Summary
המטרה העיקרית של מחקר זה היא לתקנן ולבדוק את שיטת פנאומטיים (בנוכחות אוויר) של איסוף ביצים פורל הקשת, פורל חום. שיטה זו מאפשרת יעילים ופשוטים אוסף הביצים ללא צורך עיסוי הבטן דגים.
Abstract
אוסף ביצה הוא אחד מההליכים המכריעים במהלך השחזור דגים מדגרות salmonid. שיטות קלאסי לערב את השימוש עיסוי יד על הבטן דגים לגרש את הביצים. שיטה חלופית משתמש הלחץ של גז מוזרק לתוך חלל הגוף, מה שגורם את שחרור עוקבות של הביצים. שיטה זו היא ככל הנראה יש תופעות שליליות פחות על איכות הרווחה והן ביצה broodstocks. במסמך זה, אנו משווים את התוצאות של אוויר ויד בנוכחות אחר שיטות ביחס הישרדות לשנה ו ביצים בכמות ובאיכות של שני דגים salmonid, פורל הקשת (Oncorhynchus mykiss) ופורל חום (Salmo trutta מורפיום fario). התוצאות שלנו מציינים כי בנוכחות אוויר הניב איכות טובה יותר של ביצים, גבוה יותר שיעור הישרדות לשנה בפורל הקשת. בנוסף, בנוכחות אוויר אחר הביא שיעור תמותה נמוך יותר מאשר הקבוצה נתון יד בנוכחות אחר (25% לעומת. 35%). ה-pH וקצב הבקיעה של קבוצת יד הפשיטו היה נמוך יותר מאלה של קבוצת אוויר הפשיטו. במקרה של טרוטה חומים, איכות הביצים מתקבל על ידי יד והן שיטות בנוכחות אוויר היה דומה; עם זאת, ההפסדים שנה בדגים היו גבוהות בקבוצה אוויר הפשיטו (15% לעומת 0% בדגים הפשיטו את היד). למרות היתרונות של אוויר בנוכחות אחר שיטה על יד בנוכחות אחר מבחינת איכות הביצה יכול להיות שנצפתה לא כל המינים salmonid, ההליך בנוכחות אוויר עשוי להיות אופציה מבטיח שיאומץ ב מדגרות שהיא מבטיחה רמה גבוהה של הפארמצבטית ויעילות.
Introduction
פורל הקשת (Oncorhynchus mykiss) של פורל חום (Salmo trutta מורפיום fario) שייכים למשפחת Salmonidae Salmoniformes1. הייצור של אלה שני מינים של עופות ומידגה הכללית צבר צמיחה מהירה, בשל חשיבותן המסחרית ופעילויות פנאי. בפולין, הפקה של דגים salmonid עומד על בערך בגובה 20,000 טון, עם פורל הקשת להיות השולט. מצד שני, פורל חום מייצג המקור העיקרי של דגי משאבים באירופה בשל ערכו המסחרי עופות ומידגה ואת החשיבות בחכה. בעוד רבים המערכת האקולוגית הימית, קיומה של אוכלוסיות פורל חום מאוים. כתוצאה מכך, רבייה מלאכותית הוחל היכנסי האוכלוסייה המקומית של זה מינים2.
פורל הקשת, פורל חום לבגרות מינית בדרך כלל בגיל שלוש, עם זכרים התבגרות מוקדם יותר נקבות1שנה. בתנאים מלאכותיים, ביצים עם זרע של פורל הקשת, פורל חום נאספים בדרך כלל על ידי עיסוי בטן עדין. בפועל, בקנה מידה קטן, בנוכחות אחר יד שיטת איסוף ביצים היא חסכונית. עם זאת, בקנה מידה גדול, השיטה בנוכחות אחר יד עשוי להיות עתירי עבודה מתיש. כתוצאה מכך, טכניקה זו עלולה להביא ביצים שבורות עקב ועייפותו של עובדי מדגרת. שבירה של ביצים מובילה לעיתים קרובות ירידה ב- pH של נוזל השחלות ואת שחרורו של חלמון ביצה, אשר שניהם להשפיע לרעה על ההפריה של ביצים3. יתר על כן, זו שיטה מסורתית של אוסף ביצי (שוב ושוב הקשה של הבטן) עלולה לגרום גם בתמותה broodstock הנגרמת על ידי דלקת עור המשויך ההידרדרות של המכשול מגן של ריר.
שיטת פנאומטיים אוסף ביצי שימש תחילה באוסטרליה בשנת 19574. השיטה מבוססת על ההזרקה של גזים (אוויר, חנקן או חמצן) לתוך חלל הגוף לגרש את הביצים בעזרת לחץ גזים. טכניקה זו קלה ומהירה יושם בהצלחה בדגים salmonid ללא תופעות לוואי שליליות על דגים4. לאחרונה, בשיטה זו נעשה שימוש במין הבר (צפון פייק, לוקיוס Esox) לאסוף ביצים בוגרת בתנאים מלאכותיים5. זה הוצג כי האוויר הפשיטו ביצים הפריה ויותר הבקיעה המחירים בהשוואה יד הפשיט את הביצים, בלי קשר הפתרון המשמש עבור הפריה (פתרון Woynarovich, וכך מאגר או מדגרת מים)5.
המטרה העיקרית של מחקר זה היתה לבחון את השיטה פנאומטיים (בנוכחות אוויר) של איסוף ביצים פורל הקשת, פורל חום בהשוואה יד מסורתית בנוכחות אחר שיטה. היעילות של שתי השיטות (נפח של ביצים שהושג) ושעה של אוסף, איכות של גמטות (pH נוזלים השחלות), כמו גם תמותה לאחר ההשרצה וקצב הבקיעה הושוו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוצדורות בוצעו על פי הוועדה המקומית על אתיקה לניסויים בבעלי חיים בתוך פולין.
1. ציוד הכנה
- השתמש מזרק ואת המחט להזרקה של הגז לתוך חלל הגוף דגים.
- הגדרת לחץ הגז בבר 0.5, לשמור על הלחץ הזה מתחת 1 בר בכל רחבי.
- בקרת זרימת אוויר. הדג salmonid, 1.5 ליטר/דקה היא המהירות היעילה של גז תשישות. לשמור על המהירות של האופטימלית כי מהירות גבוהה יותר לא לקבל כל הביצים ואילו מהירות איטית יותר שלא לצורך עלולה להאריך את ההליך.
- לחבר את המזרק עם מחט דפוקים (0.8-1.2 מ"מ קוטר) כדי להימנע המחט בניתוק הנגרם על ידי לחץ הגז.
2. אוויר ההשרצה
- עזים ומתנגד הדגים 0.2% Propiscin. מניחים את הדג לתוך אמבט מים עם 0.2% Propiscin ולחכות עד הדג מפסיק להגיב.
- בזהירות להתייבש לפני ההשרצה על ידי ניגוב במטלית כותנה יבשה.
- מניחים את הדג על המיטה שיפוע על 35-40 מעלות, בצד הזנב שלה בצד למטה. עם דחיפה עדינה של דגים הבטן, לבדוק את זרם ביצה של מערכת איברי המין. אם הביצים אינם קיימים, הדג צריך לא להיות הוליד.
- המקום מכולה מכוסה רשת מתחת papilla דגים כדי לאסוף את הביצים.
- להוסיף במהירות את המחט מתחת הסנפירים בטן.
- להסיר באופן חופשי את הביצים ע י הגז, עד רק יחידי הביצים יוסרו מן הגוף דגים.
- לעסות בעדינות את הבטן כדי להסיר גזים בגוף הדג.
- לאחר ההשרצה להעביר בעדינות את הדג טנק עם זרימת המים. דגים שוחרר מיכל לאחר ההשרצה אוויר אולי ישחו בתחילה על המשטח של המים. לאחר מספר דקות הדגים משחרר את הגז הנותר בעת שחייה ומתחילה לשחות בדרך כלל.
הערה: שהושג הביצים מאוד נקי ונטול זיהום דם או צואה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
זכרים בוגרים, הנקבות של פורל הקשת (גיל 2 +, 1700 ± 328 g), פורל חום (גיל 3 +, 1900 ± 435 g), התקבלו את מדגרת דגים Salmonid (Rutki-בז'וקובו (żukowo), היבשה דוגה מכון ב פולין). זכרים ונקבות הונחו במיכלים נפרדים עם נפח של-5 מ'3. טמפרטורת המים היה 12±1 מעלות צלזיוס. לפני מניפולציה, דגים היו מרדימים עם 0.2% Propiscin. הדג חולקו לשתי קבוצות. חלק מהם עברו שיטה מסורתית כדי להשיג ביצים, קרי, לחץ בבטן (n = 20). הקבוצות שנותרו עברו את ההליך פנאומטי עם השימוש של אוויר (n = 20). הביצים כל נקבה היו שנאספו בנפרד והניח קערות פלסטיק יבש.
במהלך יד חסינותו של הביצים, הדג היה קודם נקי עם מטלית יבשה תוך החזקת את הדג על הצד, הזנב. משך הזמן של ההשרצה נמדדה החל מהנקודה שבו המפעיל מחזיקה את הדגים, גם להתחיל לחיצה על הבטן או להחדיר את המחט. נקודת הקצה הוגדר בזמנו כאשר הביצים מפסיקים לזרום לקערה. יד בנוכחות אחר, עובד מיומן אחד נבחר לנהל את כל הניסוי, האוויר בנוכחות אחר ההליך בוצע על ידי עובד מיומן אחר.
במהלך ההליך, הנפח של הביצים שהושג נמדדה באמצעות צילינדר מדידה, הנוזל השחלות נאסף בנפרד מאחד כל נקבה. לאחר מכן, רמת ה-pH שלו היה נותחה באמצעות אלקטרודה pH. דגים Broodstock שימוש בניסויים שלנו סומנו בתגים המשדר משולב פסיבי (בור). תיוג אפשר לנו לבחון את שיעור התמותה בכל קבוצה של דגים.
מיד לאחר אוסף, כל מדגם היה נתון הפריה. הזרע עבור הפריה היה והאחסון על 10 דקות לפני כדי ההשרצה של מעורבבת עם Morisawa פתרון6 (0.1 M NaCl, מ' 0.04 אשלגן כלורי, מ' 0.003 CaCl2, ז 0.0015 MgCl2 x 6 H2O, 0.05 M טריס, pH 8.5), יחס 1:9-4 מעלות צלזיוס. התערובת של זרע המתקבל ארבעה פורל הקשת או פורל חום זכרים שימש בהתאמה.
מאז שיעור הבקיעה הוא המדד המתאים ביותר באיכות הביציות, פורל הקשת, פורל חום הביצים שהושג בעבודת יד, מועדוני חשפנות שיטות היו נתונים הפריה. הביצים היו מופרית בזרע על 100,000 לכל ביצה, באמצעות כ-100 הביצים כל נקבה אירועיו. ריכוז הזרע נמדדו בבית הבליעה Bürker אחרי פתרונות הזרע היו 1:2000 מדולל עם-0.7% NaCl. הביצים היו מופרית עם הזרע ב 5 מ של הפתרון וכך (0.125 M NaCl, מאגר טריס 0.002 M, 0.003 M גליצין ו מ מ 0.001 CaCl2, pH 9.0) עבור כל משתנה7. שני שכפולי בוצעו עבור כל דגימה של ביצים. שלוש דקות לאחר ההפריה, הדגימות ביצה בקפידה נשטפו במים מדגרת פעמיים. לאחר מכן, ביצים הונחו ברשת מיוחדת, הצבת כל משתנה ניסיוני בנפרד. הביצים היו ממוקמים בתוך חממות ב 8 ° C, מספר הביצים עיניים נקבע כארבעה שבועות מאוחר יותר. האחוז של ביצים המקווקו נקבע גם על-פי הנוסחה: (ביצים שהיו מופרית x 100%) / (כל ביצים ב- variant בטון).
ההבדלים בין ניסיוני טיפולים היו נחושים עם t מזווג-בדיקות רמת המובהקות של P < 0.05. הנתונים באחוזים הפך באמצעות טרנספורמציה arc-סין לפני ניתוח סטטיסטי. ניתוחים סטטיסטיים נערכו עם פריזמה GraphPad תוכנה.
משך הזמן של אוסף ביצי ביד בנוכחות אחר שיטת היה נמוך (10 כ ס) לעומת אוויר בנוכחות אחר שיטה בשני המינים (איור 1; P < 0.05). השיטות (מסורתי או פנאומטי) בנוכחות אחר לא הייתה השפעה על הנפח של ביצים המתקבל נקבות פורל הקשת והן פורל חום (איור 2). השחלות נוזלים pH של פורל הקשת אחרי היד בנוכחות אחר היה 7.6, בעוד באוויר בנוכחות אחר השיטה, ה-pH הוגדל ל- 8.0 (איור 3; P < 0.05). עם זאת, ללא קשר השיטות של אוסף ביצי, ה-pH נוזלים השחלות של פורל חום לא הושפע (איור 2). בפורל הקשת, שיעור הבקיעה היה גבוה משמעותית (איור 4; P < 0.05) הפשיטו אוויר ביצים מאשר ביצים הפשיטו את היד. אחוז התמותה היה גבוה יותר אחרי היד בנוכחות אחר לעומת אוויר בנוכחות אחר בפורל הקשת. עם זאת, פורל חום, אחוז התמותה היה גבוה יותר (15%) הפשיטו אוויר ביצים מאשר ביצים הפשיטו את היד (טבלה 1).
איור 1 . הזמן של החשפנות לאחר מסורתי (בנוכחות אחר יד) פנאומטי (בנוכחות אוויר) שיטת איסוף ביצים פורל הקשת, פורל חום. מובהקות סטטיסטית מסומן על ידי כוכביות המייצג ערך-P (* * * P < 0.001), קווי שגיאה לציין SD (n = 20). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 . הנפח של ביצים שהושג לאחר מסורתי (בנוכחות אחר יד) פנאומטי (בנוכחות אוויר) שיטות של אוסף ביצי פורל הקשת, פורל חום. קווי שגיאה לציין SD (n = 20). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 . השחלות pH נוזלים לאחר מסורתי (בנוכחות אחר יד) פנאומטי (בנוכחות אוויר) שיטות של אוסף ביצי פורל הקשת, פורל חום. מובהקות סטטיסטית מסומן על ידי כוכביות המייצג ערך-P (* * * P < 0.001), קווי שגיאה לציין SD (n = 20). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 . אחוז שיעור הבקיעה לאחר מסורתי (בנוכחות אחר יד) פנאומטי (בנוכחות אוויר) שיטות של אוסף ביצי פורל הקשת, פורל חום. מובהקות סטטיסטית מסומן על ידי כוכביות המייצג ערך-P (* * P < 0.01)., קווי שגיאה לציין SD (n = 20). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| מינים | שיטת איסוף ביצים | |
| יד בנוכחות אחר | אוויר בנוכחות אחר | |
| פורל הקשת | 35 | 25 |
| פורל חום | 0 | 15 |
טבלה 1. אחוז התמותה לאחר ההשרצה לאחר מסורתי (בנוכחות אחר יד) פנאומטי (בנוכחות אוויר) שיטות של אוסף ביצי פורל הקשת, פורל חום כפי שנמדד על שנה אחת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השיטה פנאומטיים של אוסף ביצי דגים, למרות אורכת זמן רב יותר מאשר השיטה המסורתית (יד להתפשט), ניתן לאבטח באיכות גבוהה של התבגר oocytes (העבודה). זו קשורה בסיכון נמוך הפרעה מכנית של ביצי בשעת החלת הליך זה. PH גבוהה של הנוזל בשחלה, כמו גם עלייה בשיעור הפריה, מעידות על התועלת של השיטה פנאומטיים. בסך הכל, האוויר בנוכחות אחר שיטה של אוסף ביצי ברבייה דגים יכול להיות אופציה מבטיח מבחינת סטנדרטיזציה של הפרוטוקולים מדגרת, כמו יישום מוצלח שלהם אינה קשורה המצוינות ידנית של המפעילים.
למרות האוויר ההשרצה נראה אופציה אוטומטית, מצאנו כי זה עלול לקחת יותר זמן מאשר ההשרצה ידנית. ההפרש בין משך יכול להיות ברורה במיוחד כאשר עובדים מנוסים היטב מדגרת חלים נהלים בנוכחות אחר-יד. עם זאת, זה צריך להיות מחודד בחוץ משך ההשרצה עם השימוש של אוויר בלחץ זה עדיין משביעת רצון; . בערך 20 שניות לכל דג יתר על כן, האפקטיביות של שיטה זו אינה תלויה העובדים ניסיון, כמו במקרה עם היד בנוכחות אחר שיטה.
למרות שלא נתבונן ההבדלים בין כמויות של ביצים שהושג, ההבדלים ב- pH של נוזל השחלות ניכרו במקרה של פורל הקשת. אפקט זה היה ככל הנראה קשור הביצים שבורות, כמו ה-pH הוא אינדיקטור טוב של זה תופעה3. ביצים מופרית רגישים יותר פגיעה מכנית, ולהגביר את ההתנגדות שלהם לאחר הפעלת ביצה במהלך התקשות השעה8. ביצים שבורות מופרית אחראים ההפריה נמוכים ב סלמונאיים: כפי שדווח במקום אחר. לכן, מרבית יש לנקוט במהלך איסוף ביצים. הנתונים שלנו מראים כי ביצים מופרית של פורל הקשת הם יותר ביצים של דג הפורל חום חלש. פורל הקשת הביצים שנאספו על-ידי בנוכחות אחר יד היה נמוך pH הבקיעה שער בהשוואה לאלו שהושגו על ידי הפשטת אוויר. זה לא נראה במקרה של פורל חום. הניסויים שלנו מראים כי מינים salmonid עם ביצים רך יותר, ההליך בנוכחות אוויר עשוי להיות מועיל מבחינת שלאחר ההשרצה איכות.
התמותה בודדים של broodstock לאחר ההשרצה הוא תמיד גלוי מדגרות דגים salmonid. עם זאת, ההתרחשות שלהם קשורה בתנאי בודדים והן מצב בריאותו של הדג. אוויר בנוכחות אחר נראה שיטה קלה של אוסף ביצי היה ללא אובדן מאסיבי של העור הליחה, מכשול חשוב נגד פתוגנים מן המים. למרות העובדה כי לא נתבונן כל פוסט ההשרצה התמותה (בתוך חודש אחד מן ההשרצה), שנה שלמה תצפית הראו קצת מאבד של דגים. במקרה של פורל הקשת, הבחנו כ-10% גבוה יותר הפסדים ביד התפשטה הקבוצה, ואילו בפורל חום, בנוכחות אוויר אחר הביא בתמותה 15% בשנה. אנחנו יכולים להניח כי בנוכחות אוויר יכול להיות מועיל יותר פורל הקשת מאשר פורל חום מבחינת איכות הביצה ואת התמותה הכללית של broodstock...
למרות אוויר חשפנות היא מועילה פורל הקשת ביצים אך לא פורל חום, אנו ממליצים כי הליך זה עשוי להיות יותר סטנדרטית לעומת יד נוהל הפשטת. באוויר בנוכחות אחר, הלחץ שהופעל על הבטן של דגים הוא הגורם היחיד אשר משפיע על האיכות והכמות של oocytes התבגר שהושג. השימוש של שיטה זו של מדגרות מקלה על הפסדים ביצה סלמון, אשר מתרחשות בעיקר כתוצאה ביצים שבורות11. מאז אין כישורים מיוחדים נדרשים לבצע את הליך בנוכחות אוויר, אנו מצפים כי ובאיכות דומה של ביצים ניתן להשיג על ידי שני עובדי מדגרת שאינו מיומן ומיומן. אנו ממליצים על נוהל הפשטת אוויר כאופציה מבטיחה עבור מדגרות חדש מחפש הליך איסוף ביצה מתאפיין ברמה גבוהה של הפארמצבטית ויעילות, כמו גם מעט או ללא ניסיון על ידי המפעילים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחקר הציג נתמכה על ידי פרוייקט "שיטת פנאומטיים דגים בנוכחות אחר - יישום אפשרי, השפעה על האיכות של גמטות ואת כמות ועל רווחת דגים" (ראשי תיבות: PNEUFISH) מימנו תחת "מבצעי תוכנית הפיתוח של הדיג סקטור ואזורי החוף 2007-2013"(OR-61724-OR1400001-10), קרנות הופקעו כדי מכון רבייה של בעלי חיים ומחקר מזון האקדמיה למדעים של פולין, פולין, ותמיכה על-ידי Office עלות (מזון, חקלאות עלות פעולה FA1205: AQUAGAMETE ). ברצוננו להודות, סטנלי Ifeanyi Ugwu עבור תמיכה גדולה עריכה באנגלית. אנחנו רוצים להודות גם המפיקים אנימציה "סטודיו Filmowe Ruchome Obrazki".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycine pure P.A. | AVANTOR | 527560117 | sperm activating buffer |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T1503 | sperm activating buffer |
| Sodium chloride Bioreagent | Sigma Aldrich | S5886 | sperm activating buffer |
| Calcium chloride anhydrous | Sigma Aldrich | C4901 | sperm activating buffer |
| Propiscin (0.2% etomidate solution) | IRS Olsztyn, Poland | not indicated | |
| compressor | Thomas Sheboigan WI USA | DT/SR 070800001882 | |
| reduction valve | Camozzi | cRJUS U7J | |
| air hose | ZEC T.P.U. | SH.98 | |
| syrgine | EFD | 7012118 | |
| Air spawning stage | Biopasz, Poland | PNEU001 | |
| Orion Ross Ultra electrode | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | 8102BNUWP |
References
- Nelson, J. S. Fishes of the World. , 4th, JohnWiley and Sons, Inc. Hoboken, NJ, USA. (2006).
- García-Marín, J. L., Sanz, N., Pla, C. Proportions of native and introduced brown trout in adjacent fished and unfished Spanish rivers. Conservation Biology. 12, 313-319 (1998).
- Dietrich, G. J., Wojtczak, M., Slowinska, M., Dobosz, S., Kuzminski, H., Ciereszko, A. Broken eggs decrease pH of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) ovarian fluid. Aquaculture. 273, 748-751 (2007).
- Zurbuch, P. E. A structure for easy fish recovery during drainage of an impoundment. Progressive FishCulturist. 27, 237-238 (1965).
- Cejko, B. I., et al. Effects of different stripping methods of female and activation medium on fertilization success in northern pike (Esox lucius). Czech Journal of Animal Sciences. 10, 481-486 (2016).
- Morisawa, S., Morisawa, M. Induction of potential for sperm motility by bicarbonate and pH in rainbow trout and chum salmon. Journal of Experimental Biology. 136, 13-22 (1988).
- Billard, R., Cosson, J., Perchec, G., Linhart, O. Biology of sperm and artificial reproduction in carp. Aquaculture. 129, 95-112 (1995).
- Iuchi, I., Ha, C. R., Sugiyama, H., Nomura, K. Analysis of chorion hardening of eggs of rainbow trout, Oncorhynchus mykiss. Development Growth and Differentiation. 38, 299-306 (1996).
- Wojtczak, M. A., Kowalski, R. K., Dobosz, S., Goryczko, K., Kuźminski, H., Glogowski, J., Ciereszko, A. Assessment of water turbidity for evaluation of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) egg quality. Aquaculture. 242, 617-624 (2004).
- Tabrizi, E. N., Khara, H., Nezami, S. A., Lorestani, R., Shamspour, S. Broken Eggs Influence on Fertilization Capacity and Viability of Eggs, Turbidity and pH of Ovarian Fluid and Fertilization Water in the Endangered Caspian Brown Trout, Salmo Trutta Caspius. International Journal of Biology. 3 (1), 161-166 (2011).
- Carl, G. C. Beware of the broken egg! A possible cause of heavy losses of salmon eggs. Progresive Fish-Culturist. 53, 30-31 (1941).
