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Behavior

Combinando le analisi quantitativa l'ingestione di cibo e forzatamente attivazione di neuroni per studiare l'appetito in Drosophila

doi: 10.3791/56900 Published: April 24, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Analisi quantitativa di assunzione di cibo con cibo tinto forniscono un robusto e ad alta velocità significa valutare motivazione d'alimentazione. Combinando l'analisi del consumo di cibo con termogenetica e schermi optogenetica è un approccio potente per studiare i circuiti neurali sottostanti l'appetito in adulto Drosophila melanogaster.

Abstract

Consumo alimentare è sotto il controllo stretto del cervello, che integra la condizione fisiologica, appetibilità e contenuto nutrizionale del cibo e problemi di comandi per avviare o interrompere l'alimentazione. Decifrare i processi che sottendono il processo decisionale di tempestiva e moderata alimentazione trasporta importanti implicazioni nella nostra comprensione dei disturbi fisiologici e psicologici legati al controllo dell'alimentazione. Metodi semplici, quantitativi e robusti sono necessari per misurare l'ingestione di cibo di animali dopo manipolazione sperimentale, come ad esempio forzatamente aumentando l'attività di determinati neuroni bersaglio. Qui, abbiamo introdotto analisi alimentazione colorante-etichettatura-based per facilitare lo studio Neurogenetica di controllo dell'alimentazione in adulti mosche della frutta. Esaminiamo saggi di alimentazione disponibile e quindi descrivere i nostri metodi passo-passo dal programma di installazione per l'analisi, che combinano termogenetica e optogenetica manipolazione dei neuroni controllo alimentazione motivazione con dosaggio di assunzione di cibo tingere-contrassegnati. Abbiamo anche discutere i vantaggi e le limitazioni dei nostri metodi, confrontati con altri saggi d'alimentazione, per aiutare i lettori a scegliere un'analisi appropriata.

Introduction

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Quantificare la quantità di cibo ingerito è importante per valutare gli aspetti multipli di alimentazione comandi dal cervello in risposta alle esigenze interne (ad esempio Stati di fame) e fattori esterni (ad esempio, cibo di qualità e appetibilità)1, 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9. negli ultimi anni, gli sforzi di decifrare i substrati neurali di controllo dell'alimentazione in Drosophila conducono allo sviluppo di saggi multipli per quantificare la quantità di cibo ingerito o servire come un indicatore di alimentazione motivazione direttamente 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16.

Il capillare dell'alimentatore (CAFE) dosaggio12,13 è stato sviluppato per misurare la quantità di consumo di liquidi alimentari in un microcapillary di vetro. Il dosaggio CAFE è altamente sensibile e riproducibile17 e semplifica la misurazione del consumo di cibo, soprattutto per la quantificazione di alimentazione a lungo termine18. Tuttavia, questo test richiede le mosche a salire fino alla punta della microcapillary e nutrire la testa in giù, che non è adatto per tutti i ceppi. Inoltre, perché le mosche da testare usando l'analisi CAFE hanno ad essere allevato su alimenti liquidi, l'effetto di queste condizioni il metabolismo status o la malnutrizione potenziale di allevamento rimane per essere determinata.

La risposta di estensione di proboscide (PER) dosaggio11,14 conta la frequenza delle risposte di estensione proboscide verso garbati tocchi di gocce di cibo. PER test che si è rivelato come un ottimo modo per valutare l'alimentazione motivazione della Mosca individuo e asini l'influenza dell'appetibilità e contenuto di cibo18,19. Tuttavia, non si tratta di una quantificazione diretta della quantità di assunzione.

Recentemente, è stato sviluppato un metodo semi-automatico, il saggio (MAFE)15, di alimentazione manuale. In MAFE, una singola Mosca immobilizzata è alimentata manualmente con un microcapillary contenenti alimenti. Dato che le risposte di estensione di proboscide e consumo alimentare possono essere controllati simultaneamente, MAFE è adatto per valutare i valori nutrizionali e gli effetti di manipolazione farmacologica. Tuttavia, immobilizzando una Mosca potrebbe compromettere le prestazioni comportamentali, compresa l'alimentazione.

Inoltre, volare proboscide e Activity Detector (FlyPAD)10 è stato sviluppato per quantificare automaticamente il comportamento alimentare. Utilizzando metodi di visione della macchina, FlyPAD registra interazioni fisiche tra un volo e cibo per quantificare la frequenza e la durata delle estensioni di proboscide come un indicatore di alimentazione motivazione. FlyPAD fornisce un approccio di alto-rendimento per monitorare i comportamenti d'alimentazione di una Mosca liberi di muoversi, anche se la sensibilità e la robustezza di questo sistema rimane per essere ulteriormente confermata da più studi12.

Strategie d'etichettatura sono frequentemente utilizzate per stimare l'ingestione di cibo in mosche. È comune per etichettare il cibo con traccianti chimici e, dopo la poppata, misurare la quantità di tracciante ingerito per calcolare la quantità di assunzione di cibo. Traccianti radioattivi16,17,20,21,22,23,24,25 consentono la rilevazione attraverso la cuticola senza omogeneizzazione delle mosche. Questo metodo fornisce notevolmente bassa variabilità e alta sensibilità18ed è fattibile per studio a lungo termine dell'ingestione di cibo. Tuttavia, la disponibilità di radioisotopi utilizzabile e diversi tassi di assorbimento ed escrezione devono tener conto quando si lavora con questo test.

Etichettatura e rintracciabilità assunzione di cibo con colori atossici alimentari è un più sicuro e semplice alternativa2,3,26,27,28. Mosche sono omogeneizzati dopo l'alimentazione con alimenti contenenti coloranti solubili e non assorbibili, e la quantità del colorante ingerito più tardi è quantificata utilizzando un spettrofotometro3,24,28,29 . La strategia di etichettatura è facile da eseguire e fornisce alta efficienza, ma con un avvertimento. Il volume dell'ingestione di cibo stimato da tintura ingerita è più piccolo di volume effettivo perché escrezione inizia già a 15 min dopo mosche avviare l'alimentazione17. Inoltre, il test valuta l'ingestione di cibo in genere entro un periodo di 60 minuti, che è adatto solo per indagine di alimentazione a breve termine comportamento24,28. Inoltre, molteplici fattori interni ed esterni, come genotipo17, genere17, accoppiato stato17, allevamento densità30, ritmo circadiano31,32e cibo di qualità3 , 8 , 16, influenza l'ingestione di cibo. Pertanto, la durata di alimentazione potrebbe essere necessario essere regolata in base alle specifiche condizioni sperimentali. Oltre a facilitare la quantificazione dell'ingestione di cibo, coloranti alimentari sono utilizzati anche per valutare il cibo scelte2,19,27e di visualizzare il menisco in un microcapillary in CAFE dosaggio12.

Qui, presentiamo una protocollo combinato manipolazione dell'attività neuronale con approccio d'etichettatura della tintura. Questa strategia si è dimostrata utile nel nostro studio Neurogenetica il controllo dell'alimentazione in mosche adulte frutta24. Il metodo di giudizio visivo permette per una rapida stima del consumo di cibo; Pertanto, è utile per lo screening attraverso un gran numero di ceppi in modo tempestivo. I candidati dalla schermata vengono poi analizzati in dettaglio utilizzando un metodo colorimetrico per fornire obiettivo e quantificazione precisa in studio aggiuntivo.

Oltre a saggi d'alimentazione, abbiamo inoltre descrivono i termogenetica27,33,34,35 e optogenetica36 metodi del forzatamente attivazione di neuroni bersaglio in drosofila. Per attivare i neuroni da termogenetica operazione è semplice e conveniente con Drosophila Transient Receptor potenziali Ankyrin 1 (dTRPA1), che è un canale cationico temperatura e tensione-gated che aumenta l'eccitabilità neuronale quando l'ambiente temperatura superiore a 23 ° C33,37; Tuttavia, gli esperimenti su animali ad alte temperature potrebbe produrre effetti negativi sul comportamento. Un altro approccio efficace per attivare i neuroni in Drosophila utilizza optogenetica con CsChrimson36, che è una variante rosso-spostato di channelrhodopsin che aumenta l'eccitabilità dei neuroni quando esposto alla luce. Optogenetica offre risoluzione temporale superiore e minore dispersione a comportamenti di thermogenetics. Combinando la misurazione quantitativa dell'ingestione di cibo con la manipolazione dell'attività neuronale rappresenta un efficace approccio per lo studio dei meccanismi neurali di alimentazione.

Descriviamo in dettaglio la preparazione della camera di alimentazione e le mosche da testare. Utilizzando Taotie-Gal4 mosche come un modello24, descriviamo i neuroni d'attivazione di thermogenetics e optogenetica. Due saggi di quantificazione del consumo alimentare con cibo tingere-contrassegnati sono anche descritti nel protocollo.

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Protocol

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1. preparare la camera di alimentazione

Nota: La camera di alimentazione per analisi d'etichettatura della tintura d'alimentazione è costituito da due parti: il contenitore esterno (come copertura) e l'interno contenitore (come fonte di cibo).

  1. Modificare il contenitore esterno da un flaconcino di vetro per la coltura della drosofila con (un diametro interno di 31,8 mm) e un'altezza di 80 mm (Figura 1A, 1C). Coprire il fondo del contenitore con uno strato di agarosio all'1% (5 mL) per mantenere l'alimentazione installazione correttamente umidificato e servire come un substrato morbido per le mosche a piedi al momento (Figura 1B). Il contenitore fornisce quindi un ambiente controllato ma naturalistico che trasportano con minimo sforzo o disturbo per le mosche.
    1. Preparare il contenitore esterno. Sospendere 0,5 g di agarosio in 50 mL di acqua distillata doppia, calore con agitazione frequente e far bollire per sciogliere completamente su un agitatore magnetico con una piastra di calore.
    2. Quando la si raffredda agarosio 1% a circa 60 ° C, trasferire 5 mL di agarosio all'1% a vuoto all'esterno del contenitore (Figura 1B) e lasciare che il contenitore rimangono aperti fino al raffreddamento a temperatura ambiente per produrre un pad di agarosio.
  2. Preparare il cibo tingere-contrassegnati. Composizione del cibo tingere-contrassegnati varia secondo gli scopi sperimentali differenti. Ecco un esempio di preparazione del cibo tingere-contrassegnati contenente solo saccarosio.
    1. Aggiungere 0,5 g di agarosio a 50 mL di acqua distillata doppia, calore con agitazione frequente e far bollire per sciogliere completamente su un agitatore magnetico con una piastra di calore.
    2. Quando l'agarosio 1% sopra si raffredda a circa 60 ° C, aggiungere 1,71 g di saccarosio per l'agarosio per ottenere saccarosio di 100 mM.
    3. Aggiungere 0,25 g di colorante blu (erioglaucine disodico) per la soluzione di agarosio per procurarsi il cibo di tingere-contrassegnati di 0,5% (p/v).
  3. Preparare l'interno contenitore. Mettere il vuoto all'interno di contenitori su una superficie piana orizzontale, poi aggiungere 750 µ l di blu cibo tingere-contrassegnati da contenitore per alimenti singoli, lasciarlo solidificare per almeno 5 min.
    Nota: All'interno contenitore è un piccolo piatto di plastica con un diametro interno di 13,6 mm e un'altezza di 7,5 mm (Figura 1A, 1C). Esso è riempito con cibo tingere-contrassegnati e quindi è posizionato al centro del riquadro dell'agarosi del contenitore esterno.
  4. Trasferimento debitamente compilata all'interno del contenitore in un contenitore esterno preparato e posizionarlo al centro del riquadro dell'agarosi. Lasciate che gli alloggiamenti di alimentazione rimangono aperti a temperatura ambiente per 40 minuti fino a quando la parete del contenitore esterno è libera di condensa.
    Nota: Muro a secco è necessario impedire che le mosche essere bloccato sulla parete contattando gocce d'acqua.
  5. Preparare alloggiamenti d'alimentazione con alimenti privi di tintura (stessa composizione ma senza colorante) per la sottrazione di sfondo.

2. preparazione di mosche

Nota: Femmina adulta Vola 5 a 10 giorno dopo eclosion sono normalmente utilizzati per l'alimentazione dei saggi. Si consiglia di preparare mosche di genotipi differenti, inclusi i controlli genetici e di testare in parallelo. 20 mosche (da una camera di alimentazione) generano un punto di dati.

  1. Prendere in considerazione la densità di popolazione per l'allevamento di mosche adulte. In genere, è possibile controllare la densità di popolazione variando il numero di mosche parentale secondo i ceppi e le dimensioni dei flaconi per coltura. Ad esempio, trasferire 15 maschi e 30 femmine di Cantone-S per una bottiglia di cultura con (un diametro di 31,8 mm) e un'altezza di 80 mm e lasciare che le femmine per deporre le uova per rimuovere che l'adulto Vola poi un giorno.
  2. Preparare mosche per attivazione termogenetica.
    1. Utilizzare il sistema Gal4/UAS38 per esprimere dTRPA133 in vari neuroni incrociando che UAS-dTrpA1 Vola con diverse linee di driver GAL4 (Figura 2B).
    2. Mantenere le mosche adulte il cibo standard a 22 ° C, umidità relativa di 60% e un ciclo luce-buio di 12 h/12 h.
    3. Due giorni prima l'alimentazione dosaggio, ordinare e raccogliere mosche su una rampa di volare2 CO sotto un microscopio stereo in un flacone di cibo fresco e mantenere una densità di 20 mosche per flaconcino.
  3. Preparare mosche per attivazione optogenetica.
    1. Utilizzare il sistema Gal4/UAS38 per esprimere CsChrimson36 a diversi neuroni da attraversamento UAS-CsChrimson mosche con diverse linee di driver GAL4.
    2. Raccogliere appena mosche obtecta (entro 24h) e trasferirli in un flacone con cibo standard contenente 400 µM all-trans-retinale.
    3. Per evitare l'attivazione prematura, avvolgere le fiale allevamento con carta stagnola e poi metterli in una scatola scuro per proteggere mosche da stimolazione luminosa indesiderata. Tenere lontane le mosche a 25 ° C, umidità 60% al buio per 4-6 giorni.
    4. Due giorni prima del test d'alimentazione, donna sorta Vola sul CO2 Vola tappetino sotto un microscopio stereo. Raccogliere 20 mosche nel flaconcino di un alimento e tenerli al buio prima della prova di alimentazione.
    5. Svolgere tutte le operazioni sotto la luce fioca più rapidamente possibile per evitare gli effetti causati dalla luce ambientale. Utilizzare una lampada a LED posizionata lontano dall'area di lavoro, l'intensità alla zona di lavoro è 5 µW/cm2.
      Nota: Uso di fame Cantone-S Vola come un controllo positivo per il dosaggio di alimentazione. Privare queste mosche di cibo e mantenere su agarosio all'1% per 24 h prima della prova di alimentazione. I livelli di consumo alimentare di queste mosche aiutano a valutare le fluttuazioni quotidiane.

3. termogenetica attivazione

  1. Effettuare tutte le prove di alimentazione allo stesso tempo del giorno, nei dintorni di Zeitgeber tempo 4-631,32, per minimizzare le variazioni a causa di ritmi circadiani.
  2. Preparare un incubatore (o una piccola stanza con un riscaldatore termostatato) come ambiente di riscaldamento.
  3. Prima di esperimenti comportamentali, equilibrare gli alloggiamenti di alimentazione preparati alla temperatura sperimentale (30 ° C) per 2 h garantire che la temperatura è uniforme relativa nella camera di alimentazione.
  4. Per avviare il processo di alimentazione, attentamente trasferimento 20 mosche da loro casa flaconcino in una camera di alimentazione preriscaldata in picchiettando. Continuare il processo di alimentazione a 30 ° C per 60 min ( Figura 3A) .
    Nota: Frequenti agitazioni, come aprire e chiudere lo sportello dell'incubatore, influenzare negativamente il comportamento alimentare, così dovrebbero essere minimizzate.
  5. Cessare di alimentazione a 60 min congelando gli alloggiamenti d'alimentazione a-80 ° C (o -20 ° C) per 30 min.
    Nota: Congelamento aiuta a fermare le poppate in tutte le camere contemporaneamente. Mosche a-80 ° C di congelamento serve a due scopi, per eutanasia le mosche e archiviazione fino alla omogeneizzazione fino ad una settimana.
  6. Per il gruppo di controllo di temperatura, è necessario trasferire 20 mosche in una temperatura ambiente alimentazione camera con cibo colorante color per avviare il processo di alimentazione a 22 ° C per 60 min.
  7. Cessare l'alimentazione del gruppo di controllo di temperatura di congelamento gli alloggiamenti a-80 ° C (o -20 ° C) per 30 min.

4. optogenetica attivazione

  1. Effettuare tutte le prove di alimentazione allo stesso tempo del giorno, nei dintorni di Zeitgeber tempo 4-631,32, per minimizzare le variazioni a causa di ritmi circadiani.
  2. Trasferire con cautela 20 mosche da un flaconcino in una camera di alimentazione da picchiettando e poi mettere la camera lateralmente sull'installazione di illuminazione (Figura 4A, 4B).
    1. Per la manipolazione di optogenetica, utilizzare una matrice di LED arancione (607 nm) come la fonte di stimolazione luminosa e fissare una piastra orizzontale plexiglass sopra i LED per supportare l'alimentazione chambers durante l'illuminazione. Mantenere l'installazione in un incubatore a 25 ° C con umidità del 60% (Figura 4A, 4B).
    2. Stimolare le mosche di controllo genetico in parallelo con il Taotie > CsChrimson Vola, ma in diversi alloggiamenti di alimentazione.
  3. Continuare il processo di alimentazione per 60 min con retroilluminazione di luce arancione.
    1. Determinare l'intensità di illuminazione ottimale per optogenetica sperimentalmente36. Per la Taotie > CsChrimson mosche, un'intensità di 2,2 mW/mm2 induce paralisi (cessazione della locomozione) e perdita del controllo posturale, pertanto, utilizzare un'intensità intermedia di 0.1 mW/mm2 per stimolare la Taotie > CsChrimson mosche durante la prova di alimentazione.
  4. Cessare l'alimentazione mediante congelamento alimentazione chambers a-80 ° C (o -20 ° C) per 30 min.

5. visual stima del consumo alimentare

Nota: L'approccio di valutazione visivo fornisce una stima semi-quantitativa dei consumi alimentari. Sebbene non sia più obiettivo il metodo ottico, questo metodo consente passando attraverso un gran numero di ceppi di volare in modo tempestivo, che lo rende adatto per il primo round di una schermata genetica per restringere rapidamente l'elenco dei candidati per i successivi test.

  1. Dopo il processo di alimentazione, anestetizzare e segnare le mosche su una CO2 pad volare sotto un microscopio stereo. Dare punteggio individuale per ogni volo basato sul volume e l'intensità del colore della tintura cibo nel suo addome (Figura 2A).
    Nota: Criteri per la valutazione visiva: il sistema di punteggio ha 4 livelli di assunzione di cibo corrispondente a diversi volumi e intensità di cibo colorato nell'addome.
    1. Punteggio ottenuto Vola senza cibo colorante color rilevabile un punteggio pari a 0; quelli con debole colorante blu (a mala pena rilevabile) o con cibo colorante color che occupa meno di un terzo del volume dell'addome e dare un punteggio di 1.
    2. Punteggio ottenuto Vola con cibo di tintura di colore intenso che occupa metà dell'addome un punteggio pari a 2.
    3. Quelli con intenso tinto contenuto che occupa metà dell'addome superiore Punteggio ottenuto un punteggio pari a 3 (Figura 2A).
  2. Calcolare la proporzione di mosche con punteggi diversi in ogni condizione sperimentale (Figura 2B).

6. colorimetrico quantificazione del consumo alimentare

  1. Dopo sospensione dell'alimentazione, versare 20 tutte le mosche da un'alimentazione dell'alloggiamento su un pezzo di carta di pesatura e quindi trasferirli in una provetta da 1,5 mL utilizzando una spazzola morbida.
    Nota: Non prenda tutti gli alloggiamenti fuori di-80 ° C stoccaggio allo stesso tempo per evitare mosche attaccarsi alla parete della camera a causa di condensa di acqua sulla camera fredda.
  2. Aggiungere 500 µ l di PBST al tubo e omogeneizzare le mosche usando un mulino di macinazione a 60 Hz per 5 s.
    1. Confermare sufficiente omogeneizzazione di osservazione quando non ci sono nessun rilevabili frammenti di parti del corpo.
  3. Girare i tubi con omogeneati per 30 min a 13.000 giri/min per eliminare i detriti.
  4. Dopo la centrifugazione, trasferire 100 µ l del surnatante in un pozzetto di una piastra a 96 pozzetti.
  5. Dopo tutti i campioni vengono caricati, mettere la piastra in un lettore di piastra per misurare l'assorbanza dei campioni a 630 nm.
  6. Per rimuovere l'assorbanza di fondo, sottrarre l'assorbanza dei surnatanti dalle mosche sul cibo senza tintura si autoalimenta con l'assorbanza del surnatante dalle mosche blu cibo-federazione.
    Nota: Questo passaggio è facoltativo, a seconda delle composizioni del cibo utilizzato. Quando un alimento (senza tintura) genera assorbanza a 630 nm, è necessario eseguire questo passaggio per eliminare lo sfondo.

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Representative Results

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Schermo termogenetica.

Anormalmente aumentato appetito provoca l'ingestione di cibo con privilegi elevati, indipendentemente dalle esigenze fisiologiche. Abbiamo utilizzato questo schema per progettare un alto-rendimento schermo comportamentale per ottenere maniglie genetiche dei neuroni legate alla fame e sazi stati (Figura 1). Lo schermo ha reso Taotie-Gal424. Quando i neuroni Taotie-Gal4 forzatamente furono attivati a 30 ° C, il Taotie > TrpA1 mosche ingerito grandi quantità di cibo rispetto ai controlli (Figura 2, Figura 3).

Visivamente segnando il consumo di cibo.

Perché alcuni neurotrasmettitori e neuropeptidi sono state indicate nella regolazione del comportamento alimentare, abbiamo testato le corrispondenti linee di GAL4, compresa NPF20, sNPF39, octopamina21, dopamina27, 40, serotonina41,42, AKH35e Dilp27,8,35. Per quantificare la risposta d'alimentazione, abbiamo visivamente ispezionato e segnato mosche con varie quantità di colorante rilevabile nell'intestino (Figura 2A). Dopo l'attivazione dei neuroni Taotie , circa il 58% dei Taotie > dTrpA1 mosche hanno esibito comportamenti d'alimentazione forti e il 23% di questi ha mostrati comportamenti di miti d'alimentazione (Figura 2B). Al contrario, solo marginali comportamenti d'alimentazione sono stati osservati in mosche con altri neuroni attivati via dTrpA1 (Figura 2B).

Colorimetrica quantificazione dell'ingestione di cibo.

Per quantificare l'assunzione di cibo con alta precisione e oggettività, abbiamo misurato l'assorbanza di estrazione volare ad una lunghezza d'onda specifica per il colorante aggiunto nel cibo2,27,28. Per correlare un valore di assorbanza con il volume di ingestione di cibo, una curva standard è stata ottenuta misurando l'assorbanza delle soluzioni campione (lo stesso buffer per omogeneizzare le mosche, PBST) miscelato con diverse quantità di coloranti). Come i nostri risultati dimostrano, acuta attivando i neuroni Taotie-GAL4 TRPA1 ingestione di cibo notevolmente aumentata rispetto al controllo genetico e il controllo della temperatura durante lo stesso periodo di prova (Figura 3B), suggerendo che il Taotie-GAL4 con etichettati neuroni partecipano nella regolazione dell'ingestione di cibo dell'adulto della drosofila.

Attivazione di optogenetica per promuovere l'assunzione di cibo in Drosophila.

Abbiamo usato UAS -CsChrimson per attivare i neuroni Taotie di illuminazione con una luce arancione36 (Figura 4A, 4B). Quando Taotie > CsChrimson mosche sono state stimolate da luci a LED a 607 nm, hanno ingerito significativamente più alimento che i comandi (Figura 4). Inoltre, la quantità di cibo ingerito ha correlato bene con l'intensità della luce di stimolazione (Figura 4). Pertanto, oltre a thermogenetics con dTrpA1, optogenetica attivazione con CsChrimson in neuroni Taotie promuove anche alimentazione motivazione in mosche sazie.

Figure 1
Figura 1 . Un paradigma d'alimentazione per l'analisi di appetito in mosche adulte. (A) l'alimentazione camera contiene un interno contenitore riempito con cibo colorante color e un contenitore esterno imbottito con agarosio all'1%. Da sinistra a destra, all'interno contenitore, il contenitore esterno e la camera di alimentazione completa. Contenitore (B), all'interno si trova sopra il pad di agarosio nella parte inferiore del contenitore esterno. (C) la camera di alimentazione vista superiore. (D) una schematica mostra l'esperimento di "schermo di appetito". Mosche sazie normale raramente mangiato cibo (fiala di sinistra), mentre l'attivazione forzatamente determinati neuroni di controllo alimentazione causato mosche sazi di ingerire cibo supplementare, esibendo così cibo colorante color nell'addome (destro flaconcino). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 . Visual stima dell'ingestione di cibo. (A) Exemplar immagini per mostrare i criteri per il Punteggio contenuto di cibo nell'addome. (B) la distribuzione di alimentazione punteggi in mosche con indicati neuroni attivati da dTrpA1 a 30 ° C. No-Gal4: UAS-dTrpA1 (controllo genetico); NPF-GAL4: neuropeptide F neuroni positivi; sNPF-GAL4: breve neuropeptide F neuroni positivi; TDC1-GAL4 e TDC2-GAL4: octopamina neuroni; TH-GAL4: neuroni della dopamina; 5-HT: neuroni della serotonina; AKH: neuroni positivi adipocinetico ormone; DIP2: neuroni positivi peptide insulino-simile 2; Taotie-GAL4: Taotie-GAL4 etichette neuroni (n = 120 mosche a condizione). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3 . Termogenetica-attivazione di Taotie neuroni aumenta il consumo di cibo in mosche adulte. (A), un'immagine mostra la configurazione dell'esperimento termogenetica attivazione. Il test d'alimentazione è stato effettuato in un incubatore a 30 ° C. (B) consumo alimentare di quantificazione colorimetrica in mosche sazie testato a 30 ° C o a 22 ° C per 1 h. La quantità di consumo alimentare di una singola Mosca è stata calcolata da quello di 20 mosche in una camera di alimentazione (n = 6). n.s. indica non significativa (p > 0.05); p < 0,001. One-way ANOVA seguita con il test di Tukey post hoc, era usato per analizzare i confronti multipli. Barre di errore indicano la media ± SEM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4 . Optogenetica-attivazione dei neuroni Taotie aumenta la quantità di assunzione di cibo in un modo dipendente dalla intensità. (A, B) Due viste del setup per l'attivazione optogenetica. Gli alloggiamenti di alimentazione sono state poste lateralmente su una piastra di supporto e illuminato dal basso di una matrice di LED arancione. Il lato anteriore della finestra di illuminazione è stato rimosso per mostrare l'interno LED. Esperimenti comportamentali sono stati eseguiti all'interno di un'incubatrice a 25 ° C, 60% RH. (C) consumo alimentare di mosche sazi di genotipi indicati quando testato sotto optogenetica illuminazione o al buio per 1 h (n = 6). (D) cibo ingestione di sazio Taotie > CsChrimson mosche è stato correlato con l'intensità di illuminazione (n = 6). n.s. indica non significativa (p > 0.05); p < 0,001, One-way ANOVA seguita con il test di Tukey post hoc, era usato per analizzare i confronti multipli, di Student t-test per due confronti di gruppo. Barre di errore indicano la media ± SEM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

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Questo rapporto si concentra sul processo tecnico di saggi d'alimentazione colorante-etichettatura del consumo alimentare nel contesto di termogenetica e optogenetica attivazione per manipolare i neuroni di controllo alimentazione. Questo protocollo semplice e affidabile vi aiuterà a chiarire la funzione dei neuroni del candidato nel controllo, per misurare la preferenza dell'alimento di mosche e per identificare nuovi giocatori nei circuiti di controllo alimentazione tramite schermi genetici basati su alimentazione24dell'alimentazione.

Il colorante etichettatura strategia è fattibile a indagare i comportamenti di alimentazione a breve termine. La tintura, erioglaucine disodico, disciolto in e ingerita con il cibo, è un indicatore importantissimo del consumo alimentare. Deshpande et al hanno dimostrato che il colorante blu stessa ha mostrato alcuna influenza sull'alimentazione quando misurata sia il dosaggio CAFE e il radioisotopo etichettatura alimentare assunzione dosaggio17. Allo stesso modo, i nostri risultati PER (stimolando la gamba della Mosca con soluzione di saccarosio tingere-contrassegnati o privo di tintura 100 mM) indicato che mosche hanno esibito alcuna differenza significativa nella loro risposta verso tingere-contrassegnati o privo di colorante alimentare. Tuttavia, non ci sono ancora dati chiari per quanto riguarda se il colorante è insapore in drosofila.

Oltre i passaggi critici indicato nel protocollo, prestare particolare attenzione al generale stato delle mosche da testare. Oltre ad essere allevati e mantenuti a una densità non sovraffollate, le mosche devono essere maneggiate delicatamente ed evitare inutili urti o sollecitazioni, al fine di produrre risultati coerenti di alimentazione.

Il paradigma d'alimentazione presentato qui ha alcune limitazioni. In primo luogo, i nostri metodi di quantificano il consumo di cibo in un periodo di 60 min. Per valutare le ingestioni di cibo per lunghi periodi, ad esempio un giorno, un metodo diverso, come ad esempio CAFE, sarebbe necessari. In secondo luogo, rispetto ai metodi di quantificazione utilizzando radioisotopi, il metodo colorimetrico è meno sensibile e difficile da risolvere le differenze quando sono basse quantità di consumo alimentare. In terzo luogo, considerando che alcune mosche comincerebbe a scaricarsi più presto 15 min dopo l'inizio dell'allattamento, questo protocollo misura effettivamente il risultato dell'ingestione di cibo ed escrezione in una popolazione di17. Quarto, la quantificazione colorimetrica dell'ingestione di cibo qui descritto è stato per un gruppo volo, stima dell'ingestione di cibo di una singola Mosca dipende da altri saggi d'alimentazione, come ad esempio il radioisotopo etichettatura, il dosaggio MAFE o FlyPAD. Tuttavia, alcuni vantaggi di quantificazione colorimetrica dell'ingestione di cibo, ad esempio è un metodo semplice, stabile, visibile e ad alta velocità, rendono una scelta privilegiata per la quantificazione di un gran numero di ceppi, soprattutto per alimentazione-base genetica schermi e gli studi di follow-up.

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Disclosures

Gli autori non dichiarano concorrenti interessi finanziari.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato supportato in parte dalla base nazionale ricerca programma della Cina (2012CB825504), National Natural Science Foundation of China (91232720 e 9163210042), Accademia cinese delle scienze (CAS) (GJHZ201302 e QYZDY-SSW-SMC015), Bill e Melinda Gates Programma Foundation (OPP1119434) e 100-talenti di CAS a Y. Zhu.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
UAS-CsChrimson Bloomintoon 55135
UAS-dTrpA1 Bloomintoon 26263
TDC1-GAL4  Bloomintoon 9312
TDC2-GAL4 Bloomintoon 9313
sNPF-GAL4 Provided by Z. Zhao
NPF-GAL4 Provided by Y. Rao
TH-GAL4 Provided by Y. Rao
5-HT-GAL4 Provided by Y. Rao
AKH-GAL4 Provided by Y. Rao
dip2-GAL4 Provided by Y. Rao
Taotie-GAL4 Provided by J. Carlson
Agarose Biowest G-10
Sucrose Sigma S7903
Erioglaucine disodium salt Sigma 861146
all-trans-retinal  Sigma  R2500 stored in darkness
Triton X-100 Amresco 9002-93-01
Fly food 1 L food contains: 77.7 g corn meal, 32.19 g yeast, 5 g agar, 0.726 g CaCl2, 31.62 g sucrose, 63.2 g glucose, 2 g potassium sorbate, pH   
 1x PBS buffer  1 L 1X PBS contains: 8 g Nacl, 0.2 g Kcl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4, pH 7.4
PBST buffer 1X PBS with 1% Triton X-100
 Grinding mill Shang Hai Jing Xin Tissuelyser-24
Incubator Ning Bo Jiang Nan HWS-80
Magnetic stirrer with a heat plate Chang Zhou Bo Yuan CJJ 78-1
Spectrometer Thorlabs CCS200/M
Microplate Spectrophotometer Thermo Scientific  Multiskan GO Type: 1510, REF 51119200
Fluorescence stereo microscope  Leica  M205FA
Stereo microscope Leica  S6E
Outside container Jiang Su Hai Men glass vial with a diameter of 31.8 mm and a height of 80 mm (inside dimension)
Inside container  Beijing Yi Ran machinery factory plastic dish with a diameter of 13.6 mm and a height of 7.5 mm (inside dimension)
1.5 mL Eppendorf tubes Hai Men Ning Mong
 96 well plate Corning Incorporated  Costar 3599
LEDs Xin Xing Yuan Guangdian 607 nm, 3W  https://item.taobao.com/item.htm?id=20158878058

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Combinando le analisi quantitativa l'ingestione di cibo e forzatamente attivazione di neuroni per studiare l'appetito in <em>Drosophila</em>
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Jiang, L., Zhan, Y., Zhu, Y. Combining Quantitative Food-intake Assays and Forcibly Activating Neurons to Study Appetite in Drosophila. J. Vis. Exp. (134), e56900, doi:10.3791/56900 (2018).More

Jiang, L., Zhan, Y., Zhu, Y. Combining Quantitative Food-intake Assays and Forcibly Activating Neurons to Study Appetite in Drosophila. J. Vis. Exp. (134), e56900, doi:10.3791/56900 (2018).

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