Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Behavior

Сочетая анализов количественных пищи и насильно активации нейронов для изучения аппетит у дрозофилы

doi: 10.3791/56900 Published: April 24, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Анализов количественных пищи с окрашенных пищей обеспечивают надежную и высок объём средств для оценки кормления мотивации. Сочетание пробирного потребления продуктов питания с thermogenetic и optogenetic экраны представляет собой мощный подход к расследованию нейронных цепей лежащие в основе аппетит у взрослых Drosophila melanogaster.

Abstract

Потребление продуктов питания находится под жестким контролем головного мозга, которая интегрирует физиологического статуса, вкусовых и питательных содержание продовольствия, и вопросы команд, чтобы запустить или остановить кормления. Расшифровка процессы, лежащие в основе принятия решений своевременного и умеренное питание несет серьезные последствия в нашем понимании физиологических и психологических расстройств, связанных с кормления контроля. Простой, количественные и надежные методы необходимы для измерения при приеме внутрь пищи животных после экспериментальных манипуляций, например насильно увеличение деятельности некоторых нейронов целевой. Здесь мы ввели на основе маркировки краска кормления анализов для облегчения neurogenetic изучения кормления контроля взрослых плодовых мушек. Мы обзор доступных кормления анализов, а затем описать методы нашей шаг за шагом, от установки до анализа, который объединить thermogenetic и optogenetic манипуляции нейронов, контролируя кормления мотивации с assay впускного пищевой краситель меченых. Мы также обсудить преимущества и недостатки методов нашей работы, по сравнению с другими кормления анализов, чтобы помочь читателям выбрать соответствующий assay.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Количественная оценка количество пищи, организм имеет важное значение для оценки нескольких аспектов кормления контроля мозга в ответ на внутренние потребности (например, голод государств) и внешних факторов (например, качество пищи и вкусовых качеств)1, 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9. в последние годы, усилия по расшифровке нейронных субстратов кормления контроля у дрозофилы привести к развитию несколько анализов напрямую подсчитать количество пищи, организм или служить индикатором питания мотивации 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16.

Капиллярные фидер (CAFE) пробирного12,13 был разработан для измерения объема потребления жидких пищевых продуктов в микрокапиллярной стекла. КАФЕ является весьма чувствительным и воспроизводимые17 и упрощает измерения потребления продуктов питания, особенно для количественной оценки долгосрочного питания18. Однако этот assay требует мух подняться на кончик микрокапиллярной и кормить вверх вниз, который подходит не для всех штаммов. Кроме того потому что мух проверяется с помощью кафе assay должны воспитываться на жидких пищевых продуктов, воздействие этих воспитания условия на метаболизм статус или потенциального недоедания остается быть обусловленным.

Хоботок расширение ответ (PER) пробирного11,14 подсчитывает частоту Хоботок расширение ответы к нежные прикосновения капель пищи. В Пробирной зарекомендовал себя как отличный способ оценить кормления мотивации отдельных полетов и ослов влияние вкусовых качеств и содержание питания18,19. Однако это не прямой количественной оценки объема потребления.

Недавно полуавтоматический метод, ручной подачей пробы (СДЕЛАВ)15, была разработана. В СДЕЛАВ один иммобилизованных Муха вручную подается с микрокапиллярной, содержащих продуктов питания. Учитывая, что Хоботок расширение ответы и потребление продовольствия могут контролироваться одновременно, СДЕЛАВ подходит для оценки питательной ценности и последствия манипуляции фармакологическом. Однако иммобилизирующие Муха может отрицательно сказаться поведенческих производительности, включая питание.

Кроме того, летать Хоботок и деятельность детектор (FlyPAD)10 был разработан, чтобы автоматически подсчитать кормления поведение. Используя методы видения машины, FlyPAD записи физических взаимодействий между летать и продовольствия для количественного определения частоты и продолжительности Хоботок расширений в качестве показателя кормления мотивации. FlyPAD обеспечивает что высок объём подход для мониторинга питания поведения-перемещение летать, хотя чувствительность и надежность этой системы остается далее подтверждается более исследования12.

Обозначая стратегии часто используются для оценки употребления пищи в мух. Она является общей для обозначения продуктов питания с химических индикаторов и, после кормления, измерить количество попадает трассировщик для вычисления количества потребляемой пищи. Радиоактивные Трейсеры16,17,20,21,,2223,24,25 позволяют для обнаружения через кутикулу без гомогенизации мух. Этот метод обеспечивает удивительно низкой изменчивости и высокая чувствительность18и возможно для долгосрочного исследования потребления пищи. Однако наличие использования радиоизотопов и различных темпов поглощения и выведения должны приниматься во внимание при работе с этот assay.

Маркировки и отслеживания пищи с нетоксичные красители это безопаснее и проще альтернатива2,3,26,27,28. Мухи гомогенизированных после кормления с пищей, содержащих красители растворяется и не рассасывающиеся, и количество попадает красителя позднее количественно с помощью спектрофотометра3,24,28,29 . Обозначая стратегия легко выполнить и обеспечивает высокую эффективность, но с оговоркой. Объем потребления пищи, по оценкам от краска попадает меньше, чем фактический объем, поскольку выведение начинается 15 мин в кратчайшие сроки после того, как мухи начать кормить17. Кроме того анализ оценивает проглатывание пищи обычно в течение 60-мин, который подходит только для расследования краткосрочных кормления поведение24,28. Кроме того несколько внутренних и внешних факторов, таких как генотип17, пол17, вязка государства17, воспитание плотность30, суточный ритм31,32и качества продовольствия3 , 8 , 16, влияние пищи. Таким образом продолжительность кормления может потребоваться корректироваться с учетом конкретных экспериментальных условиях. Помимо облегчения количественной оценки потребления пищи, пищевые красители используются также для оценки продовольственной Выбор2,19,27и визуализировать мениска в микрокапиллярной в кафе пробирного12.

Здесь мы представляем протокол комбинированные манипуляции нейронной активности с подходом, краситель маркировки. Эта стратегия была оказался полезным в нашей neurogenetic исследование кормления контроля взрослых плодовых мушек24. Метод визуального скоринг позволяет для быстрой оценки потребления продовольствия; Таким образом это полезно для проверки через большое количество штаммов своевременно. Кандидаты от экрана затем анализируются подробно колориметрическим методом предоставление объективной и точной количественной оценки дополнительного исследования.

Помимо питания анализов мы также описать thermogenetic27,33,34,35 и optogenetic36 методы насильственно активации нейронов целевой у дрозофилы. Чтобы активировать нейроны, thermogenetic операция является простым и удобным с дрозофилы переходных рецептор потенциальных Анкирины 1 (dTRPA1), который является воротами температуры и напряжения катиона канал, который увеличивает возбудимость нейронов когда окружающего Температура поднимается выше 23 ° C33,37; Однако тестирование животных при высоких температурах может произвести неблагоприятное воздействие на поведение. Еще один эффективный подход для активации нейронов в дрозофилы используется Оптогенетика с CsChrimson36, который является разновидностью смещается красный channelrhodopsin, которая увеличивает возбудимость нейронов при воздействии света. Оптогенетика предлагает выше временное разрешение и меньшей нарушения поведения, чем thermogenetics. Сочетая количественное измерение потребляемой пищи с манипуляции нейронной активности представляет эффективный подход для изучения нейронных механизмов кормления.

Мы подробно описать подготовка питание камеры и мух для проверки. С помощью Taotie-Gal4 летит как модель24, мы описываем активирующих нейронов, thermogenetics и Оптогенетика. Два анализов количественной оценки потребления продуктов питания с пищевой краситель меченых также описаны в протоколе.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Подготовка питания камеры

Примечание: Питание камеры для маркировки краска кормления assay состоит из двух частей: вне контейнера (для прикрытия) и внутри контейнера (в качестве источника питания).

  1. Изменить внешний контейнер от Стеклянный флакон для культивирования дрозофилы (внутренний диаметр 31,8 мм) и высотой 80 мм (рис. 1A, 1 C). Крышка нижней части контейнера с слоя агарозы 1% (5 мл) правильно держать питания установки увлажняется и служить в качестве мягкого субстрата для мух ходить по (Рисунок 1B). Контейнер предоставляет таким образом контролируемых но натуралистических настройки с минимальным стрессом или помеха для мух.
    1. Подготовьте внешний контейнер. Приостановить 0,5 г агарозы в 50 мл двойной дистиллированной воды, тепла с частым перемешиванием и варить до растворения на магнитной мешалкой с табличкой тепла.
    2. Когда охлаждает агарозы 1% до примерно 60 ° C, 5 мл 1% агарозном передать пустой вне контейнера (рис. 1B) и пусть контейнера остаются открытыми, пока не остынет до комнатной температуры приносить площадку агарозы.
  2. Подготовка красителя помечены пищи. Состав красителя меченых продуктов зависит от различных экспериментальных целях. Вот пример подготовки краситель меченых продуктов, содержащих только сахарозы.
    1. Добавить 0,5 г агарозы в 50 мл двойной дистиллированной воды, тепла с частым перемешиванием и варить до растворения на магнитной мешалкой с табличкой тепла.
    2. Когда выше агарозы 1% остывает до 60 ° C, добавьте 1.71 г сахарозы агарозы для получения 100 мм сахарозы.
    3. Добавьте 0,25 г синий краситель (erioglaucine динатриевая) решение агарозы для получения пищевой краситель меченых 0,5% (w/v).
  3. Подготовить внутри контейнера. Поставьте пустую внутри контейнеров на плоской горизонтальной поверхности, а затем добавьте 750 мкл синий краситель помечены продовольствия в отдельных пищевых контейнеров, пусть это закрепить по крайней мере 5 минут.
    Примечание: Внутри контейнера является небольшой пластиковый блюдо с внутренним диаметром 13,6 мм и высотой 7,5 мм (рис. 1A, 1 C). Он наполнен краситель меченых продуктов питания и затем помещается в центре колодки агарозы вне контейнера.
  4. Передавать заполненные внутри контейнера в контейнер подготовленных внешними и расположите его в центре колодки агарозы. Пусть питания камеры остаются открытыми при комнатной температуре за 40 мин до тех пор, пока стены вне контейнера без конденсации.
    Примечание: Сухая стена необходима для предотвращения мух от застрять на стену, обратившись в капли воды.
  5. Подготовить питание камеры с красителя бесплатное питание (такая же композиция, но без красителя) для вычитание фона.

2. Подготовка мух

Примечание: Взрослая самка летит 5-10 день после eclosion обычно используются для кормления анализов. Рекомендуется подготовить мух различных генотипов, включая генетические элементы управления и для тестирования параллельно. 20 мух (от одного кормления камеры) генерировать одну точку данных.

  1. Рассмотрим плотность населения на воспитание взрослых мух. Как правило контролировать плотность населения, изменяя количество родительских мух согласно штаммов и размеры бутылки культуры. Например передача 15 мужчин и 30 женщин кантона-S культуры бутылка с (диаметр 31,8 мм) и высотой 80 мм и пусть самки откладывают яйца на один день, а затем удалить взрослых мух.
  2. Подготовьте мух thermogenetic активации.
    1. Используйте системы Gal4/Уан38 выразить dTRPA133 в различных нейронов путем скрещивания, бла dTrpA1 летит с различными линиями GAL4 драйвера (рис. 2B).
    2. Взрослых мух на стандартное питание при 22 ° C, относительная влажность 60% и цикл 12 h/12 h свето тени.
    3. За два дня до кормления assay, сортировать и собирать мух на CO2 летать площадку под микроскопом стерео во флакон свежих продуктов и держать плотность 20 мух на флакон.
  3. Подготовьте мух для активации optogenetic.
    1. Используйте Gal4/Уан системы38 выразить CsChrimson36 в различных нейронов мухами пересечения бла-CsChrimson с различными линиями драйвер GAL4.
    2. Вновь собирать мух eclosed (в течение 24 ч) и перенести их в пробирку с стандартных продуктов, содержащих 400 мкм полностью транс ретиналь.
    3. Для предотвращения преждевременной активации, оберните воспитания флаконы с алюминиевой фольгой и затем поместить их в темной коробке для защиты от нежелательных легкой стимуляции мух. Мух при 25 ° C, влажность 60% в темноте для 4-6 дней.
    4. За два дня до кормления assay, сортировка самка летит на CO2 летать площадку под микроскопом стерео. Сбор 20 мух в пищу, один флакон и держать их в темноте до кормления испытания.
    5. Как можно избежать последствий, вызванных освещенности быстрее проводить все операции при тусклом освещении. Используйте Светодиодные лампы размещены далеко от рабочей области, интенсивность в рабочей области 5 мкВт/см2.
      Примечание: Использование голодали кантон-S летит как позитивный элемент управления для кормления assay. Лишить этих мух пищи и поддерживать на агарозы 1% за 24 часа до кормления тест. Уровни потребления продовольствия этих мух помогают оценивать повседневную колебания.

3. thermogenetic активации

  1. Проведение всех кормления экспериментов в то же время суток, вокруг Zeitgeber время 4-631,32, чтобы свести к минимуму изменения вследствие циркадные ритмы.
  2. Подготовьте инкубатора (или маленькой комнате с контролируемой температурой воды нагреватель) в качестве среды Отопление.
  3. Перед поведенческих эксперименты сбалансировать подготовленный кормления камер на экспериментальной температуры (30 ° C) для 2 h, чтобы убедиться, что температура является относительной форме в зале кормления.
  4. Чтобы начать процесс кормления, тщательно передачи 20 мух от их дома флакон в разогретой кормления камеру нежным нажатием. Продолжить процесс кормления при 30 ° C 60 мин ( Рисунок 3А) .
    Примечание: Частые агитации, такие, как открытие и закрытие двери инкубатора, отрицательно сказаться на кормление поведение, таким образом должны быть минимизированы.
  5. Прекратить кормление на 60 мин путем замораживания кормления камер-80 ° C (или-20 ° C) за 30 мин.
    Примечание: Замораживания помогает остановить кормления во всех камерах одновременно. Замораживание мух-80 ° c служит двум целям, для euthanizing мух и для хранения до гомогенизации до одной недели.
  6. Для группы контроля температуры перевести 20 мух в комнатной температуре, питание камеры с краска цвета пищи, чтобы начать процесс кормления при 22 ° C 60 мин.
  7. Прекратить кормление группе контроля температуры в морозильных камер-80 ° C (или-20 ° C) за 30 мин.

4. Optogenetic активации

  1. Проведение всех кормления экспериментов в то же время суток, вокруг Zeitgeber время 4-631,32, чтобы свести к минимуму изменения вследствие циркадные ритмы.
  2. Тщательно передачи 20 мух от одного флакона в камеру кормления нежным нажатием, а затем поместить камеру боком на освещение setup (рис. 4A, 4B).
    1. Для обработки optogenetic, используют массив оранжевый светодиоды (607 Нм) как источник света стимуляции и исправить горизонтальной оргстекла плиты выше светодиоды для поддержки кормления камеры во время освещения. Сохранить настройки в инкубаторе при 25 ° C при влажности 60% (рис. 4A, 4B).
    2. Стимулировать генетического контроля мух параллельно с Taotie > CsChrimson летит, но в разных питание камеры.
  3. Продолжите процесс кормления для 60 мин с задней подсветкой, оранжевый свет.
    1. Экспериментально определить оптимальный освещенностей для Оптогенетика36. Для Taotie > CsChrimson мух, интенсивность 2,2 МВт/мм2 вызывает паралич (прекращение локомоции) и потери постурального контроля, поэтому, использовать промежуточные интенсивности 0,1 МВт/мм2 для стимулирования Таоте > CsChrimson летит во время кормления теста.
  4. Прекратить кормление путем замораживания кормления камер-80 ° C (или-20 ° C) за 30 мин.

5. визуальной оценки потребления продовольствия

Примечание: Визуального скоринга подход обеспечивает полу количественной оценки потребления пищи. Хотя это не как цель, как оптический метод, этот метод позволяет идти через большое количество летать штаммов своевременно, что делает его пригодным для первого раунда генетических экрана быстро сузить список кандидатов для дальнейших испытаний.

  1. После процесса кормления анестезировать и оценка мух на CO2 летать площадку под микроскопом стерео. Дать отдельным оценка каждого летать на основе объема и интенсивности краска цвета пищи в его живот (рис. 2A).
    Примечание: Критерии для визуальной оценки: Оценка системы имеет 4 уровня потребления пищи, соответствующих различных объемов и интенсивности цвета еда в животе.
    1. Оценка летает без обнаружению краска цвета пищи счетом 0; Дайте те с слабый (едва обнаружению) синий краситель или с пищей краска цвета, занимая менее одной трети от объема живота показатель 1.
    2. Оценка летит с интенсивным краска цвета пищи, занимающие половину живота 2 баллов.
    3. Оценка тех, с интенсивным окрашенная содержание оккупационных больше чем половина живота Оценка 3 (рис. 2A).
  2. Рассчитайте долю мух с различными баллы в каждой экспериментальной состоянии (Рисунок 2Б).

6. колориметрические количественная оценка потребления продовольствия

  1. После прекращения кормления, излить все 20 мух от кормления камеры на кусок весом бумаги, а затем передавать их в 1,5 мл трубку с помощью мягкой щеткой.
    Примечание: Не принимайте все палат из-80 ° C для хранения в то же время избежать прилипания к стенке камеры из-за конденсации воды в холодной камере мух.
  2. Добавьте 500 мкл PBST трубки и гомогенизации мух с помощью мельницы при 60 Гц для 5 s.
    1. Подтвердите достаточно гомогенизации путем наблюдения, когда есть не поддаются обнаружению фрагментов частей тела.
  3. Спин трубы с гомогенатах 30 мин при 13000 об/мин для очистки мусора.
  4. После центрифугирования передачи 100 мкл супернатант хорошо 96-луночных плиты.
  5. После загрузки всех образцов, установите пластину в тарелку чтения для измерения оптической плотности образцов 630 Нм.
  6. Чтобы удалить фон поглощения, вычтите поглощения supernatants от мух, кормили на питание без краски от поглощения супернатант от синей еда кормили мух.
    Примечание: Этот шаг является необязательным, в зависимости от композиции используется пищи. Когда покупать продукты питания (без краски) генерирует поглощения на 630 Нм, это необходимо выполнить этот шаг, чтобы устранить фон.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Thermogenetic экран.

Аномально повышенный аппетит вызывает повышенные пищи, независимо от физиологической потребности. Мы использовали эту схему для разработки высокопроизводительных Поведенческий экран для получения генетических маркеров нейронов связанных с голодом и пресыщенный государств (рис. 1). Экран принесли Taotie-Gal424. Были насильственно активации нейронов Taotie-Gal4 при 30 ° C, Taotie > TrpA1 летит попадает в больших количествах пищи, чем элементы управления (рис. 2, рис. 3).

Визуально скоринга потребления продуктов питания.

Потому что некоторые нейротрансмиттеров и нейропептидов указали в регуляции кормления поведение, мы протестировали соответствующие линии GAL4, включая НПФ20, министерского39, октопамин21, допамина27, 40, серотонин41,42, AKH35и Dilp27,8,35. Для количественного определения кормления ответ, мы визуально осмотрела и забил мух с различным количеством обнаружению красителя в кишечнике (рисунок 2A). После активации нейронов Taotie , около 58% от Taotie > dTrpA1 мух выставлены сильные кормления поведения и 23% показал мягкая кормления поведений (рис. 2B). Напротив, только маргинальные кормления поведения были замечены в мух с другими нейронами, активированный через dTrpA1 (Рисунок 2B).

Колориметрические количественная оценка потребления пищи.

Для количественного определения пищи с высокой точности и объективности, мы измерили поглощения летать добычи на длине волны конкретных добавлен краску в питание2,27,28. Чтобы сопоставить значение поглощения с объемом потребления пищи, калибровочной кривой была получена путем измерения оптической плотности растворов образца (тот же буфер для гомогенизации мухи, PBST) смешивается с различными объемами красители). Как наши результаты показывают, острый активированную Taotie-GAL4 нейронов TRPA1 резко повышенной пищи по сравнению с генетического контроля и регулирования температуры в тот же период испытания (рис. 3B), предполагая, что Taotie-GAL4 помечены нейронов участвуют в регуляции рациона взрослых дрозофилы.

Optogenetic активации для продвижения пищи у дрозофилы.

Мы использовали бла -CsChrimson для активации нейронов Taotie освещением с оранжевого света36 (рис. 4A, 4B). Когда Taotie > CsChrimson мух были простимулированы светодиодные огни на 607 Нм, они попадает значительно больше пищи, чем элементы управления (рис. 4 c). Кроме того количество попадает пищи коррелирует с интенсивностью света стимуляции (рис. 4 d). Таким образом помимо thermogenetics с dTrpA1, optogenetic активации с CsChrimson в Taotie нейроны также способствует кормления мотивации в сытым мух.

Figure 1
Рисунок 1 . Питание парадигмы для анализа аппетит в взрослых мух. (A) кормления палаты содержит внутренний контейнер заполнен с пищевой краситель цвета и внешнего контейнера, мягкий с агарозы 1%. Слева направо, внутри контейнера, вне контейнера и полное питание камеры. (B) внутри контейнера сидит na górze агарозы панель в нижней части внешнего контейнера. Вид сверху (C) питание камеры. (D) A схема показаны эксперимент «аппетит экран». Нормальный сытым мух редко ел пищу (левый флаконе), пока принудительно активировать некоторые питания управления нейронов вызвало сытым мух глотать дополнительного питания, таким образом выставке краска цвета еда в животе (правый во флаконе). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2 . Визуальной оценки продовольственной заглатывания. (A) образец изображения, чтобы показать критерии для озвучивания содержание еда в животе. (B) распределения питания баллы в мух с указанной нейронов, активируемая dTrpA1 при 30 ° C. No-Gal4: Бас dTrpA1 (генетического контроля); НПФ-GAL4: нейропептида F позитивные нейронов; Министерского GAL4: короткие нейропептида F позитивные нейронов; TDC1-GAL4 и TDC2-GAL4: октопамин нейронов; TH-GAL4: дофаминовых нейронов; 5-HT: нейронов серотонина; AKH: adipokinetic гормон позитивные нейронов; dip2: инсулин как пептид 2 положительных нейронов; Taotie-GAL4: Taotie-GAL4 этикетки нейронов (n = 120 летит за состояние). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3 . Thermogenetic активация Нейроны Taotie увеличивает потребление продовольствия в взрослых мух. (A) изображение показывает настройки эксперимента thermogenetic активации. Кормления тест был проведен в инкубаторе на 30 ° C. (B) потребление продовольствия, колориметрические количественной оценки в сытым мух протестированы на 30 ° C или 22 ° C в течение 1 ч.. Количество потребления продовольствия одной мухи рассчитывался от того 20 мух в одной камере кормления (n = 6). н.с. указывает не значительные (p > 0,05); p < 0,001. Односторонней с Тьюки должность Специального теста ANOVA был использован для анализа нескольких сравнений. Планки погрешностей указывают среднее ± SEM. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4 . Optogenetic активации нейронов Taotie увеличивает количество пищи в зависимости от интенсивности. (A, B) Два вида установки для активации optogenetic. Питание камер были заложены боком на вспомогательную пластину и освещенные снизу массив оранжевый светодиоды. Лицевой стороне коробки освещения был удален, чтобы показать внутри светодиодов. Поведенческие эксперименты были внутри инкубатора при 25 ° C, относительной влажности 60%. (C) потребления продовольствия сытым мух генотипов указано при тестировании при optogenetic освещении или в темноте за 1 ч (n = 6). (D) питание при приеме внутрь, пресыщенный Taotie > CsChrimson мух коррелировалось с интенсивностью освещения (n = 6). н.с. указывает не значительные (p > 0,05); p < 0,001, односторонней с Тьюки должность Специального теста ANOVA был использован для анализа нескольких сравнений, студента t-тест на две группы сравнения. Планки погрешностей указывают среднее ± SEM. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Настоящий доклад сосредоточен на технический процесс маркировки краска кормления анализов потребления продовольствия в контексте thermogenetic и optogenetic активации манипулировать нейронов контроля питания. Это простой и надежный протокол поможет уточнить функции нейронов кандидата в кормлении контроля, измерения предпочтение пищи мух и для выявления новых игроков в питания цепей управления через питание-на основе генетических экраны24.

Краситель, маркировки стратегия является практически осуществимым в расследовании краткосрочных кормления поведения. Краска, динатрия erioglaucine, растворенного в и организм с пищей, является критическим показателем потребления пищи. Дешпанде et al. показали, что синий краситель, сам показал никакого влияния на кормление когда измеряется кафе пробирного и радиоизотопной маркировки продуктов питания потребление пробирного17. Аналогично наши результаты % (стимулирование мухи ноги раствором сахарозы краситель меченых или краситель бесплатно 100 мм) указал, что мух выставлены никакого существенного различия в их реакции к краситель меченых или краситель бесплатно питание. Однако есть еще нет четких данных о ли краситель вкуса у дрозофилы.

Кроме того критических шагов указывается в протоколе, уделять особое внимание Генеральной статус мух для проверки. Кроме быть выращены и поддерживается на плотность не переполнены, мухи следует подходить осторожно и избежать ненужных потрясений или напряжения, для того чтобы произвести согласованные результаты кормления.

Питание парадигмы, представленные здесь имеет определенные ограничения. Во-первых наши методы количественной оценки потребления продуктов питания в течение 60 мин. Для оценки приемов пищи в течение длительных периодов времени, таких как день, другой метод, например кафе, потребуются. Во-вторых по сравнению с методами количественной оценки с использованием радиоизотопов, колориметрический метод менее деликатным и трудным для устранения различий при низких объемов потребления продуктов питания. В-третьих с учетом того, что некоторые мух начнет выполнять 15 мин в кратчайшие сроки после начала кормления, этот протокол фактически меры в результате приема пищи и экскреции в население17. В-четвертых колориметрические количественная оценка потребления пищи, описанные здесь был летать группы, оценки употребления пищи одной мухи зависит от других кормления анализов, например радиоизотопные маркировки, СДЕЛАВ пробирного или FlyPAD. Тем не менее, определенные преимущества колориметрические количественной оценки потребления пищи, например, метод простой, стабильный, видимым и высокой пропускной способности, сделать его основным выбором для количественной оценки большого числа штаммов, особенно для кормления-на основе генетических экраны и последующих исследований.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют не конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Эта работа частично поддержали национальные базовые исследования программа Китая (2012CB825504), национальные естественные науки фонд Китая (91232720 и 9163210042), Китайской академии наук (CAS) (GJHZ201302 и QYZDY-Южный-SMC015), Билл и Мелинда Гейтс Фонд (OPP1119434) и 100-таланты программа CAS для Y. Чжу.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
UAS-CsChrimson Bloomintoon 55135
UAS-dTrpA1 Bloomintoon 26263
TDC1-GAL4  Bloomintoon 9312
TDC2-GAL4 Bloomintoon 9313
sNPF-GAL4 Provided by Z. Zhao
NPF-GAL4 Provided by Y. Rao
TH-GAL4 Provided by Y. Rao
5-HT-GAL4 Provided by Y. Rao
AKH-GAL4 Provided by Y. Rao
dip2-GAL4 Provided by Y. Rao
Taotie-GAL4 Provided by J. Carlson
Agarose Biowest G-10
Sucrose Sigma S7903
Erioglaucine disodium salt Sigma 861146
all-trans-retinal  Sigma  R2500 stored in darkness
Triton X-100 Amresco 9002-93-01
Fly food 1 L food contains: 77.7 g corn meal, 32.19 g yeast, 5 g agar, 0.726 g CaCl2, 31.62 g sucrose, 63.2 g glucose, 2 g potassium sorbate, pH   
 1x PBS buffer  1 L 1X PBS contains: 8 g Nacl, 0.2 g Kcl, 1.44 g Na2HPO4, 0.24 g KH2PO4, pH 7.4
PBST buffer 1X PBS with 1% Triton X-100
 Grinding mill Shang Hai Jing Xin Tissuelyser-24
Incubator Ning Bo Jiang Nan HWS-80
Magnetic stirrer with a heat plate Chang Zhou Bo Yuan CJJ 78-1
Spectrometer Thorlabs CCS200/M
Microplate Spectrophotometer Thermo Scientific  Multiskan GO Type: 1510, REF 51119200
Fluorescence stereo microscope  Leica  M205FA
Stereo microscope Leica  S6E
Outside container Jiang Su Hai Men glass vial with a diameter of 31.8 mm and a height of 80 mm (inside dimension)
Inside container  Beijing Yi Ran machinery factory plastic dish with a diameter of 13.6 mm and a height of 7.5 mm (inside dimension)
1.5 mL Eppendorf tubes Hai Men Ning Mong
 96 well plate Corning Incorporated  Costar 3599
LEDs Xin Xing Yuan Guangdian 607 nm, 3W  https://item.taobao.com/item.htm?id=20158878058

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gao, Q., Horvath, T. L. Neurobiology of feeding and energy expenditure. Annu Rev Neurosci. 30, 367-398 (2007).
  2. Bjordal, M., Arquier, N., Kniazeff, J., Pin, J. P., Leopold, P. Sensing of amino acids in a dopaminergic circuitry promotes rejection of an incomplete diet in Drosophila. Cell. 156, (3), 510-521 (2014).
  3. Edgecomb, R. S., Harth, C. E., Schneiderman, A. M. Regulation of feeding behavior in adult Drosophila melanogaster varies with feeding regime and nutritional state. J Exp Biol. 197, 215-235 (1994).
  4. Miyamoto, T., Slone, J., Song, X., Amrein, H. A fructose receptor functions as a nutrient sensor in the Drosophila brain. Cell. 151, (5), 1113-1125 (2012).
  5. Morton, G. J., Cummings, D. E., Baskin, D. G., Barsh, G. S., Schwartz, M. W. Central nervous system control of food intake and body weight. Nature. 443, (7109), 289-295 (2006).
  6. Pool, A. H., Scott, K. Feeding regulation in Drosophila. Curr Opin Neurobiol. 29, 57-63 (2014).
  7. Soderberg, J. A., Carlsson, M. A., Nassel, D. R. Insulin-Producing Cells in the Drosophila Brain also Express Satiety-Inducing Cholecystokinin-Like Peptide, Drosulfakinin. Front Endocrinol (Lausanne). 3, 109 (2012).
  8. Stafford, J. W., Lynd, K. M., Jung, A. Y., Gordon, M. D. Integration of taste and calorie sensing in Drosophila. J Neurosci. 32, (42), 14767-14774 (2012).
  9. Wu, Q., Zhang, Y., Xu, J., Shen, P. Regulation of hunger-driven behaviors by neural ribosomal S6 kinase in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, (37), 13289-13294 (2005).
  10. Itskov, P. M., et al. Automated monitoring and quantitative analysis of feeding behaviour in Drosophila. Nat Commun. 5, 4560 (2014).
  11. Mair, W., Piper, M. D., Partridge, L. Calories do not explain extension of life span by dietary restriction in Drosophila. PLoS Biol. 3, (7), e223 (2005).
  12. Diegelmann, S., et al. The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster. J Vis Exp. (121), (2017).
  13. Ja, W. W., et al. Prandiology of Drosophila and the CAFE assay. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, (20), 8253-8256 (2007).
  14. Shiraiwa, T., Carlson, J. R. Proboscis extension response (PER) assay in Drosophila. J Vis Exp. (3), e193 (2007).
  15. Qi, W., et al. A quantitative feeding assay in adult Drosophila reveals rapid modulation of food ingestion by its nutritional value. Mol Brain. 8, 87 (2015).
  16. Ja, W. W., et al. Water- and nutrient-dependent effects of dietary restriction on Drosophila lifespan. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (44), 18633-18637 (2009).
  17. Deshpande, S. A., et al. Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology. Nat Methods. 11, (5), 535-540 (2014).
  18. Deshpande, S. A., et al. Acidic Food pH Increases Palatability and Consumption and Extends Drosophila Lifespan. J Nutr. 145, (12), 2789-2796 (2015).
  19. Dus, M., Min, S., Keene, A. C., Lee, G. Y., Suh, G. S. Taste-independent detection of the caloric content of sugar in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, (28), 11644-11649 (2011).
  20. Shen, P., Cai, H. N. Drosophila neuropeptide F mediates integration of chemosensory stimulation and conditioning of the nervous system by food. J Neurobiol. 47, (1), 16-25 (2001).
  21. Yang, Z., et al. Octopamine mediates starvation-induced hyperactivity in adult Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, (16), 5219-5224 (2015).
  22. Ramdya, P., Schneider, J., Levine, J. D. The neurogenetics of group behavior in Drosophila melanogaster. J Exp Biol. 220, (Pt 1), 35-41 (2017).
  23. Sanchez-Alcaniz, J. A., Zappia, G., Marion-Poll, F., Benton, R. A mechanosensory receptor required for food texture detection in Drosophila. Nat Commun. 8, 14192 (2017).
  24. Zhan, Y. P., Liu, L., Zhu, Y. Taotie neurons regulate appetite in Drosophila. Nat Commun. 7, 13633 (2016).
  25. Yu, Y., et al. Regulation of starvation-induced hyperactivity by insulin and glucagon signaling in adult Drosophila. Elife. 5, (2016).
  26. Wood, J. G., et al. Sirtuin activators mimic caloric restriction and delay ageing in metazoans. Nature. 430, (7000), 686-689 (2004).
  27. Inagaki, H. K., et al. Visualizing Neuromodulation In Vivo: TANGO-Mapping of Dopamine Signaling Reveals Appetite Control of Sugar Sensing. Cell. 148, (3), 583-595 (2012).
  28. Wong, R., Piper, M. D., Wertheim, B., Partridge, L. Quantification of food intake in Drosophila. PLoS One. 4, (6), e6063 (2009).
  29. Sen, R., et al. Moonwalker Descending Neurons Mediate Visually Evoked Retreat in Drosophila. Curr Biol. 27, (5), 766-771 (2017).
  30. Ewing, L. S., Ewing, A. W. Courtship of Drosophila melanogaster in large observation chambers: the influence of female reproductive state. Behaviour. 101, (1), 243-252 (1987).
  31. Chatterjee, A., Tanoue, S., Houl, J. H., Hardin, P. E. Regulation of gustatory physiology and appetitive behavior by the Drosophila circadian clock. Curr Biol. 20, (4), 300-309 (2010).
  32. Xu, K., Zheng, X., Sehgal, A. Regulation of feeding and metabolism by neuronal and peripheral clocks in Drosophila. Cell Metab. 8, (4), 289-300 (2008).
  33. Hamada, F. N., et al. An internal thermal sensor controlling temperature preference in Drosophila. Nature. 454, (7201), 217-255 (2008).
  34. Viswanath, V., et al. Ion channels - Opposite thermosensor in fruitfly and mouse. Nature. 423, (6942), 822-823 (2003).
  35. Yu, Y., et al. Regulation of starvation-induced hyperactivity by insulin and glucagon signaling in adult Drosophila. Elife. 5, (2016).
  36. Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nat Methods. 11, (3), 338-346 (2014).
  37. Viswanath, V., et al. Opposite thermosensor in fruitfly and mouse. Nature. 423, (6942), 822-823 (2003).
  38. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted Gene-Expression as a Means of Altering Cell Fates and Generating Dominant Phenotypes. Development. 118, (2), 401-415 (1993).
  39. Lee, K. S., You, K. H., Choo, J. K., Han, Y. M., Yu, K. Drosophila short neuropeptide F regulates food intake and body size. J Biol Chem. 279, (49), 50781-50789 (2004).
  40. Marella, S., Mann, K., Scott, K. Dopaminergic Modulation of Sucrose Acceptance Behavior in Drosophila. Neuron. 73, (5), 941-950 (2012).
  41. Albin, S. D., et al. A Subset of Serotonergic Neurons Evokes Hunger in Adult Drosophila. Current Biology. 25, (18), 2435-2440 (2015).
  42. Ro, J., et al. Serotonin signaling mediates protein valuation and aging. eLife. 5, e16843 (2016).
Сочетая анализов количественных пищи и насильно активации нейронов для изучения аппетит у <em>дрозофилы</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jiang, L., Zhan, Y., Zhu, Y. Combining Quantitative Food-intake Assays and Forcibly Activating Neurons to Study Appetite in Drosophila. J. Vis. Exp. (134), e56900, doi:10.3791/56900 (2018).More

Jiang, L., Zhan, Y., Zhu, Y. Combining Quantitative Food-intake Assays and Forcibly Activating Neurons to Study Appetite in Drosophila. J. Vis. Exp. (134), e56900, doi:10.3791/56900 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter