प्लेटों में ले जाया गया. केवल भीतरी 24 कुओं पुनः के लिए इस्तेमाल किया गया परीक्षण परख (इस प्रोटोकॉल के वर्तमान संस्करण के भीतर 32 कुओं का इस्तेमाल होता के रूप में पुनः के लिए प्रोटोकॉल अनुभाग में वर्णित परीक्षण स्क्रीन) और यौगिकों फिर से थे तपसिल में छह नकारात्मक नियंत्रण परख प्लेटों के साथ परीक्षण DMSO विलायक के साथ इलाज किया । एक नकारात्मक नियंत्रण थाली कुल जीवन रक्षा (चित्रा 1) के लिए समय पर बनाए गए थे । जब नियंत्रण पशुओं के लगभग 95% मर गए थे, सभी प्लेट पूरी तरह से रन बनाए थे (सभी जीवित और मृत कीड़े की गिनती की गई) ।

फिर से हिट कॉल करने के लिए परीक्षण के परिणाम, एक कट ऑफ नकारात्मक नियंत्रण + 2 मानक विचलन (एसडी) के औसत प्रतिशत जिंदा स्कोर पर किया गया था. परीक्षण के कुओं के लिए, औसत प्रतिशत जीवित (स्कोरिंग के समय में) स्कोर प्रतिशत औसत द्वारा गणना की गई तीन से एक अच्छी तरह के लिए दोहराने से जीवित स्कोर । इस विशेष परख के लिए, नकारात्मक नियंत्रण ' वेल्स औसत प्रतिशत जीवित स्कोर तीन के औसत के रूप में गणना की गई 48 कुओं के लिए दोहराने (तपसिल नकारात्मक नियंत्रण प्लेटों के 2 सेट) । फिर से हिट कॉल करने के लिए इस्तेमाल किया एसडी परीक्षण रासायनिक सेट 48 नकारात्मक नियंत्रण औसत प्रतिशत जीवित स्कोर भर में एसडी था. इस रणनीति का प्रयोग, इस अध्ययन के 179 यौगिकों के पुनः परीक्षण पुस्तकालय से 57 हिट पाया, का प्रदर्शन है कि पुनः के 32% की कुल परीक्षण रसायनों का परीक्षण सकारात्मक (चित्रा 1बी) । नकारात्मक नियंत्रण और टेस्ट वेल्स के लिए औसत प्रतिशत के जीवित स्कोर के लिए बिन्नी ने संकेत दिया कि टेस्ट वेल्स ने कंट्रोल वेल्स (चित्रा 1सी) का प्रदर्शन किया ।

उंमीदवार स्क्रीन: छोटे पैमाने पर स्क्रीन एक ऊपर वर्णित पुनर्परीक्षण के समान तरीके से किया जा सकता है । यहां, हम 139 यौगिकों के साथ एक उंमीदवार स्क्रीन से परिणामों का वर्णन । इन उंमीदवारों को लंबी उंर को बढ़ावा देने की संभावना संरचनाओं के रूप में इकट्ठे थे । इस स्क्रीन के लिए, हम दो अलग खुराकों (50 µ मीटर और 100 µ मीटर) में परीक्षण प्लेटों की 5 दोहराने का प्रदर्शन किया. इसके अतिरिक्त, हम दो अलग खुराक युक्त एक एकल सकारात्मक नियंत्रण (NP1) प्लेट के साथ 8 नकारात्मक नियंत्रण प्लेटों का उपयोग किया; ५० µ मीटर आणि १०० µ मी.

नकारात्मक नियंत्रण प्लेटों पर नजर रखी गई जब तक ~ पशुओं के 90% मृत थे । उस समय, कुओं सभी नियंत्रण कुओं में रहते है और मृत कीड़े गिनती द्वारा बनाए गए थे, और परीक्षण कुओं कि रहते कीड़े निहित से । स्कोरिंग के समय जीवित प्रतिशत प्रत्येक अच्छी तरह के लिए औसत प्रतिशत जीवित स्कोर की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया गया । नकारात्मक नियंत्रण के लिए, 32 कुओं था प्रतिशत जिंदा स्कोर से 8 प्रतिकृति. सकारात्मक नियंत्रण के लिए, वहां थे 4 अच्छी तरह से प्रत्येक खुराक के लिए 4 में औसत स्कोर को दोहराने । हिट वेल्स के लिए एक औसत प्रतिशत जीवित स्कोर है कि औसत नकारात्मक नियंत्रण प्रतिशत से अधिक था के साथ बुलाया गया था + 2 एसडी स्कोर जिंदा । यह कटऑफ उंमीदवार स्क्रीन से 14 हिट छोड़ दिया और नकारात्मक नियंत्रण कुओं के सभी बाहर रखा । कि कटऑफ भी सकारात्मक नियंत्रण कुओं के सभी 100 µ मीटर और सकारात्मक नियंत्रण के 50% में इलाज के 50 µ m पर इलाज शामिल थे । इन परिणामों के रूप में यहां प्रस्तुत कर रहे है बिन्नी दोनों के लिए औसत प्रतिशत जीवित स्कोर 50 µ एम (चित्रा 2) और 100 µ एम (चित्रा 2बी) परीक्षण स्क्रीन ।

अंत में, सभी प्लेटें फिर से एक देर से समय बिंदु पर रन बनाए थे, जो एक समय था जब नकारात्मक नियंत्रण के 99% से अधिक से संबंधित पशुओं का इलाज किया मर गए । उन परिणामों ने संकेत दिया कि सकारात्मक नियंत्रण कुओं अभी तक बाहर नकारात्मक नियंत्रण और परीक्षण कुओं प्रदर्शन (चित्रा 2सी) । जबकि परीक्षण कुओं नकारात्मक नियंत्रण से थोड़ा बेहतर थे । यह उत्तरार्द्ध परिणाम संकेत है कि परीक्षण कुओं के कई नियंत्रण उपचार (तालिका 1) के सापेक्ष विषाक्तता प्रदर्शित करने के लिए प्रकट द्वारा पक्षपातपूर्ण है, जिससे इस सरल व्याख्या को मिला । यह उंमीद की जा रही थी, के बाद से उंमीदवार पुस्तकालय सी. एलिगेंसमें अज्ञात जैविक गतिविधि के साथ रसायनों की एक सही स्क्रीन था, जबकि फिर से परीक्षण स्क्रीन मूलतः पूर्व यौगिकों कि विषाक्त नहीं थे के लिए जांच की थी । चूंकि इस प्राथमिक स्क्रीन यौगिकों कि लंबी उंर के लिए गया था, काफी विषाक्त रसायनों फिर से परीक्षण सेट में नहीं होना चाहिए था ।

Figure 1
चित्र 1 : एक उच्च प्रवाह स्क्रीन और पुनः परीक्षण से प्रतिनिधि परिणाम
(एक प्रतिनिधि नकारात्मक नियंत्रण फिर से परीक्षण परख में इस्तेमाल प्लेट सेएक) उत्तरजीवी वक्र । इस वक्र 24 परख के 18 दिनों में 4 बार इस परख में इस्तेमाल कुओं में सभी रहते है और मृत कीड़े स्कोरिंग से निर्माण किया गया था । वयस्कता के 18 दिन में, नियंत्रण के लिए ~ 5% अस्तित्व का आकलन किया गया और सभी नियंत्रण परीक्षण और प्लेटें तो भी रन बनाए थे । (B) स्क्रीन के परिणामों को सारांशित करने वाली तालिका और पुनः परीक्षण । () वेल्स के बिन्नी ने पुनः परीक्षण स्क्रीन से नियंत्रण और परीक्षण दोनों शर्तों के लिए औसत प्रतिशत जिन्दा स्कोर किया. नियंत्रण के लिए, स्कोर 48 कुओं से प्रत्येक 3 की औसत से मिलकर कर रहे है दोहराने । परीक्षण के परिणाम 179 कुओं से प्रत्येक से मिलकर कर रहे है औसत स्कोर से तीन प्रतिकृतियां । चित्र 1 पिछले प्रकाशन1से पुनरुत्पादित है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : एक उंमीदवार स्क्रीन से प्रतिनिधि परिणाम
(A) बिन्नी के 50 µ मीटर परीक्षार्थी स्क्रीन से नतीजों की जांच करते हैं । 139 टेस्ट अच्छी तरह से परिणाम औसत प्रतिशत जीवित स्कोर 5 से दोहराने का प्रतिनिधित्व करते हैं । 32 नकारात्मक नियंत्रण परिणामों से 8 दोहराने औसत प्रतिशत जीवित स्कोर से मिलकर बनता है । 4 सकारात्मक नियंत्रण परिणाम से 4 से औसत प्रतिशत जिंदा स्कोर से मिलकर बनता है (16 कुल कुओं में 50 µ मीटर NP1 युक्त) । () बिन्नी ने 100 µ मीटर परीक्षार्थी स्क्रीन से परिणामों की जांच की । सभी के रूप में एक ही है (एक), सिवाय इसके कि परीक्षण कुओं और सकारात्मक नियंत्रण में 100 µ मीटर सांद्रता पर इलाज किया गया । दोनों (A और B) में समान ऋणात्मक नियंत्रण प्लेटें दिखाई देती हैं । () पुनः से प्रतिनिधि परिणाम एक अपेक्षाकृत अति देर समय बिंदु पर प्लेटों स्कोरिंग । सकारात्मक नियंत्रण नाटकीय रूप से अंय सभी प्रदर्शन, अगर इस समय बिंदु पर रहते कीड़े के साथ कुओं के प्रतिशत के लिए सिर्फ लेखांकन, जो परीक्षण कुओं के खिलाफ पक्षपाती के रूप में मुख्य पाठ और 1 तालिकामें वर्णित है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

औसत प्रतिशत के स्कोर पर जिंदा रहे बिन्नी
समूहीकृत स्कोर सभी मृत (0) 1-10 11-20 21-30 31-40 > 41
पुनः परीक्षण
# का (-) नियंत्रण 16 31 1 0 0 0
टेस् ट वेल्स की # (50 µ m) 46 69 50 8 3 3
उमेदवार विक्री
# का (-) नियंत्रण 0 11 21 0 0 0
के # (+) नियंत्रण (50 µ m) 0 0 2 2 0 0
के # (+) नियंत्रण (100 µ m) 0 0 0 0 2 2
टेस् ट वेल्स की # (50 µ m) 94 22 21 2 0 0
टेस् ट वेल्स की # (100 µ m) 86 25 21 6 1 0

तालिका 1: प्रतिनिधि अलग स्क्रीन से बिन्नी परिणाम
यहाँ हम दोनों परदेस (री-टेस्ट और उम्मीदवार) से औसत प्रतिशत जिन्दा स्कोर करने वाले बिन्नी को पेश करते हैं. फिर से परीक्षण स्क्रीन में, चोटी के साथ नकारात्मक नियंत्रण के समान है फिर से नकारात्मक नियंत्रण नाटकीय रूप से सही (लंबे समय तक रहता है) मेज की ओर परीक्षण । यह पुनः परीक्षण सेट में मौजूद एकाधिक समर्थक दीर्घायु यौगिकों की उपस्थिति को इंगित करता है । उंमीदवार स्क्रीन में, हम देखते है कि चोटी सभी मृत श्रेणी में है, जबकि वहां भी तालिका के दाईं ओर से एक स्पष्ट संकेत है । यह प्रत्याशी सेट में समर्थक दीर्घायु यौगिकों की उपस्थिति इंगित करता है, लेकिन यह भी यौगिकों का सेट उंमीदवार के बीच महत्वपूर्ण विषाक्तता की उपस्थिति इंगित करता है ।

Discussion

यहां हमने 96-वेल प्लेट्स में संवर्धन C. एलिगेंस के लिए एक सरल विधि बताई है । हम रासायनिक स्क्रीनिंग और उंर परख में उपयोग के लिए इन संस्कृतियों का वर्णन है, लेकिन वे परख के कई प्रकार के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । जबकि रासायनिक स्क्रीनिंग के लिए बहु अच्छी तरह से संस्कृति की स्थिति पहले8सूचना दी गई है, उंर विश्लेषण10के लिए सहित, परख यहां वर्णित कई मायनों में अलग है । उंर परख यहां वर्णित 96 का इस्तेमाल अच्छी तरह से प्लेटें, बाँझ म्यूटेंट पर निर्भर करता है (बजाय रासायनिक नसबंदी के), का प्रयोग करती है संस्कृति की स्थिति, सरल तरल हैंडलिंग कीड़ों को स्थानांतरित करने के लिए उपयोग करता है, और मैंयुअल रूप से समापन बिंदु पर रन बनाए । विभिंन इस परख में इस्तेमाल दृष्टिकोण जांच तरीकों कि इन शर्तों में शामिल की तलाश में शोधकर्ताओं के लिए मदद की हो सकती है ।

इस प्रोटोकॉल के लिए महत्वपूर्ण तत्वों परख के लिए उत्पादित प्लेटों की गुणवत्ता पर मुख्य रूप से केंद्र । प्लेटें बनाने के पहले, यह आवश्यक है कि आगर सतह बुलबुले और अन्य खामियों से मुक्त है । आगर सतह में इन परिवर्तनों को लगभग हमेशा burrowing और अच्छी तरह से नुकसान के लिए सीसा । दूसरा, इस प्रोटोकॉल सेटअप और drugging चरणों के दौरान जमा बंद तरल पदार्थ सुखाने पर निर्भर करता है । यह महत्वपूर्ण है कि इन तरल पदार्थ पूरी तरह से हटा रहे हैं, लेकिन आगर सूख नहीं बन जाता है । Anecdotally, यह प्रतीत होता है कि कुओं में कीड़े है कि पूरी तरह से सूख नहीं कर रहे है (तरल में तैराकी) से अधिक ठीक से सूखे कुओं रहते हैं, जबकि अधिक प्लेटों के सूखने की ओर जाता है और सुखाना के खुर, जो कीड़ा burrowing और नुकसान की ओर जाता है । इस प्रोटोकॉल का एक अंय महत्वपूर्ण तत्व बाँझ स्थितियों को बनाए रखने है । किसी भी उंर परख के साथ के रूप में, वहां की थाली सेटअप के साथ शामिल काम का एक बहुत कुछ है, और कई अवसरों और समय संदूषण बर्बाद कर व्यवस्थित और प्लेटों पर बढ़ने के लिए परख के लिए मौजूद हैं ।

जबकि उंर परख यहां वर्णित सी. एलिगेंसमें यौगिकों की स्क्रीनिंग के लिए उपयोगी है, यह विशेष आनुवंशिक पृष्ठभूमि तक ही सीमित है, के रूप में यह एक तापमान संवेदनशील (टीएस) बाँझ तनाव पर निर्भर करता है; हम TJ1060, जो उच्च बाँझ penetrance है इस्तेमाल किया । यह इस विधि के साथ स्क्रीनिंग के लिए उपलब्ध उपभेदों को प्रतिबंधित करता है । वांछित पृष्ठभूमि में टीएस बाँझ उत्परिवर्तनों को पार करने या रासायनिक नसबंदी का उपयोग सहित वैकल्पिक दृष्टिकोण. हमने इस परख के साथ रासायनिक नसबंदी की कोशिश नहीं की है, लेकिन यह संभव होना चाहिए । संभावित बाधाओं को सही मंच पर और उचित खुराक में कीड़े पर बंध्याकरण रखने शामिल हैं । प्रोटोकॉल यहां वर्णित एक तरल मशीन है कि तेजी से है का उपयोग करता है, लेकिन करने के लिए वयस्कों को प्रभावी ढंग से वितरण प्रकट नहीं होता । तो, इन कीड़ों प्लेटों पर विकसित और इसलिए प्लेटों पर नसबंदी रासायनिक के साथ इलाज किया जाना चाहिए । इष्टतम खुराक और समय का निर्धारण सफलता के लिए महत्वपूर्ण होगा । वैकल्पिक रणनीतियों एक वितरण विधि है कि वयस्कों को स्थानांतरित कर सकते है का उपयोग शामिल है । अतीत में, हमने पाया है कि मशीनों की पहचान करने और तरह वयस्कों आम तौर पर बहुत सरल तरल संचालकों, जो निलंबित लार्वा के समरूप slurries वितरण कर सकते है की तुलना में धीमी कर रहे हैं ।

सामांय में, हम तेजी से उंर पर बड़े सकारात्मक प्रभाव के लिए रसायनों और उपचार स्क्रीन के लिए इस विधि का उपयोग करें । विधि विशेष रूप से प्रभावी है जब एकाधिक खुराक, उच्च दोहराने की संख्या के साथ प्रयोग किया जाता है, और नकारात्मक नियंत्रण है कि हमेशा बनाए रखा और परीक्षण प्लेटों के बीच interspersed के करीब निगरानी । इस पांडुलिपि में वर्णित स्क्रीन को डिजाइन और कार्यान्वित करते समय सकारात्मक नियंत्रण भी उपयोगी होते हैं । हालांकि, एक प्रभावी सकारात्मक होने के लिए, नियंत्रण के लिए काफी शक्तिशाली और/ जब स्क्रीन मूल रूप से लागू किया गया था, एक उपयुक्त प्रबल और मजबूत यौगिक पहचाना नहीं जा सका । वर्तमान में, यहां वर्णित स्क्रीन में उपयोगी सकारात्मक नियंत्रण के लिए संभावित उंमीदवारों के ' बुढ़ापे ' साहित्य में कई रिपोर्टों रहे हैं । इस पांडुलिपि के अपेक्षित परिणाम खंड के उंमीदवार स्क्रीन अनुभाग में वर्णित के रूप में, और चित्रा 2 और तालिका 1में, यौगिक NP1 इस स्क्रीन के लिए एक प्रभावी सकारात्मक नियंत्रण है । हम आम तौर पर 3 mm संस्कृति प्लेटों पर मानक उंर परख के साथ इन स्क्रीन से सकारात्मक हिट की पुष्टि करें ।

Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि कोई धन इस काम का समर्थन इकाई डेटा के संग्रह पर कोई इनपुट था, परिणामों का विश्लेषण, या प्रकाशित करने का निर्णय ।

Acknowledgments

हम तकनीकी सहायता के लिए दिपा Bhaumik, हारून मिलर और बॉब ह्यूजेस धंयवाद । उपभेदों CGC द्वारा प्रदान की गई, जो अनुसंधान अवसंरचना कार्यक्रम (P40 OD010440) के NIH कार्यालय द्वारा वित्त पोषित है । हम जॉर्जिया वुड्स और उपयोगी विचार विमर्श के लिए वृद्धि, कपाही और Melov लैब्स के सदस्यों के लिए आभारी हैं । एमएल स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों (NIH) प्रशिक्षण अनुदान T32 AG000266 और एक एलिसन मेडिकल फाउंडेशन/अमेरिकन फेडरेशन ऑफ एजिंग रिसर्च पोस्ट डॉक्टरेट फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया था । यह काम BioAge लैब्स, एक लैरी एल Hillblom फाउंडेशन अनुदान, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से स्वास्थ्य अनुदान UL1024917 के राष्ट्रीय संस्थानों से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, Geroscience पर अनुशासनात्मक अनुसंधान कंसोर्टियम का समर्थन है, और 1R01AG029631-01A1 G.J.L.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LB Broth Miller Granules VWR
Unispense  Wheaton Science Products automated fluid dispensing apparatus
96 well assay plate; COSTAR 3370 Corning
Multidrop 384; automated 8 channel dispenser Thermo Fisher Scientific
manufactored worm pick Genesee Scientific
Belly Dancer Orbital Shaker Stovall Life Science inc.
microplate shaker; MTS 2/4 Digital IKA Works, inc. 
automated 96-well liquid handler; Biomek FX Liquid Handler  Beckman Coulter
automated 96-well liquid handler; Bench Top Pipettor  Sorenson Bioscience, inc.
manual 8 or 12 multi-channel pipettes we use rainin…
transparent 96 well film cover; TempPlate RT Optical Film  USA Scientific
table top centrifuge; Centrifuge 5810 R Eppendorf

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References

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<em>Caenorhabditis एलिगेंस</em> में उच्च प्रवाह रासायनिक स्क्रीनिंग के लिए एक सरल तरीका
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Lucanic, M., Garrett, T., Gill, M. S., Lithgow, G. J. A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans. J. Vis. Exp. (133), e56892, doi:10.3791/56892 (2018).More

Lucanic, M., Garrett, T., Gill, M. S., Lithgow, G. J. A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans. J. Vis. Exp. (133), e56892, doi:10.3791/56892 (2018).

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