Summary
Vi beskriver en ursprungliga överföring RNA analysplattform heter SPOt (strömlinjeformad plattform för observation tRNA). SPOt samtidigt åtgärder cellulära nivåer av alla tRNAs i biologiska prover, i bara tre steg och i mindre än 24 timmar.
Abstract
Överföring RNA (tRNA) är rikligt kort icke-kodande RNA arter som vanligtvis 76 till 90 nukleotider i längd. tRNAsna är direkt ansvariga för proteinsyntes genom att översätta kodon i mRNA in i amino syra ordnar. tRNAs ansågs länge som städning molekyler som saknade tillsynsuppdrag. En växande mängd bevis tyder dock på att cellulära tRNA nivåerna fluktuerar i korrespondens till varierande förhållanden såsom celltyp, miljö och stress. Fluktuationer i tRNA uttryck påverkar direkt gen översättning, gynnar eller förtränga uttrycket av specifika proteiner. Slutligen förstå dynamiken i proteinsyntesen kräver utveckling av metoder kunna leverera högkvalitativa tRNA profiler. Metoden som vi presenterar här heter SPOt, som står för strömlinjeformad plattform för observation tRNA. Platsen består av tre steg börjar med metabola märkning av cellkulturer med radioaktiva fosfat, följt av guanidinium kaliumtiocyanat-fenol-kloroform utvinning av radioaktiva totala RNAs och slutligen hybridisering på egen tryckt macroarrays. tRNA nivåer beräknas genom att kvantifiera radioaktivitet Ljusstyrkorna vid varje sond plats. I protokollet presenteras här profil vi tRNAs i Mycobacterium smegmatis mc2155, en nonpathogenic bakterie som ofta används som modellorganism för att studera tuberkulos.
Introduction
Cellulära tRNA nivåer används varierar enligt villkor såsom celltyp, miljö och stress1,2,3. SPOt, strömlinjeformad plattform för observation tRNA, är ett original, pålitlig, och okomplicerad teknik som tillåter snabb och exakt kvantifiering av överföring RNA-nivåer i laboratorium-fullvuxna organismer.
tRNAs har anmärkningsvärt stabil sekundära och tertiära strukturer4. De visar också talrika post-transcriptional ändringar5. Dessa funktioner utgör betydande strukturella och sekvens vägspärrar förspänns eller ibland förhindra direkt och reproducerbara tRNA profilering med standard riktmärke RNA kvantifiering tekniker6. Forskargrupper runt om i världen var tvungna att utveckla kreativa men ofta invecklade tekniker för att bedöma cellulära tRNA nivåer. Några av dessa metoder inkluderar: (1) tvådimensionella elektroforetisk separation av metaboliskt märkt tRNAs kombinerat med metodisk spot tilldelning av nordliga plumpen1; (2) individuell kvantifiering av Northern blot använder noggrant standardiserat radioaktiva DNA sonder7; (3) efter extraktion märkning med cyanin fluorokromer följt av microarray analys3, och (4) i vitro strippar av tRNA ändringar med hjälp av rekombinant demodification enzymer kombineras med omvänd Transkription och efterföljande hög genomströmning sekvensering8.
Platsen är en enkel och ursprungliga kombination av två standard och enkla metoder: (1) RNA kropp märkning, som består i syntesen, i växande organismer, av radioaktiva totala RNAs och (2) tRNA macroarrays, en systematisk och miniatyriserade genomisk verktyg optimerad för tRNA segregation.
Prover är strömlinjeformade från levande organismer till kvantifiering plattformen. De analyseras direkt efter extraktion och bearbetas inte längre som avsevärt inskränker fördomar jämfört med tekniker som kräver efter extraktion förstärkning eller enzymatiska behandlingar. Platsen är mångsidig och kan enkelt kombineras till polysome fraktionering att identifiera och kvantifiera tRNA subpopulations som är fysiskt associerade med att översätta ribosomer.
Det protokoll som presenteras här är optimerad för Mycobacterium smegmatis, och det användes också framgångsrikt till profil tRNAs Escherichia coli9, Saccharomyces cerevisiae10, mus, och mänskliga cellodlingar11 .
Protocol
1. kultur och metabola märkning
- Peta en gång i mitten av locket av en steril 1,5 mL mikro-centrifugrör med 18 gauge nål att tillåta ordentlig luftning. Inokulera 500 µL kompletterade steril 7 h 9 buljong med 5 µL M. smegmatis från förrätt kultur odlas över natten12.
Obs: Receptet för en liter 7 h 9 buljong är: 4,7 g kommersiella 7H 9 pulver, 2 mL Glycerol, 1 mL Tween 80, 0,85 g NaCl, 5 g Albumin, 2 g dextros, H2O (för att få total volym till 1 L).- (Försiktighet) Efter standard strålningsskydd praxis, spike kultur media med 20 µCi/mL [32P] Na2HPO4. Odla bakterier vid 37 ° C och 1200 rpm agitation, i en shaker inkubator placeras bakom en 9 mm tjock akryl sköld.
- Midlog fas (O.D.600 nm ~ 0,5), överföra hela kulturen till en 2-mL-skruvlock tube och pellet radioaktiva bakterier vid rumstemperatur genom centrifugering för 2 min på 10.000 x g. samla supernatanten innehållande unincorporated radioaktiva fosfat i lämpliga avfallsbehållare.
2. beredning av totala RNAs
Obs: Totala RNAs extraheras från bakteriell pellets använder kommersiella RNA extraktion reagens (innehållande guanidinium kaliumtiocyanat, fenol och kloroform) efter tillverkarens protokollet.
- Tillsätt 1 mL av kommersiella RNA extraktion reagens och cirka 200 µL av glaspärlor på pelleten. Förslut röret ordentligt och störa bakteriella i en Homogenisatorer för 2 min under maximal agitation, (ställa in nummer fem på valda instrumentet (se Tabell för material)).
- Centrifugera provet vid 12 000 x g under 10 minuter vid 4 ° C. Överför supernatanten till en ny 2-mL-tub och kasta pärlor på lämpligt sätt. Tillsätt 0,2 mL kloroform och skaka röret kraftigt för hand för 15 s. Centrifugera vid 12 000 x g under 15 minuter vid 4 ° C.
- Samla in den vattenhaltiga fasen av provet i en ny tub av mete röret på 45°. Undvika att någon av interphasen eller organiska skikt. Tillsätt 2 µL av färgade fällningsmedel och 0,5 mL 100% isopropanol. Skaka tuben kraftigt för hand för 5 s. Centrifugera vid 12 000 x g under 10 minuter vid 4° C.
- Ta bort supernatanten från röret och kasseras enligt föreskrifter som den flytande fraktionen kan innehålla spår av radioaktivitet. Luft torr pellets för 5 min sedan Återsuspendera i 200 µL 2 X saltlösning-natriumcitrat (SSC), 0,1% (w/v) sodium dodecyl sulfate (SDS) final.
Obs: Sammansättningen av lager 20 X SSC är 3,0 M NaCl, 0,3 M natriumcitrat, pH 7,0.
3. beredning av 96 väl skrivaren plattor
Obs: tRNA microarrays trycks manuellt med fyrtio två 70-mer DNA oligonukleotider kompletterande 3' ände varje M. smegmatis tRNA (terminal CCA undantagna) med en åtta-pin arrayer. Sekvenserna av DNA oligonukleotiden sonderna liksom layouten sonden i väl-plattan och matrisen tillhandahålls (kompletterande fil 1 - blad 1 till 3 respektive).
- Design DNA-prober av första hämtning tRNA sekvenser eller tRNA kodning gener från tRNA databaser såsom den genomiska tRNAen databas13. Trim bevarade 3' slutet CCA om kodad. Omvänd komplement resulterande sekvensen. Beställning sonden baserat på de första 70 nukleotiderna.
- Återsuspendera torr DNA sonder i vatten. Justera sonder koncentration till 100 µM. I en 96 väl-platta, förbereda 120 µL av 50 µM oligos i 3 X SSC, 0,01% (w/v) SDS slutlig (utspädd 60 µL av lager sonder i enskilda brunn med 60 µL av 6 X SSC, 0,01% (w/v) SDS.
- Täckplatta med aluminiumfolie för att förhindra avdunstning eller kontaminering, frysa omedelbart och hålla på-20 ° C tills den behövs.
4. matris utskrift
- Tina plattan med 96 brunnar vid rumstemperatur (tar cirka 20 min).
- Märka amine-belagd objektglas med en diamant penna. Placera bilder i indexering enhet. Följ de rutnät placeringarna och gör följande.
- Försiktigt doppa replicator stiften i brunnarna.
- Försiktigt ut matrisen på glasskivor, med ett minimalt tryck (du kommer att känna ett litet motstånd). Fortsätta skriva ut utan rengöring arrayer tills klar med block A.
- När du är redo att gå vidare till nästa block, följ tvätt proceduren som beskrivs nedan.
- Doppa replicator i 5% blekmedel och skaka försiktigt.
- Tryck replicator absorberande papper.
- Doppa replicator i destillerat vatten, skaka försiktigt och tryck in i papper. Upprepa detta en gång.
- Doppa replicator i isopropanol, skaka försiktigt och tryck in i papperet.
- Torka replicator på fläkten för ca 20 s innan du går vidare till nästa block av plattan med 96 brunnar. Fortsätta att önskat antal utskrifter.
- Låt glasen torka sedan crosslink oligos till bild med ett 254-nm UV crosslinker.
- Inställt 999,990 µJ cm2energinivån.
- Sätt bilderna ansiktet på en ren yta i crosslinker. Tryck på ”start”.
- Blockera arrayer övernattning i 450 mL blockerar lösning på en magnetomrörare, i rumstemperatur och under långsam agitation. Samla och återanvända blockerande lösning upp till fyra gånger.
Obs: Receptet för den blockerande lösningen är: 125 mM fosfatbuffert (NaH2PO4bulgariska2HPO4-) pH 7,2, 2,25% SDS (w/v), 0,5 mM EDTA, 0,5 X SSC, 1% BSA (w/v). - Tvätta bilderna 2 gånger för 5 min vid rumstemperatur i 500 mL destillerat vatten. Torkar glasen genom centrifugering för 10 s vid rumstemperatur i en microarray centrifug. Store matriser i torr, mörk plats för upp till 6 månader.
5. matrisen hybridisering
- Före hybridisering skölj diabilder i kokande vatten och torka genom centrifugering (som i 4.6).
- Placera matris inuti en hybridisering kassett och ladda radiomärkt RNA-prov.
- Kör den automatiserade hybridisering-tvätt stationen för högsta reproducerbarhet.
- Programstegen enligt följande. Villkor packningar för 2 min på 75 ° C. Införa sond vid 60 ° C.
Denaturera sonder och prover 5 min vid 90 ° C. Hybridisera prover för 3 h vid 60 ° C.- Tvätta bilder vid 50 ° C två gånger med 2 X SSC, 0,1% (w/v) SDS, flöde 10 s och hålla 20 s. Tvätta diabilder på 42 ° C två gånger med 0,1 X SSC, 0,1% SDS, flöde 10 s och håll 20 s. Tvätta diabilder på 42 ° C två gånger med 0,1 X SSC , flöde 10 s och håll 20 s.
- Programstegen enligt följande. Villkor packningar för 2 min på 75 ° C. Införa sond vid 60 ° C.
- Torra diabilder genom centrifugering (som i 4.6).
6. matris kvantifiering
- Wrap diabilder med en tunn plastfilm. Kolla bilder för radioaktiva signal med en geigermätare på dess känsligaste inställningen. Exponera diabilder på en lagring fosfor skärm i en exponering kassett i rumstemperatur i 10 till 90 h beroende på signalstyrka.
Obs: Eftersom känsligheten av Geigerräknare varierar från ett instrument till en annan, exponering gånger måste optimeras empiriskt. - Skanna bild på 50 µm upplösning med hjälp av en phosphorimager. Kvantifiera och bakgrund-subtrahera radioaktivitet stödnivåer vid varje sond plats med hjälp av gratis bild J programvaran uppgraderas med en microarray profiler.
- Organisera och bearbeta data med hjälp av ett elektroniskt kalkylblad. Generera värmekartor med verktyget villkorsstyrd formatering. Representera till exempel varje sond signal som ett bråktal (uttryckt i ‰) av den totala sond signalen.
Representative Results
Tre oberoende biologiska replikerar visar att, under de testade odlingsbetingelser, alla M. smegmatis tRNAs uttrycks över bakgrundsnivån (figur 1). I detta särskilda experiment består observerade standardavvikelsen för varje sond mellan 2 (Arg (TCT)) och 22% (Cys (GCA)) med en median på 5% (figur 1). Falska ändringar mellan replikat påverkas avsevärt av faktorer såsom array förberedelse och hybridisering. Hög reproducerbarhet uppnås genom noggrann och konsekvent array utskrift samt automatiserad prov hybridisering. Det finns en 5-faldig skillnad mellan tRNA Ile (GAT) och tRNA (Val (TAC), de högsta och lägsta rikliga arterna respektive. Plats visar att uttrycket av tRNA isoacceptors inte är enhetliga. Isoacceptors är arter som håller samma aminosyran men Visa olika anticodon sekvenser och därför avkoda olika kodon på mRNA. Till exempel alla alanin isoacceptors uttrycks på liknande nivåer, medan den högsta och lägsta arginin accepterande tRNAs skiljer 3 gånger.
Figur 1: representativa tRNA macroarray resultat. (A) skannade bakteriell, mus och mänskliga macroarrays. M. smegmatis matriser använder endast 43 sonder istället för 48 för mus och människa. Följaktligen, visar bakteriell matrisen 40 tomma platser (sonder replikeras åtta gånger på varje matris) som blandas med bakgrunden. De flesta av dem är grupperade i det övre vänstra hörnet. (B) Histogram och heatmap representationer av tRNA profiler i M. smegmatis under optimala odlingsbetingelser. Sonden signaler är genomsnittet av tre oberoende experiment (inklusive bakteriell tillväxt, metabola märkning, utvinning och array hybridisering) och uttrycks per tusen värden av totala tRNAs. Standardavvikelser för de tre replikat indikeras som felstaplar och nyanser av orange på histogram och heatmap respektive. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Beta partikelutsläpp är kända bakteriehämmande och bakteriedödande medel14, men strålning i intervallet testade har ingen betydande inverkan på cell fitness. Scintillation räknar visade att radioaktiviteten är införlivad med 25% av totalt-cell extrakt och därefter 1% av renat totala RNAs.
Sonderna identiska storlekar, jämförbara smälttemperatur och GC innehåll, tillsammans med ett enhetligt protokoll för macroarray spotting, hybridisering och kvantifiering tillåter för opartisk mätning av tRNA nivåer direkt från plats signaler.
Plats är reproducerbara och specifika. Dess stort dynamiskt omfång och lätt justerbar tröskelvärdet tillåter profilering låg rikliga arter, såsom tRNAs förknippas med polysomes, helt enkelt genom att förlänga array exponering gånger9. Efter den inledande investeringen i nödvändig utrustning genomsnitt kör kostnad per prov, inklusive förbrukningsvaror, $15 per prover.
Platsen är tillämplig på någon organism vars arvsmassa är tillgänglig för sonden design. Modellorganismer som odlas i vitro är perfekta kandidater för metabola märkning. Som däggdjur genomen koda ofta många isodecoders (tRNAs som delar identiska Anticodonsen men Visa små skillnader i deras kropp sekvenser) måste sonderna vara delvis urartat till att bevara homogen hybridisering av nära tRNA arter. Slutligen, vidhäftande däggdjursceller avkastning vanligtvis lägre mängder av total-RNA jämfört med organismer odlas i suspension som M. smegmatis, så kulturer behöver vara väsentligen skalas upp.
Disclosures
Någon intressekonflikt förklarade.
Acknowledgments
Detta arbete fick stöd av SC INBRE bidrag från National Institute of General Medical Science - NIH (P20GM103499 att R.G.) och beviljar CA555536 & CA154664 från National Cancer Institute för P.H.H. Detta program var delvis genom ett bidrag till den College of Charleston från Howard Hughes Medical Institute igenom före college & Grundutbildning Science Education Program och stöds genom bidrag från nationellt centrum för forskningsresurser (P20 RR016461 5) och National Institute of General Medical Sciences (8 P20 GM103499) från de National institutionerna of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass slide indexing system | V&P Scientific, Inc. | VP 470 | |
| Glass slide arrayer replicator | V&P Scientific, Inc. | VP 478 | |
| 96 well microplate indexing system | V&P Scientific, Inc. | VP 472 | |
| Wash and blot station | V&P Scientific, Inc. | VP 475 | |
| Replicator pin dryer | V&P Scientific, Inc. | VP 474 | |
| Amine coated slides | Molecular Devices | K2615 | |
| Hybridizer / Automated hybridization and washing station | Digilab | Hyb10022 | |
| Shaker incubator | Eppendorf Themomixer | 05-400-200 | |
| Screw cap 2 ml tubes | Thermo Scientific | 21-403-201 | |
| [32P] Na2HPO4 | Perkin Elmer | NEX011001MC | |
| Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform (Trizol) | Invitrogen | 15596026 | |
| 0.5 mm glass beads | Research Products International Corp. | 9831 | |
| Mini bead mill | VWR | 25-020 | |
| Storage phosphore screen | Fujifilm | BAS-IP SR 0813 | |
| Phosphorimager | GE Healthcare | Typhoon FLA7000 | |
| DNA oligonucleotides | IDT | N/A | |
| UV crosslinker | Spectroline | Select series 254 nm | |
| Microarray centrifuge | Arrayit Corporation | MHC110V | |
| Mycobacterium smegmatis | ATCC | 700084 | |
| Single-use needles | BD (Becton Dickinson) | 305185 | |
| 2 ml centrifuge tube | Fisherbrand | 14-666-317 | |
| Precipitant (GlucoBlue) | Invitrogen | AM9516 | |
| 7H9 broth | Difco | 271310 | |
| Chloroform | Fisher Chemicals | C298-500 | |
| Isopropanol | Fisher Chemicals | A451-4 | |
| 20 X SSC | Lonza | 51205 | |
| SDS | Fisher Bioreagents | BP166-100 | |
| hybridisation cassette | GE Healthcare | 63-0035-44 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Tween 80 | Amresco | M126-100ML | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-212 | |
| Albumin | Spectrum Chemicals | A3611 | |
| Dextrose | Fisher Chemicals | D16-1 | |
| EDTA (Ethylenediaminetetraacetic Acid) | Fisher Bioreagents | BP2482-500 | |
| 0.5 M Phosphate buffer pH 7.2 | Alfa Aesar | AAJ63974AP |
References
- Emilsson, V., Kurland, C. G. Growth rate dependence of transfer RNA abundance in Escherichia coli. EMBO J. 9 (13), 4359-4366 (1990).
- Dittmar, K. A., Goodenbour, J. M., Pan, T. Tissue-specific differences in human transfer RNA expression. PLoS Genet. 2 (12), e221 (2006).
- Pavon-Eternod, M., Gomes, S., Geslain, R., Dai, Q., Rosner, M. R., Pan, T. tRNA over-expression in breast cancer and functional consequences. Nucleic Acids Res. 37 (21), 7268-7280 (2009).
- Giegé, R., Jühling, F., Pütz, J., Stadler, P., Sauter, C., Florentz, C. Structure of transfer RNAs: similarity and variability. Wiley Interdiscip Rev RNA. 3 (1), 37-61 (2012).
- Machnicka, M. A., Olchowik, A., Grosjean, H., Bujnicki, J. M. Distribution and frequencies of post-transcriptional modifications in tRNAs. RNA Biol. 11 (12), 1619-1629 (2014).
- Torres, A. G., Piñeyro, D., Rodríguez-Escribà, M., Camacho, N., Reina, O., Saint-Léger, A., Filonava, L., Batlle, E., Ribas de Pouplana, L. Inosine modifications in human tRNAs are incorporated at the precursor tRNA level. Nucleic Acids Res. 43 (10), 5145-5157 (2015).
- Cognat, V., Deragon, J. M., Vinogradova, E., Salinas, T., Remacle, C., Maréchal-Drouard, L. On the evolution and expression of Chlamydomonas reinhardtii nucleus-encoded transfer RNA genes. Genetics. 179 (1), 113-123 (2008).
- Zheng, G., Qin, Y., Clark, W. C., Dai, Q., Yi, C., He, C., et al. Efficient and quantitative high-throughput tRNA sequencing. Nat Methods. 12 (9), 835-837 (2015).
- Grelet, S., McShane, A., Hok, E., Tomberlin, J., Howe, P. H., Geslain, R. SPOt: A novel and streamlined microarray platform for observing cellular tRNA levels. PLoS One. 12 (5), e0177939 (2017).
- Eriani, G., Karam, J., Jacinto, J., Morris Richard, E., Geslain, R. MIST, a Novel Approach to Reveal Hidden Substrate Specificity in Aminoacyl-tRNA Synthetases. PLoS One. 10 (6), e0130042 (2015).
- Grelet, S., McShane, A., Geslain, R., Howe, P. H. Pleiotropic Roles of Non-Coding RNAs in TGF-β-Mediated Epithelial-Mesenchymal Transition and Their Functions in Tumor Progression. Cancers. 9 (7), (2017).
- Belanger, A. E., Hatfull, G. F. Exponential-phase glycogen recycling is essential for growth of Mycobacterium smegmatis. J Bacteriol. 181 (21), 6670-6678 (1999).
- Chan, P. P., Lowe, T. M. GtRNAdb: A database of transfer RNA genes detected in genomic sequence. Nucl. Acids Res. 37 (Database issue), D93-D97 (2009).
- Schmidt, C. F. The Effect of Radioactive Phosphorus upon a Suspension of Escherichia coli. J Bacteriol. 55 (5), 705-710 (1948).
