Summary
スポット (tRNA を観察するための合理化されたプラットフォーム) の名前、元のトランスファー RNA 解析プラットフォームについて述べる。スポットは、生体試料中唯一の 3 つの手順で、24 時間以内にすべての tRNAs の細胞レベルを同時に測定します。
Abstract
トランスファー Rna (tRNA) が豊富な短い非コード RNA 種通常 76 に 90 のヌクレオチド長であります。Trna は mRNA のコドンをアミノ酸配列に翻訳することによってタンパク質合成を直接担当です。Trna は長い規制機能に欠けていた家は維持分子として考慮されました。ただし、証拠の成長するボディは、セル型、環境、ストレスなどさまざまな条件に対応携帯電話の tRNA のレベルが変動することを示します。TRNA 表現の揺らぎは、優遇または特定蛋白質の発現を抑制遺伝子翻訳を直接影響します。最終的にタンパク質合成の動的を理解と、高品質の tRNA のプロファイルを提供することができる方法の開発が必要です。ここで紹介する方法は、スポット観測 tRNA の合理化されたプラットフォームの略という名前です。スポットは、放射性の総 Rna のためチオシアン酸-フェノール-クロロホルム抽出が続く放射性の正燐酸塩と培養細胞の代謝ラベリングで始まる 3 つの手順で構成されています、最後に社内で交配の印刷macroarrays。tRNA のレベルを推定するには、プローブの各スポットで放射能強度の定量化します。ここで提示されたプロトコルアラビノースイソメラーゼmc2155、結核を研究するモデル生物としてよく使用されます非病原性細菌の Trna をプロファイルします。
Introduction
セルの種類・環境・ ストレス1,2,3などの条件によると携帯電話の tRNA のレベルが変動します。スポット、tRNA を観察するための合理化されたプラットフォームは、元、信頼性の高い研究所成長生物の転移 RNA レベルの高速高精度の定量化ができる簡単なテクニックです。
Trna は、非常に安定した二次および第三構造4を持っています。また、多数の転写後変更5を表示します。これらの機能は、重要な構造とシーケンス障害バイアスまたは防止 tRNA プロファイル標準ベンチマーク RNA 定量技術6を使用して直接かつ再現性を表します。世界中の研究グループは、細胞の tRNA のレベルを評価するために創造的な多くの場合複雑な技術の開発を余儀なくされました。これらのメソッドのいくつかを含める: 代謝ラベルの付いた Trna (1) 二次元電気泳動分離は北のしみ1整然としたスポット割り当てと組み合わせる(北に 2) 個々 の定量化のしみを使用して慎重に標準化された放射性 DNA プローブ7;(続いて 3) ポスト抽出ラベリング シアニン螢マイクロ アレイ解析3と (4)の in vitro遺伝子組換え demodification 酵素逆のトランスクリプションと組み合わせるとそれ以降を使用して tRNA 変更のストリップ高スループット シーケンス8。
スポットは 2 つのスタンダードでシンプルなアプローチのシンプルで元の組み合わせ: (1) RNA の体ラベリング、合成は、成長する生物、放射性の総 Rna や tRNA (2) macroarrays、体系的かつ小型化されたゲノムのツールで構成されていますtRNA の分離のために最適化されています。
サンプルは、生物から定量化プラットフォームに合理化します。彼らは抽出後直接分析し、さらにポスト抽出増幅または酵素治療を必要とする技術と比較してバイアスが大幅に制限されるに処理されません。スポットは多目的、リボソームの翻訳に物理的に関連付けられている tRNA サブポピュレーションの定量化ポリソーム分別に簡単に組み合わせることができます。
ここで提示されたプロトコルがアラビノースイソメラーゼ、最適化され、大腸菌9、酵母10マウスとヒトの細胞培養11 でプロファイル Trna にも正常に使っていました.
Protocol
1 文化および代謝ラベリング
- 適切な通気を許可するように 18 g 針で滅菌 1.5 mL マイクロ遠心チューブのキャップの中心を突く一度。補われた滅菌 7 h 9 500 μ L 接種液 5 μ L M. smegmatisのスターターからの文化成長一晩12。
注: 7 H 9 の 1 リットルのレシピ スープは: 4.7 g 商業 7 H 9 粉、2 mL、グリセリン 1 mL Tween 80、0.85 g 塩化ナトリウム 5 g、アルブミン 2 g、ブドウ糖 H2O (容量は 1 L にさせる)。- (注意)次の標準的な放射線防護の実践 [32P] Na2HPO420 µCi/mL と培養基をスパイクします。9 mm 厚のアクリル盾の後ろに置かれたシェーカー インキュベーターの 37 ° C および 1,200 の rpm の撹拌でバクテリアします。
- 2 mL スクリュー キャップ チューブ midlog 段階 (O.D.600 nm 〜 0.5)、転送全体の文化と 10,000 x g に 2 分を収集の上清含む未採用放射性オルトリン酸の遠心分離によって室温で放射性細菌をペレット適切な廃棄容器。
2. 総 Rna の準備
注: 総 Rna (ため、フェノールおよびクロロホルムを含む)、商業 RNA 抽出試薬を用いた細菌のペレットから抽出する製造元のプロトコルに続きます。
- 商業の RNA 抽出試薬 1 mL とペレットにガラスビーズの約 200 μ L を追加します。しっかりとチューブをキャップし、最大の動揺の下で 2 分間ホモジナイザーで細菌を混乱させる (選ばれた器械の数 5 を設定 (材料の表を参照))。
- 4 ° C で 10 分間、12,000 × g で遠心分離機サンプル上清を新しい 2 mL チューブに転送、ビーズを適切に廃棄します。0.2 mL のクロロホルムを追加、4 ° C で 15 分間 12,000 × g で遠心する 15 s. の手でチューブを積極的に振る
- 45 ° で管釣りで新しいチューブにサンプルの水相を収集します。界面の有機層を描画しないでください。2 色鉛塩法の μ L と 100% イソプロパノールの 0.5 mL 追加します。4 ° C で 10 分間 12,000 × g で遠心する 5 s. の手でチューブを積極的に振る
- チューブから上澄みを除去し、適切に破棄と液体成分分率は放射能の痕跡を含む場合があります。5 分間乾燥ペレットの空気、クエン酸塩ナトリウム (SSC) 0.1% (w/v) ナトリウム dodecyl 硫酸塩 (SDS) 最終的な X 2 の 200 μ L で再懸濁します。
注: 組成株式 20 X SSC の 3.0 M NaCl、0.3 M クエン酸ナトリウム、pH 7.0 です。
3. 96 よくプリンター プレートの準備
注: tRNA のマイクロ アレイ手動で 40 2 70 mer DNA オリゴヌクレオチド 8 ピン arrayer を使用して (ターミナル CCA を除く) 各のM. smegmatis tRNA の 3' 末端に相補的な印刷されます。ウェル プレートとアレイのプローブのレイアウトと同様、DNA のオリゴヌクレオチド プローブのシーケンスを提供 (補足ファイル 1 ● シート 1 に 3 それぞれ)。
- デザイン DNA は最初取得する tRNA シーケンスや tRNA 遺伝子ゲノムの tRNA など tRNA データベースから、データベース13をプローブします。トリム保存 3' 末端の CCA エンコードされている場合。逆の補数結果のシーケンス。最初 70 ヌクレオチドに基づいて順序プローブ。
- 水で乾燥 DNA プローブを再懸濁します。100 μ M のプローブの濃度を調整します。96 ウェル プレート、3 X SSC、0.01% (w/v) SDS ファイナル (希薄 60 μ L 個人の株式のプローブの 6 X SSC、0.01% (w/v) SDS の 60 μ L で 50 μ M oligos の 120 μ L を準備します。
- 蒸発や汚染を防ぐため、すぐに凍結し、-20 ° c まで必要な維持するスズ箔と板をカバーしてください。
4. 配列印刷
- 常温 (約 20 分所要) 96 ウェル プレートを解凍します。
- ダイヤモンド ペンでアミン コーテッド ガラス スライドにラベルを付けます。インデックス ユニットにスライドを配置します。グリッド配置をに従って、次のようにです。
- 井戸のレプリケーター ピンを慎重に浸しなさい。
- 優しく (小さな抵抗を感じるが) 最小限の圧力を使用してスライド ガラスに配列を印刷します。ブロック A と完了するまで arrayer を洗浄することがなく印刷を続行します。
- 次のブロックに移動する準備ができたら、以下の洗濯手順に従います。
- 5% の漂白剤のレプリケーターを浸し、軽く振る。
- 吸収性の紙にレプリケーターを押し込みます。
- 蒸留水でレプリケーターを浸し、軽く振るし、紙に押します。この手順をもう一度繰り返します。
- イソプロパノールにレプリケーターを浸し、軽く振るし、紙に押します。
- 約 20 のためファンのレプリケーターを乾燥 s 96 ウェル プレートの次のブロック移動する前に。必要なプリント枚数を続けます。
- 乾燥し、架橋 254 nm UV 架橋剤を使用してスライドに oligos のスライドを許可します。
- エネルギー レベルを 999,990 μ J/cm2に設定します。
- スライドの顔を架橋剤できれいな表面に設置します。「スタート」を押してください。
- 磁性攪拌器、常温と低速攪拌法の解決を妨げるの 450 mL で一晩配列をブロックします。収集し、最大 4 倍のブロッキング液を再利用します。
注: ブロックのソリューションのためのレシピは: 125 mM リン酸緩衝 (NaH2PO4/Na2HPO4-) pH 7.2, 2.25 %sds (w/v)、0.5 ミリメートルの EDTA、0.5 X SSC、1 %bsa (w/v)。 - 500 mL の蒸留水に室温で 5 分間 2 回スライドを洗います。10 遠心分離によってスライドを乾燥室温マイクロ アレイ遠心分離機で s。最大 6 ヶ月のための乾燥した、暗い場所にストア配列。
5. アレイ ハイブリダイゼーション
- 交配する前に、水を沸騰のスライドをすすいで (4.6) のように遠心分離によって乾燥します。
- ハイブリダイゼーション カセット内部配列を置き、標識 RNA サンプルをロードします。
- 最大再現性の自動ハイブリダイゼーション洗濯駅を実行します。
- プログラムのステップ次のよう。75 ° C で 2 分間条件ガスケット60 ° C でプローブをご紹介します。
プローブと 90 ° C で 5 分間のサンプルを変化させなさい。60 ° C で 3 時間サンプルを交配させる- 2 × SSC、0.1% (w/v) SDS 流 10 秒 2 回 50 ° C でスライドを洗うし、20 s の 0.1 0.1% SDS X SSC フロー 10 s で 2 回 42 ° C で洗浄スライドと 0.1 で二回 42 ° C で 20 s. 洗浄スライドを保持する保持 X SSC、フロー 10 s とホールド 20 s。
- プログラムのステップ次のよう。75 ° C で 2 分間条件ガスケット60 ° C でプローブをご紹介します。
- (4.6) のように遠心分離によってスライドを乾燥します。
6. 配列の定量化
- 薄いプラスチック フィルムを使用してスライドをラップします。その最も敏感な設定のガイガー カウンターを使用した放射性の信号用のスライドを確認します。信号の強さに応じて 10 に 90 時間室温で露出カセット ストレージ蛍光体スクリーンにスライドを公開します。
注: ガイガー カウンターの感度は、別の 1 つの楽器によって異なります、露光時間する必要があります最適化する経験的。 - 50 μ m 解像度を phosphorimager を使用してスライドをスキャンします。バック グラウンド減算マイクロ アレイのプロファイラーを使用してアップグレード無料画像 J ソフトウェアを使用しての各プローブ スポットで放射能強度を定量化します。
- 整理および電子スプレッドシートを使用してデータを処理します。条件付き書式設定ツールを使用してヒート マップを生成します。たとえば各プローブ信号として表現 (‰ 単位) 分数合計プローブ信号の。
Representative Results
3 つの独立した生物は、すべてM. smegmatis Trna テスト成長条件下で、バック グラウンド レベル (図 1) の上に表現されているショーをレプリケートします。この実験では、各プローブの観測の標準偏差は 2% (Arg (TCT)) と、5% (図 1) で中央値 22% (Cys (GCA)) との間で構成されています。複製間で虚偽の変更はアレイの準備および交配などの要因によって大きく影響されました。高い再現性はサンプルの交配を自動化し同様、慎重かつ一貫性のある配列印刷によって実現されます。TRNA の 5-fold 違いがあるイル (GAT) と tRNA (ヴァル (TAC)、最高と最低豊富な種それぞれ。スポットは、tRNA isoacceptors の発現は一様でないことを示しています。Isoacceptors は、同じアミノ酸を保持するが、異なるアンチコドン シーケンスを表示およびデコード Mrna のコドンを別の種です。一方、たとえば、すべてアラニン isoacceptors を表現し、似たようなレベルで受け入れる Trna が 3 倍異なる最高と最低のアルギニン。
図 1: 代表的な tRNA macroarray 結果。(A)スキャンした細菌、マウスおよび人間 macroarrays。M. smegmatis配列は、マウスおよびヒトの 48 ではなくのみ 43 プローブを使用します。結果として、細菌の配列には、背景とブレンド 40 の空スポット (プローブ アレイごとに 8 回にレプリケートされます) が表示されます。それらのほとんどは左上隅にクラスター化します。M. smegmatisの最適な成長条件下に tRNA のプロフィールの(B)のヒストグラムとヒートマップ表現。プローブ信号 (細菌の増殖、新陳代謝、抽出およびアレイ交配を含む) 3 つの独立実験の平均および合計 Trna の千の値に従って表現されます。3 つのレプリケートの標準偏差はそれぞれ誤差範囲とヒストグラムとヒートマップにオレンジの色合いとして示されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Discussion
ベータ粒子の放出は、テストの範囲に放射セル フィットネスにも大きな影響を与えるしかし静菌と殺菌剤14、知られています。シンチレーションを示した放射能が全細胞抽出液の 25%、その後、浄化された総 Rna の 1% に組み込まれています。
プローブの同一サイズ、同等の溶解温度と GC コンテンツ、macroarray のスポッティング、統一プロトコル交配および定量化のスポット信号から直接レベルの tRNA の公平な測定できます。
スポットは、再現性と特定です。その広いダイナミック レンジと簡単に調整可能なしきい値により、配列露出度9を延長することにより単にポリソームに関連付けられている Trna などの低豊富な種をプロファイリングします。必要な設備の初期投資後の消耗品を含むサンプル当たりのランニング コスト サンプルあたり 15 ドルの平均値します。
スポットは、あらゆる有機体のゲノムはプローブ設計のために適用されます。試験管内で栽培されているモデル生物は、代謝ラベリングを理想的な候補です。哺乳類のゲノムはしばしば多くの isodecoders (Trna と同じ anticodons を共有するものの、彼らのボディのシーケンスの小さい相違を表示) をエンコード、プローブは閉じる tRNA 種の同種交配を維持するために部分的に退化した必要があります。最後に、付着性の哺乳類セルは通常低い文化を大幅にスケール アップする必要があるので、 M. smegmatisなどペンションで成長した有機体と比較して総 RNA 量を得られます。
Disclosures
利害の対立が宣言されていません。
Acknowledgments
この作品が支持された SC INBRE 付与から国立科学研究所の一般医療 - NIH によって (r. g. に P20GM103499) し、国立がん研究所から P.H.H. に CA555536 ・ CA154664 を付与このプログラム部分で支えられましたチャールストン大学に就学及び学部科学教育プログラムによってハワード ヒューズ医学研究所からの助成金によって、センターからの助成金によって研究資源 (5 P20 RR016461)国立科学研究所の一般医療 (8 P20 GM103499) 国立衛生研究所から。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass slide indexing system | V&P Scientific, Inc. | VP 470 | |
| Glass slide arrayer replicator | V&P Scientific, Inc. | VP 478 | |
| 96 well microplate indexing system | V&P Scientific, Inc. | VP 472 | |
| Wash and blot station | V&P Scientific, Inc. | VP 475 | |
| Replicator pin dryer | V&P Scientific, Inc. | VP 474 | |
| Amine coated slides | Molecular Devices | K2615 | |
| Hybridizer / Automated hybridization and washing station | Digilab | Hyb10022 | |
| Shaker incubator | Eppendorf Themomixer | 05-400-200 | |
| Screw cap 2 ml tubes | Thermo Scientific | 21-403-201 | |
| [32P] Na2HPO4 | Perkin Elmer | NEX011001MC | |
| Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform (Trizol) | Invitrogen | 15596026 | |
| 0.5 mm glass beads | Research Products International Corp. | 9831 | |
| Mini bead mill | VWR | 25-020 | |
| Storage phosphore screen | Fujifilm | BAS-IP SR 0813 | |
| Phosphorimager | GE Healthcare | Typhoon FLA7000 | |
| DNA oligonucleotides | IDT | N/A | |
| UV crosslinker | Spectroline | Select series 254 nm | |
| Microarray centrifuge | Arrayit Corporation | MHC110V | |
| Mycobacterium smegmatis | ATCC | 700084 | |
| Single-use needles | BD (Becton Dickinson) | 305185 | |
| 2 ml centrifuge tube | Fisherbrand | 14-666-317 | |
| Precipitant (GlucoBlue) | Invitrogen | AM9516 | |
| 7H9 broth | Difco | 271310 | |
| Chloroform | Fisher Chemicals | C298-500 | |
| Isopropanol | Fisher Chemicals | A451-4 | |
| 20 X SSC | Lonza | 51205 | |
| SDS | Fisher Bioreagents | BP166-100 | |
| hybridisation cassette | GE Healthcare | 63-0035-44 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Tween 80 | Amresco | M126-100ML | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Albumin | Spectrum Chemicals | A3611 | |
| Dextrose | Fisher Chemicals | D16-1 | |
| EDTA (Ethylenediaminetetraacetic Acid) | Fisher Bioreagents | BP2482-500 | |
| 0.5 M Phosphate buffer pH 7.2 | Alfa Aesar | AAJ63974AP |
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