Summary
Trombocyttal lagerstyring baseret på screening microparticle indhold i trombocyttal koncentrater er en ny kvalitet forbedring initiativ i hospitalers blodbanker. Målet er at differentiere aktiveret fra ikke-aktiveret blodplader til at optimere brugen af blodplader. At yde ikke-aktiveret blodplader til hæmatologi-onkologi patienter kan reducere deres høje risiko bliver ildfaste.
Abstract
Trombocyttal lagerstyring baseret på screening microparticle indhold i trombocyttal koncentrater er en ny kvalitet forbedring initiativ for hospitalers blodbanker. Celler fragment fra mikropartikler (MP) når de er stressede. Blod og blodkomponenter kan indeholde cellulære fragmenter fra en bred vifte af celler, især fra aktiveret blodplader. Når du udfører deres roller som medfødte immun celler og store aktører i koagulation og hæmostase, blodplader Skift figur og generere mikropartikler. Med dynamisk lysspredning (DLS)-baseret microparticle opdagelse, er det muligt at differentiere aktiveret (høj microparticle) fra ikke-aktiveret (lavt microparticle) blodplader i transfusioner, og optimere anvendelsen af dette knappe blodprodukt. Tidligere forskning tyder på, at give ikke-aktiveret blodplader til profylaktisk brug i hæmatologi-onkologi patienter kunne reducere deres risiko for at blive ildfaste og forbedre patientplejen. Målet med denne screeningsmetode er at rutinemæssigt differentiere aktiveret fra ikke-aktiveret blodplader. Metoden beskrevet her skitserer trinene der skal udføres rutinemæssig trombocyt lagerstyring i en blodbank: at opnå en stikprøve fra en trombocyt transfusion, Ilægning af prøven i kapillær DLS måling, udfører DLS test til identificere mikropartikler, og ved hjælp af den rapporterede microparticle indhold til at identificere aktiveret blodplader.
Introduction
Interessen for mikropartikler har drejet sig hovedsagelig om deres deltagelse i celle til celle kommunikation og biologiske processer. 1 , 2 , 3 for nylig, mikropartikler har også tiltrukket interesse som potentielle tidlig diagnostisk markører af autoimmune og hjerte-kar-sygdomme. 4 , 5 mikropartikler, også kendt som ekstracellulære blærer eller exosomes, har været bredt undersøges ved flowcytometri. Desværre, på trods af bestræbelserne på at standardisere konventionel flow flowcytometri protokoller der er ikke enighed om den optimale protokol til brug. 6 , 7 , 8 , 9 , 10
Selv om konventionelle flowcytometri kan karakterisere specifikke MP delpopulationer, rapporterede11 det har flere begrænsninger. 11 , 12 , 13 , 14 nogle af disse begrænsninger er blevet behandlet ved hjælp af højere magt lasere og detektorer i en såkaldt "små partikler option",15,16 samt påvisning på 15-25 ° fremad scatter vinkel og modificeret kappe pres . 17 , 18 alligevel, en hurtig og nem at bruge screeningsmetode, der kan kombineres med disse sofistikerede metoder er stadig nødvendig for at udnytte mikropartikler som tidlig diagnostisk markører. Forhøjede niveauer af mikropartikler er påviselige i omkring en tredjedel af normal blod donorer19 og kan indikere subklinisk betingelser. Høje microparticle niveauer i donorblod produkter kan derfor uforenelig med sårbare modtagere. 20
Når de leverer trombocyt transfusioner, er der en risiko for ikke-immune refraktion - en tilstand, hvori en patients krop afviser fortløbende transfusioner og tillader ikke, at en betydelig del af blodplader til at cirkulere. 21 , 22 ikke-immune refraktion kan resultere i spildt transfusioner, sundhedsmæssige komplikationer for patienter og udvidede hospital stays. 23 trombocyt transfusioner med høje numre af mikropartikler kan være en medvirkende faktor for udviklingen af ikke-immune refraktion i sårbare hæmatologi-onkologi patienter. 20 det er muligt at administrere trombocyt lager Ifølge sammensætningen af trombocyt transfusioner ved screening for mikropartikler dermed mindske risikoen for sårbare patienter. Men de fleste microparticle tests kræver isolering af mikropartikler fra blodplader5,12 eller er ellers meget labor intensivt24,25 , og kan derfor ikke gennemføres rutinemæssigt på hospitalet blodbanker.
Den teknik beskrevet bruger her dynamisk lysspredning (DLS) - også kendt som photon korrelation spektroskopi eller kvasi elastisk lysspredning. I årtier, har dynamisk lysspredning været flittigt brugt i den farmaceutiske industri til at karakterisere liposomal narkotika formuleringer eller emulsioner hvor partikelstørrelser er i rækken sub micron. 26 , 27 imidlertid værktøjer udviklet til disse programmer er ikke optimeret til skærmen blodprodukter. En ny DLS system blev udviklet for at overvinde de tekniske begrænsninger og skabe dynamiske lys spredning nyttig for screening af trombocyt transfusioner. 28
Dynamisk lysspredning målingerne udføres af lysende de suspenderede partikler med laserlys og analyserer tid variationen af spredte lysintensiteten, som er en konsekvens af partikler i suspension. Yderligere, denne metode bruger inverse forholdet mellem partikel hastighed og størrelse - små partikler gå hurtigt og store partikler bevæger sig langsomt - at give oplysninger om størrelse distributioner og relative koncentrationer af prøven komponenter. Ved hjælp af DLS, den gennemsnitlige microparticle kan indhold og gennemsnitlige radius af komponenten microparticle kvantificeres. Indhold af mikropartikler i blodprodukt er givet som % MP baseret på området i den målte histogram for partikel radier fra 50-550 nm. Mens partikler med radier under 50 nm registreres af DLS og rapporteret af DLS system, de ikke indgår i % MP. I stedet for at isolere mikropartikler fra blodplader, bestemmes heterogenitet af trombocyt transfusioner baseret på den relative indhold af mikropartikler og blodplader i en prøve. I virkeligheden, kan forholdet mellem trombocyttal og microparticle toppene bruges til at beregne den absolutte MP koncentration når trombocyttallet er kendt. 19
DLS giver sundhedspersonale med kvalitative og kvantitative oplysninger om mikropartikler fundet i prøver fremstillet af humant blod eller blodprodukter. Den største fordel ved den beskrevne DLS teknik over alternative teknikker såsom flowcytometri, elektronmikroskopi,29 nanopartikel tracking analyse30 eller afstemmelige resistive puls sensing31 er prøveforberedelsen: delprøver af trombocyt koncentrater kan måles direkte uden at skulle isolere MP fra blodplader, prøveopløsning eller andre ændringer. 9 , 17 endvidere DLS er en absolut dimensionering metode og lider ikke af manglen på kalibrering perler med passende brydningsindeks. 14 , 32
En sammenhæng mellem trombocyt aktivering og MP indhold har tidligere vist ved mikroskopi33,20 og kan udledes af stigningen i MP indhold i patologiske tilstande15,34, 35 , 36 og betingelser in vitro- kendt for at aktivere blodplader. 19 , 37 , 38 dog yderligere undersøgelser er nødvendige for fuldt ud at forstå forholdet mellem DLS-målt microparticle indhold og trombocyt aktivering. Baseret på vores nuværende viden, aktiveres blodpladerne indeholder høje numre af mikropartikler, de er bedst anvendes til terapeutisk behandling af aktivt blødning patienter39, mens hæmatologi-onkologi patienter drage fordel af ikke-aktiveret blodplader med ingen eller lavt indhold af mikropartikler20. Det er for nylig blevet rapporteret, at in vitro- lydhørhed af donor blodplader ikke markant indvirkning, recovery og overlevelse af disse blodplader i enkelt transfusioner til stabile, for det meste ikke blødning hæmatologi-onkologi patienter40 . Af denne konstatering, kan det konkluderes, at trombocyt aktivering identificeret ved høj MP indhold også spiller nogen væsentlig rolle i den forebyggende behandling af patienter. Men på grund af den smalle udvalg af patienter, denne undersøgelse ikke adresse donor faktorers indvirkning for komplekse patienter, der er febril (udelukket fra undersøgelsen), ikke stabil og modtager mange mere end bare et trombocyttal transfusion. Spørgsmålet hvordan kompleksiteten af disse patienters tilfælde kan reduceres - som holder løftet om at reducere refraktion - forbliver ubesvaret.
Mikropartikler er tidlige markører for inflammation41,42,43,44 og trombocyt aktivering45 og opdages derfor i mange normale donorer. 19 derfor, aktiveres blodpladerne og mikropartikler er til stede i trombocyttal donationer. Det er rimeligt at hypotesen om, at patienter med feber, dvs, en fuldt aktiveret medfødte immunsystem, ikke kan tåle den ekstra udfordring af en transfusion af aktiverede blodplader. Men undersøgelser er nødvendige for at bevise denne hypotese. Microparticle screening kan afhjælpe den nuværende usikkerhed om indholdet af trombocyt transfusioner og reducere kompleksiteten af patientbehandlingen.
Forholdet mellem aktiveret til ikke-aktiveret blodplader i en blodbank afhænger først og fremmest befolkningens donor og i langt mindre grad om transport, bestråling, patogen inaktivering og andre processer, der kan øge trombocyt aktivering i koncentrater. 19 data fra store hospitalers blodbanker i USA viste, at den gennemsnitlige sammensætning af trombocyt lager er 49% aktiveret og 51% ingen-aktiveret (interval for aktiverede blodplader: 38-62%, personlig kommunikation). Hvis blod produkt udbydere eller hospitalsblodbanker ønsker at vide, hvor mange aktiveret og ikke-aktiveret trombocyt koncentrater, de producerer eller modtager, og ønsker at styre deres beholdning baseret på trombocyt aktivering som anført af microparticle indhold, dette protokollen kan være relevant for dem.
Baseret på trombocyt sammensætning en blodbank vil være i stand til direkte ikke-aktiveret, homogen blodplader for profylaktisk brug og aktiveret, heterogene blodplader til terapeutisk brug. Trombocyttal screening gør det muligt hospitaler til at maksimere brugen af den tilgængelige lagerbeholdning, som forbedrer patientpleje og nedsætter omkostningerne. Denne protokol er beregnet til laboratoriepersonale, der er bekendt med grundlæggende håndtering og manipulation af blodprodukter.
Præsenteres her er en screeningsmetode for mikropartikler i trombocyttal transfusioner, der rutinemæssigt kan anvendes til at administrere hospital blodbank lager hvor at vælge produkt baseret på microparticle indhold er ønskeligt. Formålet med denne protokol er at skitsere gennemførelsen og evalueringen af DLS for screening af donerede blodplader. Den beskrevne protokol adresser de almindelige spørgsmål af non-invasiv adgang til prøver, integration af test i blodbank arbejdsflow og præstationsegenskaber.
Protocol
Følgende protokol er blevet udført i overensstemmelse med alle canadiske blod tjenester (CBS) retningslinjer. Frivillige gav samtykke, at deres donationer kunne være brugt til at udføre disse undersøgelser. Trombocyttal koncentrater blev udarbejdet ifølge CBS standardforskrifter. Alle performance test beskrevet her blev udført på centret for blod forskning på University of British Columbia, Vancouver, Canada med institutionelle etik forskningsudvalg godkendelse.
1. kvalitetskontrol Check
- Udføre en kvalitetskontrol kontrol mindst én gang pr. test dag at kontrollere den korrekte funktion af ordningen med DLS. Måle forudsat kontrol beads (50 nm radius) følge producentens vejledning til brug.
- Hente kontrol hætteglasset fra kølelager og tillade 15 min at varme til stuetemperatur. Perlerne skal reagensglasset stuetemperatur før anvendelse.
- Tænde DLS system før forberede prøven så 15 min laseren varme op periode er fuldført, når den første prøve er klar til test.
- Når konsollen er startet, skal du følge instruktionerne på berøringsskærmen til at logge på og vælge indstillingen System Test til at måle kontrolprøve.
- Vortex Bland hætteglas til 10 s for at sikre en repræsentativ stikprøve.
- Fyld en kapillær med kontrol perlerne ved hjælp af en 100 µL fast volumen pipette, pipette tip og kapillær fra testkit.
- Når testen er fuldført skal du følge instruktionerne på skærmen på DLS system.
Bemærk: Kontrol perle testresultater er automatisk i forhold til oplysningerne i kontrol perle stregkodeetiket og en PASS eller mislykkes anmeldelse samt prøve oplysninger vises på skærmbilledet DLS system i slutningen af testen.
2. at opnå en prøve fra et trombocyttal koncentrat
Bemærk: Disse trin beskriver processen for non-invasiv prøveudtagning fra trombocyt transfusion i DLS test kapillær rutinemæssig trombocyt lagerstyring. En oversigt er vist i figur 1. Nødvendige tilbehør: rør sealer, manuel tube stripper, saks og splash skærme.
- Fjerne trombocyt koncentrat fra uprøvet opgørelse.
- Opnå prøve af trombocyt produkt enten fra en ubrugt prøveudtagning pose (Fortsæt til trin 2.3) eller en slange segment (Fortsæt til trin 2.4 Hvis tomme eller trin 2.5 Hvis ikke tømme).
Hvis du vil afbryde posen bruge slanger eller slange segment et rør sealer. Følg producentens anvisninger til at operere rør sealer. Kort, klemme slangen til at blive beseglet i en præcis position mellem to opvarmede kæber. I en håndholdt enhed, skal du trykke på den smeltet slanger sammen og afkøles under højtryk mens du trykker på håndtaget (varighed er angivet med grønt lys) resulterer i en permanent, lækagesikre segl. -
Prøvetagning fra en pose
- Bland indholdet af trombocyt posen godt af blid vandret bevægelse for 5 s (deponering fra ende til anden fem gange).
- Åbne klemmen til posen. Posen er evakueret og fylder i sig selv. Det er ikke nødvendigt at fylde posen helt som kun 100 µL prøven vil blive krævet for DLS test.
- Fjern posen fra posen ved varmeforsegling de forbinder rør med et rør sealer. Fortsæt med trin 3.
-
Prøvetagning fra tomme rør
- Kontroller, at trombocyt taske slanger har været gemt Tom og slangen blok er stadig på plads. Visuelt inspicere slangen for at kontrollere, at der ikke er en betydelig mængde af trombocyt koncentrat i slangen. Hvis slangen ikke er tom fortsætte med trin 2,5.
- Luk røret stripper på slangen som tæt på slangen blok som muligt ved at komprimere håndtagene for at klemme slangen mellem rullerne.
- Hænge tasken lodret og holde komprimere stripper håndtag.
- Mens holde stripper lukket, slip slangen blok.
- Langsomt trække stripper ned Tom slangen giver mulighed for slanger til langsomt fylde bag stripper. Fortsætte indtil afsnittet nedenfor stripper har fuldt oppustet eller stripper er inden for 1 tomme udgangen af slangen.
- Når standsested er nået med stripper, brug rør sealer til varme forsegle slangen 1 tomme over stripper.
- Frigive håndtag for manuel tube stripper.
- Varme seal igen 1-2 inches over den tidligere sæl at oprette den Test segment.
- Afbrød den Test segment fra trombocyt enhed. Dette segment vil blive brugt til DLS test.
-
Prøvetagning fra slangen, ikke der er tomme
- Hænge tasken lodret og frigøre slangen blok hvis på plads.
- Visuelt inspicere slangen for at afgøre, om der er nogen væsentlig solid klumper. Hvis der findes solid klumper, forsegle over dem sådan, at de ikke kan fjernes i posen.
- Luk røret stripper på slangen som tæt forseglet rør som muligt.
- Strip indholdet af slangen i posen ved at komprimere håndtagene for at klemme slangen mellem rullerne, og samtidig opretholde lukketryk, flytte røret stripper langs slangen mod posen.
- Fjern trombocyt taske fra hængende krog og forsigtigt mix taske til 5 s ved deponering det fra ende til anden fem gange samtidigt med at holder stripper lukket.
- Hænge tasken lodret samtidig holde stripper lukket.
- Langsomt trække stripper ned Tom slangen, giver mulighed for slanger til langsomt fylde bag stripper. Fortsætte indtil afsnittet nedenfor stripper har fuldt oppustet eller stripper er inden for 1 tomme udgangen af slangen.
- Når standsested er nået med stripper, brug rør sealer til varme forsegle slangen 1 tomme over stripper.
- Frigive stripper.
- Varme seal igen 1-2 inches over den tidligere sæl at oprette den Test segment.
- Skåret og skille sig af med den sidste del af slangen.
- Afbrød den Test segment fra trombocyt enhed. Dette segment vil blive brugt til DLS test.
3. Fyld prøven til DLS test kapillær
- Brug en splash skærme og ren, tør saks, skåret ene ende af posen slanger eller Test segment.
Bemærk: Kapillar bruges til DLS test bør fyldt straks. - Fylde kapillar ved hjælp af værktøjet prøveudtagning (samlet 100 µL fast volumen pipette, pipette tip og kapillær) trække prøven direkte fra åbnede posen eller slange segment i kapillar.
- Forsegle bunden af den fyldte kapillær ved forsigtigt at skubbe den fyldte kapillær i kapillarrør fugemasse under anvendelse af en blid twist og pres mod bakken.
- Afbryde den 100 µL fast volumen pipette og tip fra kapillær, sikre kapillar forbliver fast forankret i kapillarrør fugemassen.
- Fjerne kapillar fra bakken kapillarrør fugemasse, tørres af med en isopropylalkohol pad og sikre, at ingen luftbobler er fanget af forsigtigt svippede i bunden af kapillar.
- Sted kapillær i DLS-systemet.
4. udførelse af DLS testen
- Vælg indstillingen MP test til at indlede en ny DLS test til måling af microparticle indhold af et trombocyttal prøve.
- Angiv prøve oplysninger (Donation identifikation nummer (ISBT), samling/produktion udløbsdato og Product Code) ved hjælp af stregkodescanner eller manuelt.
- Hvis ingen produktkoden er tilgængelig som DLS system kan udtrække den flydende medium oplysninger, vælge den passende flydende medium manuelt (for de fleste trombocyt koncentrater Vælg plasma men prøver indeholdende trombocyt tilsætningsstof løsning (PAS), angive den procentdel af resterende plasma).
Bemærk: En lille afvigelse i PAS procentdel fra den nominelle 65% vil medføre en lille fejl i viskositet (automatisk beregnet af DLS system) som minimalt påvirker den beregnede MP radius, men ikke % MP. - Placer kapillar i DLS systemet når instrueret og starte testen.
- Når testen er fuldført, skal du fjerne prøven fra kapillær indehaveren og bortskaffe hjælpematerialer passende ifølge facilitet retningslinjer. Fjerne prøven fra kapillær indehaveren og bortskaffe hjælpematerialer passende ifølge facilitet retningslinjer.
- Tag trombocyt taske med den farve, der svarer til det resultat, for eksempel orange for ikke-aktiveret (ensartet) med % MP lig med eller under 15% og lyserødt til aktiveret (heterogene) med % MP over 15%.
Figur 1 : Metode oversigt. Oversigt over trinene der skal udføres rutinemæssig trombocyt lagerstyring i en blodbank: at opnå en stikprøve fra en trombocyt koncentrat, Ilægning af prøven i kapillær DLS måling, udfører DLS test for at identificere mikropartikler og ved hjælp af den rapporterede microparticle indhold til at identificere aktiveret blodplader. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Representative Results
Gennemsnitlige forberedelsestid
Trombocyttal screening proces ved hjælp af en DLS system er sammenfattet i figur 1. Blodplader er testet med DLS systemet på tidspunktet for modtagelse fra blod leverandør. Som beskrevet i tabel 1 , er den gennemsnitlige forberedelsestid til uddannede brugere 2 min 23 s mens oprydning og post-test arbejdstider er 14 s og 46 s, henholdsvis. I alt, den gennemsnitlige bruger tager 3 min og 23 s hands-on tid pr. test.
| Aktivitet | Aktive tid | Gang-lager testtid | I ALT |
| Forberede DLS System | 14 s | ||
| Samle prøveudtagning værktøj | 28 s | ||
| Få segment | 52 s | ||
| Fylde kapillær og start test | 49 s | ||
| 5 min | |||
| Oprydning | 14 s | ||
| Tag og lager trombocyt taske | 46 Sørensen | ||
| Samlede tid pr. prøve | 3 min 23 s | 5 min | 8 min 23 s |
Tabel 1: aktiv test tid opdeling. Testen selv er en gåtur væk test med en gennemsnitlig varighed af 5 min. Den gennemsnitlige bruger tager 3 min 23 s til at forberede en test DLS system, få og en analyseprøve efter denne protokol og tag trombocyt taske.
Præcision
Præcisionen af DLS system blev vurderet på tre microparticle niveauer, 0-7, 12-25% og 28-75%. Den klinisk relevante række % MP er 3-75%. To operatører testet low, medium og høj kontrolprøver til 16 åbningsdage på to DLS systemer parallelt. Prøverne blev testet i to eksemplarer, men i tilfældig rækkefølge på hver test dag.
Tabel 2 opsummeres i enheden præcision af DLS målinger for procent mikropartikler (% MP) i forhold til blodplader.
| Microparticle indhold | |||
| Lav | Medium | Høj | |
| Betyde % MP (%) | 4.4 | 19,5 | 53,8 |
| Standardafvigelse (%) | 1.8 | 2.6 | 5.8 |
| CV (%) | 40,4 | 13.2 | 10.6 |
Tabel 2: inden for enhedens præcision af procent mikropartikler (% MP). På meget lavt microparticle indhold lille blodplader kan bidrage til % øget MP resulterer i variation for lavt microparticle indhold prøver.
Tabel 3 viser inden for enheden præcisionen af DLS målinger for gennemsnitlige microparticle radius mellem 50-550 nm.
| Microparticle indhold | |||
| Lav | Medium | Høj | |
| Betyde Radius (nm) | 331 | 161 | 188 |
| Standardafvigelse (mm) | 133 | 41 | 25 |
| CV (%) | 40,1 | 25.2 | 13.5 |
Tabel 3: inden for enhedens præcision af microparticle radius. På meget lavt microparticle indhold lille blodplader kan bidrage til procent mikropartikler (% MP) resulterer i øget variation for lavt microparticle indhold prøver.
Tabel 4 viser reproducerbarhed af DLS målinger for procent mikropartikler (% MP).
| Microparticle indhold | |||
| Lav | Medium | Høj | |
| Betyde % MP (%) | 4.4 | 29.2 | 53.6 |
| Reproducerbarhed (%) | 1.5 | 2.3 | 5 |
| CV (%) | 35 | 11.8 | 9.4 |
Tabel 4: Reproducerbarhed af dynamiske lys spredning (DLS) målinger for procent mikropartikler (% MP).
Linearitet
Figur 2 viser at DLS resultater er lineære, dvs., passe en lige linje med hensyn til de tildelte værdier af prøverne. Syv prøver blev udarbejdet med forskellige microparticle indhold. Prøver med høje (MP7) og lav (MP1) microparticle indhold og matchende trombocyt koncentration var forberedt og mixet i forskellige forhold for at oprette mellemliggende prøver (MPx). Prøverne blev testet med flowcytometri som tidligere beskrevet19 og DLS og % MP resultater for hver koncentration blev afbildet som input og output. Determinationskoefficienten fandtes for at være 0.985. Eksempler på DLS histogrammer for lave og høje microparticle indhold er vist i fig. 3A. DLS resultater blev bekræftet ved flowcytometri (fig. 3B).
Figur 2 : Sammenligning af flowcytometri og DLS resultater. Lineær sammenhæng mellem % MP bestemmes af Flow flowcytometri (input) og DLS (output), de oprindelige DLS data fra de to prøver, præget af åbne symbolet ○ er vist i figur 3. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Microparticle indhold til at skelne mellem aktiveret og ikke-aktiveret blodplader. (A) DLS resultaterne af MP indhold i aktiverede blodplader (stiplet linje) var 57% sammenlignet med 4% i ikke-aktiveret blodplader (solid line). Tests blev udført på en måling temperatur på 37 ° C, plasma viskositet indstilling af 1,06 x10-3 Pa·s, og samlede intensitet indstillinger mellem 200-600 kHz. (B) Flow flowcytometri resultater (opnået som beskrevet tidligere19) af de samme prøver som vist i (A); forward scatter histogrammer repræsenterer P1 og P2 MP og trombocyttal porte, henholdsvis; til aktiveret blodplader faldt (venstre) 76% af begivenheder i MP porten i forhold til 6% for ikke-aktiveret blodplader (til højre). Den lineære regressionslinje antyder en konstant relative bidrag af baggrundsstøj % MP ved flowcytometri fører til de konsekvent højere resultater. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Specificitet/interferens
International Organization for Standardization (ISO) definerer analytiske specificitet som evne af en måleprocedure til at opdage eller måle kun målestørrelsen, mens der er andre mængder, der er til stede i prøven. Den analytiske specificiteten af microparticle screening kan blive påvirket af røde blodlegemer (RBC). DLS måler MP indhold i forhold til trombocyt indhold. RBC kan interferere fordi spredning bidrag af RBC er inkluderet i spredning bidrag af blodplader, at reducere det relative bidrag fra MP. Lovfæstede grænser for det tilladte indhold af RBC i blodprodukter findes; en konservativ konvertering af tærsklen anbefalet af AABB for tilladte RBC koncentration i trombocyttal koncentrater-2 mL pakket RBC i én enhed af blodplader resulterede i 8.0 x1010 celler/L (antagelser: RBC volumen er 8,5 x10-14L, hæmatokrit af pakket RBC er 68%, trombocyttal-unittens lydstyrke er 200 mL). De rapporterede resterende RBC koncentrationer i forskellige produkter er langt under denne tærskelværdi46.
Tre forskellige donorer doneret blodplader og røde blodlegemer (RBC) på to forskellige dage, som støtteberettigede, til tre uafhængige forsøg. Den indledende RBC indhold i trombocyttal koncentrater (kontrolprøve) var 0,05 - 0,15 x109 celler/L som bestemt med en hemocytometer. Fem ekstra prøver var lavet af spiking i kendte mængder af RBC i delprøver af trombocyt koncentrat; målniveauer RBC i disse prøver blev 1.0, 5.0, 10, 40 og 80 x109 celler/L.
Tærsklen indblanding af røde blodlegemer var ca 1,0 x1010 celler/L (figur 4), som også korreleret med det niveau, hvor tilstedeværelsen af røde blodlegemer var visuelt tydeligt (figur 5). Over dette niveau, blev % MP undervurderet som betyder at i visuelt rød prøver, som indeholder RBC i stedet for hæmoglobin-den rapporterede microparticle indhold vil være for lavt.
Figur 4 : Lineær sammenhæng mellem % MP (DLS) og RBC koncentration (celler/L). Stigende RBC koncentrationer af 0,1 x109, 1,0 x109, 5.0 x109, 1,0 x1010, 4.0 x1010og 8,0 x1010 celler/L (fra venstre til højre) fra 3 uafhængige eksperimenter (○ eksperiment 1, ● eksperiment 2, □ eksperiment 3, lineær regression linjer er vist for hvert forsøg). Over 1,0 x1010 RBC/L fører til undervurdering af % MP. Visuelle udseende af RBC indeholdende prøver er vist i figur 5. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Visuel udseende af RBC indeholdende prøver. Rødme af trombocyt prøver indeholdende RBC koncentrationer af 0,1 x109, 1,0 x109, 5.0 x109, 1,0 x1010, 4.0 x1010og 8,0 x1010 celler/L fra venstre mod højre. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Nøjagtighed
Nøjagtigheden er defineret som forskellen mellem et enkelt måleresultat og en ægte antalsværdi tildelt til prøven. Denne målefejl omfatter en systematisk komponent anslået ved måling bias og en tilfældig komponent anslået af en standardafvigelse. Nøjagtigheden af et måleresultat er således en kombination af korrekthed og præcision.
En perle standard blev brugt til at fastslå rigtigheden af DLS test. Nøjagtigheden blev evalueret på to koncentrationer inden klinisk relevante for analysen af 3-75% MP. Reference perle blandinger blev brugt til at forberede prøverne af kendte koncentrationer, fordi reference perler har en kendt størrelse og koncentration. Derfor kan reference perler blandes for at få prøver med ønskede partikelstørrelse og koncentrationer.
Standard polystyren perler med en 125 nm radius blev brugt til at repræsentere mikropartikler og perler med 1,5 µm radius blev brugt til at repræsentere blodplader. Nøjagtigheden af microparticle analysen blev vurderet med perle blandinger af ca 20% og 50% MP indhold. Nøjagtigheden af de målte partikel radier sammenlignet med partikel radier dokumenteret på certifikater analyse for reference perler som vist i tabel 5.
| 125 nm perler | 1,5 µm perler | |||||
| Certifikat for analyse | Certifikat for analyse | |||||
| 20% MP | 50% MP | 20% MP | 50% MP | |||
| Betyde Radius | 122.0 | 113.8 | 124.4 | 1.5 | 1,6 | 1,60 |
| Std Dev | 4.5 | 2,83 | 3.6 | 0,035 | 0,06 | 0,07 |
| CV | 3,60% | 2,48% | 2.89% | 2,20% | 3.74% | 4.05% |
| Nøjagtighed | 6,70% | 2,00% | 6,50% | 6,30% | ||
Tabel 5: nøjagtigheden af dynamiske lys spredning (DLS) målinger. Størrelse sammenligning for DLS resultater mod analysecertifikat for perler med 125 nm radius og 1,5 µm radius i blandinger.
Discussion
Denne protokol beskriver en dynamisk lysspredning metode for microparticle screening optimeret til høj partikel koncentrationerne fundet i biologiske prøver såsom trombocyt koncentrater. Metoden for DLS er i sagens natur standardiseret til nøjagtigt for at måle størrelsen. Den relative koncentration af mikropartikler kan omdannes til en absolut koncentration, hvis trombocyttal koncentration er kendt og trombocyttal topareal anvendes som reference peak19. Som trombocyt koncentrationer fremstilles normalt med hæmatologi analysatorer eller flow cytometers disse metoder kan betragtes som følgesvend teknologier til DLS.
Funktionaliteten af DLS system er forsikret ved at køre kontrol perler regelmæssigt. Destilleret vand kan måles for at kontrollere at baggrundsstøj er minimal. Kommercielt tilgængelige trombocyt standarder kan analyseres som MP-negative kontroller og efter tilsætning af 125 nm radius perler, som MP-positive kontrol. Inden for de biologiske vifte af MP koncentrationer af interesse er procedurerne, der praktisk og hurtig til at udføre som en del af blod bank rutinen.
I modsætning til flowcytometri, er denne metode ikke baseret på sammenligne spredning intensiteter af partikler, men snarere hastigheden af deres Brownske bevægelser. Således, exosomes kan også påvises trods deres lille størrelse og er rapporteret særskilt fra MP.
Udformet som en screeningsværktøj, er begrænsninger af denne metode relateret til dets manglende evne til at skelne mellem forskellige typer af mikropartikler. Der er potentielle plads til forbedring, hvis yderligere isolation trin bruges; prøver kan blive testet før og efter de særlige fjernelse af mikropartikler gennem antistof kombineret magnetisk bead capture. Derudover kan det antages, at alle detekterede mikropartikler er celle afledte fordi Chylomichroner dannet i hyperlipidæmi47,48 og små bakterier eller vira6 vil også blive rapporteret i rækken microparticle. Men andre garantier eksisterer inden for blodforsyningen til undgå stærkt lipemic eller forurenede blodplader til at indtaste den hospital blodbank.
Valget af antikoagulans i stikprøven påvirker omfanget af trombocyt aktivering og derfor MP indhold49. Denne faktor skal anses for sammenligninger af forskellige produkter. Desuden udveksling af plasma med MP gratis suspension medier såsom PAS vil påvirke MP indhold og tærsklen for bestemmelse af heterogenitet-hvis kun omkring en tredjedel af den oprindelige MP indhold er tilbage inden for den resterende plasma i koncentrat en Derfor vil lavere MP indhold tærskel angive det samme niveau af trombocyt aktivering som 100% plasma. Procent MP er MP indhold i forhold til blodplader. Tidligere forlød det, at den gennemsnitlige trombocyttallet PAS produkt var lavere, så den gennemsnitlige % MP stadig var 9,5%19. % MP tærsklen for PAS blodplader licenseret i USA er i øjeblikket angivet til 10%.
Mens den primære kilde til MP i trombocyttal koncentrater er donor, processer, der forårsager stress til blodplader vil øge MP niveau afhængigt af modtagelighed af blodplader til at understrege-hvis blodplader er allerede stærkt aktiveret, mindre stressfaktorer såsom forlænget holdbarhed, patogen inaktivering, vask, kan bestråling eller transport over lange afstande føre til betydelige stigning i MP indhold. Ingen af disse stressfaktorer har vist sig at påvirke homogen, ikke-aktiveret blodplader19. Derudover bør opmærksomhed være opmærksom på mulighederne for ændringer i prøven sammensætning inden for kapillær hvis ikke testet umiddelbart efter fremstillingen (afslutning af trin 3 i denne protokol).
Denne protokol fokuserer på bestemmelse af partikler til stede i trombocyttal transfusioner og bruge mikropartikler som biomarkører for trombocyt aktivering sammensætning. Trombocyttal transfusioner er markeret som enten ingen-aktiveret (orange) eller aktiveret (pink) baseret på en microparticle procent tærskel på 15%. Tærsklen på 15% MP for blodplader i 100% plasma var empirisk bestemt som gennemsnit 66th percentil fra flere steder.
Formålet med trombocyt lagerstyring baseret på rutinemæssig microparticle screening med DLS er at forbedre patienternes pleje og drev omkostningsbesparelser ved at forhindre ikke-immune trombocyt refraktion. Gennemførelsen af DLS system for screening af trombocyt poser vil muliggøre bruger hen til direkte ikke-aktiveret blodplader til patientgrupper mest udsatte for at udvikle trombocyt refraktion.
Disclosures
EMS er grundlægger af LightIntegra Technology Inc., en medicinsk udstyr selskab til at udvikle det ThromboLUX System til microparticle og trombocyttal kvalitetstest. Alle andre forfattere er medarbejdere i LightIntegra teknologi. Produktion og gratis adgang til denne artikel er sponsoreret af LightIntegra Technology Inc.
Acknowledgments
Vi takker af bloddonorer og personale på canadiske blod Services Network Center for anvendt udvikling for indsamling og produktion af trombocyt-enheder, der anvendes i denne undersøgelse. Vi anerkender Canada Foundation for Innovation og Michael Smith Foundation for sundhedsforskning infrastruktur-midler på UBC centrum blod forskning. Finansiering af offentliggørelse blev leveret af LightIntegra Technology Inc., producenten af ThromboLUX.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ThromboLUX-M | LightIntegra Technology Inc. | LPN120 | DLS System |
| ThromboSight Software | LightIntegra Technology Inc. | LPN124 | DLS analysis software |
| Capillaries | LightIntegra Technology Inc. (included in test kit, vendor Optinova MLE) | LPN065 | Custom extruded non-activating, non-birefringent plastic tube, inspected and irradiated |
| MiniPet | LightIntegra Technology Inc. (included in test kit, vendor TriContinent Scientific) | LPN082 | 100 µL fixed volume pipette for sampling |
| MicroFlex 1-200 µL Pipette tips | LightIntegra Technology Inc. (included in test kit, vendor ESBE Scientific) | LPN080 | Pipette tips for sampling |
| Critoseal | LightIntegra Technology Inc. (included in test kit, vendor Fisher Scientific) | LPN075 | Capillary Tube Sealant |
| Dukal Alcohol Pad or equivalent | LightIntegra Technology Inc. (included in test kit, vendor Dukal Corp.) | LPN085 | Isopropyl pad (saturated with 70% isopropyl alcohol) |
| Control beads, 50 nm radius | LightIntegra Technology Inc. (included in test kit, vendor PolySciences Inc.) | LPN128 | Control beads |
| Microbead NIST Traceable Particle Size Standard, 3 µm | PolySciences Inc. | 64060 | Standard microbeads: 1.5 µm radius Polystyrene beads; range 1.43-1.58 µm; 1% solids suspensions in de-ionized water |
| Nanobead NIST Traceable Particle Size Standard, 250 nm | PolySciences Inc. | 64014-15 | Standard nanobeads: 125 nm radius Polystyrene beads; range 120 - 130 nm; 1% solids suspensions in de-ionized water |
| Genesis BPS RapidSeal II or equivalent | Genesis BPS | 428-SE640 | Tube sealer |
| Fresenius Kabi Tube Stripper or equivalent | Fresenius Kabi | 6R4452 | Manual tube stripper |
| Biohazard Shield - Cell Counter or equivalent | CardinalHealth | S1389-75 | Splash Shield |
| Corning LSE Vortex Mixer or equivalent | Corning Incorporated | 6775 | Vortex mixer |
| FACSCanto II Flow cytometer with FACSDiva software version 6.1.3 or equivalent | BD Biosciences | 338960 | Flow cytometer |
References
- Dinkla, S., et al. Platelet microparticles inhibit IL-17 production by regulatory T cells through P-selectin. Blood. 127 (16), 1976-1986 (2016).
- Yin, W., Ghebrehiwet, B., Peerschke, E. I. Expression of complement components and inhibitors on platelet microparticles. Platelets. 19 (3), 225-233 (2008).
- Aatonen, M., Gronholm, M., Siljander, P. R. Platelet-derived microvesicles: multitalented participants in intercellular communication. Semin Thromb Hemost. 38 (1), 102-113 (2012).
- Suades, R., Padro, T., Alonso, R., Mata, P., Badimon, L. High levels of TSP1+/CD142+ platelet-derived microparticles characterise young patients with high cardiovascular risk and subclinical atherosclerosis. Thromb Haemost. 114 (6), 1310-1321 (2015).
- Obeid, S., et al. Development of a NanoBioAnalytical platform for "on-chip" qualification and quantification of platelet-derived microparticles. Biosens Bioelectron. 93, 250-259 (2017).
- Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J Extracell Vesicles. 2, (2013).
- Lacroix, R., Robert, S., Poncelet, P., Dignat-George, F. Overcoming Limitations of Microparticle Measurement by Flow Cytometry. Semin Thromb Hemost. 36 (8), 807-818 (2010).
- Lacroix, R., et al. Standardization of platelet-derived microparticle enumeration by flow cytometry with calibrated beads: results of the International Society on Thrombosis and Haemostasis SSC Collaborative workshop. J Thromb Haemost. 8 (11), 2571-2574 (2010).
- Shah, M. D., Bergeron, A. L., Dong, J. F., Lopez, J. A. Flow cytometric measurement of microparticles: pitfalls and protocol modifications. Platelets. 19 (5), 365-372 (2008).
- Nolan, J. P., Jones, J. C. Detection of platelet vesicles by flow cytometry. Platelets. 28 (3), 256-262 (2017).
- Connor, D. E., Exner, T., Ma, D. D., Joseph, J. E. The majority of circulating platelet-derived microparticles fail to bind annexin V, lack phospholipid-dependent procoagulant activity and demonstrate greater expression of glycoprotein Ib. Thromb Haemost. 103 (5), 1044-1052 (2010).
- Inglis, H., Norris, P., Danesh, A. Techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. J Vis Exp. (97), (2015).
- Inglis, H. C., et al. Techniques to improve detection and analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. Cytometry A. 87 (11), 1052-1063 (2015).
- van der Pol, E., Coumans, F., Varga, Z., Krumrey, M., Nieuwland, R. Innovation in detection of microparticles and exosomes. J Thromb Haemost. 11, Suppl 1 36-45 (2013).
- Boudreau, L. H., et al. Platelets release mitochondria serving as substrate for bactericidal group IIA-secreted phospholipase A2 to promote inflammation. Blood. 124 (14), 2173-2183 (2014).
- Rousseau, M., et al. Detection and quantification of microparticles from different cellular lineages using flow cytometry. Evaluation of the impact of secreted phospholipase A2 on microparticle assessment. PLoS One. 10 (1), 0116812 (2015).
- Groot Kormelink, T., et al. Prerequisites for the analysis and sorting of extracellular vesicle subpopulations by high-resolution flow cytometry. Cytometry A. 89 (2), 135-147 (2016).
- van der Vlist, E. J., Nolte-'t Hoen, E. N., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J., Wauben, M. H. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nat Protoc. 7 (7), 1311-1326 (2012).
- Maurer-Spurej, E., Larsen, R., Labrie, A., Heaton, A., Chipperfield, K. Microparticle content of platelet concentrates is predicted by donor microparticles and is altered by production methods and stress. Transfus Apher Sci. 55 (1), 35-43 (2016).
- Maurer-Spurej, E., et al. Platelet quality measured with dynamic light scattering correlates with transfusion outcome in hematologic malignancies. Transfusion. 49 (11), 2276-2284 (2009).
- Hess, J. R., et al. Clinical and laboratory correlates of platelet alloimmunization and refractoriness in the PLADO trial. Vox Sang. 111 (3), 281-291 (2016).
- Doughty, H. A., et al. Relative importance of immune and non-immune causes of platelet refractoriness. Vox Sang. 66 (3), 200-205 (1994).
- Vassallo, R. R., Norris, P. J. Can we "terminate" alloimmune platelet transfusion refractoriness. Transfusion. 56 (1), 19-22 (2016).
- Anderson, W., Kozak, D., Coleman, V. A., Jaemting, A. K., Trau, M. A comparative study of submicron particle sizing platforms: Accuracy, precision and resolution analysis of polydisperse particle size distributions. J colloid inter sci. 405, 322-330 (2013).
- Gyoergy, B., et al. Improved Flow Cytometric Assessment Reveals Distinct Microvesicle (Cell-Derived Microparticle) Signatures in Joint Diseases. Plos One. 7 (11), 49726-49726 (2012).
- Urey, C., et al. Combining gas-phase electrophoretic mobility molecular analysis (GEMMA), light scattering, field flow fractionation and cryo electron microscopy in a multidimensional approach to characterize liposomal carrier vesicles. Int J Pharm. 513 (1-2), 309-318 (2016).
- Mohr, K., et al. Evaluation of multifunctional liposomes in human blood serum by light scattering. Langmuir. 30 (49), 14954-14962 (2014).
- Maurer-Spurej, E., Brown, K., Labrie, A., Marziali, A., Glatter, O. Portable dynamic light scattering instrument and method for the measurement of blood platelet suspensions. Physics in Medicine and Biology. 51 (15), 3747-3758 (2006).
- Arraud, N., et al. Extracellular vesicles from blood plasma: determination of their morphology, size, phenotype and concentration. J Thromb Haemost. 12 (5), 614-627 (2014).
- Ambrose, A. R., Alsahli, M. A., Kurmani, S. A., Goodall, A. H. Comparison of the release of microRNAs and extracellular vesicles from platelets in response to different agonists. Platelets. , 1-9 (2017).
- Buzas, E. I., Gardiner, C., Lee, C., Smith, Z. J. Single particle analysis: Methods for detection of platelet extracellular vesicles in suspension (excluding flow cytometry). Platelets. 28 (3), 249-255 (2017).
- Stoner, S. A., et al. High sensitivity flow cytometry of membrane vesicles. Cytometry A. 89 (2), 196-206 (2016).
- Labrie, A., Marshall, A., Bedi, H., Maurer-Spurej, E. Characterization of platelet concentrates using dynamic light scattering. Transfus Med Hemother. 40 (2), 93-100 (2013).
- Ueba, T., et al. Plasma level of platelet-derived microparticles is associated with coronary heart disease risk score in healthy men. J Atheroscler Thromb. 17 (4), 342-349 (2010).
- Badimon, L., Suades, R., Fuentes, E., Palomo, I., Padro, T. Role of Platelet-Derived Microvesicles As Crosstalk Mediators in Atherothrombosis and Future Pharmacology Targets: A Link between Inflammation, Atherosclerosis, and Thrombosis. Front Pharmacol. 7, 293 (2016).
- Berezin, A. E., Kremzer, A. A., Berezina, T. A., Martovitskaya, Y. V. The pattern of circulating microparticles in patients with diabetes mellitus with asymptomatic atherosclerosis. Acta Clin Belg. 71 (1), 38-45 (2016).
- Marcoux, G., et al. Microparticle and mitochondrial release during extended storage of different types of platelet concentrates. Platelets. 28 (3), 272-280 (2017).
- Yanez-Mo, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. J Extracell Vesicles. 4, 27066 (2015).
- Reddoch, K. M., et al. Hemostatic function of apheresis platelets stored at 4 degrees C and 22 degrees C. Shock. 41, Suppl 1 54-61 (2014).
- Kelly, A. M., et al. The effect of variation in donor platelet function on transfusion outcome: a semirandomized controlled trial. Blood. 130 (2), 214-220 (2017).
- Peerschke, E. I., Yin, W., Ghebrehiwet, B. Platelet mediated complement activation. Adv Exp Med Biol. 632, 81-91 (2008).
- Redman, C. W., Sargent, I. L. Microparticles and immunomodulation in pregnancy and pre-eclampsia. J Reprod Immunol. 76 (1-2), 61-67 (2007).
- Ripoche, J. Blood platelets and inflammation: their relationship with liver and digestive diseases. Clin Res Hepatol Gastroenterol. 35 (5), 353-357 (2011).
- Ling, Z. L., Combes, V., Grau, G. E., King, N. J. Microparticles as immune regulators in infectious disease - an opinion. Front Immunol. 2, 67 (2011).
- Melki, I., Tessandier, N., Zufferey, A., Boilard, E. Platelet microvesicles in health and disease. Platelets. 28 (3), 214-221 (2017).
- Culibrk, B., et al. Application of the ADVIA cerebrospinal fluid assay to count residual red blood cells in blood components. Vox Sang. 103 (3), 186-193 (2012).
- Connolly, K. D., et al. Lipoprotein-apheresis reduces circulating microparticles in individuals with familial hypercholesterolemia. J Lipid Res. 55 (10), 2064-2072 (2014).
- Mork, M., et al. Prospects and limitations of antibody-mediated clearing of lipoproteins from blood plasma prior to nanoparticle tracking analysis of extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 6 (1), 1308779 (2017).
- Raczat, T., et al. The influence of four different anticoagulants on dynamic light scattering of platelets. Vox Sang. 107 (2), 196-199 (2014).
