Summary
Nós descrevemos uma plataforma de análise de RNA de transferência original chamada SPOt (plataforma simplificada para observar o tRNA). Local simultaneamente mede níveis celulares de todos os tRNAs em amostras biológicas, em apenas três passos e em menos de 24 horas.
Abstract
RNAs de transferência (tRNA) são curtos não-codificantes do RNA espécies abundantes que são tipicamente de 76 a 90 nucleotídeos de comprimento. os tRNAs são diretamente responsáveis pela síntese de proteínas, traduzindo códons de RNAm em sequências de aminoácidos. os tRNAs tempo foram considerados como moléculas de domésticas que faltava funções reguladoras. No entanto, um conjunto crescente de evidências indica que os níveis de tRNA celular flutuarem em correspondência com condições variáveis tais como o tipo de célula, ambiente e stress. A flutuação da expressão de tRNA influencia directamente a tradução do gene, favorecendo ou reprimindo a expressão de proteínas específicas. Em última análise, compreender a dinâmica da síntese de proteínas requer o desenvolvimento de métodos capazes de fornecer perfis de tRNA de alta qualidade. O método que apresentamos aqui é chamado SPOt, sigla para plataforma simplificada para Observing tRNA. Ponto consiste de três etapas, começando com rotulagem metabólico de culturas de células com ortofosfato radioactivo, seguido pela extração de tiocianato-fenol-clorofórmio guanidínio de RNAs totais radioactivos e finalmente hibridação na in-house impressos macroarrays. níveis de tRNA são estimados por quantificar as intensidades de radioatividade em cada ponto de sonda. No protocolo apresentado aqui nós perfil tRNAs em Mycobacterium smegmatis mc2155, uma bactéria não-patogênicas frequentemente usada como um organismo modelo para estudar a tuberculose.
Introduction
Níveis de tRNA celular variam de acordo com condições tais como o tipo de célula, ambiente e stress1,2,3. SPOt, plataforma simplificada para observar o tRNA, é uma original, confiável e uma técnica simples que permite a rápida e precisa de quantificação dos níveis de RNA de transferência em organismos laboratório-crescido.
os tRNAs têm estruturas secundárias e terciárias notavelmente estável4. Eles também exibem numerosas modificações pós-transcricional5. Esses recursos representam significativa estrutural e bloqueios de estradas sequência de polarização ou às vezes impedindo direta e reprodutíveis tRNA perfis usando de técnicas de quantificação de RNA de referência padrão6. Grupos de pesquisa ao redor do mundo foram obrigados a desenvolver técnicas criativas, mas muitas vezes complicadas para avaliar níveis de tRNA celular. Alguns desses métodos incluem: (1) separação eletroforética bidimensional de tRNAs metabolicamente rotulado combinado com atribuição local metódica pelo Borrão do Norte1; (2) individual quantificação por Northern blot usando cuidadosamente padronizado radioativo DNA sondas7; (3) pós-extração de rotulagem com fluorochromes cianina seguido de análise de microarray3e (4) em vitro descascamento de modificações de tRNA usando enzimas recombinantes demodification combinadas com a transcrição reversa e subsequentes arranjar em sequência do elevado-throughput,8.
SPOt é uma combinação simples e original de duas abordagens de padrão e simples: corpo de RNA (1) rotulagem, que consiste na síntese, no cultivo de organismos, de RNAs totais radioactivos e (2) tRNA macroarrays, uma ferramenta genômica sistemática e miniaturizada otimizado para segregação de tRNA.
As amostras são simplificadas de organismos vivos para a plataforma de quantificação. Eles são analisados diretamente após a extração e não processados mais longe que limita significativamente a preconceitos em relação às técnicas que requerem amplificação pós-extração ou tratamentos enzimáticos. SPOt é versátil e pode ser facilmente combinado para fracionamento de polysome a identificação e quantificação de subpopulações de tRNA fisicamente associados traduzir ribossomas.
O protocolo aqui apresentado é otimizado para Mycobacterium smegmatis, e foi usado também com sucesso para os tRNAs perfil em9 Escherichia coli,10 Saccharomyces cerevisiae, rato e culturas de células humanas11 .
Protocol
1. cultura e rotulagem metabólica
- Picar uma vez o centro da tampa de um tubos de microcentrífuga estéril 1,5 mL com uma agulha de calibre 18, para permitir a aeração adequada. Inocular a 500 µ l de completados estéril 7h 9 caldo com 5 µ l de M. smegmatis de um starter cultura adulta durante a noite12.
Nota: A receita para um litro de 7h 9 caldo é: 4,7 g comercial 7h 9 em pó, 2 mL de glicerol, 1 mL de Tween 80, 0,85 g de NaCl, 5 g de albumina, 2 g de Dextrose, H2O (para trazer o volume total de 1 L).- (Cuidado) Seguindo as práticas padrão de protecção contra as radiações, spike o meio de cultura com 20 µCi/mL [32P] Na2HPO4. Cresce bactérias a 37 ° C e 1.200 rpm agitação, numa incubadora shaker colocado atrás de um escudo acrílico grosso de 9mm.
- Na fase midlog (O.D.600 nm ~ 0.5), transferir toda a cultura para um tubo de 2 mL tampa de rosca e bactérias radioativas à temperatura de pelotas por centrifugação para 2 min a 10.000 g. x coletar ortofosfato radioactivo não incorporado contendo sobrenadante em recipiente de resíduos adequado.
2. preparação do RNA total
Nota: Total RNAs são extraídos de pelotas bacterianas usando um reagente de extração de RNA comercial (contendo guanidínio tiocianato, fenol e clorofórmio) seguindo o protocolo do fabricante.
- Adicione 1 mL do reagente de extração de RNA comercial e aproximadamente 200 µ l de esferas de vidro para a pelota. Tampar o tubo firmemente e perturbar a bacteriana em um homogeneizador por 2 min sob agitação máxima, (definindo o número cinco no instrumento escolhido (consulte a Tabela de materiais)).
- Amostra de centrifugação a 12.000 x g por 10 min a 4 ° C. Transferir o sobrenadante para um novo tubo de 2 mL e descartar os grânulos apropriadamente. Adicionar 0,2 mL de clorofórmio e agitar vigorosamente o tubo à mão por 15 s. centrifugar a 12.000 x g por 15 min a 4 ° C.
- Recolha a fase aquosa da amostra para um tubo novo por pesca o tubo a 45°. Evite qualquer interfase ou camada orgânica de desenho. Adicione 2 µ l de dessensibilizador colorida e 0,5 mL de isopropanol 100%. Agite o tubo vigorosamente à mão para 5 s. centrifugar a 12.000 x g por 10 min a 4° C.
- Remover o sobrenadante do tubo e descartar adequadamente como a fracção líquida pode conter vestígios de radioactividade. Ar seco da pelota por 5 min e Resuspenda em 200 µ l de solução salina-citrato de sódio (SSC), 0,1% (p/v) Dodecil sulfato de sódio (SDS) final de 2x.
Nota: A composição de estoque 20 X SSC é 3,0 M NaCl, citrato de sódio 0,3 M, pH 7,0.
3. preparação de 96 placas de impressora bem
Nota: tRNA microarrays manualmente são impressos com quarenta e dois 70-mer oligonucleotídeos de DNA complementares à extremidade 3' de cada tRNA M. smegmatis (terminal CCA excluído) usando um arrayer de oito pinos. As sequências de DNA do oligonucleotide sondas, bem como o layout de sonda na placa de bem e a matriz são fornecidas (arquivo complementar 1 - folha 1 a 3 respectivamente).
- Projeto DNA sondas por primeiro recuperando sequências de tRNA ou tRNA codificação genes de tRNA bancos de dados como o tRNA Genomic Database13. Guarnição conservada 3' extremidade CCA se codificado. Complemento de inverter a sequência resultante. Sonda de ordem com base nos primeiros 70 nucleotídeos.
- Resuspenda sondas de DNA secas na água. Ajuste a concentração de sondas de 100 µM. Em uma placa-96, preparar 120 µ l de 50 µM oligos em 3 X SSC, 0,01% (p/v) SDS final (diluir 60 µ l de estoque sondas poço individuais com 60 µ l de 6 X SSC, 0,01% (p/v) SDS.
- Cubra o prato com papel alumínio para evitar evaporação ou contaminação, congelar imediatamente e manter a-20 ° C até ser necessário.
4. impressão matriz
- Descongele a placa de 96 poços à temperatura ambiente (leva cerca de 20 min).
- Lâminas de vidro de rótulo amina-revestido com uma caneta de diamante. Coloque slides em unidade de indexação. Siga as colocações de grade e proceda como a seguir.
- Mergulhe cuidadosamente os pinos replicator em poços.
- Delicadamente, imprima a matriz nas corrediças de vidro, usando a pressão mínima (você vai sentir uma pequena resistência). Continuar a impressão sem limpeza a arrayer até terminar com o bloco A.
- Quando estiver pronto para avançar para o próximo bloco, siga o procedimento de lavagem descrito abaixo.
- Mergulhe o replicador em lixívia a 5% e agite suavemente.
- Replicador de imprensa em papel absorvente.
- Mergulhe replicator na água destilada, agitar suavemente e pressione no papel. Repita este passo uma vez.
- Mergulhe o replicador em isopropanol, agite e pressione o papel.
- Secar o replicador no ventilador por cerca de 20 s antes de passar para o próximo bloco da placa de 96 poços. Continue para o número desejado de cópias.
- Permitir que os slides secar em seguida crosslink o oligos para o slide usando um agente reticulante UV de 254 nm.
- Defina o nível de energia a 999.990 µ j/cm2.
- Colocar o rosto de slides sobre uma superfície limpa no crosslinker. Pressione "start".
- Bloquear as matrizes durante a noite em 450 mL de solução em um agitador magnético, à temperatura ambiente e sob agitação lenta de bloqueio. Recolher e reutilizar a solução bloqueio até quatro vezes.
Nota: A receita para a solução de bloqueio é: 125 mM de tampão de fosfato (NaH2PO4/num2HPO4-) pH 7,2, SDS de 2,25% (p/v), 0,5 mM EDTA, 0,5 X SSC, BSA 1% (p/v). - Lave as lâminas 2 vezes durante 5 min à temperatura ambiente em 500 mL de água destilada. Secar as lâminas por centrifugação para 10 s à temperatura ambiente em uma centrífuga de microarray. Matrizes de loja em um lugar seco e escuro por até 6 meses.
5. hibridização de matriz
- Antes da hibridização enxague slides em água fervente e seque por centrifugação (como em 4.6).
- Matriz de lugar dentro de uma gaveta de hibridização e carga radiolabeled amostra de RNA.
- Execute estação de hibridação-lavagem automatizada para máxima reprodutibilidade.
- Como seguindo as etapas do programa. Gaxetas de condição por 2 min a 75 ° C. Introduzir a sonda a 60 ° C.
Desnaturar sondas e amostras de 5 min a 90 ° C. Cruzar as amostras por 3 h a 60 ° C.- Lave os slides a 50 ° C, duas vezes com 2 X SSC, 0,1% (p/v) SDS, fluxo 10 s e mantenha 20 s. lavagem slides a 42 ° C, duas vezes com 0.1 X SSC, 0,1% SDS, fluxo 10 s e segurar 20 slides de lavagem s. a 42 ° C, duas vezes com 0,1 X SSC , fluxo 10 s e espera 20 s.
- Como seguindo as etapas do programa. Gaxetas de condição por 2 min a 75 ° C. Introduzir a sonda a 60 ° C.
- Slides secas por centrifugação (como em 4.6).
6. quantificação de matriz
- Enrole os slides usando uma fina película de plástico. Verifique slides para sinal radioativo, usando um contador Geiger na sua configuração mais sensível. Expor slides em uma tela de fósforo de armazenamento em uma gaveta de exposição à temperatura de 10 a 90 h dependendo da intensidade do sinal.
Nota: Como a sensibilidade dos contadores Geiger variam de um instrumento para outro, tempos de exposição devem ser otimizados empiricamente. - Digitalize slides em 50 µm resolução usando um phosphorimager. Quantificar e fundo-subtrair intensidades de radioatividade em cada ponto de sonda usando o software Image J livre atualizado com um gerador de perfil de microarray.
- Organizar e processar os dados utilizando uma planilha eletrônica. Gere mapas de calor usando a ferramenta de formatação condicional. Representa por exemplo cada sinal da sonda como uma fração (expressada em ‰) do sinal de sonda total.
Representative Results
Três biológica independente Replica mostram que, sob as condições de crescimento testadas, todos os tRNAs M. smegmatis exprimem-se acima do nível do plano de fundo (Figura 1). Nesta experiência particular, o desvio padrão observado para cada sonda está compreendido entre 2% (Arg (TCT)) e 22% (Cys (GCA)), com uma mediana de 5% (Figura 1). Falsas mudanças entre repetições são significativamente influenciadas por fatores como preparação da matriz e hibridação. Alta reprodutibilidade é conseguida com impressão de matriz de cuidadoso e consistente, bem como automatizado da hibridação de amostra. Há uma 5-fold diferença entre tRNA Ile (GAT) e tRNA (Val (TAC), a mais alta e mais baixa abundante espécie respectivamente. Ponto mostra que a expressão do tRNA isoacceptors não é uniforme. Isoacceptors são espécies que mantenha o mesmo aminoácido mas exibir sequências anticodão diferentes e, portanto, decodificar diferentes códons sobre mRNAs. Por exemplo, todos os isoacceptors de alanina são expressos em níveis semelhantes, Considerando que a arginina maior e menor, aceitando os tRNAs diferem por 3 vezes.
Figura 1: resultados de tRNA representativo macroarranjo. (A) digitalizados bacteriano, mouse e macroarrays humano. Matrizes de M. smegmatis usam apenas 43 sondas em vez de 48 para rato e humanos. Como consequência, a matriz bacteriana exibe 40 pontos vazios (sondas são replicadas oito vezes em cada matriz) que se misturam com o fundo. A maioria deles é agrupada no canto superior esquerdo. (B) histograma e heatmap representações de perfis de tRNA em M. smegmatis sob condições de crescimento ideal. Sinais de sonda são a média de três experimentos independentes (incluindo o crescimento bacteriano, rotulagem metabólicos, hibridação de extração e matriz) e são expressos como por mil valores de tRNAs total. Desvios-padrão para as três repetições são indicados como barras de erro e tons de laranja no histograma e heatmap, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Emissões de partículas beta são conhecidas agentes bactericidas e bacteriostáticas,14, no entanto, radiações na faixa testada não tem nenhum impacto significativo na aptidão de célula. Contagem de cintilação mostrou que a radioatividade é incorporada por 25% do total-célula extratos e, posteriormente, 1% do RNA total purificada.
Das sondas tamanhos idênticos, temperatura de fusão comparável e conteúdo GC, juntamente com um protocolo uniforme para macroarranjo manchando, hibridização e quantificação permite imparcial medição dos níveis de tRNA diretamente de sinais local.
SPOt é reprodutível e específicos. Seu grande alcance dinâmico e facilmente ajustável limiar permite a criação de perfil baixos espécies abundantes, tais como os tRNAs associados polissomos, simplesmente prolongando matriz exposição vezes9. Após o investimento inicial para o equipamento necessário, a execução, custo por amostra, incluindo consumíveis, média de US $15 por amostras.
SPOt é aplicável a qualquer organismo cujo genoma está disponível para o projeto da sonda. Organismos-modelo que são cultivados em vitro são candidatos ideais para a rotulagem metabólicos. Como genomas de mamíferos codificam frequentemente muitos isodecoders (os tRNAs que compartilham anticódons idênticos mas exibir pequenas diferenças em suas sequências de corpo) sondas precisam ser parcialmente degenerado para preservar homogênea hibridação de espécies perto do tRNA. Finalmente, células de mamíferos aderentes rendem normalmente menor quantidade de RNA total, em comparação com os organismos cultivados em suspensão tais como M. smegmatis, então culturas precisam ser substancialmente ampliados.
Disclosures
Não há conflito de interesse declarado.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado por um subsídio de SC INBRE do Instituto Nacional de General Medical ciência - NIH (P20GM103499 de R.G.) e concede a CA555536 & CA154664, do Instituto Nacional do câncer para P.H.H. Este programa foi apoiado em parte por uma concessão à Universidade de Charleston do Howard Hughes Medical Institute, através da pre-faculdade & graduação programa de educação científica e por concessões do centro nacional para recursos de pesquisa (5 P20 RR016461) e o Instituto Nacional de General Medical Ciências (P20 8 GM103499) dos institutos nacionais de saúde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass slide indexing system | V&P Scientific, Inc. | VP 470 | |
| Glass slide arrayer replicator | V&P Scientific, Inc. | VP 478 | |
| 96 well microplate indexing system | V&P Scientific, Inc. | VP 472 | |
| Wash and blot station | V&P Scientific, Inc. | VP 475 | |
| Replicator pin dryer | V&P Scientific, Inc. | VP 474 | |
| Amine coated slides | Molecular Devices | K2615 | |
| Hybridizer / Automated hybridization and washing station | Digilab | Hyb10022 | |
| Shaker incubator | Eppendorf Themomixer | 05-400-200 | |
| Screw cap 2 ml tubes | Thermo Scientific | 21-403-201 | |
| [32P] Na2HPO4 | Perkin Elmer | NEX011001MC | |
| Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform (Trizol) | Invitrogen | 15596026 | |
| 0.5 mm glass beads | Research Products International Corp. | 9831 | |
| Mini bead mill | VWR | 25-020 | |
| Storage phosphore screen | Fujifilm | BAS-IP SR 0813 | |
| Phosphorimager | GE Healthcare | Typhoon FLA7000 | |
| DNA oligonucleotides | IDT | N/A | |
| UV crosslinker | Spectroline | Select series 254 nm | |
| Microarray centrifuge | Arrayit Corporation | MHC110V | |
| Mycobacterium smegmatis | ATCC | 700084 | |
| Single-use needles | BD (Becton Dickinson) | 305185 | |
| 2 ml centrifuge tube | Fisherbrand | 14-666-317 | |
| Precipitant (GlucoBlue) | Invitrogen | AM9516 | |
| 7H9 broth | Difco | 271310 | |
| Chloroform | Fisher Chemicals | C298-500 | |
| Isopropanol | Fisher Chemicals | A451-4 | |
| 20 X SSC | Lonza | 51205 | |
| SDS | Fisher Bioreagents | BP166-100 | |
| hybridisation cassette | GE Healthcare | 63-0035-44 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Tween 80 | Amresco | M126-100ML | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Albumin | Spectrum Chemicals | A3611 | |
| Dextrose | Fisher Chemicals | D16-1 | |
| EDTA (Ethylenediaminetetraacetic Acid) | Fisher Bioreagents | BP2482-500 | |
| 0.5 M Phosphate buffer pH 7.2 | Alfa Aesar | AAJ63974AP |
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