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Behavior

Combinando os ensaios quantitativos de ingestão de alimentos e forçosamente, ativando os neurônios para estudar o apetite em Drosophila

doi: 10.3791/56900 Published: April 24, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Ensaios quantitativos de ingestão de alimentos com comida tingido fornecem um robusto e alta produtividade significa avaliar a motivação de alimentação. Combinando o ensaio de consumo de alimentos com thermogenetic e telas de optogenetic é uma poderosa abordagem para investigar os circuitos neurais subjacentes apetite em adultos melanogaster da drosófila.

Abstract

Consumo de alimentos está sob o controle apertado do cérebro, que integra o estado fisiológico, palatabilidade e conteúdo nutricional dos alimentos e questões de comandos para iniciar ou parar a alimentação. Decifrando os processos subjacentes a tomada de decisão oportuna e moderada alimentação traz implicações importantes em nossa compreensão de distúrbios fisiológicos e psicológicos relacionados ao controle de alimentação. Métodos quantitativos, simples e robustos são necessários para mensurar a ingestão de alimentos de animais após manipulação experimental, como à força, aumentando as atividades de certos neurônios do alvo. Aqui, nós introduzimos a ensaios de alimentação corante-rotulagem-based para facilitar o estudo neurogenetic de controle de alimentação em adultos de moscas de fruta. Podemos rever ensaios de alimentação disponíveis e em seguida descrever nossos métodos passo a passo da configuração para análise, que combinam thermogenetic e manipulação de optogenetic de neurônios controlando alimentação motivação com ensaio de ingestão de alimentos tingir-etiquetados. Também discutimos as vantagens e limitações dos nossos métodos, em comparação com outros ensaios de alimentação, para ajudar os leitores a escolher um ensaio apropriado.

Introduction

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Quantificar a quantidade de comida ingerida é importante para avaliar vários aspectos da alimentação controles pelo cérebro em responder às necessidades internas (tais como Estados de fome) e fatores externos (como a qualidade dos alimentos e palatabilidade)1, 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9. nos últimos anos, os esforços de decifrar os substratos neurais de controle de alimentação em Drosophila levam ao desenvolvimento de vários ensaios para diretamente a quantificar a quantidade de comida ingerida ou servir como um indicador de alimentação motivação 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16.

O ensaio de alimentador capilar (CAFE)12,13 foi desenvolvido para medir a quantidade de consumo de alimentos líquidos em uma conta de vidro. O ensaio CAFE é altamente sensível e reprodutível17 e simplifica a medição do consumo de alimentos, especialmente para quantificação de alimentação a longo prazo18. No entanto, este ensaio requer as moscas para subir até a ponta da conta e alimentar de ponta-cabeça, que não é adequado para todas as estirpes. Além disso, porque as moscas a ser testado usando o ensaio de café têm de ser criados no alimento líquido, o efeito destas condições no status de metabolismo ou desnutrição a potencial de criação permanece ser determinado.

O ensaio de Proboscis extensão resposta (PER)11,14 conta a frequência de respostas de extensão narigudo em direção a toques suaves de gotas de comida. POR ensaio provado-se como uma excelente maneira de avaliar alimentação motivação de mosca individual e bundas a influência de palatabilidade e conteúdo de alimentos18,19. No entanto, não é uma quantificação directa da quantidade de ingestão.

Recentemente, foi desenvolvido um método semiautomático, manual do ensaio (MAFE)15, de alimentação. Em MAFE, uma única mosca imobilizada é alimentada manualmente com uma conta que contém o alimento. Dado que as respostas de extensão de narigudo e consumo de alimentos podem ser monitorados simultaneamente, MAFE é adequado para avaliar valores de nutrientes e os efeitos da manipulação farmacológica. No entanto, imobilizando uma mosca pode afetar negativamente seu desempenho comportamental, incluindo a alimentação.

Além disso, voar Proboscis e atividade Detector (FlyPAD)10 foi desenvolvido para quantificar automaticamente o comportamento alimentar. Usando métodos de visão de máquina, FlyPAD registros de interações físicas entre uma mosca e comida para quantificar a frequência e duração das extensões de tromba como um indicador de alimentação motivação. FlyPAD fornece uma abordagem de alto rendimento para monitorar os comportamentos de alimentação de uma mosca em movimento livre, embora a sensibilidade e a robustez deste sistema continua a ser confirmada por mais de12estudos.

Estratégias de rotulagem são frequentemente usadas para estimar a ingestão de alimentos em moscas. É comum de rotular os alimentos com traçadores químicos e, após a alimentação, medir a quantidade de traçador ingerido para calcular a quantidade de ingestão de alimentos. Traçadores radioativos,16,17,20,21,22,23,24,25 permitir a detecção através da cutícula sem homogeneização das moscas. Este método fornece notavelmente baixa variabilidade e alta sensibilidade18e é viável para o estudo de longo prazo da ingestão de alimentos. No entanto, a disponibilidade de radioisótopos utilizáveis e diferentes taxas de absorção e excreção devem ser tida em conta quando se trabalha com este ensaio.

Rotulagem e rastreamento de ingestão de alimentos com cores de alimentos tóxicos é um mais simples e mais segura alternativa2,3,26,,27,28. Moscas são homogeneizadas após a alimentação com alimentos que contenham corantes solúveis e não absorvível, e a quantidade do corante ingerido mais tarde é quantificada utilizando um espectrofotômetro3,24,28,29 . A estratégia de rotulagem é fácil de executar e fornece alta eficiência, mas com uma ressalva. O volume de ingestão de alimentos, estimado a partir da tintura ingerida é menor que o volume real porque excreção começa tão cedo quanto 15 min depois moscas Iniciar alimentação17. Além disso, o ensaio avalia a ingestão de comida tipicamente dentro de um período de 60 min, que só é adequado para investigação do comportamento alimentar a curto prazo24,28. Além disso, vários fatores internos e externos, tais como o genótipo17, gênero17, acasalou estado17, criação de densidade30, ritmo circadiano31,32e comida de qualidade3 , 8 , 16, ingestão de alimentos de influência. Portanto, a alimentação duração talvez precise ser ajustado de acordo com as condições experimentais específicas. Além de facilitar a quantificação da ingestão de alimentos, cores de alimentos também são usadas para avaliar opções de comida a2,19,27e visualizar o menisco em uma conta no CAFE ensaio12.

Aqui, apresentamos uma protocolo combinado manipulação da atividade neuronal com abordagem de criação de etiquetas de tintura. Esta estratégia tem sido provada útil em nosso estudo neurogenetic alimentando o controle em adultos de moscas de fruta24. O método de Pontuação visual permite uma rápida estimativa do consumo de alimentos; assim, é útil para o rastreio através de um grande número de estirpes em tempo hábil. Os candidatos a partir da tela são então analisados em detalhe, usando um método colorimétrico para fornecer objectivas e quantificação exacta em estudo adicional.

Além de ensaios de alimentação, também descrevemos o thermogenetic27,33,34,35 e optogenetic36 métodos forçosamente ativando neurônios alvo em Drosophila. Para ativar os neurônios por thermogenetic a operação é simples e conveniente com Drosophila transitória do Receptor potencial Ankyrin 1 (dTRPA1), que é um canal de cação de temperatura e voltagem-dependente que aumenta a excitabilidade neuronal quando a temperatura ambiente temperatura se eleva acima de 23 ° C33,,37; no entanto, testes com animais em altas temperaturas podem produzir efeitos adversos sobre o comportamento. Outra abordagem eficaz para ativar os neurônios em Drosophila é usando o optogenetics com CsChrimson36, que é uma variante avermelhado do channelrhodopsin que aumenta a excitabilidade dos neurônios quando expostos à luz. Optogenetics oferece a maior resolução temporal e a menor perturbação de comportamentos do que thermogenetics. Combinando a medição quantitativa de ingestão de alimentos com a manipulação da atividade neuronal representa uma abordagem eficaz para estudar os mecanismos neurais de alimentação.

Descrevemos em detalhe a preparação da câmara de alimentação e as moscas a ser testado. Usando moscas Taotie-Gal4 como um modelo24, descrevemos ativando neurônios por thermogenetics e optogenetics. Dois ensaios de quantificação do consumo de alimento com comida tingir-etiquetados são também descritos no protocolo.

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Protocol

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1. preparar a câmara de alimentação

Nota: A câmara de alimentação para criação de etiquetas de corante alimentar ensaio consiste de duas partes: o recipiente externo (como uma capa) e o interior contêiner (como fonte de alimento).

  1. Modificar o recipiente externo de um frasco de vidro para o cultivo da drosófila com (diâmetro interno de 31,8 mm) e uma altura de 80 mm (figura 1A, 1C). Cobrir o fundo do recipiente com uma camada de agarose a 1% (5 mL) para manter a configuração de alimentação adequadamente humedecidas e servir como um substrato macio para as moscas andar em cima (figura 1B). O recipiente, desse modo, oferece um ambiente controlado mas naturalista, carregando com o mínimo de estresse ou perturbação para as moscas.
    1. Prepare o recipiente externo. Suspender a 0,5 g de agarose em 50 mL de água bidestilada, calor com agitação frequente e ferva até para dissolver completamente em um agitador magnético com uma placa de calor.
    2. Quando esfria de agarose a 1% para cerca de 60 ° C, transferir 5ml de agarose a 1% para um vazio fora do recipiente (figura 1B) e deixe o recipiente ficar aberto até arrefecido à temperatura ambiente para produzir uma almofada de agarose.
  2. Prepare alimentos tingir-etiquetados. Composição dos alimentos tingir-etiquetados varia de acordo com diferentes fins experimentais. Aqui está um exemplo de preparar o alimento tingir-etiquetados, contendo apenas a sacarose.
    1. Adicionar 0,5 g de agarose a 50 mL de água bidestilada, calor com agitação frequente e deixe ferver até para dissolver completamente em um agitador magnético com uma placa de calor.
    2. Quando a agarose 1% acima esfria a cerca de 60 ° C, adicione 1,71 g de sacarose para o agarose para obter sacarose 100 mM.
    3. Adicione 0,25 g de corante azul (erioglaucine dissódico) para a solução de agarose para obter comida de tingir-etiquetados de 0,5% (p/v).
  3. Preparar o interior recipiente. Colocar o vazio dentro de recipientes sobre uma superfície plana e horizontal e, em seguida, adicione 750 µ l de comida azul tingir-etiquetados para recipiente de alimento individuais, deixe solidificar durante pelo menos 5 min.
    Nota: Dentro do recipiente é um pequeno prato de plástico com diâmetro interno de 13,6 mm e uma altura de 7,5 mm (figura 1A, 1C). Ele está cheio de comida tingir-etiquetados e então está posicionado no centro da almofada do agarose do recipiente externo.
  4. Transferir um enchido dentro de contêiner para um recipiente fora preparado e posicioná-lo no centro do painel de agarose. Deixe-as câmaras de alimentação ficar aberto à temperatura ambiente por 40 min até a parede do recipiente externo é livre de condensação.
    Nota: Parede seca é necessária para impedir que as moscas sendo preso na parede, entrando em contato com gotas de água.
  5. Preparar a alimentação câmaras com comida sem corantes (mesma composição mas sem tingem) para subtração de fundo.

2. preparação de moscas

Nota: Fêmea adulta voa 5 a 10 dias após a eclosão são normalmente utilizados para ensaios de alimentação. É recomendável para moscas de genótipos diferentes, incluindo controles de genéticas, de preparar e testar em paralelo. 20 moscas (a partir de uma câmara de alimentação) geram um ponto de dados.

  1. Considere a densidade de população para a criação de moscas adultas. Normalmente, controle a densidade de população, variando o número de moscas parentais de acordo com as tensões e as dimensões dos frascos de cultura. Por exemplo, transferir 15 machos e 30 fêmeas de Cantão-S para um frasco de cultura com (de 31,8 mm de diâmetro) e uma altura de 80 mm e deixe as fêmeas para pôr ovos para um dia, em seguida, remover que o adulto voa.
  2. Prepare-se para ativação thermogenetic moscas.
    1. Use o sistema de Gal4/UAS38 para expressar dTRPA133 em vários neurônios por cruzamento que UAS-dTrpA1 voa com diferentes linhas de motorista GAL4 (Figura 2B).
    2. Mantenha as moscas adultas no padrão alimentar de 22 ° C, umidade relativa de 60% e um ciclo claro-escuro de 12 h/12 h.
    3. Dois dias antes da alimentação do ensaio, classificar e coletar moscas num CO2 bloco voar sob um microscópio estéreo em um frasco de alimentos frescos e manter uma densidade de 20 moscas por frasco.
  3. Prepare-se para a ativação de optogenetic moscas.
    1. Use o sistema de Gal4/UAS38 para expressar CsChrimson36 nos neurônios diferentes por moscas de UAS-CsChrimson cruzando com linhas diferentes de motorista GAL4.
    2. Coletar recém eclosed (dentro de 24 h) moscas e transferi-los em um frasco com o alimento padrão contendo 400 µM all-trans-retinal.
    3. Para prevenir a ativação prematura, embrulhar os frascos de criação com folha de alumínio e em seguida, colocá-los em uma caixa escura para proteger moscas de estimulação de luz indesejada. Manter as moscas a 25 ° C, umidade de 60% no escuro por 4-6 dias.
    4. Dois dias antes do ensaio de alimentação, fêmea tipo voa em CO2 pad voar sob um microscópio estéreo. Recolher 20 moscas no frasco de um alimento e mantê-los no escuro antes do teste de alimentação.
    5. Realizar todas as operações sob a luz ofuscante tão rapidamente quanto possível, para evitar os efeitos causados pela luz ambiente. Usar uma lâmpada de LED colocada longe da área de trabalho, a intensidade na área de trabalho é 5 µW/cm2.
      Nota: Uso de fome Cantão-S voa como um controle positivo para o ensaio de alimentação. Privar estas moscas de comida e manter em agarose a 1% por 24 horas antes do teste de alimentação. Os níveis de consumo de alimentos destas moscas ajudam a avaliar as flutuações diárias.

3. thermogenetic ativação

  1. Conduzir experimentos de alimentação todas ao mesmo tempo do dia, em torno de Zeitgeber tempo 4-631,,32, para minimizar variações devido ao ritmo circadiano.
  2. Prepare uma incubadora (ou uma pequena sala com um aquecedor de temperatura controlada) como o ambiente de aquecimento.
  3. Antes de experimentos comportamentais, equilibrar as câmaras de alimentação preparadas à temperatura experimental (30 ° C) por 2 h assegurar que a temperatura é uniforme relativo na câmara de alimentação.
  4. Para iniciar o processo de alimentação, cuidadosamente transferi 20 moscas de seu frasco em casa em uma câmara de alimentação pré-aquecida tocando suave. Continuar o processo de alimentação a 30 ° C por 60 min ( Figura 3A) .
    Nota: Frequentes agitações, tais como abertura e fechamento da porta de incubadora, afetar adversamente o comportamento alimentar, assim, devem ser minimizadas.
  5. Cesse a alimentação a 60 min por congelamento as câmaras de alimentação de-80 ° C (ou a-20 ° C) por 30 min.
    Nota: Congelamento ajuda a parar as mamadas em todas as câmaras em simultâneo. Congelamento de moscas a-80 ° C tem duas finalidades, para eutanásia as moscas e para armazenamento até homogeneização por até uma semana.
  6. Para o grupo de controle de temperatura, transferi 20 moscas para uma temperatura ambiente alimentando câmara com cor de corante alimentar para iniciar o processo de alimentação a 22 ° C por 60 min.
  7. Cesse a alimentação do grupo de controle de temperatura congelando as câmaras a-80 ° C (ou a-20 ° C) por 30 min.

4. Optogenetic ativação

  1. Conduzir experimentos de alimentação todas ao mesmo tempo do dia, em torno de Zeitgeber tempo 4-631,,32, para minimizar variações devido ao ritmo circadiano.
  2. Transferir com cuidado 20 moscas de um frasco para uma câmara de alimentação suave tocando e em seguida, colocar a câmara lateralmente sobre a instalação de iluminação (Figura 4A, 4B).
    1. Para manipulação de optogenetic, usar uma matriz de LEDs laranja (607 nm) como a fonte da luz de estimulação e fixar uma placa horizontal do plexiglás acima os LEDs para apoiar a alimentação câmaras durante a iluminação. Manter a instalação em uma incubadora a 25 ° C, com 60% de umidade (Figura 4A, 4B).
    2. Estimular as controle genético de moscas em paralelo com o Taotie > CsChrimson voa, mas em diferentes câmaras de alimentação.
  3. Continue o processo de alimentação para 60 min com iluminação traseira pela luz laranja.
    1. Determinar as intensidades de iluminação ideal para optogenetics experimentalmente36. Para o Taotie > CsChrimson moscas, uma intensidade de 2,2 mW/mm2 induz paralisia (cessação de locomoção) e perda de controle postural, portanto, use uma intensidade intermediária de 0.1 mW/mm2 para estimular o Taotie > CsChrimson voa durante o teste de alimentação.
  4. Cesse a alimentação por congelamento câmaras de alimentação de-80 ° C (ou a-20 ° C) por 30 min.

5. visual estimativa de consumo de alimentos

Nota: A abordagem de Pontuação visual fornece uma estimativa semi-quantitativa de consumos de alimentos. Embora não seja tão objectiva quanto o método óptico, este método permite a passar por um grande número de estirpes voar em tempo hábil, tornando-o adequado para a primeira rodada de uma tela de genética para rapidamente reduzir a lista de candidatos para testes adicionais.

  1. Após o processo de alimentação, anestesiar e marcar as moscas em um CO2 almofada voar sob um microscópio estéreo. Dar Pontuação individual para cada mosca com base no volume e intensidade de cor de corante de comida em seu abdômen (Figura 2A).
    Nota: Critérios para estimativa visual: o sistema de Pontuação tem 4 níveis de ingestão de alimentos, correspondentes a diferentes volumes e intensidades de alimentos coloridos no abdômen.
    1. Pontuação voa sem detectável cor de corante alimentar uma pontuação de 0; aqueles com corante azul (mal detectável) fraco ou com cor de corante alimentar ocupando menos de um terço do volume do abdome dar uma pontuação de 1.
    2. Pontuação voa com intensa cor de corante alimentar, ocupando metade do abdome um placar de 2.
    3. Aqueles com intensa tingido conteúdo ocupando metade do abdome superior a marcar uma pontuação de 3 (Figura 2A).
  2. Calcule a proporção de moscas com pontuações diferentes em cada condição experimental (Figura 2B).

6. colorimétrica quantificação do consumo de alimentos

  1. Após cessação da alimentação, despejar todas as 20 moscas de uma alimentação de câmara em um pedaço de papel de pesagem, em seguida, transferi-los para um tubo de 1,5 mL, usando uma escova macia.
    Nota: Não tome todas as câmaras de armazenamento-80 ° C ao mesmo tempo para evitar moscas, furar a parede da câmara devido a condensação de água na câmara fria.
  2. Adicionar 500 µ l de PBST ao tubo e homogeneizar as moscas usando um moinho de moedura em 60Hz para 5 s.
    1. Confirme a homogeneização suficiente pela observação quando existem não detectáveis fragmentos de partes do corpo.
  3. Gire os tubos com homogenates por 30 min a 13.000 rpm para limpar os escombros.
  4. Após a centrifugação, transferi 100 µ l do sobrenadante para um poço de uma placa de 96 poços.
  5. Depois que todas as amostras são carregadas, coloquei a placa em um leitor de placa para medir a absorvância das amostras em 630 nm.
  6. Para remover a absorvância de fundo, subtrair o valor da absorvância dos sobrenadantes de moscas alimentados com comida sem tintura valor da absorvância do líquido sobrenadante de moscas alimentados com comida azuis.
    Nota: Esta etapa é opcional, dependendo das composições dos alimentos utilizados. Quando um alimento voar (sem tintura) gera a absorvância a 630 nm, é necessário efectuar este passo para eliminar o fundo.

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Representative Results

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Thermogenetic tela.

Anormalmente, aumento do apetite faz com que a ingestão de alimentos elevados, independentemente de necessidades fisiológicas. Utilizamos este regime para projetar um elevado-throughput comportamental tela para obter alças genéticas de neurônios relacionados à fome e saciado Estados (Figura 1). A tela rendeu Taotie-Gal424. Quando os neurônios Taotie-Gal4 foram ativados forçosamente a 30 ° C, o Taotie > TrpA1 voa ingeridas quantidades maiores de alimentos do que os controles (Figura 2, Figura 3).

Visualmente, marcando o consumo de alimentos.

Porque alguns neurotransmissores e neuropeptídeos têm sido indicados na regulação do comportamento alimentar, nós testamos as linhas correspondentes de GAL4, incluindo NPF20, sNPF39, octopamina21, dopamina27, 40,41,de serotonina42, AKH35e Dilp27,8,35. Para quantificar a resposta alimentação, visualmente inspeccionada e marcou moscas com diferentes quantidades de corante detectável no intestino (Figura 2A). Após a ativação de neurônios Taotie , cerca de 58% dos Taotie > dTrpA1 moscas exibiram comportamentos de alimentação fortes e 23% destes apresentaram comportamentos de alimentação suave (Figura 2B). Em contraste, apenas marginais comportamentos de alimentação foram observados em moscas com outros neurônios ativados via dTrpA1 (Figura 2B).

Colorimétrica quantificação da ingestão de alimentos.

Para quantificar a ingestão de alimentos com alta precisão e objectividade, medimos o valor da absorvância da extração voar num comprimento de onda específico para o corante adicionado em alimentos2,,27,28. Para um valor de absorvância se correlacionam com o volume de ingestão de alimentos, obteve-se uma curva padrão medindo a absorbância das soluções de amostra (a mesma reserva para homogeneizar as moscas, PBST) misturado com diferentes quantidades de corantes). Como nossos resultados demonstram, aguda ativado Taotie-GAL4 neurônios pelo TRPA1 dramaticamente maior ingestão de alimentos em comparação com o controle genético e o controle de temperatura durante o mesmo período de teste (Figura 3B), sugerindo que a Taotie-GAL4 neurônios rotulados participarem na regulação da ingestão de alimentos de adultos drosófila.

Optogenetic ativação para promover a ingestão de alimentos em Drosophila.

Costumávamos UAS -CsChrimson para ativar neurônios Taotie pela iluminação com uma luz laranja36 (Figura 4A, 4B). Quando Taotie > CsChrimson moscas foram estimuladas por luzes LED no 607 nm, que ingeriram significativamente mais comida do que controles (Figura 4). Além disso, a quantidade de alimento ingerido correlacionados com as intensidades de luz de estimulação (Figura 4). Assim, além de thermogenetics com dTrpA1, ativação de optogenetic com CsChrimson em neurônios Taotie também promove a motivação alimentar em moscas saciadas.

Figure 1
Figura 1 . Um paradigma de alimentação para a análise de apetite em moscas adultas. (A) a alimentação câmara contém dentro de uma recipiente preenchido com cor de corante alimentar e um recipiente exterior acolchoado com agarose a 1%. Da esquerda para a direita, dentro do recipiente, o recipiente exterior e a câmara de alimentação completa. (B), dentro de recipiente senta em cima da almofada de agarose na parte inferior do recipiente externo. (C) vista superior da câmara de alimentação. (D), um diagrama esquemático mostrando a experiência de "tela de apetite". Moscas saciadas normais raramente comeram comida (frasco de esquerda), enquanto forçosamente ativando certos neurônios de controle a alimentação causaram moscas saciadas a ingerir alimentos adicionais, exibindo cor de corante alimentar no abdômen (frasco de direito). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 . Estimativa Visual da ingestão de alimentos. (A) Exemplar de imagens para mostrar os critérios de contabilização de conteúdo alimentar no abdômen. (B) a distribuição de alimentação partituras em moscas com neurônios indicados sendo ativados por dTrpA1 a 30 ° C. N-Gal4: UAS-dTrpA1 (controle genético); PFN-GAL4: neuropeptide F neurônios positivos; sNPF-GAL4: curto neuropeptide F neurônios positivos; TDC1-GAL4 e TDC2-GAL4: octopamina neurônios; TH-GAL4: neurônios de dopamina; 5-HT: neurônios de serotonina; AKH: adipokinetic hormônio positivo os neurônios; DIP2: neurônios positivos insulin-como peptídeo 2; Taotie-GAL4: Taotie-GAL4 rotula neurônios (n = 120 moscas por condição). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 . Thermogenetic-ativação de Taotie neurônios aumenta o consumo de alimentos em moscas adultas. (A), uma imagem mostra a instalação do experimento ativação thermogenetic. O teste de alimentação foi realizado em uma incubadora a 30 ° C. (B) consumo de alimentos por quantificação colorimétrica em moscas saciadas testado em 30 ° C ou 22 ° C, durante 1 h. A quantidade de consumo de alimentos de uma única mosca foi calculada a partir de 20 moscas em uma câmara de alimentação (n = 6). n.s. indica não significativa (p > 0,05); p < 0,001. One-Way ANOVA seguido com teste post hoc de Tukey foi utilizado para analisar as comparações múltiplas. Barras de erro indicam média ± SEM. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4 . Optogenetic-ativação dos neurônios Taotie aumenta a quantidade de ingestão de alimentos de forma dependente da intensidade. (A, B) Dois modos de exibição da configuração para a ativação de optogenetic. As câmaras de alimentação foram colocadas lateralmente sobre uma placa de suporte e iluminados do fundo por uma matriz de LEDs laranja. Parte frontal da caixa de iluminação foi removido para mostrar o interior LEDs. Os experimentos comportamentais foram realizados dentro de uma incubadora a 25 ° C, 60% RH. (C) consumo de alimentos de moscas saciados de genótipos indicados quando testado sob iluminação de optogenetic ou no escuro por 1h (n = 6). (D) alimentos ingestão por saciado Taotie > CsChrimson moscas foi correlacionada com a intensidade de iluminação (n = 6). n.s. indica não significativa (p > 0,05); p < 0,001, One-Way ANOVA seguido com teste post hoc de Tukey foi utilizado para analisar a comparações múltiplas, Student t-teste para duas comparações de grupo. Barras de erro indicam média ± SEM. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

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Este relatório concentra-se no processo técnico de ensaios de alimentação corante-rotulagem de consumo de alimentos no contexto de thermogenetic e ativação de optogenetic para manipular os neurônios controlando a alimentação. Este protocolo simples e de confiança vai ajudar a elucidar a função dos neurônios do candidato na alimentação de controle, para medir a preferência alimentar de moscas e para identificar novos jogadores nos circuitos de controle de alimentação através de telas de genética baseada em alimentação24.

O corante rotulagem estratégia é viável na investigação de comportamentos de alimentação a curto prazo. O corante, erioglaucine dissódico, dissolvido em e ingeridos com a comida, é um indicador crítico do consumo de alimentos. Deshpande et al. demonstraram que a tintura azul não se mostrou nenhuma influência na alimentação quando medido pelo ensaio de CAFE e o radioisótopo rotulagem alimentar ingestão ensaio17. Da mesma forma, nossos resultados por (estimulando a perna da mosca com solução de sacarose 100mm tingir-etiquetados ou sem corantes) indicam que moscas não exibiram nenhuma diferença significativa em sua resposta para tingir-etiquetados ou sem corantes alimentares. No entanto, existem ainda não limpar dados sobre se o corante é insípido em Drosophila.

Além dos passos críticos indicados no protocolo, preste particular atenção ao general estatuto das moscas a ser testado. Além de ser criados e mantidos em uma densidade não-superlotadas, as moscas devem ser manuseadas com cuidado e evite choques desnecessários ou pressões, a fim de produzir resultados consistentes de alimentação.

O paradigma de alimentação apresentado aqui tem certas limitações. Em primeiro lugar, nossos métodos de quantificam o consumo de alimentos durante um período de 60 min. Para avaliar a ingestão de alimentos durante períodos mais longos, como um dia, um método diferente, como café, seria necessários. Segundo, em comparação com métodos de quantificação, usando radioisótopos, o método colorimétrico é menos sensível e difícil de resolver diferenças quando quantidades de consumo de alimentos estão baixas. Em terceiro lugar, Considerando que algumas moscas começaria a quitação tão cedo quanto 15 min após o início da alimentação, este protocolo realmente mede o resultado da ingestão de alimentos e excreção em uma população de17. Em quarto lugar, a colorimétrica quantificação da ingestão de alimentos descrito aqui foi para um grupo de mosca, estimativa da ingestão de alimentos de uma única mosca depende de outros ensaios de alimentação, por exemplo marcando o radioisótopo, o ensaio MAFE ou FlyPAD. No entanto, certas vantagens de colorimétrica quantificação da ingestão de alimentos, tais como sendo um método simples, estável, visível e elevado-throughput, tornam uma principal escolha para quantificação de um grande número de estirpes, especialmente para alimentação-base genética telas e os estudos de seguimento.

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Disclosures

Os autores declaram não concorrentes interesses financeiros.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado em parte pelo nacional pesquisa básica programa da China (2012CB825504), Nacional Natural Science Foundation da China (91232720 e 9163210042), da Academia Chinesa de Ciências (CAS) (GJHZ201302 e SMC015-QYZDY-SSW), Bill e Melinda Gates Foundation (OPP1119434) e 100-talentos programa de CAS para Y. Zhu.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
UAS-CsChrimson Bloomintoon 55135
UAS-dTrpA1 Bloomintoon 26263
TDC1-GAL4  Bloomintoon 9312
TDC2-GAL4 Bloomintoon 9313
sNPF-GAL4 Provided by Z. Zhao
NPF-GAL4 Provided by Y. Rao
TH-GAL4 Provided by Y. Rao
5-HT-GAL4 Provided by Y. Rao
AKH-GAL4 Provided by Y. Rao
dip2-GAL4 Provided by Y. Rao
Taotie-GAL4 Provided by J. Carlson
Agarose Biowest G-10
Sucrose Sigma S7903
Erioglaucine disodium salt Sigma 861146
all-trans-retinal  Sigma  R2500 stored in darkness
Triton X-100 Amresco 9002-93-01
Fly food 1 L food contains: 77.7 g corn meal, 32.19 g yeast, 5 g agar, 0.726 g CaCl2, 31.62 g sucrose, 63.2 g glucose, 2 g potassium sorbate, pH   
 1x PBS buffer  1 L 1X PBS contains: 8 g Nacl, 0.2 g Kcl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4, pH 7.4
PBST buffer 1X PBS with 1% Triton X-100
 Grinding mill Shang Hai Jing Xin Tissuelyser-24
Incubator Ning Bo Jiang Nan HWS-80
Magnetic stirrer with a heat plate Chang Zhou Bo Yuan CJJ 78-1
Spectrometer Thorlabs CCS200/M
Microplate Spectrophotometer Thermo Scientific  Multiskan GO Type: 1510, REF 51119200
Fluorescence stereo microscope  Leica  M205FA
Stereo microscope Leica  S6E
Outside container Jiang Su Hai Men glass vial with a diameter of 31.8 mm and a height of 80 mm (inside dimension)
Inside container  Beijing Yi Ran machinery factory plastic dish with a diameter of 13.6 mm and a height of 7.5 mm (inside dimension)
1.5 mL Eppendorf tubes Hai Men Ning Mong
 96 well plate Corning Incorporated  Costar 3599
LEDs Xin Xing Yuan Guangdian 607 nm, 3W  https://item.taobao.com/item.htm?id=20158878058

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References

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Combinando os ensaios quantitativos de ingestão de alimentos e forçosamente, ativando os neurônios para estudar o apetite em <em>Drosophila</em>
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Jiang, L., Zhan, Y., Zhu, Y. Combining Quantitative Food-intake Assays and Forcibly Activating Neurons to Study Appetite in Drosophila. J. Vis. Exp. (134), e56900, doi:10.3791/56900 (2018).More

Jiang, L., Zhan, Y., Zhu, Y. Combining Quantitative Food-intake Assays and Forcibly Activating Neurons to Study Appetite in Drosophila. J. Vis. Exp. (134), e56900, doi:10.3791/56900 (2018).

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