Summary
Dosages quantitatifs-la prise alimentaire avec de la nourriture teint fournissent un robuste et haut débit moyens d’évaluer la motivation alimentation. Combinant le dosage de la consommation de nourriture avec thermogenetic et optogenetic écrans est une approche puissante pour enquêter sur les circuits neurones sous-tendant l’appétit chez les adultes Drosophila melanogaster.
Abstract
La consommation d’aliments est sous le contrôle étroit du cerveau, qui intègre l’état physiologique, la saveur et le contenu nutritionnel des aliments et des commandes de questions pour démarrer ou arrêter l’alimentation. Décrypter les mécanismes sous-jacents à la prise de décision en temps opportun et modérée l’alimentation comporte des implications majeures dans notre compréhension des troubles physiologiques et psychologiques liés au contrôle de l’alimentation. Méthodes quantitatives, simples et robustes sont nécessaires pour mesurer l’ingestion d’aliments des animaux après la manipulation expérimentale, tels que force augmentant les activités de certains neurones de la cible. Ici, nous avons introduit des tests alimentaires étiquetage-teintée pour faciliter l’étude neurogénétique de contrôle d’alimentation chez la drosophile adulte. Nous examinons les tests alimentaires et ensuite décrire nos méthodes étape par étape de l’installation d’analyse qui combine thermogenetic et optogenetic manipulation des neurones contrôlant l’alimentation motivation avec test d’admission marqués au colorant alimentaire. Nous discuterons les avantages et les limites de nos méthodes, par rapport aux autres tests alimentaires, pour aider les lecteurs à choisir un test approprié.
Introduction
Quantifier la quantité de nourriture ingérée est importante pour évaluer les aspects multiples de l’alimentation des contrôles par le cerveau pour répondre aux besoins internes (tels que les États de la faim) et facteurs externes (tels que la qualité des aliments et la palatabilité)1, 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9. ces dernières années, les efforts de déchiffrage les substrats neurones de contrôle d’alimentation chez la drosophile mener à l’élaboration de multiples essais pour quantifier la quantité de nourriture ingérée directement ou de servir d’indicateur de l’alimentation de motivation 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16.
Le FEeder capillaire (CAFE) dosage12,13 a été développé pour mesurer la quantité de consommation d’aliments liquides dans un verre microcapillaire. Le dosage du café est très sensible et reproductible17 et simplifie la mesure de la consommation alimentaire, notamment pour quantifier l' alimentation à long terme18. Toutefois, ce test nécessite les mouches de grimper jusqu'à l’extrémité de la microcapillaire et nourrir la tête en bas, qui n’est pas approprié pour toutes les souches. En outre, parce que les mouches à tester à l’aide du test CAFE doivent être élevés sur la nourriture liquide, l’effet de ces conditions sur l’état du métabolisme ou la malnutrition potentielle d’élevage reste encore à déterminer.
Le Proboscis Extension réponse (PER) dosage11,14 compte la fréquence des réponses extension trompe vers douce touche de gouttes de nourriture. PAR test s’est révélé comme un excellent moyen d’évaluer l’alimentation motivation des mouche individuelle et des ânes l’influence de la palatabilité et le contenu des aliments18,19. Cependant, il n’est pas une quantification directe du montant de l’apport.
Récemment, une méthode semi-automatique, le manuel d’alimentation15de dosage (maltais), a été mis au point. En maltais, une seule mouche immobilisée est alimentée manuellement avec un microcapillaire contenant de la nourriture. Étant donné que les réponses d’extension de trompe et la consommation d’aliments peuvent être surveillés en même temps, MAFE est pertinente pour évaluer les valeurs nutritives et les effets des manipulations pharmacologiques. Cependant, immobiliser une mouche aurait un impact négatif sur sa performance comportementale, y compris l’alimentation.
En outre, fly Proboscis et détecteur d’activité (FlyPAD)10 a été développé pour mesurer automatiquement le comportement alimentaire. En utilisant les méthodes de machine vision, FlyPAD enregistre des interactions physiques entre une mouche et les aliments à quantifier la fréquence et la durée des extensions trompe comme un indicateur de l’alimentation de motivation. FlyPAD fournit une approche de haut-débit pour surveiller les comportements alimentaires d’une mouche de mouvement libre, même si la sensibilité et la robustesse de ce système reste à être confirmée par plusieurs études12.
Stratégies de marquage sont fréquemment utilisés pour estimer l’ingestion alimentaire chez les mouches. Il est fréquent d’étiqueter les aliments avec des traceurs chimiques et, après s’être nourries, mesurer la quantité de traceur ingéré pour calculer la quantité de nourriture absorbée. Permettre à traceurs radioactifs16,17,20,21,22,23,24,25 pour la détection à travers la cuticule sans homogénéisation des mouches. Cette méthode fournit remarquablement faible variabilité et une sensibilité élevée18et il serait possible d’étude à long terme de la prise alimentaire. Cependant, la disponibilité des radio-isotopes utilisables et différents taux d’absorption et d’excrétion devraient prendre en considération lorsque vous travaillez avec ce test.
Étiquetage et le traçage de la prise alimentaire avec les colorants alimentaires non toxiques est un plus sûr et plus simple variante2,3,26,27,28. Les mouches sont homogénéisés après s’être nourries avec des aliments contenant des colorants solubles et non résorbables, et le colorant ingéré plus tard doser à l’aide d’un spectrophotomètre3,24,28,29 . La stratégie d’étiquetage est facile à exécuter et fournit le rendement élevé, mais avec une mise en garde. Le volume de l’apport alimentaire estimé à partir de la teinture ingérée est plus petit que le volume réel parce que l’excrétion commence dès 15 min après le démarrage de mouches alimentation17. En outre, le test évalue ingestion alimentaire généralement dans un délai de 60 minutes, qui est conçu uniquement pour l’enquête de court terme alimentation comportement24,28. En outre, plusieurs facteurs internes et externes, tels que le génotype17, genre17, accouplés état17, élevage de densité30, rythme circadien31,32et nourriture de qualité3 , 8 , 16, influence la prise alimentaire. Par conséquent, la durée d’alimentation devrez peut-être être ajustée en fonction des conditions expérimentales spécifiques. En plus de faciliter la quantification de l’apport alimentaire, colorants alimentaires sont également utilisés pour évaluer la nourriture choix2,19,27et de visualiser le ménisque dans un microcapillaire CAFE test12.
Ici, nous introduisons une manipulation protocole combiné de l’activité neuronale avec colorant-étiquetage approche. Cette stratégie a été prouvée utile dans notre étude neurogénétique sur l’alimentation de contrôle dans la drosophile adulte24. La méthode de notation visuelle permet une estimation rapide de la consommation d’aliments ; ainsi, il est utile pour le dépistage par un grand nombre de souches en temps opportun. Les candidats de l’écran sont ensuite analysées en détail à l’aide d’une méthode colorimétrique pour fournir des objectifs et une quantification précise dans une autre étude.
Outre les tests alimentaires, nous décrivons également les thermogenetic27,33,34,35 optogenetic36 méthodes et d’activation par la force des neurones cibles chez la drosophile. Pour activer les neurones par thermogenetic opération est simple et pratique avec Drosophila Transient Receptor potentiels Ankyrin 1 (dTRPA1), qui est un canal cationique température - et voltage-dépendants qui augmente l’excitabilité neuronale lorsque la température ambiante la température s’élève au-dessus de 23 ° C33,37; Cependant, animaux à des températures élevées peut produire des effets indésirables sur le comportement. Une autre approche efficace pour activer les neurones chez la drosophile utilise optogenetics avec CsChrimson36, qui est une variante décalée vers le rouge de channelrhodopsin qui augmente l’excitabilité des neurones lorsqu’ils sont exposés à la lumière. Optogenetics offre la meilleure résolution temporelle et la moindre perturbation des comportements que thermogenetics. Combinant des mesures quantitatives de la prise alimentaire avec la manipulation de l’activité neuronale représente une approche efficace pour étudier les mécanismes neurones de l’alimentation.
Nous décrivons en détail la préparation de la chambre d’alimentation et les mouches à tester. À l’aide de mouches Taotie-Gal4 comme un modèle24, nous décrivons activation des neurones par thermogenetics et optogenetics. Deux essais de quantification de la consommation d’aliments avec marqués au colorant alimentaire sont également décrites dans le protocole.
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Protocol
1. préparation de la chambre d’alimentation
Remarque : La chambre d’alimentation pour marquage colorant alimentaire test se compose de deux parties : le conteneur extérieur (comme un couvercle) et l’intérieur conteneur (comme source de nourriture).
- Modifier le conteneur à l’extérieur d’un flacon de verre pour la culture des Drosophila (d’un diamètre intérieur de 31,8 mm) et une hauteur de 80 mm (Figure 1 a, 1C). Couverture du fond du récipient avec une couche d’agarose à 1 % (5 mL) pour garder la configuration alimentation correctement humidifiée et servir un substrat mou pour les mouches de marcher sur (Figure 1 b). Le conteneur a ce qui offre un cadre contrôlé mais naturaliste emportant avec stress minimal ou de perturbation pour les mouches.
- Préparer le récipient extérieur. Suspendre les 0,5 g d’agarose dans 50 mL d’eau bidistillée, chaleur avec agitation fréquente et faites bouillir pour dissoudre complètement sur un agitateur magnétique avec une plaque de chaleur.
- Quand le 1 % d’agarose refroidit à environ 60 ° C, 5 mL d’agarose à 1 % de transfert d’un vide à l’extérieur du récipient (Figure 1 b) et laisser le conteneur restent ouverts jusqu'à ce que refroidi à la température ambiante pour donner une touche de gel d’agarose.
- Préparer les aliments marqués au colorant. Composition de l’aliment dye-labeled varie en fonction des fins expérimentales différentes. Voici un exemple de préparation de la nourriture dye-labeled contenant uniquement de saccharose.
- Ajouter 0,5 g de gel d’agarose à 50 mL d’eau bidistillée, chaleur avec agitation fréquente et faire bouillir pour dissoudre complètement sur un agitateur magnétique avec une plaque de chaleur.
- Lorsque l’agarose à 1 % ci-dessus refroidi à environ 60 ° C, ajouter 1,71 g de saccharose à l’agarose à obtenir de saccharose de 100 mM.
- Ajouter 0,25 g de colorant bleu (érioglaucine disodique) à la solution de gel d’agarose pour obtenir 0,5 % (p/v) marqués au colorant alimentaire.
- Préparer l’intérieur conteneur. Placez le vide à l’intérieur de conteneurs sur une surface plane et horizontale, puis ajoutez 750 µL de bleu marqués au colorant alimentaire au conteneur alimentaire individuelle, laissez-le se solidifient pendant au moins 5 min.
Remarque : L’intérieur conteneur est un petit plat en plastique avec un diamètre interne de 13,6 mm et une hauteur de 7,5 mm (Figure 1 a, 1C). Il est rempli de marqués au colorant alimentaire et est alors positionnée au centre du coussinet d’agarose du conteneur à l’extérieur. - Transférer un remplis à l’intérieur du récipient dans un récipient extérieur préparé et placez-la au centre du coussinet d’agarose. Laisser les chambres alimentation restent ouverts à température ambiante pendant 40 min jusqu'à ce que la paroi du récipient extérieur est sans condensation.
Remarque : La cloison sèche est nécessaire pour empêcher les mouches d’être collée sur le mur en communiquant avec les gouttes d’eau. - Préparer les chambres alimentation avec des aliments sans colorant (même composition mais sans teignent) pour la soustraction du fond.
2. préparation des mouches
Remarque : Femelle adulte vole 5 à 10 jours après l’éclosion sont normalement utilisés pour les essais d’alimentation. Il est recommandé de préparer les mouches de génotypes différents, y compris les contrôles génétiques et de tester en parallèle. 20 mouches (d’une chambre d’alimentation) génèrent un point de données.
- Tenir compte de la densité de la population pour l’élevage des mouches adultes. En règle générale, de contrôler la densité de la population en faisant varier le nombre de mouches parentales selon les souches et les dimensions des flacons de culture. Par exemple, transférer 15 hommes et 30 femmes du Canton-S dans un flacon d’hémoculture (d’un diamètre de 31,8 mm) et une hauteur de 80 mm et laisser les femelles pour pondre des œufs pendant une journée puis retirez que l’adulte vole.
- Préparer les mouches pour l’activation thermogenetic.
- Utiliser le système de Gal4/UAS38 pour exprimer dTRPA133 dans différents neurones par croisement que SAMU-dTrpA1 vole avec des lignées GAL4 pilote (Figure 2 b).
- Garder les mouches adultes sur norme alimentaire à 22 ° C, humidité relative de 60 % et un cycle lumière-obscurité de 12 h/12 h.
- Deux jours avant le repas de dosage, trier et collecter des mouches sur un socle de mouche de2 CO sous un microscope stéréo dans un flacon d’aliments frais et garder une densité de 20 mouches par flacon.
- Préparer les mouches pour l’activation de l’optogenetic.
- Utiliser le système de Gal4/UAS38 pour exprimer CsChrimson36 dans différents neurones par passage SAMU-CsChrimson mouches, avec différentes lignes de pilote GAL4.
- Recueillir nouvellement éclos (à moins de 24h) mouches et transférez-les dans un flacon avec de la nourriture standard contenant 400 µM all-trans-rétinal.
- Pour empêcher l’activation prématurée, envelopper les flacons d’élevage avec du papier aluminium et mettez-les ensuite dans une boîte sombre pour protéger des mouches de photostimulation indésirable. Garder les mouches à 25 ° C, 60 % d’humidité dans l’obscurité pendant 4 à 6 jours.
- Deux jours avant le test de l’alimentation, femelle tri vole le CO2 mouche pavé sous un microscope stéréo. Recueillir 20 mouches flacon un aliment et gardez-les dans l’obscurité avant le test de l’alimentation.
- Effectuer toutes les opérations sous faible lumière aussi rapidement que possible afin d’éviter les effets causés par la lumière ambiante. Utiliser une lampe à LED placée loin de la zone de travail, l’intensité à la zone de travail est 5 µW/cm2.
Remarque : Utilisation de faim Canton-S vole comme témoin positif pour l’analyse de l’alimentation. Priver ces mouches d’aliments et maintenir sur agarose à 1 % pendant 24 h avant le test de l’alimentation. Les niveaux de consommation alimentaire de ces mouches aident à évaluer les fluctuations quotidiennes.
3. thermogenetic activation
- Effectuer toutes les expériences d’alimentation à la fois de la journée, autour de Zeitgeber temps 4-631,32, afin de minimiser les variations dues aux rythmes circadiens.
- Préparer un incubateur (ou une petite pièce avec un chauffage à température contrôlée) comme environnement de chauffage.
- Avant les expériences comportementales, équilibrer les chambres alimentation préparés à la température expérimentale (30 ° C) pendant 2 h pour s’assurer que la température est uniforme relative à la chambre d’alimentation.
- Pour démarrer le processus d’alimentation, soigneusement transfert 20 mouches de leur flacon d’origine dans une chambre d’alimentation préchauffée en tapotant doucement. Poursuivre le processus de l’alimentation à 30 ° C pendant 60 min ( Figure 3 a) .
Remarque : Agitations fréquentes, telles que l’ouverture et la fermeture de la porte de l’incubateur, affecter le comportement alimentaire, donc doivent être minimisées. - Cesser de nourrir après 60 min en gelant les chambres alimentation à-80 ° C (ou -20 ° C) pendant 30 min.
Remarque : Congélation permet d’arrêter les tétées dans toutes les chambres en même temps. Congélation à-80 ° C, les mouches sert à deux fins, pour euthanasier les mouches et pour stockage jusqu'à homogénéisation jusqu'à une semaine. - Pour le groupe de contrôle de température, transférer 20 mouches dans une température ambiante alimentation chambre avec couleur colorant alimentaire pour démarrer le processus d’alimentation à 22 ° C pendant 60 min.
- Cesser l’alimentation du groupe de contrôle de température en gelant les chambres à-80 ° C (ou -20 ° C) pendant 30 min.
4. activation de Optogenetic
- Effectuer toutes les expériences d’alimentation à la fois de la journée, autour de Zeitgeber temps 4-631,32, afin de minimiser les variations dues aux rythmes circadiens.
- Transvaser avec soin 20 mouches d’un flacon dans une chambre d’alimentation en tapotant doucement et puis mettre la chambre sur le côté sur l’installation d’éclairage (Figure 4 a, 4 b).
- Pour une manipulation optogenetic, utilisez un tableau de LEDs orange (607 nm) comme source de stimulation lumineuse et fixer une plaque de plexiglas horizontale au-dessus des LED pour soutenir l’alimentation chambers au cours de l’illumination. Garder la configuration dans un incubateur à 25 ° C avec une humidité de 60 % (Figure 4 a, 4 b).
- Stimuler les mouches de contrôle génétique en parallèle avec le Taotie > CsChrimson vole, mais dans différentes chambres d’alimentation.
- Poursuivre le processus d’alimentation pendant 60 min avec éclairage arrière par la lumière orange.
- Déterminer les intensités d’éclairage optimal pour optogenetics expérimentalement36. Pour la Taotie > CsChrimson mouches, une intensité de 2,2 mW/mm2 induit la paralysie (cessation de locomotion) et la perte du contrôle postural, par conséquent, utiliser une intensité intermédiaire de 0,1 mW/mm2 pour stimuler la Taotie > CsChrimson vole pendant le test de l’alimentation.
- Cesser l’alimentation par congélation alimentation chambres à-80 ° C (ou -20 ° C) pendant 30 min.
5. visual estimation de la consommation d’aliments
Remarque : L’approche de notation visual fournit une estimation semi-quantitative de consommations alimentaires. Bien que ce n’est pas aussi objectif que la méthode optique, cette méthode permet en passant par un grand nombre de souches mouches en temps opportun, ce qui convient pour la première ronde d’un dépistage génétique pour affiner rapidement la liste des candidats à d’autres essais.
- Après le processus d’alimentation, une anesthésie et marquer les mouches sur un CO2 mouche pavé sous un microscope stéréo. Donne pointage individuel à chaque volée basée sur le volume et l’intensité de la couleur colorant alimentaire dans son abdomen (Figure 2 a).
NOTE : Critères d’estimation visuelle : le système de pointage a 4 niveaux d’ingestion de nourriture correspondant aux différents volumes et les intensités des aliments colorés dans l’abdomen.- Score de mouches sans détectable couleur colorant alimentaire un score de 0 ; ceux avec un colorant bleu (à peine détectable) faible ou avec couleur colorant alimentaire occupant moins d’un tiers du volume de l’abdomen donne un score de 1.
- Score vole avec intense couleur colorant alimentaire, occupant la moitié de l’abdomen d’un score de 2.
- Ceux avec intense teints contenu occupant plus de la moitié de l’abdomen marquer un score de 3 (Figure 2 a).
- Calculer la proportion des mouches avec des scores différents dans chacune des conditions expérimentales (Figure 2 b).
6. colorimétrique quantification de la consommation d’aliments
- Après cessation de l’alimentation, versez toutes les 20 mouches d’une alimentation de chambre sur un morceau de papier de pesage, puis transférez-les dans un tube de 1,5 mL à l’aide d’une brosse douce.
Remarque : Ne prenez pas toutes les chambres de stockage de-80 ° C dans le même temps pour éviter les mouches collent à la paroi de la chambre à cause de la condensation d’eau sur la zone froide. - Ajouter 500 µL de PBST dans le tube et homogénéiser les mouches à l’aide d’un moulin à 60Hz pour 5 s.
- Confirmer l’homogénéisation suffisante par observation lorsqu’il n’y a aucun fragment détectable de parties du corps.
- Faites tourner les tubes avec des homogénats pendant 30 min à 13 000 tr/min pour dégager les débris.
- Après centrifugation, transférer 100 µL de surnageant dans un puits d’une plaque de 96 puits.
- Après que tous les échantillons sont chargés, mettre la plaque dans un lecteur de plaque pour mesurer l’absorbance des échantillons à 630 nm.
- Pour enlever l’absorbance de fond, de soustraire l’absorbance des surnageants de mouches se nourrissent alimentaire sans colorant de l’absorbance de surnageant de mouches bleues nourris avec des aliments.
Remarque : Cette étape est facultative, selon la composition de l’aliment utilisé. Quand un aliment mouche (sans colorant) génère l’absorbance à 630 nm, il est nécessaire d’effectuer cette étape pour éliminer le fond.
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Representative Results
Écran thermogenetic.
Appétit anormalement élevé provoque la prise alimentaire élevée, indépendamment des besoins physiologiques. Nous avons utilisé ce régime à un haut débit de conception comportementale écran pour obtenir des handles génétiques des neurones liés à la faim et rassasiés des États (Figure 1). L’écran a donné Taotie-Gal424. Lorsque les neurones Taotie-Gal4 ont été activés par la force à 30 ° C, la Taotie > TrpA1 vole ingérée de plus grandes quantités de nourriture que les témoins (Figure 2, Figure 3).
Visuellement marquant la consommation alimentaire.
Parce que certains neurotransmetteurs et des neuropeptides ont été indiqués dans la régulation du comportement alimentaire, nous avons testé les lignes correspondantes de GAL4, y compris les FNP20, sNPF39, octopamine21, dopamine27, 40, sérotonine41,42, AKH35et Dilp27,8,35. Afin de quantifier la réponse alimentaire, nous visuellement inspecté et a marqué des mouches avec des quantités variables de colorant détectable dans le tube digestif (Figure 2 a). Après l’activation des neurones Taotie , environ 58 % des Taotie > dTrpA1 mouches présentaient des comportements alimentaires solides et 23 % de ces comportements ont montré d’alimentation légères (Figure 2 b). En revanche, seuls les comportements alimentaires marginaux ont été observés chez les mouches avec d’autres neurones activés via dTrpA1 (Figure 2 b).
Dosage colorimétrique de l’apport alimentaire.
Afin de quantifier la prise alimentaire avec haute précision et d’objectivité, nous avons mesuré l’absorbance d’extraction mouche à une longueur d’onde spécifique pour le colorant ajouté dans les aliments de27,2,28. Pour mettre une valeur d’absorbance en corrélation avec le volume de la prise alimentaire, une courbe d’étalonnage a été obtenue en mesurant l’absorbance des solutions échantillon (le même tampon pour homogénéiser les mouches, PBST) mélangé avec différentes quantités de colorants). Nos résultats démontrent, aiguë actionné Taotie-GAL4 neurones par TRPA1 considérablement accru la prise alimentaire comparée à contrôle génétique et le contrôle de la température durant la même période de l’essai (Figure 3 b), ce qui suggère que la Taotie-GAL4 neurones marqués participent à la régulation de la prise alimentaire des adultes Drosophila.
Optogenetic activation pour promouvoir la prise alimentaire chez la drosophile.
Nous avons utilisé des SAMU -CsChrimson pour activer les neurones Taotie par illumination avec une lumière orange36 (Figure 4 a, 4 b). Lorsque Taotie > CsChrimson mouches ont été stimulées par les lumières de LED à 607 nm, ils ont ingéré significativement plus de nourriture que les témoins (Figure 4). En outre, les quantités d’aliments ingérés corrélation avec les intensités de lumière de stimulation (Figure 4). Ainsi, outre thermogenetics avec dTrpA1, activation d’optogenetic avec CsChrimson dans les neurones Taotie favorise également l’alimentation de motivation chez les mouches rassasiés.
Figure 1 . Un paradigme alimentation pour analyser l’appétit chez les mouches adultes. Chambre (A) l’alimentation contient un intérieur conteneur rempli de couleur colorant alimentaire et un récipient extérieur rembourré avec agarose à 1 %. De gauche à droite, l’intérieur conteneur, le conteneur à l’extérieur et la chambre d’alimentation complete. (B) l’intérieur conteneur repose sur le coussinet de gel d’agarose au fond du récipient extérieur. Vue de dessus (C) de la chambre d’alimentation. (D) un schéma montrant l’expérience « écran d’appétit ». Mouches rassasiés normales rarement mangeaient de la nourriture (flacon de gauche), tout en activant par la force certains neurones de contrôle alimentaire causé mouches rassasiés d’ingérer des aliments supplémentaires, exposant ainsi couleur colorant alimentaire dans l’abdomen (flacon de droite). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 . Estimation visuelle de l’ingestion alimentaire. (A) Exemplar des images pour montrer les critères pour la notation contenu alimentaire dans l’abdomen. (B) la distribution de l’alimentation des scores chez les mouches avec des neurones indiqués être activés par dTrpA1 à 30 ° C. No-Gal4 : SAMU-dTrpA1 (contrôle génétique) ; FNP-GAL4 : neuropeptide F neurones positifs ; sNPF-GAL4 : court neuropeptide F neurones positifs ; TDC1-GAL4 et TDC2-GAL4 : octopamine neurones ; TH-GAL4 : les neurones de dopamine ; 5-HT : neurones de sérotonine ; AKH : adipocinétique hormone positif les neurones ; DIP2 : neurones positifs de peptide de type insuline 2 ; Taotie-GAL4 : Taotie-GAL4 étiquettes neurones (n = 120 mouches par État). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 . Thermogenetic-activation de la Taotie neurones augmente la consommation d’aliments chez les mouches adultes. (A), une image illustre la configuration de l’expérience de l’activation thermogenetic. Le test de l’alimentation a été réalisé dans un incubateur à 30 ° C. (B) la consommation d’aliments par dosage colorimétrique chez les mouches rassasiés testé à 30 ° C ou 22 ° C pendant 1 h. Le montant de la consommation d’aliments d’une seule mouche a été calculé à partir de 20 mouches dans une chambre d’alimentation (n = 6). n.s. indique non significative (p > 0,05) ; p < 0,001. ANOVA à suivi avec test post hoc de Tukey a été utilisé pour analyser des comparaisons multiples. Barres d’erreur indiquent la moyenne ± SEM. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 . Optogenetic-activation des neurones Taotie augmente la quantité de nourriture absorbée de manière dépendante de l’intensité. (A, B) Deux points de vue de la configuration pour l’activation de l’optogenetic. Les chambres alimentation ont été portées sur le côté sur une plaque d’appui et éclairée du fond par une série de LEDs orange. La face avant de la boîte de l’illumination a été enlevée pour montrer l’intérieur LEDs. Les expériences comportementales ont été effectuées à l’intérieur d’un incubateur à 25 ° C, 60 % HR. (C) la consommation d’aliments de mouches rassasiés des génotypes indiqués lorsqu’il est testé sous illumination optogenetic ou dans l’obscurité pendant 1 h (n = 6). (D) Food ingestion rassasié par Taotie > CsChrimson mouches est corrélée avec l’intensité de l’éclairage (n = 6). n.s. indique non significative (p > 0,05) ; p < 0,001, ANOVA à suivi avec test post hoc de Tukey a été utilisé pour analyser des comparaisons multiples, de Student t-test pour les deux comparaisons de groupe. Barres d’erreur indiquent la moyenne ± SEM. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Ce rapport met l’accent sur le processus technique de tests alimentation colorant-étiquetage de la consommation alimentaire dans le contexte de thermogenetic et optogenetic activation pour manipuler des neurones contrôlant l’alimentation. Ce protocole simple et fiable vous aidera à élucider la fonction des neurones de candidat dans l’alimentation de contrôle, pour mesurer les préférences alimentaires des mouches et d’identifier de nouveaux joueurs dans l’alimentation des circuits de contrôle via écrans génétique axée sur l’alimentation24.
Le colorant stratégie d’étiquetage n’est possible dans les enquêtes sur les comportements alimentaires à court terme. Le colorant, érioglaucine disodique, dissous dans et ingérés avec les aliments, est un indicateur essentiel de la consommation d’aliments. Dethier et coll. ne démontré que le colorant bleu lui-même aucune influence sur l’alimentation lorsqu’elle est mesurée par le dosage du café et le radio-isotope étiquetage alimentaire d’admission test17. De même, nos résultats pour (stimulant la jambe de la mouche avec une solution de saccharose marqué colorant ou sans colorant 100 mM) a indiqué que les mouches ne montraient aucune différence significative dans leur réponse vers la nourriture marqués au colorant ou sans colorant. Cependant, il n’y a encore aucune donnée claire au sujet de la question de savoir si le colorant est insipide chez la drosophile.
En outre, les étapes critiques a indiqué dans le protocole, prêter une attention particulière au général statut des mouches à tester. Outre étant élevés et maintenue à une densité non surpeuplés, les mouches doivent être manipulés délicatement et éviter les chocs inutiles ou contraintes, afin de produire des résultats constants d’alimentation.
Le paradigme alimentation présenté ici comporte certaines limites. Tout d’abord, nos méthodes de quantifient la consommation d’aliments sur une période de 60 min. Afin d’évaluer l’apport alimentaire sur de longues périodes, comme une journée, une autre méthode, comme café, serait nécessaire. Deuxièmement, par rapport aux méthodes de quantification à l’aide de radio-isotopes, la méthode colorimétrique est moins sensible et difficile de résoudre les différends lorsque des quantités de consommation alimentaire sont faibles. Troisièmement, étant donné que quelques mouches commenceront à s’acquitter, dès 15 min après le début de l’alimentation, ce protocole mesure en fait le résultat net de la prise alimentaire et excrétion chez une population de17. Quatrièmement, la quantification colorimétrique de l’apport alimentaire décrit ici a été pour un groupe de mouche, estimation de l’ingestion de nourriture d’une seule mouche dépend d’autres tests alimentaires, tels que l’étiquetage des radio-isotopes, le dosage MAFE ou FlyPAD. Néanmoins, certains avantages de dosage colorimétrique de l’apport alimentaire, comme étant une méthode simple, stable, visible et haut débit, en font un choix privilégié pour la quantification d’un grand nombre de souches, en particulier pour alimentation base génétique les écrans et les études de suivi.
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Disclosures
Les auteurs déclarent sans intérêts financiers concurrents.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu en partie par la National base Research Programme of China (2012CB825504), Fondation de sciences naturelles nationales de la Chine (91232720 et 9163210042), Chinese Academy of Sciences (CAS) (GJHZ201302 et QYZDY-SSW-SMC015), Bill et Melinda Gates Programme de Fondation (OPP1119434) et 100-Talents d’autorités de certification à Zhu Y..
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| UAS-CsChrimson | Bloomintoon | 55135 | |
| UAS-dTrpA1 | Bloomintoon | 26263 | |
| TDC1-GAL4 | Bloomintoon | 9312 | |
| TDC2-GAL4 | Bloomintoon | 9313 | |
| sNPF-GAL4 | Provided by Z. Zhao | ||
| NPF-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| TH-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| 5-HT-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| AKH-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| dip2-GAL4 | Provided by Y. Rao | ||
| Taotie-GAL4 | Provided by J. Carlson | ||
| Agarose | Biowest | G-10 | |
| Sucrose | Sigma | S7903 | |
| Erioglaucine disodium salt | Sigma | 861146 | |
| all-trans-retinal | Sigma | R2500 | stored in darkness |
| Triton X-100 | Amresco | 9002-93-01 | |
| Fly food | 1 L food contains: 77.7 g corn meal, 32.19 g yeast, 5 g agar, 0.726 g CaCl2, 31.62 g sucrose, 63.2 g glucose, 2 g potassium sorbate, pH | ||
| 1x PBS buffer | 1 L 1X PBS contains: 8 g Nacl, 0.2 g Kcl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4, pH 7.4 | ||
| PBST buffer | 1X PBS with 1% Triton X-100 | ||
| Grinding mill | Shang Hai Jing Xin | Tissuelyser-24 | |
| Incubator | Ning Bo Jiang Nan | HWS-80 | |
| Magnetic stirrer with a heat plate | Chang Zhou Bo Yuan | CJJ 78-1 | |
| Spectrometer | Thorlabs | CCS200/M | |
| Microplate Spectrophotometer | Thermo Scientific | Multiskan GO Type: 1510, REF 51119200 | |
| Fluorescence stereo microscope | Leica | M205FA | |
| Stereo microscope | Leica | S6E | |
| Outside container | Jiang Su Hai Men | glass vial with a diameter of 31.8 mm and a height of 80 mm (inside dimension) | |
| Inside container | Beijing Yi Ran machinery factory | plastic dish with a diameter of 13.6 mm and a height of 7.5 mm (inside dimension) | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | Hai Men Ning Mong | ||
| 96 well plate | Corning Incorporated | Costar 3599 | |
| LEDs | Xin Xing Yuan Guangdian | 607 nm, 3W | https://item.taobao.com/item.htm?id=20158878058 |
References
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