Summary
L'obiettivo principale di questo studio è quello di standardizzare e testare il metodo pneumatico (aria di smontaggio) di raccolta delle uova di trota iridea e fario. Questo metodo consente di efficace e semplice raccolta delle uova senza la necessità di massaggio addome pesce.
Abstract
Raccolta delle uova è una delle procedure più cruciali durante la riproduzione dei pesci in incubatoi salmonidi. Metodi classici implicano l'uso di mano massaggio su addomi pesce per espellere le uova. Un metodo alternativo utilizza la pressione del gas iniettato nella cavità del corpo, causando il rilascio successivo delle uova. Questo metodo è creduto per avere effetti meno negativi sulla qualità sia il benessere e l'uovo della broodstocks. Nel presente documento, si confrontano i risultati di aria e mano stripping metodi riguardo alla sopravvivenza di un anno e uovo quantità e qualità in due di salmonidi, trota iridea (Oncorhynchus mykiss) e la trota fario (Salmo trutta morpha fario). I nostri risultati indicano che strippaggio ha reso una migliore qualità delle uova e maggiore tasso di sopravvivenza di un anno in trota iridea. Inoltre, strippaggio ha provocato il più basso tasso di mortalità rispetto al gruppo sottoposto a mano stripping (25% vs. 35%). Il tasso di pH e schiusa del gruppo mano spogliato era inferiore rispetto a quelli del gruppo air spogliato. Nel caso di trota fario, la qualità delle uova ottenute da mano e metodi strippaggio era simile; Tuttavia, le perdite di un anno in pesce erano più alte nel gruppo aria spogliato (15% rispetto allo 0% in mano spogliato pesce). Anche se i vantaggi di air stripping metodo sopra mano stripping in termini di qualità delle uova potrebbero non essere osservati in tutte le specie di salmonidi, la procedura di strippaggio potrebbe essere un'opzione di promessa da adottare nelle avannotterie come assicura un elevato livello di riproducibilità e l'efficienza.
Introduction
La trota iridea (Oncorhynchus mykiss) e la trota fario (Salmo trutta morpha fario) appartengono alla famiglia Salmonidae Salmoniformes1. La produzione di queste due specie in acquacoltura globale ha guadagnato una crescita rapida, a causa della loro importanza commerciale e ricreativo. In Polonia, produzione di salmonidi è di circa 20 000 tonnellate, con trota iridea essendo la specie dominante. D'altra parte, la trota fario rappresenta un'importante fonte di risorse di pesci d'acqua dolce in Europa a causa del suo valore commerciale in acquacoltura e importanza per la pesca sportiva. In molti ecosistemi acquatici, è minacciata l'esistenza di popolazioni di trota fario. Di conseguenza, riproduzione artificiale è stata applicata per rifornire le popolazioni locali di questa specie2.
Trota iridea e fario raggiungono la maturità sessuale solitamente all'età di tre, con i maschi fare maturare un anno prima rispetto a femmine1. In condizioni artificiali, uova e sperma di trota iridea e fario è solitamente raccolti dal delicato massaggio addominale. In pratica, su piccola scala, un metodo di raccolta delle uova mano-stripping è conveniente. Tuttavia, su larga scala, il metodo mano-stripping può essere laborioso e faticoso. Di conseguenza, questa tecnica può comportare le uova rotte a causa della stanchezza dei lavoratori incubatoio. Rottura delle uova spesso conduce ad una diminuzione del pH del fluido ovarico e il rilascio di tuorlo d'uovo, entrambi i quali influenzare negativamente la fecondazione delle uova3. Inoltre, questo metodo tradizionale di raccolta delle uova (premendo ripetutamente dell'addome) può anche provocare i riproduttori mortalità causata tramite l'infezione della pelle associato con il deterioramento della barriera protettiva del muco.
Pneumatico metodo di raccolta delle uova era usata nel Regno Unito nel 19574. Il metodo si basa sull'iniezione di gas (aria, azoto o ossigeno) nella cavità del corpo per espellere le uova tramite la pressione del gas. Questa tecnica facile e veloce è stata applicata con successo a salmonidi senza effetti collaterali negativi sul pesce4. Recentemente, questo metodo è stato utilizzato in specie selvatiche (luccio, Esox lucius) per raccogliere le uova mature in condizioni artificiali5. È stato dimostrato che aria spogliato uova aveva maggiore fecondazione e da cova tariffe rispetto a mano spogliato uova, indipendentemente dalla soluzione utilizzata per fertilizzazione (Woynarovich soluzione, Billard buffer o incubatoio acqua)5.
L'obiettivo principale di questo studio era di verificare il metodo pneumatico (aria di smontaggio) di raccolta delle uova di trota iridea e fario rispetto a mano tradizionale metodo di spogliatura. L'efficienza di entrambi i metodi (volume delle uova ottenute) e tempo di raccolta, la qualità dei gameti (pH fluido ovarico), come pure la mortalità tasso e post-deposizione delle uova da cova sono stata confrontata.
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Protocol
Procedure sono state effettuate in conformità con il comitato locale sull'etica di animale esperimenti in Olsztyn, Polonia.
1. preparazione del materiale
- Utilizzare una siringa ed un ago per iniezione di gas nella cavità del corpo di pesce.
- Impostare la pressione del gas a 0.5 bar e mantenere questa pressione per essere inferiore a 1 bar in tutto.
- Controllare il flusso di aria. Per i salmonidi, 1,5 L/min è la velocità più efficiente di esaurimento del gas. Mantenere la velocità ottimale perché maggiore velocità potrebbe non ottenere tutte le uova, mentre una velocità più lenta potrebbe prolungare inutilmente la procedura.
- Collegare la siringa con un ago avvitato (0.8-1.2 mm di diametro) per evitare la separazione dell'ago causata dalla pressione del gas.
2. aria di deposizione delle uova
- Anestetizzare il pesce con 0,2% Propiscin. Mettere il pesce in un bagno di acqua con il 0,2% Propiscin e attendere che il pesce non risponde.
- Asciugare con cura prima deposizione strofinando con un panno di cotone asciutto.
- Posto il pesce il bancale inclinato circa 35-40°, il suo lato di coda verso il basso. Con una leggera spinta dell'addome del pesce, controllare il flusso delle uova dal tratto genitale. Se non sono presenti le uova, il pesce non deve essere generato.
- Posizionare un contenitore coperto di maglia sotto la papilla di pesce per raccogliere le uova.
- Inserire rapidamente l'ago sotto le pinne addominali.
- Liberamente rimuovere le uova dal gas fino a quando solo singolare uova vengono rimossi dal corpo dei pesci.
- Massaggiare delicatamente l'addome per rimuovere l'eccesso di gas dal corpo dei pesci.
- Dopo la deposizione, trasferire delicatamente il pesce ad un serbatoio con flusso d'acqua. Pesce rilasciato al serbatoio dopo la deposizione delle uova di aria potrebbe inizialmente nuotare sulla superficie dell'acqua. Dopo alcuni minuti il pesce rilascia il gas rimanente durante il nuoto e inizia a nuotare normalmente.
Nota: Le uova ottenute sono molto pulite e libere da contaminazioni di sangue o feci.
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Representative Results
Maschi maturi e femmine di trota iridea (età 2 +, 1700 ± 328 g) e trota fario (età 3 +, 1900 ± 435g) sono stati ottenuti da the Salmonid Fish Hatchery (Rutki-Żukowo, nell'entroterra della pesca Institute a Olsztyn, Polonia). I maschi e le femmine sono state collocate in serbatoi separati con un volume di circa 5 m3. La temperatura dell'acqua era 12 ± 1 ° C. Prima della modifica, i pesci sono stati anestetizzati con 0,2% Propiscin. I pesci sono stati divisi in due gruppi. Parte di loro ha subito un metodo tradizionale per ottenere uova, cioè, la pressione addominale (n = 20). I gruppi rimanenti hanno subito la procedura pneumatica con l'uso di aria (n = 20). Uova da ogni femmina sono stati raccolte separatamente e messi in ciotole di plastica asciutto.
Durante mano stripping delle uova, il pesce è stato cancellato prima con un panno asciutto tenendo premuto il pesce sul suo lato, coda. La durata di deposizione delle uova è stata misurata a partire dal punto in cui l'operatore detiene il pesce e neanche, avviare premendo addome o iniettare l'ago. Il punto finale è stato impostato al momento quando uova fermerà alla ciotola. Per mano di spogliatura, un operaio specializzato è stato scelto per condurre l'esperimento intero, e l'aria procedura di smontaggio è stato effettuato da un altro operaio qualificato.
Durante la procedura, il volume delle uova ottenute è stato misurato utilizzando un cilindro graduato e il fluido ovarico sono stati raccolti separatamente da ogni esemplare femmina. Da allora in poi, il suo livello di pH è stato analizzato utilizzando un elettrodo di pH. Pesci riproduttori utilizzati nei nostri esperimenti sono stati marcati con tag Transponder passivi integrati (PIT). Tagging ci ha permesso di osservare il tasso di mortalità in ciascun gruppo di pesci.
Immediatamente dopo la raccolta, ogni campione è stato sottoposto a fertilizzazione. Spermatozoi per la fecondazione era raccolto circa 10 minuti prima di deposizione delle uova e memorizzata diluito in Morisawa soluzione6 (0,1 M di NaCl, KCl, 0,003 M CaCl2, 0,0015 M MgCl2 x 6 H2O 0,04 M, 0,05 M Tris, pH 8.5), nel rapporto 1:9 a 4 ° C. La miscela di spermatozoi ottenuti da quattro trota iridea o trota fario maschi è stata utilizzata rispettivamente.
Poiché il tasso di schiusa è la misura più appropriata della qualità delle uova, le uova di trota iridea e fario ottenute artigianalmente e pneumatici metodi stripping sono stati sottoposti a fertilizzazione. Le uova sono state fertilizzate con circa 100.000 spermatozoi per ogni uovo, utilizzando circa 100 uova da ogni femmina generata. Le concentrazioni di spermatozoi sono state misurate in camera di Bürker dopo soluzioni di sperma sono stati diluiti 1:2000 con 0,7% NaCl. Uova sono state fecondate con lo sperma in 5 mL di soluzione di Billard (0,125 M NaCl, tampone Tris 0,002 M, 0,003 M glicina e 0,001 mM CaCl2, pH 9.0) per ogni variante7. Due repliche sono state eseguite per ogni campione di uova. Tre minuti dopo la fecondazione, i campioni di uova sono stati accuratamente lavati due volte in acqua di vivaio. Quindi, le uova sono stati disposti in una griglia speciale, ponendo ogni variante sperimentale separatamente. Le uova fecondate sono state collocate in incubatrice a 8 ° C e il numero di uova embrionate era determinato circa quattro settimane più tardi. La percentuale di uova covate inoltre è stata determinata secondo la formula: (uova che sono state fecondate x 100%) / (tutte le uova nella variante concreta).
Le differenze fra i trattamenti sperimentali sono state determinate con t-test accoppiato a un livello di significatività P < 0,05. I dati espressi in percentuale è stati trasformati utilizzando la trasformazione dell'arco-peccato prima di analisi statistica. Le analisi statistiche sono state condotte con GraphPad Prism software.
La durata della raccolta delle uova a mano metodo di spogliatura era più breve (circa 10 s.) in confronto ad aria stripping metodo in entrambe le specie (Figura 1; P < 0,05). I metodi (tradizionali o pneumatici) di "stripping" non hanno avuto un'influenza sul volume delle uova ottenute dalle femmine sia trota iridea e fario (Figura 2). PH di fluido ovarico in trota iridea dopo stripping mano era 7.6, mentre, nell'aria metodo di spogliatura, il pH è stato aumentato a 8.0 (Figura 3; P < 0,05). Tuttavia, indipendentemente dal fatto i metodi di raccolta delle uova, il pH di fluido ovarico nella trota fario era inalterato (Figura 2). In trota iridea, il tasso di schiusa era significativamente più alto (Figura 4; P < 0,05) in aria-spogliato uova rispetto a mano-spogliato uova. La percentuale di mortalità era più alta dopo mano stripping in confronto ad aria stripping in trota iridea. Tuttavia, in trota marrone, mortalità percentuale era più alto (15%) in aria-spogliato uova rispetto a mano-spogliato uova (tabella 1).
Figura 1 . Tempo di stripping dopo tradizionale (stripping di mano) e pneumatici (a strippaggio) metodo di raccolta di uova di trota iridea e fario. Significatività statistica è indicata da un asterisco, che rappresenta il valore di P (* * * P < 0,001), barre di errore indicano SD (n = 20). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 . Il volume delle uova ottenute dopo tradizionale (stripping di mano) e pneumatici (a strippaggio) metodi di raccolta delle uova di trota iridea e fario. Barre di errore indicano SD (n = 20). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 . PH di fluido ovarico dopo tradizionale (stripping di mano) e pneumatici (a strippaggio) metodi di raccolta delle uova di trota iridea e fario. Significatività statistica è indicata da un asterisco, che rappresenta il valore di P (* * * P < 0,001), barre di errore indicano SD (n = 20). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 . Percentuale del tasso di schiusa dopo tradizionale (stripping di mano) e pneumatici (a strippaggio) metodi di raccolta delle uova di trota iridea e fario. Significatività statistica è indicata da un asterisco, che rappresenta il valore di P (* * P < 0.01)., barre di errore indicano SD (n = 20). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Specie | Metodo di raccolta delle uova | |
| Mano di spogliatura | Aria di spogliatura | |
| Trota iridea | 35 | 25 |
| Trota fario | 0 | 15 |
Tabella 1. Percentuale di mortalità post-riproduttiva dopo tradizionale (stripping di mano) e pneumatici (a strippaggio) metodi di raccolta delle uova di trota iridea e fario, misurata in un anno.
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Discussion
Il pneumatico metodo di raccolta delle uova di pesce, anche se richiede più tempo rispetto al metodo tradizionale (stripping mano), può garantire un'alta qualità degli ovociti stagionati (questo lavoro). Questo è legato al basso rischio di rottura meccanica delle uova durante l'applicazione di questa procedura. PH elevato del fluido dell'ovaia, come pure un aumento del tasso di fertilizzazione, attestano l'utilità del metodo pneumatico. Nel complesso, l'aria, metodo di raccolta delle uova di sbancamento nella riproduzione dei pesci potrebbe essere un'opzione promettente in termini di standardizzazione dei protocolli di vivaio, come loro applicazione di successo non è correlato all'eccellenza manuale degli operatori.
Anche se l'aria di deposizione delle uova sembra essere un'opzione automatica, abbiamo trovato che potrebbe richiedere più tempo del manuale di deposizione delle uova. Questa differenza di durata possa essere evidente soprattutto quando ben sperimentato incubatoio lavoratori applicano procedure di smontaggio a mano. Tuttavia, occorre rilevare che la durata di deposizione delle uova con l'uso di pressione d'aria è ancora soddisfacente; circa 20 secondi per ogni pesce. Inoltre, l'efficacia di questa tecnica non è dipendente da esperienza di lavoratori, come è il caso con mano metodo di spogliatura.
Anche se non abbiamo osservato alcuna differenza tra volumi di uova ottenute, le differenze del pH del fluido ovarico erano evidenti nel caso di trota iridea. Questo effetto è stato molto probabilmente collegato le uova rotte, come il pH è un buon indicatore di questo fenomeno3. Uova non fecondate sono più suscettibili di danno meccanico e il loro aumento di resistenza dopo l'attivazione dell'uovo durante l'indurimento tempo8. Non fecondate le uova rotte sono responsabili per i tassi di fertilizzazione inferiori nei salmonidi come riportato altrove. Pertanto, si deve prestare attenzione massima durante la raccolta delle uova. I nostri dati suggeriscono che le uova non fecondate di trota iridea sono più deboli rispetto alle uova di trota fario. Uova di trota iridea raccolte per stripping mano avevano più basso pH e da cova tasso rispetto a quelli ottenuti da strippaggio. Questo non è stato visto nel caso di trota fario. I nostri esperimenti suggeriscono che per salmonidi specie con le uova più morbide, la procedura strippaggio potrebbe essere vantaggiosa in termini di post-generazione di qualità.
Mortalità individuale dei riproduttori dopo la deposizione è sempre visibile in incubatoi di salmonidi. Tuttavia, la loro occorrenza è correlato alla sia individuali e lo stato di salute dei pesci. Strippaggio sembra essere un delicato metodo di raccolta delle uova, come non c'era nessuna perdita massiccia di muco pelle, un'importante barriera contro gli agenti patogeni dall'acqua. Nonostante il fatto che non abbiamo osservato alcuna mortalità post-riproduttiva (entro un mese dalla deposizione delle uova), tutto l'anno l'osservazione ha mostrato alcuni perde di pesce. Nel caso di trota iridea, abbiamo osservato circa 10% più alto di perdite in mano spogliato gruppo, mentre, in trota marrone, strippaggio provocato mortalità del 15% nel corso dell'anno. Possiamo supporre che strippaggio potrebbe essere più utile per la trota iridea fario in termini di qualità delle uova e la mortalità globale dei riproduttori.
Anche se strippaggio è benefico a uova di trota iridea ma non a trota fario, suggeriamo che questa procedura potrebbe essere più standardizzata rispetto alla procedura di "stripping" a mano. Nell'aria di spogliatura, la pressione applicata all'addome del pesce è l'unico fattore che influenza la qualità e la quantità degli ovociti stagionati ottenuti. L'utilizzo di questo metodo in incubatoi allevia le perdite di uova di salmone, che si verificano soprattutto a causa di uova rotte11. Poiché nessuna abilità speciali è necessarie per eseguire la procedura di strippaggio, ci aspettiamo che quantità e qualità delle uova simili possono essere ottenuti con entrambi lavoratori qualificati e non qualificati incubatoio. Ci consiglia di strippaggio procedura come opzione di promessa per nuovi incubatoi che cercano per procedura di raccolta dell'uovo caratterizzata da elevata riproducibilità ed efficienza, così come poco o nessun esperienza dagli operatori.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Lo studio presentato è stato sostenuto dal progetto "pneumatico metodo di pesce stripping - possibile applicazione, influenza sulla quantità e qualità dei gameti e il benessere dei pesci" (acronimo: PNEUFISH) finanziate nell'ambito di "operativa programma di sviluppo di the pesca Settore e Coastal Zone 2007-2013"(OR-61724-OR1400001/10), fondi stanziati alla ricerca di cibo e Institute of Animal Reproduction Accademia polacca delle scienze, Olsztyn, Polonia e supporto di Ufficio COST (cibo e agricoltura costo azione FA1205: AQUAGAMETE ). Vorremmo ringraziare, Giuseppe Ippolito Stanley per il grande supporto in inglese di editing. Vogliamo riconoscere anche i produttori di animazione "Studio Filmowe mobile Obrazki".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycine pure P.A. | AVANTOR | 527560117 | sperm activating buffer |
| Trizma base | Sigma Aldrich | T1503 | sperm activating buffer |
| Sodium chloride Bioreagent | Sigma Aldrich | S5886 | sperm activating buffer |
| Calcium chloride anhydrous | Sigma Aldrich | C4901 | sperm activating buffer |
| Propiscin (0.2% etomidate solution) | IRS Olsztyn, Poland | not indicated | |
| compressor | Thomas Sheboigan WI USA | DT/SR 070800001882 | |
| reduction valve | Camozzi | cRJUS U7J | |
| air hose | ZEC T.P.U. | SH.98 | |
| syrgine | EFD | 7012118 | |
| Air spawning stage | Biopasz, Poland | PNEU001 | |
| Orion Ross Ultra electrode | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA | 8102BNUWP |
References
- Nelson, J. S. Fishes of the World. , 4th, JohnWiley and Sons, Inc. Hoboken, NJ, USA. (2006).
- García-Marín, J. L., Sanz, N., Pla, C. Proportions of native and introduced brown trout in adjacent fished and unfished Spanish rivers. Conservation Biology. 12, 313-319 (1998).
- Dietrich, G. J., Wojtczak, M., Slowinska, M., Dobosz, S., Kuzminski, H., Ciereszko, A. Broken eggs decrease pH of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) ovarian fluid. Aquaculture. 273, 748-751 (2007).
- Zurbuch, P. E. A structure for easy fish recovery during drainage of an impoundment. Progressive FishCulturist. 27, 237-238 (1965).
- Cejko, B. I., et al. Effects of different stripping methods of female and activation medium on fertilization success in northern pike (Esox lucius). Czech Journal of Animal Sciences. 10, 481-486 (2016).
- Morisawa, S., Morisawa, M. Induction of potential for sperm motility by bicarbonate and pH in rainbow trout and chum salmon. Journal of Experimental Biology. 136, 13-22 (1988).
- Billard, R., Cosson, J., Perchec, G., Linhart, O. Biology of sperm and artificial reproduction in carp. Aquaculture. 129, 95-112 (1995).
- Iuchi, I., Ha, C. R., Sugiyama, H., Nomura, K. Analysis of chorion hardening of eggs of rainbow trout, Oncorhynchus mykiss. Development Growth and Differentiation. 38, 299-306 (1996).
- Wojtczak, M. A., Kowalski, R. K., Dobosz, S., Goryczko, K., Kuźminski, H., Glogowski, J., Ciereszko, A. Assessment of water turbidity for evaluation of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) egg quality. Aquaculture. 242, 617-624 (2004).
- Tabrizi, E. N., Khara, H., Nezami, S. A., Lorestani, R., Shamspour, S. Broken Eggs Influence on Fertilization Capacity and Viability of Eggs, Turbidity and pH of Ovarian Fluid and Fertilization Water in the Endangered Caspian Brown Trout, Salmo Trutta Caspius. International Journal of Biology. 3 (1), 161-166 (2011).
- Carl, G. C. Beware of the broken egg! A possible cause of heavy losses of salmon eggs. Progresive Fish-Culturist. 53, 30-31 (1941).
