Summary
Vi beskriver en oprindelige transfer RNA analyse platform kaldet SPOt (strømlinet Platform for observere tRNA). SPOt samtidig foranstaltninger cellulære niveauer af alle tRNAer i biologiske prøver, i kun tre trin, og i mindre end 24 timer.
Abstract
Overførsel RNA'er (tRNA) er rigelige kort ikke-kodende RNA arter, der er typisk 76-90 nukleotider i længde. tRNAer er direkte ansvarlige for proteinsyntese ved at oversætte kodon i mRNA i aminosyresekvenser. tRNAer blev længe betragtet som hus-holder molekyler, der manglede regulerende funktioner. En voksende mængde af beviser tyder imidlertid på, at cellulære tRNA niveauer svinger i korrespondance til varierende forhold som celletype, miljø og stress. Udsving i tRNA udtryk indvirker direkte gen oversættelse, favorisere eller undertrykke udtryk for bestemte proteiner. I sidste ende begribe dynamikken i proteinsyntesen kræver udvikling af metoder til at levere høj kvalitet tRNA profiler. Den metode, vi præsenterer her hedder SPOt, som står for strømlinet Platform for observere tRNA. Stedet består af tre trin starter med metaboliske mærkning af cellekulturer med radioaktivt orthofosfat, efterfulgt af guanidinium kaliumthiocyanat-phenol-chloroform udvinding af radioaktivt samlede RNA'er og endelig hybridisering på in-house udskrives macroarrays. tRNA niveauer er anslået af kvantificere radioaktivitet intensitet på hver probe spot. I protokollen præsenteres her profil vi tRNAer i Mycobacterium smegmatis mc2155, en nonpathogenic bakterie ofte brugt som en model organisme for at studere tuberkulose.
Introduction
Cellulære tRNA niveauer svinger betingelser som celletype, miljø og stress1,2,3. SPOt, strømlinet Platform for observere tRNA, er en original, pålidelig og enkel teknik, der giver mulighed for hurtig og præcis kvantificering af transfer RNA niveauer i laboratorie-dyrkede organismer.
tRNAer har bemærkelsesværdigt stabilt sekundære og tertiære strukturer4. De viser også talrige post-transcriptional ændringer5. Disse funktioner repræsenterer betydelige strukturelle og sekvens vejspærringer påvirke eller undertiden forhindrer direkte og reproducerbare tRNA profilering ved hjælp af standard benchmark RNA kvantificering teknikker6. Forskergrupper verden blev tvunget til at udvikle kreative, men ofte indviklede teknikker til at vurdere cellulære tRNA niveauer. Nogle af disse metoder omfatter: (1) to-dimensionelle elektroforetisk adskillelse af metabolisk mærket tRNAer kombineret med metodisk spot tildeling af nordlige skamplet1; (2) individuelle kvantificering af Northern duppes ved hjælp af omhyggeligt standardiseret radioaktive DNA-sonder7; (3) efter udvinding mærkning med cyanine fluorokromer efterfulgt af microarray analyse3, og (4) in vitro- stripning af tRNA ændringer ved hjælp af rekombinante demodification enzymer kombineret med reverse transkription og efterfølgende høj overførselshastighed sekventering8.
Stedet er en enkel og original kombination af to standard og ligetil tilgange: (1) RNA krop mærkning, der består i syntesen, i voksende organismer, radioaktive samlede RNA'er og (2) tRNA macroarrays, en systematisk og miniaturized genomisk værktøj optimeret til tRNA adskillelse.
Prøverne er strømlinet fra levende organismer til kvantificering platform. De analyseres direkte efter ekstraktion og behandlet ikke nogen yderligere, som væsentligt begrænser afvigelser i forhold til teknikker kræver efter udvinding forstærkning eller enzymatiske behandlinger. Stedet er alsidigt og nemt kan kombineres til polysome fraktionering at identificere og kvantificere tRNA delpopulationer, der er fysisk forbundet med at oversætte ribosomer.
Protokollen præsenteres her er optimeret til Mycobacterium smegmatis, og det var også med held anvendes til profil tRNAer i Escherichia coli-9, Saccharomyces cerevisiae10, mus og menneskelige cellekulturer11 .
Protocol
1. kultur og metaboliske mærkning
- Stikke en gang i midten af hætten af en sterile 1,5 mL micro-centrifugeglas med en 18-gauge kanyle til at give ordentlig udluftning. Podes 500 µL af suppleres med steril 7H 9 bouillon med 5 µL af M. smegmatis fra en forret kultur dyrket overnight12.
Bemærk: Opskriften på en liter 7H 9 bouillon er: 4,7 g kommercielle 7H 9 pulver, 2 mL Glycerol, 1 mL Tween 80, 0.85 g NaCl, 5 g Albumin, 2 g Dextrose, H2O (til at bringe samlede volumen på 1 L).- (Advarsel) Efter standard strålingsbeskyttelse praksis, spike dyrkningsmedier med 20 µCi/mL [32P] Na2HPO4. Vokse bakterier på 37 ° C og 1.200 rpm agitation i en shaker inkubator placeret bag en 9-mm tykke akryl skjold.
- Midlog fase (O.D.600 nm ~ 0,5), overføre det hele kultur ind i en 2-mL-skruelåg rør og pellet radioaktive bakterier ved stuetemperatur ved centrifugering, for 2 min på 10.000 x g. indsamle supernatanten indeholdende selskabsform radioaktive orthofosfat i passende spildbakken.
2. forberedelse af samlede RNA'er
Bemærk: Samlede RNA'er er udvundet fra bakteriel pellets ved hjælp af en kommerciel RNA udvinding reagens (indeholdende guanidinium kaliumthiocyanat, phenol og kloroform) efter producentens protokol.
- Tilsæt 1 mL af kommercielle RNA udvinding reagens og ca 200 µL af glasperler på pelleten. Cap røret sikkert og forstyrre bakteriel i en homogeniseringsapparat i 2 min. under højst agitation, (indstilling nummer fem på valgte instrument (Se Tabel af materialer)).
- Centrifuge prøve på 12.000 x g i 10 min. ved 4 ° C. Overføre supernatanten til en ny 2-mL-rør og kassér perlerne korrekt. Der tilsættes 0,2 mL chloroform og rystes rør kraftigt med Haanden for 15 s. centrifuger på 12.000 x g i 15 min. ved 4 ° C.
- Indsamle den vandige fase af prøven i et nyt rør ved lystfiskeri tube på 45°. Undgå tegning interphase eller organiske lag. Tilføj 2 µL af farvede fældningsmiddel og 0,5 mL 100% isopropanol. Rystes glasset kraftigt med Haanden for 5 s. centrifuger på 12.000 x g i 10 min. ved 4° C.
- Fjern supernatanten fra røret og kassér passende som den flydende fraktion kan indeholde spor af radioaktivitet. Luft tørre pellet i 5 min og derefter resuspend i 200 µL af 2 X saltvand-natrium citrat (SSC), 0,1% (w/v) sodium dodecyl sulfat (SDS) endelige.
Bemærk: Sammensætning af stock 20 X SSC er 3,0 M NaCl, natriumcitrat 0.3 M, pH 7,0.
3. forberedelse af 96 godt printer plader
Bemærk: tRNA microarrays manuelt udskrives med fyrre to 70-mer DNA oligonukleotider komplementære til 3' enden af hver M. smegmatis tRNA (terminal CCA udelukket) ved hjælp af et otte-benet arrayer. Sekvenser af DNA oligonukleotid sonder samt sonde layout i brønden-plade og array leveres (supplerende fil 1 - sheet 1 til 3 henholdsvis).
- Design DNA sonder ved første hente tRNA sekvenser eller tRNA kodning gener fra tRNA databaser såsom genomisk tRNA Database13. Trim bevaret 3' enden CCA hvis kodet. Omvendt supplerer den resulterende sekvens. Bestil sonde baseret på de første 70 nukleotider.
- Resuspend tørre DNA-sonder i vand. Justere sonder koncentration til 100 µM. I en 96 godt-plade, forberede 120 µL af 50 µM oligos i 3 X SSC, 0,01% (w/v) SDS finalen (fortyndet 60 µL af stock sonder i individuelle godt med 60 µL af 6 X SSC, 0,01% (w/v) SDS.
- Dække plade med sølvpapir til at forhindre fordampning eller forurening, fryse straks og holde ved-20 ° C indtil det skal bruges.
4. array udskrivning
- Optø den 96-brønd plade ved stuetemperatur (tager ca 20 min).
- Label Amin-belagt glas dias med en diamant pen. Placer dias til indeksering enhed. Følg gitter placeringer og gøre som følger.
- Omhyggeligt dyppe replicator pins i brøndene.
- Forsigtigt udskrive array på glas dias, ved hjælp af minimal tryk (du vil føle en lille modstand). Fortsætte udskrivning uden rengøring arrayer indtil færdig med blokken A.
- Når du er klar til at gå videre til den næste klods, Følg den nedenfor beskrevne metode med vask.
- Dyp replicator i 5% blegemiddel og Ryst forsigtigt.
- Tryk replicator i absorberende papir.
- Dyp replicator i destilleret vand og Ryst forsigtigt tryk ind i papir. Gentag dette trin en gang.
- Dyp replicator i isopropanol og Ryst forsigtigt tryk ind i papiret.
- Tørre replicator på fan for omkring 20 s før man går videre til den næste blok af 96-brønd plade. Fortsat ønskede antal udskrifter.
- Tillad dias tørre derefter bitmapgenkendelse oligos dias ved hjælp af en 254-nm UV crosslinker.
- Angive energi til 999,990 µJ/cm2.
- Sætte dias ansigt på en ren overflade i crosslinker. Tryk på "start".
- Blokere arrays overnatning i 450 mL blokerende løsning på en magnetomrører, ved stuetemperatur og under langsom agitation. Indsamle og genbruge blokerende løsning op til fire gange.
Bemærk: Opskriften på den blokerende løsning er: 125 mM fosfat buffer (NaH2PO4/Na2HPO4-) pH 7,2, 2,25% SDS (w/v), 0,5 mM EDTA, 0,5 X SSC, 1% BSA (w/v). - Vask dias 2 gange for 5 min ved stuetemperatur i 500 mL destilleret vand. Tørre dias ved centrifugering for 10 s ved stuetemperatur i et microarray centrifuge. Store arrays i et tørt og mørkt sted i op til 6 måneder.
5. array hybridisering
- Forud for hybridisering skyl dias i kogende vand og tørre ved centrifugering (som i 4.6).
- Sted array inde en hybridisering kassette og belastning radiolabeled RNA prøve.
- Kør den automatiserede hybridisering-vask station for maksimal reproducerbarhed.
- Programtrin som følgende. Betingelsen propper i 2 min på 75 ° C. Indføre sonden ved 60 ° C.
Denaturere sonder og prøver 5 min. ved 90 ° C. Krydse prøver i 3 timer ved 60 ° C.- Vaske dias ved 50 ° C to gange med 2 X SSC, 0,1% (w/v) SDS, flow 10 s og holde 20 s. vask dias på 42 ° C to gange med 0,1 X SSC, 0,1% SDS, flow 10 s og holde 20 s. vask dias på 42 ° C to gange med 0,1 X SSC , flow 10 s og hold 20.
- Programtrin som følgende. Betingelsen propper i 2 min på 75 ° C. Indføre sonden ved 60 ° C.
- Tør dias ved centrifugering (som i 4.6).
6. array kvantificering
- Wrap dias ved hjælp af en tynd plastfolie. Kontroller dias for radioaktivt signal ved hjælp af en geigertæller på sin mest følsomme indstilling. Udsætte dias på en storage phosphor skærm i en eksponering kassettebånd ved stuetemperatur i 10 til 90 timer afhængigt af signalstyrken.
Bemærk: Som følsomhed af Geiger tællere varierer fra ét instrument til en anden, eksponering gange skal optimeres empirisk. - Scanne dias på 50 µm opløsning ved hjælp af en phosphorimager. Kvantificere og baggrund-trække radioaktivitet intensitet på hver probe sted ved hjælp af den gratis billede Jørgensen software opgraderet med en microarray profiler.
- Organisere og behandle data ved hjælp af et elektronisk regneark. Generere varme kort ved hjælp af værktøjet betinget formatering. Repræsentere for eksempel hver probe signal som en brøk (udtrykt i ‰) af den samlede sonde signal.
Representative Results
Tre uafhængige biologiske replikater viser, at de testede vækst betingelser, alle M. smegmatis tRNAer udtrykkes over baggrundsniveau (figur 1). I denne særlige eksperiment består den observerede standardafvigelse for hver probe mellem 2% (Arg (TCT)) og 22% (Cys (GCA)) med en median på 5% (figur 1). Falsk ændringer mellem replikater er væsentligt påvirket af faktorer såsom array forberedelse og hybridisering. Høj reproducerbarhed opnås gennem en omhyggelig og konsekvent array udskrivning samt automatiseret prøve hybridisering. Der er 5-fold forskel mellem tRNA Ile (GAT) og tRNA (Val (TAC), den højeste og laveste rigelige arter hhv. Stedet viser, at udtrykket af tRNA isoacceptors ikke er ensartede. Isoacceptors er arter, der holder den samme aminosyre men vise forskellige anticodon sekvenser og derfor afkode forskellige kodon på mRNAs. For eksempel, alle alanin isoacceptors er udtrykt på lignende niveauer, mens den højeste og laveste arginin accepterer tRNAer afvige 3-fold.
Figur 1: repræsentative tRNA macroarray resultaterne. (A) scannet bakteriel, mus og menneskelige macroarrays. M. smegmatis arrays brug kun 43 sonder i stedet for 48 for mus og mennesker. Som en konsekvens, viser den bakterielle array 40 tomme pletter (sonder replikeres otte gange på hver matrix), der blander sig med baggrunden. De fleste af dem er grupperet i øverste venstre hjørne. (B) Histogram og heatmap repræsentationer af tRNA profiler i M. smegmatis under optimale vækstbetingelser. Sonden signaler er gennemsnittet af tre uafhængige eksperimenter (herunder bakterievækst, metabolisk mærkning, udvinding og array hybridisering) og udtrykkes som pr tusind værdier af samlede tRNAer. Standardafvigelserne for de tre gentagelser er angivet som fejllinjer og nuancer af orange på histogram og heatmap henholdsvis. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Beta partikel emissioner er kendt bakteriehæmmende og bakteriedræbende stoffer14, men stråling i rækken testet har nogen væsentlig indflydelse på celle fitness. Scintillation tælle viste, at radioaktiviteten er indarbejdet i 25% af total-celle ekstrakter og efterfølgende, 1% af renset samlede RNA'er.
Sonder ens størrelser, sammenlignelige smeltepunktet og GC indhold, sammen med en ensartet protokol for macroarray spotting, hybridisering og kvantificering tillader objektiv måling af tRNA niveauer direkte fra spot signaler.
Stedet er reproducerbare og specifikke. Dens store dynamikområde og nemt justerbar tærskel giver mulighed for profilering lav rigelige arter, såsom tRNAer forbundet med polysomes, ved blot at forlænge array eksponering gange9. Efter den indledende investering for det nødvendige udstyr gennemsnit drift omkostninger pr. sample, herunder forbrugsvarer, $15 per prøver.
SPOt finder anvendelse på enhver organisme, hvis genom er tilgængelig for sonden design. Modelorganismer, der dyrkes in vitro- er ideelle kandidater til metaboliske mærkning. Som pattedyr genomer ofte indkode mange isodecoders (tRNAer, der deler samme anticodons men vises små forskelle i deres krop sekvenser) skal sonder være delvist degenererede at bevare homogene hybridisering af tæt tRNA arter. Endelig, vedhængende pattedyrceller give typisk lavere mængder af total RNA sammenlignet med organismer vokset i suspension som M. smegmatis, så kulturer skal skaleres betydeligt.
Disclosures
Nogen interessekonflikt erklæret.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af SC INBRE tilskud fra den nationale Institute General Medical Science - NIH (P20GM103499 til R.G.) og grants CA555536 og CA154664 fra National Cancer Institute til P.H.H. Dette program blev delvist understøttet af et stipendium til College of Charleston fra Howard Hughes Medical Institute gennem pre college & Undergraduate Science Education Program og tilskud fra det nationale Center for forskningsressourcer (5 P20 RR016461) og National Institute of General Medical Sciences (8 P20 GM103499) fra de nationale kontorer i sundhed.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass slide indexing system | V&P Scientific, Inc. | VP 470 | |
| Glass slide arrayer replicator | V&P Scientific, Inc. | VP 478 | |
| 96 well microplate indexing system | V&P Scientific, Inc. | VP 472 | |
| Wash and blot station | V&P Scientific, Inc. | VP 475 | |
| Replicator pin dryer | V&P Scientific, Inc. | VP 474 | |
| Amine coated slides | Molecular Devices | K2615 | |
| Hybridizer / Automated hybridization and washing station | Digilab | Hyb10022 | |
| Shaker incubator | Eppendorf Themomixer | 05-400-200 | |
| Screw cap 2 ml tubes | Thermo Scientific | 21-403-201 | |
| [32P] Na2HPO4 | Perkin Elmer | NEX011001MC | |
| Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform (Trizol) | Invitrogen | 15596026 | |
| 0.5 mm glass beads | Research Products International Corp. | 9831 | |
| Mini bead mill | VWR | 25-020 | |
| Storage phosphore screen | Fujifilm | BAS-IP SR 0813 | |
| Phosphorimager | GE Healthcare | Typhoon FLA7000 | |
| DNA oligonucleotides | IDT | N/A | |
| UV crosslinker | Spectroline | Select series 254 nm | |
| Microarray centrifuge | Arrayit Corporation | MHC110V | |
| Mycobacterium smegmatis | ATCC | 700084 | |
| Single-use needles | BD (Becton Dickinson) | 305185 | |
| 2 ml centrifuge tube | Fisherbrand | 14-666-317 | |
| Precipitant (GlucoBlue) | Invitrogen | AM9516 | |
| 7H9 broth | Difco | 271310 | |
| Chloroform | Fisher Chemicals | C298-500 | |
| Isopropanol | Fisher Chemicals | A451-4 | |
| 20 X SSC | Lonza | 51205 | |
| SDS | Fisher Bioreagents | BP166-100 | |
| hybridisation cassette | GE Healthcare | 63-0035-44 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Tween 80 | Amresco | M126-100ML | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Albumin | Spectrum Chemicals | A3611 | |
| Dextrose | Fisher Chemicals | D16-1 | |
| EDTA (Ethylenediaminetetraacetic Acid) | Fisher Bioreagents | BP2482-500 | |
| 0.5 M Phosphate buffer pH 7.2 | Alfa Aesar | AAJ63974AP |
References
- Emilsson, V., Kurland, C. G. Growth rate dependence of transfer RNA abundance in Escherichia coli. EMBO J. 9 (13), 4359-4366 (1990).
- Dittmar, K. A., Goodenbour, J. M., Pan, T. Tissue-specific differences in human transfer RNA expression. PLoS Genet. 2 (12), e221 (2006).
- Pavon-Eternod, M., Gomes, S., Geslain, R., Dai, Q., Rosner, M. R., Pan, T. tRNA over-expression in breast cancer and functional consequences. Nucleic Acids Res. 37 (21), 7268-7280 (2009).
- Giegé, R., Jühling, F., Pütz, J., Stadler, P., Sauter, C., Florentz, C. Structure of transfer RNAs: similarity and variability. Wiley Interdiscip Rev RNA. 3 (1), 37-61 (2012).
- Machnicka, M. A., Olchowik, A., Grosjean, H., Bujnicki, J. M. Distribution and frequencies of post-transcriptional modifications in tRNAs. RNA Biol. 11 (12), 1619-1629 (2014).
- Torres, A. G., Piñeyro, D., Rodríguez-Escribà, M., Camacho, N., Reina, O., Saint-Léger, A., Filonava, L., Batlle, E., Ribas de Pouplana, L. Inosine modifications in human tRNAs are incorporated at the precursor tRNA level. Nucleic Acids Res. 43 (10), 5145-5157 (2015).
- Cognat, V., Deragon, J. M., Vinogradova, E., Salinas, T., Remacle, C., Maréchal-Drouard, L. On the evolution and expression of Chlamydomonas reinhardtii nucleus-encoded transfer RNA genes. Genetics. 179 (1), 113-123 (2008).
- Zheng, G., Qin, Y., Clark, W. C., Dai, Q., Yi, C., He, C., et al. Efficient and quantitative high-throughput tRNA sequencing. Nat Methods. 12 (9), 835-837 (2015).
- Grelet, S., McShane, A., Hok, E., Tomberlin, J., Howe, P. H., Geslain, R. SPOt: A novel and streamlined microarray platform for observing cellular tRNA levels. PLoS One. 12 (5), e0177939 (2017).
- Eriani, G., Karam, J., Jacinto, J., Morris Richard, E., Geslain, R. MIST, a Novel Approach to Reveal Hidden Substrate Specificity in Aminoacyl-tRNA Synthetases. PLoS One. 10 (6), e0130042 (2015).
- Grelet, S., McShane, A., Geslain, R., Howe, P. H. Pleiotropic Roles of Non-Coding RNAs in TGF-β-Mediated Epithelial-Mesenchymal Transition and Their Functions in Tumor Progression. Cancers. 9 (7), (2017).
- Belanger, A. E., Hatfull, G. F. Exponential-phase glycogen recycling is essential for growth of Mycobacterium smegmatis. J Bacteriol. 181 (21), 6670-6678 (1999).
- Chan, P. P., Lowe, T. M. GtRNAdb: A database of transfer RNA genes detected in genomic sequence. Nucl. Acids Res. 37 (Database issue), D93-D97 (2009).
- Schmidt, C. F. The Effect of Radioactive Phosphorus upon a Suspension of Escherichia coli. J Bacteriol. 55 (5), 705-710 (1948).
