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Biology

बैसिलस सबटिलिस के एकल-कक्ष Microfluidic विश्लेषण

Published: January 26, 2018 doi: 10.3791/56901
Automatic Translation
1, 2
1Department of Microbiology and Molecular Genetics, Oklahoma State University, 2Department of Molecular and Cellular Biology, Harvard University

Summary

हम एक उदाहरण के रूप में बैसिलस सबटिलिस का उपयोग कर व्यक्तिगत बैक्टीरियल कोशिका वंश के microfluidic विश्लेषण के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं । विधि सूक्ष्म नियंत्रणीय और समान विकास की स्थिति के तहत सेल पीढ़ियों के सैकड़ों के प्रेक्षण की अनुमति से माइक्रोबायोलॉजी में पारंपरिक विश्लेषणात्मक तरीकों की कमियों पर काबू ।

Abstract

Microfluidic प्रौद्योगिकी सूक्ष्म जीव विज्ञान में पारंपरिक विश्लेषणात्मक तरीकों के लिए सीमाओं के कई पर काबू पा । थोक संस्कृति के तरीकों के विपरीत, यह एकल सेल संकल्प और लंबे समय अवलोकन पीढ़ियों के सैकड़ों फैले बार प्रदान करता है; agarose पैड आधारित माइक्रोस्कोपी के विपरीत, यह एक समान विकास की स्थिति है कि कसकर नियंत्रित किया जा सकता है । क्योंकि विकास माध्यम के निरंतर प्रवाह को स्थानीय रासायनिक कोशिका वृद्धि और चयापचय की वजह से वातावरण में अप्रत्याशित बदलाव से एक microfluidic डिवाइस में कोशिकाओं को अलग, जीन अभिव्यक्ति में प्रामाणिक परिवर्तन और के जवाब में सेल विकास विशिष्ट उत्तेजनाओं और अधिक आत्मविश्वास से मनाया जा सकता है । बैसिलस सबटिलिस यहां एक मॉडल बैक्टीरियल प्रजातियों के रूप में प्रयोग किया जाता है एक "मां मशीन" सेलुलर विश्लेषण के लिए प्रकार विधि का प्रदर्शन । हम कैसे निर्माण और एक microfluidic उपकरण पाइपलाइन को दिखाने के लिए, यह कोशिकाओं के साथ लोड, सूक्ष्म इमेजिंग आरंभ, और एक वृद्धि माध्यम से दूसरे में स्विचन द्वारा एक उत्तेजना के लिए कोशिकाओं का पर्दाफाश । एक stress-उत्तरदाई रिपोर्टर इस विधि द्वारा प्राप्त किया जा सकता है जो डेटा का प्रकार प्रकट करने के लिए एक उदाहरण के रूप में उपयोग किया जाता है । हम भी संक्षेप में इस तरह के प्रयोगों के अंय प्रकार के लिए इस विधि के अनुप्रयोगों, जैसे बैक्टीरियल sporulation के विश्लेषण के रूप में चर्चा ।

Introduction

पृथ्वी पर जीवन का सबसे हड़ताली सुविधाओं में से एक अपने महान लचीलापन और विविधता है । आणविक जीवविज्ञान का एक केंद्रीय लक्ष्य तर्क है जिसके द्वारा कोशिकाओं को जीन और प्रोटीन का उपयोग करने के लिए पर्यावरण की स्थिति की एक विस्तृत विविधता के तहत उनके विकास और फिटनेस को अधिकतम समझ है । इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए, वैज्ञानिकों को विश्वास कैसे व्यक्तिगत कोशिकाओं के बढ़ने, विभाजन का पालन करने में सक्षम होना चाहिए, और शर्तों का एक दिया सेट के तहत अपने जीन एक्सप्रेस, टिप्पण कैसे कोशिकाओं को अपने वातावरण में बाद में परिवर्तन का जवाब । हालांकि, माइक्रोबायोलॉजी में पारंपरिक विश्लेषणात्मक तरीके तकनीकी सीमाएं हैं जो प्रश्नों के प्रकारों को प्रभावित करती हैं जिन्हें संबोधित किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, बल्क संस्कृति आधारित विश्लेषण वर्षों में बहुत उपयोगी है, फिर भी वे केवल जनसंख्या-स्तर के डेटा की पेशकश करते हैं जो सार्थक सेल-टू-सेल रूपांतरों या कुल जनसंख्या में कोशिकाओं की छोटी उप-आबादी के व्यवहार को मुखौटा कर सकते हैं. एकल सेल प्रकाश माइक्रोस्कोपी के आधार पर रहने वाले बैक्टीरिया का विश्लेषण एकल सेल व्यवहार प्रकट लेकिन यह भी तकनीकी रूप से सीमित कर रहे हैं । बैक्टीरिया आम तौर पर विकास के माध्यम से युक्त agarose पैड पर मैटीरियल हैं, लेकिन सेल विकास और विभाजन सूक्ष्म दृश्य भीड़ और उपलब्ध पोषक तत्वों के बस कुछ सेल चक्र के बाद घट जाती है, काफी प्रेक्षण समय1सीमित, 2. इसके अलावा, पोषक तत्वों के स्थानीय घट और चयापचय प्रतिफल के सहवर्ती buildup सेल विकास के कारण लगातार तरीके कि उपाय या भविष्यवाणी करने के लिए मुश्किल है में स्थानीय सेल विकास के माहौल बदल रहे हैं । agarose पैड का उपयोग कर इस तरह के पर्यावरण परिवर्तन स्थिर राज्य व्यवहार या विकास की स्थिति में विशिष्ट परिवर्तन के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाओं के अध्ययन के लिए एक चुनौती मुद्रा3.

Microfluidic प्रौद्योगिकी, जिसमें एक तरल माध्यम लगातार microfabricated उपकरणों के माध्यम से प्रवाहित है, क्लासिक प्रयोगात्मक सीमाओं के लिए एक समाधान प्रदान करता है । एक microfluidic डिवाइस लाइव सेल माइक्रोस्कोपी के लिए स्थिति में व्यक्तिगत कोशिकाओं को रख सकते हैं, जबकि विकास मध्यम के प्रवाह लगातार ताजा पोषक तत्वों के साथ कोशिकाओं को प्रदान करता है और दूर चयापचय शोधकार्य और अतिरिक्त कोशिकाओं को धो देता है, जिससे एक अत्यधिक समान वृद्धि का निर्माण पर्यावरण. निरंतर वृद्धि की स्थिति के तहत, सेल व्यवहार पर्यावरण कारकों के प्रभाव से अलगाव में देखा जा सकता है, कोशिकाओं के आंतरिक तर्क की एक बेरोक देखने की अनुमति । द्रव प्रवाह के रूप में कोशिकाओं के साथ भीड़ बनने से microfluidic डिवाइस रोकता है, दसियों या पीढ़ियों के सैकड़ों के लिए एकल कोशिका वंश का अवलोकन संभव हो जाता है4,5. इस तरह के लंबे समय अवलोकन बार अंयथा undetectable दीर्घकालिक या दुर्लभ सेल व्यवहार का पता लगाने की अनुमति । अंत में, माध्यम की संरचना है कि उपकरण के माध्यम से बहती है पर बदला जा सकता है, की अनुमति कोशिकाओं के रूप में मनाया जाएगा के रूप में वे एक तनाव की शुरुआत या एक विशेष यौगिक के हटाने या निकालने के लिए प्रतिक्रिया ।

Microfluidics पहले से ही कई महत्वपूर्ण आवेदनों का आनंद लिया है । उदाहरण के लिए, यह ऊतक में इस्तेमाल किया गया है, अंग-, या शरीर पर एक चिप उपकरणों, जिसमें कई मानव कोशिका प्रकार के सह रहे हैं-एक vivo हालत में अनुकरण करने के लिए प्रसंस्कृत6; microstructured वातावरण में निमेटोड आंदोलन के अध्ययन के लिए7; बैक्टीरियल फिल्म के बीच बातचीत की जांच करने के लिए (जैसे, 8); और encapsulation और कोशिकाओं या रसायनों के छोटे संस्करणों के हेरफेर के लिए (उदा, 9) । Microfluidic उपकरणों को भी सूक्ष्म जीव विज्ञान के क्षेत्र में तेजी से लोकप्रिय हो गए है (उत्कृष्ट समीक्षा के लिए, 10 और 11देखें), विशेष रूप से उनके शारीरिक और प्रवाह के गुणों को अच्छी तरह से प्राकृतिक माइक्रोबियल niches12से मिलान कर रहे हैं । उदाहरण के लिए, microfluidics हाल ही में ठीक सेल विकास और विभाजन13,14,15को मापने के रूप में ऐसे प्रयोजनों के लिए विज्ञानियों द्वारा नियोजित किया गया है, रोगज़नक़ आंदोलन16का विश्लेषण, निरीक्षण कोरम संवेदन17 और शारीरिक संक्रमण18, और प्रोटीन के लिए19गिनती, कई अंय उदाहरणों के बीच । विधि यहां प्रस्तुत विशेष रूप से एक जीवाणु कोशिका वंश के विश्लेषण के बजाय उपभेदों या प्रजातियों के संयोजन के लिए बनाया गया है । microfluidic डिवाइस यहां का प्रदर्शन किया "मां मशीन" डिजाइन4, जिसमें कोशिकाओं को एक microfluidic खाई के भीतर एक बंद अंत और एक खुले अंत के साथ एकल फ़ाइल बड़े हो रहे है की एक भिंनता का इस्तेमाल; कोशिका वृद्धि और विभाजन के तरल प्रवाह में संतति कोशिकाओं को खुले छोर से ऊपर और बाहर धकेलता है । हमारे विश्लेषण आमतौर पर केवल "मां" सेल कि खाई के बंद अंत में सीमित है पर ध्यान केंद्रित । हम पिछले प्रकाश माइक्रोस्कोपी पर एक उंनति के रूप में इस विधि पर विचार agarose पैड पर सेल स्थिरीकरण के रूप में एकल सेल विश्लेषणात्मक तकनीक, आधारित । जबकि बी सबटिलिस यहां एक मॉडल के रूप में प्रयोग किया जाता है, विधि भी अंय जीवाणु प्रजातियों के लिए लागू है (ई कोलाई एक और आम मॉडल है; विभिंन कोशिका आकार या morphologies के साथ कुछ प्रजातियों के नए उपकरणों के निर्माण की आवश्यकता हो सकती है विभिंन आयामों के साथ) । फ्लोरोसेंट पत्रकारों के उपयोग के लिए कोशिकाओं को चिह्नित करने के लिए और जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन कल्पना आनुवंशिक रूप से परितंत्रीय प्रजातियों के उपयोग की आवश्यकता है; हालांकि, सेल विकास और आकृति विज्ञान के विश्लेषण भी फ्लोरोसेंट मार्करों के बिना संभव हो रहे हैं ।

वर्तमान प्रोटोकॉल सिलिकॉन photolithography का उपयोग कर मास्टर, जो बड़े पैमाने पर किया गया है कहीं और5वर्णित के निर्माण की प्रक्रिया शामिल नहीं है; परास्नातक microfabrication सुविधाओं से भी आसानी से आउटसोर्स किया जा सकता है । यह एक प्रबलित सिलिकॉन मास्टर से एक PDMS डिवाइस की ढलाई भी शामिल है; कवर ग्लास का एक टुकड़ा करने के लिए डिवाइस संबंध; मध्यम स्विचन परमिट करने के लिए चुटकी वाल्व सहित microfluidic प्रवेश और आउटलेट नलसाजी, कोडांतरण; passivating डिवाइस, बैक्टीरियल कोशिकाओं की तैयारी, और बैक्टीरियल कोशिकाओं के साथ डिवाइस लोड हो रहा है; डिवाइस के लिए नलसाजी संलग्न और कोशिकाओं equilibrating; और इमेजिंग के लिए एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप पर डिवाइस लोड हो रहा है । क्योंकि कई अलग छवि अधिग्रहण और प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर उपकरण के लिए कल्पना और ब्याज के विभिंन डेटा का विश्लेषण किया जा सकता है4,5, उदाहरण छवियों को दिखाया जाता है, लेकिन छवि पर कब्जा तरीके इस प्रोटोकॉल में शामिल नहीं हैं ।

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Protocol

1. PDMS डिवाइस कास्टिंग

  1. एक धूल से मुक्त वातावरण में, मिश्रण PDMS बहुलक और इलाज एजेंट एक 10:1 अनुपात में और degas के लिए शूंय के तहत कम से कम 10 मिनट ।
  2. एक polystyrene पेट्री प्लेट में अटूट एल्यूमीनियम पंनी का एक टुकड़ा पर एक सिलिकॉन मास्टर (या एक epoxy या उसके प्रतिकृति टुकड़े) प्लेस । degassed PDMS मिश्रण गुरु पर लगभग 5 मिमी. Degas के लिए पेट्री प्लेट की गहराई करने के लिए कम से 10 मिनट के लिए डालो । सतह बुलबुले को तोड़ने के लिए हवा की एक कोमल धारा का प्रयोग करें ।
    नोट: उपयोग किए गए दो-tiered डिवाइस के आयाम के साथ CAD फ़ाइल में प्रदान किए जाते हैं5 (देखें अनुपूरक फ़ाइल 1) । एक प्लास्टिक प्रतिकृति मास्टर आंशिक रूप से degassing के दौरान फ्लोट कर सकते हैं; यदि ऐसा होता है, तो एक साफ़ प्लास्टिक applicator के साथ प्रतिकृति पुश करें ।
  3. एक ओवन में ६० डिग्री सेल्सियस और कमरे के तापमान को शांत करने के लिए कम से 1 एच के लिए PDMS इलाज । एल्यूमीनियम पंनी मास्टर युक्त निकालें और पेट्री प्लेट से PDMS ठीक हो । ध्यान से मास्टर के पीछे से एल्यूमीनियम पंनी छील, तो ध्यान से मास्टर से PDMS छील ।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, PDMS कमरे के तापमान पर रात भर ठीक हो सकता है । एक सिलिकॉन-वेफर मास्टर के सापेक्ष कमजोरी epoxy चिपकने का उपयोग करने के लिए स्थाई रूप से एक 1/16 इंच-वेफर के रूप में एक ही आकार के मोटी एल्यूमीनियम डिस्क के लिए वेफर बांड से दूर किया जा सकता है ।
  4. एक वेफर के रूप में आम तौर पर थोड़ा अलग आयामों के साथ कई microfluidic उपकरणों में शामिल हैं ( अनुपूरक फ़ाइल 1देखें), एक साफ, तेज स्केलपेल का उपयोग कर आकार के लिए एक ही डिवाइस में कटौती.
    नोट: नित्य B. सबटिलिस कार्य के लिए, १.०-µm-वाइड सेल खाइयों के साथ उपकरणों का उपयोग करें, जो एक सी या एफ के साथ सीएडी फ़ाइल में चिह्नित कर रहे हैं ।

2. डिवाइस छिद्रण और संबंध

  1. पैटर्न की सुविधाओं की दृश्यता को बढ़ाने के लिए डिवाइस के patterned पक्ष पर पारदर्शी कार्यालय टेप का एक टुकड़ा ( सामग्री की तालिकादेखें) रखें । प्रवेश और आउटलेट बंदरगाहों दिखाई द्रव चैनलों के विपरीत छोर पर परिपत्र क्षेत्रों के रूप में पहचाने जाते है (चित्र 1) । अपनी दृश्यता में सुधार जब प्रवेश और आउटलेट पिन के लिए डिवाइस में छेद छिद्रण, और एक ठीक इत्तला दे दी मार्कर का उपयोग कर डॉट्स के साथ दुकानों के निशान ।
    नोट: यह सुनिश्चित करने के लिए कि प्रवेश और आउटलेट पिन भीड़ नहीं कर रहे हैं, हर दूसरे चैनल छिद्रित है, बस डिवाइस के लिए वर्णमाला के उपनामित के नीचे चैनल के साथ शुरुआत.
  2. PDMS डिवाइस फ्लिप ताकि नमूनों पक्ष नीचे है, और एक ०.७५-mm बायोप्सी पंच का उपयोग कर चिह्नित डॉट्स के लिए डिवाइस के माध्यम से पंच; घूंसे छोड़ें ।
    नोट: डिवाइस पैटर्न के साथ छिद्रित कर रहे हैं, क्योंकि छेद बायोप्सी पंच द्वारा उत्पन्न आम तौर पर थोड़ा भड़के हुए पंच बहुलक में प्रवेश करती है । एक औंधा अभिविन्यास में डिवाइस छिद्रण सुनिश्चित करता है कि नमूनों की ओर छेद एक तेज सीमा है.
  3. एक stereomicroscope का प्रयोग, यह सुनिश्चित करें कि छिद्रित छेद प्रवेश और उपकरण के आउटलेट क्षेत्रों के साथ ओवरलैप । एक पतले इत्तला दे दी चिमटी का प्रयोग छिद्रित छेद से PDMS के किसी भी बाहरी टुकड़े को दूर करने के लिए ।
  4. डिवाइस के दोनों किनारों से धूल हटाने और एक साफ polystyrene पेट्री प्लेट में जगह के लिए चिपकने वाला टेप का प्रयोग करें । १००% isopropyl शराब के साथ गीला करके एक 22 मिमी x ४० मिमी कवर ग्लास तैयार करें और एक cleanroom पोंछे के साथ रगड़; धूल से मुक्त हवा या नाइट्रोजन की एक धारा के साथ सूखी ।
  5. एक ऑक्सीजन प्लाज्मा क्लीनर में साफ कवर गिलास के साथ एक साथ छिद्रित PDMS डिवाइस सुविधा पक्ष रखें.
    1. प्लाज्मा-निम्नलिखित सेटिंग्स के साथ डिवाइस का इलाज: वैक्यूम, ७० mTorr; हे२ दाब, २०० mTorr; कालावधी, 15 एस; बिजली, 30 डब्ल्यू प्लाज्मा उपचार अवधि खत्म होने के तुरंत बाद, डिवाइस को हटाने और प्लाज्मा क्लीनर से कवर गिलास ।
    2. PDMS पलटना और यह कवर कांच के केंद्र पर जगह है ताकि नमूनों पक्ष संपर्क गिलास; सुनिश्चित करें कि खिला चैनल (प्रवेश और आउटलेट क्षेत्रों के बीच चल रहा है) कवर कांच की लंबी धुरी के साथ गठबंधन कर रहे हैं । नीचे प्रेस बहुत धीरे से सुनिश्चित करें कि कांच के खिलाफ PDMS जवानों ।
  6. ६० डिग्री सेल्सियस से कम 1 घंटे के लिए एक ओवन में इकट्ठे डिवाइस सेंकना । बेकिंग के बाद, मैंयुअल रूप से सत्यापित करें कि PDMS डिवाइस के एक कोने पर धीरे से धक्का द्वारा कांच के लिए बंधुआ है ।
    नोट: एक बार डिवाइस बंधुआ है, यह 24 घंटे के भीतर इस्तेमाल किया जाना चाहिए, के रूप में बहुलक तेजी से hydrophobic प्लाज्मा उपचार के बाद बढ़ती समय के साथ हो जाएगा ।

३. Microfluidic नलसाजी तयारी

  1. बहुलक टयूबिंग की लंबाई कट (इनर व्यास (आईडी) ०.०२ इंच, बाहरी व्यास (आयुध डिपो) ०.०६ इंच) उचित लंबाई को सिरिंज पंप से स्विचन तंत्र तक पहुंचने के लिए (अगर इस्तेमाल किया) और डिवाइस जब माइक्रोस्कोप पर मुहिम शुरू की । के रूप में कई लंबाई के रूप में वहां microfluidic गलियों में कटौती कर रहे हैं ।
  2. चुटकी वाल्व के लिए Y जंक्शनों को इकट्ठा (यदि उपयोग) काटने और संलग्न 2-सेमी लंबाई लचीला सिलिकॉन टयूबिंग (०.०३ इंच आईडी, ०.०६५ इंच आयुध डिपो) "y" और 1-सिलिकॉन टयूबिंग के सेमी लंबाई के ऊपर नजला करने के लिए "वाई के नीचे कंटिया करने के लिए"
  3. कट 10-सेमी (या उपयुक्त) बहुलक टयूबिंग की लंबाई; उंहें एक छोर पर स्विच जंक्शन के लिए उंहें 1-मुख्यमंत्री सिलिकॉन टयूबिंग क्षेत्रों में डालने के लिए "वाई के नीचे कंटिया पर" से कनेक्ट उंहें दूसरे छोर पर 21G सुई कि उनके प्लास्टिक सिरिंज एडेप्टर से हटा दिया गया है और लगभग ९० डिग्री लगभग सुई अंत से 9 मिमी तुला से कनेक्ट करें ।
  4. ट्यूबिंग क्षेत्रों है कि सीरिंज से टयूबिंग में सुई डालने से स्विच तंत्र के लिए चलेंगे के एक छोर करने के लिए 21G कुंद सुई कनेक्ट । वाई जंक्शनों के प्रवेश नजला पर सिलिकॉन टयूबिंग क्षेत्रों में टयूबिंग की प्रत्येक लंबाई के अंय छोर डालें ।
    नोट: जगह में चुटकी वाल्व और जंक्शनों को पकड़ने के लिए उपकरण के कुछ प्रकार का उपयोग करें; यह आसानी से एक micropipette टिप बॉक्स (चित्रा 2d) से बनाया जा सकता है ।
  5. एक अपशिष्ट चोंच के लिए डिवाइस के आउटलेट से अपशिष्ट ले जाने के लिए बहुलक टयूबिंग की लंबाई में कटौती । ऊपर वर्णित के रूप में तैयार तुला 21G सुई के लिए एक छोर पर उन्हें कनेक्ट. एक बेकार चोंच में ट्यूबों के दूसरे छोर टेप ।
  6. ०.१ मिलीग्राम/एमएल गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA) युक्त मीडिया के उपयुक्त संस्करणों को तैयार करें और वांछित आकार और सीरिंज की संख्या भरें । सिरिंज पंप में प्रवेश टयूबिंग और लोड सीरिंज से जुड़ी तैयार 21G सुई के लिए BSA भरी हुई सीरिंज कनेक्ट.
    नोट: विशिष्ट प्रयोगों के लिए डिवाइस के 5 चैनलों का उपयोग किया जाता है, एक 20 मिलीलीटर सिरिंज के साथ प्रत्येक. एक प्रयोग जिसमें मध्यम स्विच है 5 सीरिंज प्रत्येक के 2 बैंकों की आवश्यकता होगी । यहां, पहले बैंक युक्त पंप चरण के रूप में कहा जाता है-1 पंप, और दूसरा बैंक युक्त पंप, पोस्ट के साथ स्विच माध्यम, चरण-2 पंप के रूप में जाना जाता है ।
  7. एक उच्च प्रवाह दर (> 500 µ l/मिनट) में सिरिंज पंप चलाकर प्रवेश नलसाजी से हवा पर्ज, सिरिंज पंप खड़ी है और सिरिंज दोहन करने के लिए शीर्ष करने के लिए हवा के बुलबुले लाने के द्वारा शुरुआत । एक बार हवा सीरिंज से मिटा दिया गया है, सिरिंज पंप जगह क्षैतिज और उत्तरोत्तर नल या बंद करने के लिए स्विच तंत्र के माध्यम से ऊपर सीरिंज से बहुलक लाइनों झटका और हवा के बुलबुले मिटाने के लिए । सिरिंज के दूसरे बैंक के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएँ (यदि मीडिया स्विचन).
  8. हवा के बुलबुले के बाद पर्ज कर रहे हैं, चरण-2 सिरिंज पंप सेट (यानी, माध्यम है कि दूसरा इस्तेमाल किया जाएगा, स्विच के बाद) १.५ µ एल मिनट के लिए, तो प्रवाह को थामने. दूसरे मध्यम चरण के लिए इसी वाई जंक्शनों की शाखा पर लचीला टयूबिंग के क्षेत्रों पर छोटे बांधने की मशीन क्लिप प्लेस । एक मामूली प्रवाह दर पर चरण-1 सिरिंज पंप चलाने के लिए जारी रखें (उदा., 10 µ l/न्यूनतम 30 मिनट के लिए Y जंक्शन के प्रवेश टयूबिंग बहाव से दूसरे माध्यम को मिटाने के लिए/

4. सेल कल्चर की तैयारी

  1. वांछित माध्यम में रुचि के तनाव की एक संस्कृति रातोंरात बढ़ती, स्थिर चरण के लिए । जीवाणु तनाव एक उत्परिवर्तन है कि कोशिकाओं को प्रदान करता है unmobile, ताकि कोशिकाओं को डिवाइस के चैनलों के बाहर तैरना नहीं है शामिल होना चाहिए ।
    नोट: इस प्रोटोकॉल में, जीवाणु तनाव B. सबटिलिस ३६१० एक डायनA233V प्रतिस्थापन युक्त है (इस उत्परिवर्तन का कारण बनता है flagellum सीधे होने के बजाय पेचदार, रोकने के सेल गतिशीलता), एक पीrsbV-mNeonGreen सेल तनाव के लिए रिपोर्टर, और एक गठन पीhyperspank-mNeptune (लाल) रिपोर्टर कोशिकाओं को उजागर करने के लिए । पौंड लेनोक्स माध्यम उदाहरण प्रोटोकॉल में प्रयोग किया जाता है । microfluidics प्रयोगों के लिए विशिष्ट उपभेदों एक या एक से अधिक फ्लोरोसेंट transcriptional पत्रकारों और एक constitutively का उत्पादन, cytoplasmic फ्लोरोसेंट प्रोटीन कोशिकाओं के स्वचालित पता लगाने की सुविधा के लिए होते हैं । पौंड लेनोक्स रिच मीडियम का इस्तेमाल किया गया था जब वृद्धि दोष नहीं देखा गया था, लेकिन microfluidic शर्तों के तहत कम से सबटिलिस विकास को बाधित किया जा सकता है क्योंकि स्रावित siderophores दूर मध्यम प्रवाह से धोया जाता है. ऐसी परिस्थितियों में, विकास के माध्यम से सोडियम साइट्रेट और घाट क्लोराइड के अलावा द्वारा बहाल किया जा सकता है, के रूप में S7५० मध्यम11के लिए सूचना दी ।
  2. प्रयोग की सुबह, एक चकित २५०-मिलीलीटर वृद्धि मध्यम के 25 मिलीलीटर युक्त कुप्पी में बी सबटिलिस कोशिकाओं 1:50 पतला । 1 से अधिक की एक ऑप्टिकल घनत्व के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति मिलाते में 5-6 ज के लिए कोशिकाओं को विकसित करना ।
    नोट: एक घने कोशिका संस्कृति बेहतर है क्योंकि स्थिर-चरण B. सबटिलिस कोशिकाओं छोटे होते है और कम अक्सर सेल श्रृंखला में पाया, उपकरण लदान की सुविधा । विभिंन जीवाणु प्रजातियों इष्टतम लदान के लिए अंय मध्यम या विकास की स्थिति की आवश्यकता हो सकती है ।
  3. एक 5-µm ताकना आकार फिल्टर, एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में सेल संस्कृति के लगभग 15 मिलीलीटर फिल्टर के साथ लगे एक सिरिंज का उपयोग कर सबटिलिस सेल श्रृंखला को दूर करने के लिए (यह ई. कोलाई के लिए अनावश्यक है और अंय प्रजातियों के साथ आवश्यक नहीं हो सकता है) ।
    नोट: अपेक्षाकृत कुछ कोशिकाओं को हटाया जाना चाहिए; निस् पंकिल होना चाहिए ।
  4. कमरे के तापमान पर ४,००० x g पर 10 मिनट के लिए फ़िल्टर संस्कृति केंद्रापसारक । बंद डालो supernatant और अवशिष्ट supernatant ट्यूब में शेष द्रव में सेल गोली reसस्पेंड, लगभग ५०० µ एल ताजा माध्यम की अगर सेल निलंबन pipetting की सुविधा के लिए आवश्यक जोड़ने ।

5. डिवाइस लोड हो रहा है

  1. धीरे खाली पतली जेल-लोडिंग micropipette युक्तियाँ ( सामग्री की तालिकादेखें) microfluidic डिवाइस के आउटलेट छेद में जगह है ।
  2. एक P200 micropipette के साथ पतली जेल-लोडिंग सुझावों का उपयोग करना, प्रवेश छेद में 1 मिलीग्राम/एमएल BSA युक्त माध्यम इंजेक्शन द्वारा डिवाइस passivate, आउटलेट छेद में सुझावों को देख microfluidic चैनलों (चित्रा 2a) के भरने की निगरानी । लगभग 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर डिवाइस मशीन ।
    नोट: BSA आमतौर पर एक अवरुद्ध या passivation एजेंट है कि PDMS बहुलक की hydrophobic सतह के लिए बाध्य करेगा के रूप में प्रयोग किया जाता है, इसके hydrophilicity में वृद्धि और अंय प्रोटीन या कोशिकाओं के (कोशिका सतह अणुओं के द्वारा) के बंधन को कम करने ।
  3. पतली जेल-लोड हो रहा है सुझावों का उपयोग करना, (अनुभाग 4 से) reसस्पैंड कोशिकाओं के साथ प्रत्येक चैनल लोड, उपकरण के माध्यम से कोशिकाओं की प्रगति की निगरानी करने के लिए आउटलेट चैनल में सुझावों का उपयोग कर (चित्रा 2 बी).
    नोट: लोड हो रहा है P200 micropipette अपनी अधिकतम २००-µ l मात्रा करने के लिए सेट कर रहा है और फिर एक छोटी मात्रा aspirating (लगभग आधे पिपेट टिप की पतली धारा की मात्रा) की कोशिकाओं से पहले हवा का एक तकिया aspirating की स्थापना की सुविधा है । reसस्पैंड कोशिकाओं की मात्रा सटीक नहीं की जरूरत है, के रूप में PDMS डिवाइस की मात्रा micropipette की है कि छोटे रिश्तेदार है । हम reसस्पैंड कोशिकाओं के घनत्व के लिए कोई ऊपरी सीमा का पता है, जब तक सेल निलंबन डिवाइस में pipetted जा सकता है । सेल के झुरमुट डिवाइस को रोकना कर सकते है और पूरी तरह से pipetting और/
  4. धीरे से जेल लोड युक्तियां आउटलेट छेद से निकालें, एक समय में एक काम करने के लिए डिवाइस को नुकसान को रोकने के ।
  5. डिवाइस को एक उपयुक्त रोटर एडेप्टर में एक बेंच-टॉप microcentrifuge में लगभग ६,००० x g पर 10 मिनट (चित्र 2c) के लिए केंद्रापसारक ।
    नोट: किसी microcentrifuge रोटर (चित्र 2c) में फ़िट करने के लिए डिज़ाइन किया गया था जो एक कस्टम-मशीन्ड एल्यूमिनियम रोटर एडेप्टर का उपयोग हुआ; अलग केंद्रापसारक मॉडल उपयुक्त रोटर एडेप्टर के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है । अनुकूलक की महत्वपूर्ण विशेषता यह है कि यह कोशिका खाइयों के बंद सिरों की दिशा में पार्श्व बल प्रदान करता है, जिससे कोशिकाएँ साइड चैनलों में मजबूर होती हैं.
  6. माइक्रोस्कोप (चित्रा 3) के तहत सफल लोडिंग की पुष्टि करें) लेकिन स्लाइड धारक को डिवाइस चिपका के बिना/
    नोट: इस प्रोटोकॉल में, एक 60X, १.४ NA Ph3 तेल-विसर्जन उद्देश्य दोनों सत्यापन के लिए इस स्तर पर और बाद में इमेजिंग के लिए प्रयोग किया जाता है ।

6. डिवाइस असेंबली, Equilibration, और बढ़ते

  1. ध्यान से एक मंच डालने पर लोड डिवाइस माउंट टेप PDMS के दोनों ओर से मंच डालने के नीचे करने के लिए कवर ग्लास (यानी, पलटने से पहले मंच डालने के उपकरण संलग्न). मंच डालने-डिवाइस विधानसभा पलटना इतना है कि PDMS ऊपर का सामना करना पड़ रहा है और एक नरम सतह पर जगह है, जैसे एक धूल से मुक्त पोंछ (चित्रा 2d).
  2. चरण-1 सिरिंज पम्प की प्रवाह दर को समायोजित करने के लिए ३५ µ l/एक समय में एक लेन के साथ कार्य करना, प्रवेश सुई डालने और फिर आउटलेट सुई (यानी, अपशिष्ट चोंच के लिए चल रहाहै; चित्रा 2E).
  3. साफ धूल से मुक्त पोंछ के साथ किसी भी अतिरिक्त माध्यम मिटा और नेत्रहीन लीक के लिए डिवाइस का निरीक्षण । अतिरिक्त कोशिकाओं की उपस्थिति के लिए आउटलेट टयूबिंग की जांच करें (आमतौर पर एक पंकिल धारी के रूप में प्रदर्शित) और मध्यम meniscus, जो धीरे बेकार चोंच की ओर कदम होगा ।
  4. लगभग 15-30 मिनट के लिए ३५ µ l/मिनट पर चलाने के लिए डिवाइस की अनुमति दें, जब तक सभी कनेक्टेड गलियों अपशिष्ट चोंच में draining हैं ।
  5. १.५ µ l/मिनट के लिए चरण-1 सिरिंज पंप सेट और प्रवाह को थामने । माइक्रोस्कोप करने के लिए पूरे पंप और डिवाइस तंत्र लाओ (इस प्रक्रिया को एक रोलिंग गाड़ी पर यह सब रखकर सहायता प्राप्त है) और चरण-1 मध्यम प्रवाह को पुनः आरंभ १.५ µ l/ध्यान से एक औंधा प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप पर डिवाइस के साथ मंच डालने माउंट, का उपयोग प्रवेश और आउटलेट टयूबिंग मार्ग के लिए आवश्यक के रूप में टेप ।
  6. इमेजिंग के लिए डिवाइस पर वांछित पदों का पता लगाने और इमेजिंग के रूप में वांछित शुरू करते हैं । ध्यान दें कि कोशिकाओं को आम तौर पर कुछ घंटे (लगभग 10 पीढ़ियों) की आवश्यकता के लिए स्थिर स्थिति घातीय चरण वृद्धि तक पहुंचने के लिए, और छवि अधिग्रहण की शुरुआत के रूप में वांछित इतना है कि इमेजिंग equilibration अवधि के बाद शुरू होता है देरी हो सकती है ।
    नोट: घातीय चरण में आयोजित कोशिकाओं के स्थिर राज्य वृद्धि सेल डिवीजन टाइंस ट्रैकिंग द्वारा अनुवर्ती छवि विश्लेषण के दौरान सत्यापित किया जाना चाहिए और यह सुनिश्चित करना है कि वे एक निरंतर ंयूनतम मूल्य तक पहुंच चुके हैं ।

7. मध्यम स्विचन

  1. इमेजिंग के क्रमिक दौर के बीच, चरण के प्रवाह को थामने-1 सिरिंज पंप. ध्यान से चरण-2 सिलिकॉन टयूबिंग से बांधने की मशीन क्लिप क्लिप, वाई जंक्शन के चरण-1 शाखा पर सिलिकॉन टयूबिंग के लिए प्रत्येक चलती । संयुक्त राष्ट्र के चरण-2 सिरिंज पंप के प्रवाह को थामने (जो ३.८ चरण में १.५ µ l/मिनट के लिए सेट किया गया था) और इमेजिंग जारी.
    नोट: पर १.५ µm/एक 10-सेमी की लंबाई के साथ बहुलक टयूबिंग बहाव Y जंक्शनों की, दूसरे चरण के माध्यम लगभग ५० मिनट में डिवाइस तक पहुंचता है । डिवाइस के लिए समय empirically मीडिया है कि फ्लोरोसेंट अनुरेखक कणों को रोकने का उपयोग कर परीक्षण किया जा सकता है ।

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Representative Results

सफल प्रारंभिक सेल लोड हो रहा है, के रूप में चरण के विपरीत माइक्रोस्कोपी द्वारा मूल्यांकन के रूप में डिवाइस के लिए microfluidic नलसाजी संलग्न से पहले, सभी या लगभग microfluidic पक्ष चैनलों के सभी होने के रूप में विचार किया जाएगा एक या एक से अधिक बैक्टीरिया की कोशिकाओं युक्त ( चित्र 3ए) । इष्टतम लोड हो रहा है प्रत्येक चैनल में कई कोशिकाओं को दिखाने के लिए, लेकिन चैनल फिर भी equilibration अवधि के दौरान सेल वृद्धि के कारण कोशिकाओं के साथ भरना होगा (चित्र बी) । गरीब लदान के साथ लेन, जिसमें अपेक्षाकृत कुछ (< 50%) साइड चैनल कोशिकाओं के साथ लोड कर रहे हैं, इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन परिणामस्वरूप डेटा घनत्व कम सेल वंश प्रत्येक इमेजिंग स्थिति में imaged जा रहा है के कारण कम हो जाएगा ।

एक बार डिवाइस शुरू में भरी हुई है, यह microfluidic नलसाजी संलग्न द्वारा equilibrated है और ३५ µ एल के एक अपेक्षाकृत उच्च प्रवाह दर पर उपकरण के माध्यम से मध्यम बह/ equilibration कदम डिवाइस से खिला चैनल में हवा के बुलबुले और अतिरिक्त कोशिकाओं को दूर करने के लिए कार्य करता है, और बढ़ शुरू करने के लिए पक्ष चैनलों में कोशिकाओं को प्रोत्साहित करने के लिए. कोशिकाओं है कि मध्यम प्रवाह पर डिवाइस से हटा रहे है अक्सर एक हल्के रंग का अपशिष्ट कंटेनर की ओर आउटलेट टयूबिंग के माध्यम से चलती बैंड के रूप में नग्न आंखों से मनाया जा सकता है; इस तरह के बैंड के आंदोलन एक दृश्य सूचक है कि द्रव पाइपलाइन और उपकरण के माध्यम से सामांय रूप से बह रही है के रूप में कार्य करता है । एक equilibrated डिवाइस के सूक्ष्म निरीक्षण पक्ष चैनलों के अधिकांश में एक फ़ाइल में सीमित कुछ कोशिकाओं को प्रकट करना चाहिए (चित्र 3 बी, 0 मिनट).

एक बार एक equilibrated डिवाइस ३७ डिग्री सेल्सियस पर १.५ µ l/मिनट में प्रवाह के तहत माइक्रोस्कोप पर रखा जाता है, कोशिकाओं लगभग 2 घंटे (चित्र 3 बी) के पाठ्यक्रम पर वर्दी और निरंतर घातीय चरण विकास फिर से शुरू होगा. लगातार घातीय वृद्धि सीधे छवि विश्लेषण के बाद कोशिकाओं की पीढ़ी के समय में एक पठार की उपस्थिति से सत्यापित किया जाना चाहिए । इस बिंदु पर, कक्ष प्रतिदीप्ति और/या brightfield इमेजिंग के लिए इच्छित के रूप में के लिए तैयार हैं । एक सफलतापूर्वक भरी हुई है और equilibrated डिवाइस आमतौर पर मज़बूती से कम 24 घंटे (चित्र 4a, सी) की अवधि के लिए imaged किया जा सकता है । एक मध्यम स्विच का परिचय (चित्र 4a-सी) प्रयोग की सीमा है कि आयोजित किया जा सकता है फैलता है, लेकिन यह भी भयावह कोशिका मौत की घटनाओं (चित्रा 4d) की आवृत्ति बढ़ जाती है, शायद हवा की शुरूआत के माध्यम से बुलबुले कि टयूबिंग से सफलतापूर्वक पर्ज नहीं थे । एक और घटना है कि भयावह कोशिका मृत्यु का कारण हो सकता है कि प्रवेश पर स्थित कोशिकाओं के समूहों और उखाड़ फेंकना हो सकता है खिला चैनल के माध्यम से पारित, के रूप में चित्रा 4dमें दिखाया गया है । हम वर्तमान में नहीं समझ क्यों इस उपकरण में भयावह कोशिका मृत्यु का कारण बनता है, और हम अभी तक एक विधि से ऐसी घटनाओं को रोकने के लिए तैयार नहीं है उत्पंन ।

Figure 1
चित्र 1: microfluidic डिवाइस की योजनाबद्ध. एक उपकरण योजनाबद्ध लगभग पैमाने पर दिखाया गया है । वर्णमाला के लिए कुंद-समाप्त सुइयों कनेक्ट करने के लिए छिद्रित कर रहे हैं कि प्रवेश और आउटलेट क्षेत्रों के साथ लेबल है. सामांयतया, आधे प्रतिमान वाले चैनल का उपयोग किया जाता है (छायांकित धूसर) । कक्ष खाइयों के लिए नामित की ओर उंमुख हैं । साथ सीएडी फ़ाइल ( अनुपूरक फ़ाइल 1देखें) डिवाइस पर सभी सुविधाओं को दर्शाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2: Microfluidic डिवाइस passivation, सेल लोड कर रहा है, और equilibration. (क) BSA-युक्त माध्यम से passivation के बाद एक बंधुआ उपकरण. जेल-लोडिंग युक्तियां आउटलेट छेद में रखा जाता है उपकरण के माध्यम से मध्यम और कोशिकाओं के पारित होने की निगरानी । जेल के पतले हिस्से में मीडियम meniscus-लोडिंग टिप्स (arrow) दिख रहा है । (B) सेल लोडिंग के बाद डिवाइस । कोशिकाएं जेल में एक पारदर्शी सफेद परत के रूप में दिखाई दे रहे है युक्तियां (तीर) लोड हो रहा है । (ग) जेल-लोडिंग युक्तियां एक कस्टम गढ़े केंद्रापसारक अनुकूलक में केंद्रापसारक से पहले हटा रहे हैं । मेडिकल टेप (नीला) एल्यूमीनियम भागों पर रखा गया है डिवाइस तकिया । (D) लोड करने के बाद, डिवाइस को एक माइक्रोस्कोप स्टेज डालने के लिए टेप किया जाता है और प्रवेश और आउटलेट पिन से जुड़ा होता है । दिखाया छवि में, मध्यम स्विचन चुटकी वाल्व और वाई connectors कि एक micropipette टिप बॉक्स से बने उपकरण में व्यवस्थित कर रहे है द्वारा संभव बनाया है । (ई) एक पूरे इकट्ठे उपकरण के योजनाबद्ध दृश्य, सिरिंज पंप से अपशिष्ट कंटेनर के लिए । आउटलेट टयूबिंग एक छोटे से अपशिष्ट चोंच को चलाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: सेल लोड हो रहा है और microfluidic डिवाइस में वृद्धि. (a) बाएं से दाएं, चरण-कंट्रास्ट माइक्रोग्राफ केवल सेल लोडिंग से पहले मध्यम से युक्त एक डिवाइस के बाद, कोशिकाओं के बाद pipetting के माध्यम से जोड़ा गया है, लेकिन केंद्रापसारक से पहले एक ही डिवाइस, और केंद्रापसारक लदान के बाद एक ही डिवाइस । (ख) कक्ष अनुकूलन और डिवाइस में वृद्धि का समय पाठ्यक्रम (LB, ३७ ° c, प्रवाह १.५ µ l/ अनुकूलन की शुरुआत में, स्थिर चरण कक्ष अपेक्षाकृत कम और संकीर्ण हैं । के रूप में कोशिकाओं के अनुकूल है और घातीय चरण वृद्धि (६०-१२० मिनट) के लिए वापस, वे एक लंबा और व्यापक आकृति विज्ञान अपनाने । १२० मिनट के बाद, डिवाइस में सभी कोशिकाओं वर्दी घातीय चरण विकास शुरू कर रहे हैं, और डिवाइस इमेजिंग के लिए तैयार है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4: microfluidic डिवाइस में कक्ष वृद्धि और मध्यम स्विचिंग । (क) Kymographs से पहले विकास के ५५० मिनट दिखा रहा है और एक मध्यम स्विच के बाद विकास के १,००० मिनट (ग्रे डैश्ड लाइन) एक तनाव के रूप में 2% इथेनॉल में । 10-ंयूनतम अंतराल पर छवियां कैप्चर की गईं । शीर्ष पैनल एक तनाव प्रेरित जीन के लिए एक transcriptional mNeonGreen रिपोर्टर (ग्रीन चैनल) से पता चलता है । नीचे पैनल एक गठित mNeptune रिपोर्टर (लाल चैनल) है कि स्वचालित सेल विभाजन के लिए इस मामले में प्रयोग किया जाता है दिखाता है । (B) पैनल A में डैश्ड बॉक्स में kymographs के भागों का क्लोज़-अप दृश्य, मध्यम स्विच के बाद हरे चैनल में परिवर्तनीय प्रतिक्रिया दिखा रहा है । ध्यान दें कि विकास स्विच के माध्यम से जारी है, हालांकि इथेनॉल की उपस्थिति के कारण कोशिकाओं को कम हो जाते है और एक थोड़ा धीमी गति से हो जाना । समय स्केल क्षैतिज पट्टी द्वारा दिखाया जाता है, और अनुलंब पट्टी द्वारा दूरी दिखाई जाती है । (ग) पैनल ए में दिखाए गए प्रयोग से एक एकल कोशिका वंश के विश्लेषण प्रतिदीप्ति डेटा का उदाहरण निशान । अनुलंब डैश्ड रेखाएं मध्यम स्विच को एक चाले के रूप में 2% इथेनॉल में इंगित करती हैं । (D) किसी विफल मध्यम स्विच का उदाहरण । जब दूसरा माध्यम कक्षों तक पहुँचता है, तो चैनलों में कोशिकाएँ लीजड जाती हैं. स्विच मुख्य चैनल में द्वारा पारित कि कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या के साथ है, एक चमकदार फ्लोरोसेंट संकेत के कारण (एक फिर से स्केल धोया-बाहर क्षेत्र के लिए इसी छवि यह ऊपर दिखाया गया है) । स्विच के बाद, कोई आगे कोशिकाओं को मनाया जाता है, हालांकि dimly फ्लोरोसेंट कोशिका मलबे चैनलों में रहता है । समय स्केल क्षैतिज पट्टी द्वारा दिखाया जाता है, और अनुलंब पट्टी द्वारा दूरी दिखाई जाती है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

इस microfluidics प्रोटोकॉल में लचीला है कि कई कदम के लिए एक विशेष प्रजातियों या तनाव या एक विशिष्ट प्रयोजन के लिए इसके उपयोग का अनुकूलन संशोधित किया जा सकता है । दरअसल, इस प्रोटोकॉल में हम मूल "मां मशीन" अवधारणा में संशोधन किया है4 के लिए बी सबटिलिसके साथ इसके उपयोग का अनुकूलन । अक्सर, खाइयों जिसमें कोशिकाओं को सीमित कर रहे है एक एकल परत सुविधा का गठन, जबकि इस प्रोटोकॉल में हम दो परत सेल खाइयों का उपयोग करें, एक उथले कोशिकाओं के आसपास के चैनल के साथ । दो परत डिजाइन एक तरह से पोषक तत्वों के प्रवाह को अधिकतम करने के लिए और सबटिलिस कोशिकाओं से चयापचयों के रूप में शुरू किया गया था, विशेष रूप से लंबे समय में (> 75 µm) खाइयों5; हालांकि, एकल परत सुविधाओं अक्सर इष्टतम सेल विकास के लिए पर्याप्त है और सामांयतः ई. कोलाईके लिए इस्तेमाल किया जाता है, खासकर जब वे कम कर रहे है (~ 25 µm)4। हम आम तौर पर अब खाइयों का उपयोग करें, क्योंकि वे आवृत्ति जो बी सबटिलिस सेल चेन, जो stochastically उठता के साथ कम, मुख्य खिला चैनल5में मध्यम प्रवाह के द्वारा उनकी खाइयों से बाहर निकाला जाता है ।

इसके अलावा संशोधनों, जैसे विभिन्न सुविधा आयामों (जैसे, चैनल चौड़ाई) या विशेषताओं के साथ उपकरणों के उपयोग के रूप में (उदा., आकृति, खुले सिरों की संख्या) उपयुक्त के रूप में प्रतिस्थापित किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, सेल खाइयों कि दोनों सिरों पर खुले है का उपयोग करें (बजाय केवल एक छोर पर, वर्तमान प्रोटोकॉल के रूप में) अंय अध्ययनों में इस्तेमाल किया गया है1,20,21। खाइयों कि दोनों सिरों पर खुले है सेल उंर बढ़ने से बचने क्योंकि वे लगातार नवजात कोशिकाओं से भरा जा रहा है (के रूप में मां मशीनों, जहां सबसे पुराना सेल ट्रैक और नए कोशिकाओं चैनल से बाहर धकेल दिया जाता है के खिलाफ), हालांकि तथ्य यह है कि पुराने कोशिकाओं को धक्का दिया है बाहर दोनों समाप्त होता है आमतौर पर 10 से कम पीढ़ियों1,21के लिए अपने प्रेक्षणीय खिड़की सीमा । हम आम तौर पर लंबे समय तक प्रेक्षणीय खिड़कियां (पीढ़ियों के सैकड़ों) एक मां मशीन है, जो यह भी स्मृति प्रक्रियाओं के लिए जो इंतज़ार कर रहे समय दसियों या पीढ़ियों के सैकड़ों लंबे होते है मापने के लिए संभव बनाने की पेशकश की लंबी5। हम भी मां मशीन डिजाइन का इस्तेमाल किया है कोशिकाओं है कि तेजी से नहीं बढ़ रहे हैं, के रूप में sporulation22के हमारे विश्लेषण में निरीक्षण । ऐसे मामलों में, वृद्धि खाइयों भर अतिरिक्त कोशिकाओं सार्थक22विश्लेषण किया जा सकता है ।

प्रोटोकॉल में कदम के कई अपेक्षाकृत है कि वे काफी प्रोटोकॉल परिणाम को प्रभावित किए बिना संशोधित किया जा सकता है में क्षमा कर रहे हैं । उदाहरण के लिए, 10 मीटर KOH और फिर शुद्ध पानी में अनुक्रमिक 10-ंयूनतम स्नान sonication चरणों द्वारा कवर ग्लास सफाई के लिए बुलाया प्रोटोकॉल के एक पुराने संस्करण है, लेकिन हमने पाया है कि अच्छा डिवाइस संबंध और ऑपरेशन सरल isopropanol का उपयोग कर प्राप्त किया गया था आधारित यहां सफाई का कदम बताया । यदि एक बांडिंग मुद्दा उठा कि कवर कांच की सफाई पर संदेह कास्ट, एक और अधिक कड़े सफाई प्रोटोकॉल के लिए वापस जाने की सिफारिश की है । इसी तरह, जब तक हम एक केंद्रापसारक कदम कक्ष खाइयों में सेल लदान को अधिकतम करने के लिए उपयोग करते हैं, काफी पूरा लदान भी इस कदम के बिना प्राप्त किया जा सकता है, बशर्ते कि बहुत केंद्रित कोशिकाओं लदान कदम के लिए उपयोग किया जाता है । इस वैकल्पिक रणनीति विशेष रूप से शोधकर्ताओं के लिए उपयोगी हो सकता है जो एक आसानी से उपलब्ध केंद्रापसारक अनुकूलक डिवाइस स्पिन नहीं है । फिर, passivating/चिकनाई एजेंट (इस प्रोटोकॉल में BSA) के विभिंन सांद्रता इस्तेमाल किया जा सकता है; हम नियमित रूप से सांद्रता का उपयोग उच्च रूप में 1 मिलीग्राम/एमएल । मामलों में जहां एक तनाव BSA के प्रति संवेदनशील हो सकता है, स्वीकार्य परिणाम भी एक passivating एजेंट के अभाव में प्राप्त किया जा सकता है । दरअसल, जब हम एक microfluidic डिवाइस का उपयोग कर रहे थे sporulation, जो कोशिका भुखमरी की आवश्यकता की जांच करने के लिए, हम चिंतित थे कि BSA कोशिकाओं के लिए एक संभावित पोषक तत्व स्रोत के रूप में कार्य हो सकता है, और इसलिए हम इसे किसी भी पर्याप्त देख बिना मध्यम प्रवाह से लोप प्रतिकूल प्रभाव22.

विशेष रूप से, डिवाइस के माध्यम से मध्यम के निरंतर प्रवाह में एक बंद प्रणाली, एक कुप्पी के रूप में सेल के विकास के साथ तुलना में थोड़ा अलग phenotypes में लाना कर सकते हैं । उदाहरण के लिए, पोषक तत्व या यौगिक कमी चुनौतीपूर्ण हो सकता है, के रूप में कोशिकाओं को अक्सर मध्यम प्रवाह से ट्रेस यौगिकों सफाई कर सकते हैं. दरअसल, हमने देखा है कि भुखमरी के माध्यम से उत्प्रेरण सेल sporulation एक कुप्पी में से एक microfluidic डिवाइस में एक लंबा समय की आवश्यकता है । इसी प्रकार, हमने देखा है कि ऊर्जा तनाव के प्रेरण oxidative फास्फारिलीकरण युग्मक carbonyl साइनाइड एम-chlorophenyl hydrazone (CCCP) का उपयोग करने की आवश्यकता है microfluidic डिवाइस में कई गुना उच्च सांद्रता कुप्पी संस्कृति में रिपोर्ट की तुलना में 23. इसलिए, कुछ अनुकूलन विभिंन मध्यम additives के साथ संतोषजनक परिणाम प्राप्त करने के लिए आवश्यक हो सकता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस परियोजना GM018568 के तहत स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा वित्त पोषित किया गया । इस प्रोटोकॉल भाग में नेनो सिस्टम (सीएनएस), राष्ट्रीय नैनो समंवित बुनियादी सुविधा नेटवर्क (NNCI) है, जो NSF पुरस्कार no १५४१९५९ के तहत राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन द्वारा समर्थित है के एक सदस्य के लिए केंद्र में किया गया था । सीएनएस हार्वर्ड यूनिवर्सिटी का हिस्सा है । बहुत धंयवाद थॉमस नॉर्मन और नातान यहोवा के कारण में उनके काम के लिए कर रहे है और निर्माण मास्टर यहां दिखाया उपकरणों के लिए इस्तेमाल किया टेंपलेट और उपकरण के मूल संस्करण बनाने में । हम भी अपने बहुमूल्य सहयोगी सलाह के लिए जोहन Paulsson धंयवाद और उनकी सलाह के लिए अपनी प्रयोगशाला के सदस्यों को धंयवाद और बैक्टीरियल microfluidic उपकरणों के लिए जारी सुधार ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning (240)4019862 This is referred to as PDMS in the protocol. There are 2 components that are mixed at a 10:1 ratio
0.75-mm biopsy punch World Precision Instruments 504529
22 x 40 mm No. 1.5 cover glass VWR 48393 172
Plasma Etch PE-50 Plasma Etch Inc. PE-50 Instrument used to bond PDMS to glass using oxygen plasma treatment
Tygon flexible tubing ID 0.02", OD 0.06" Saint-Gobain PPL Corp. AAD04103 For the main part of the tubing, e.g. attached to the needles
Silicone Tubing, 0.04" ID, 0.085" OD HelixMark Standard Silicone Tubing 60-795-05 For pinch valves and Y-junction connection
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A7906-100G Used as passivation agent
ART Gel Pipet Tips (P200) Molecular BioProducts 2155 For loading the device with medium and cells
Acrodisc 32-mm syringe filter with 5-μm Supor membrane Pall Life Sciences 4560 For filtering cultures before device loading
21-ga blunt needles, 1" McMaster-Carr 75165A681
Y connector with 200-series barbs, 1/16" ID tubing, polypropylene Nordson Medical Y210-6005 The company is AKA Value Plastics
Eclipse Ti-E inverted microscope Nikon This unit has been discontinued by the manufacturer and is replaced by the Ti 2 E.
LB Lennox Sigma-Aldrich L3022
Microfuge 18 Beckman Coulter 367160
Bacillus subtilis strain NCIB3610 Bacillus Genetic Stock Center 3A1 wild-type parental strain modified for use in the experiments shown in this protocol
Gravity convection oven VWR 414005-106 for curing PDMS and baking assembled devices
Scotch-Weld Epoxy Kit 3M 2216 B/A may be used to bond a silicon wafer to an aluminum backing plate
Scotch Magic tape, 3/4" width 3M to clean dust from PDMS devices and to place over features to increase visibility (denoted "office tape" or "adhesive tape" in protocol)
Stereomicroscope Nikon SMZ800N listed here as an example; nearly any stereomicroscope will do
Isopropyl alcohol Sigma-Aldrich W292907 To clean cover glass
Syring pump, 6 channel New Era Pump Systems Inc. NE-1600
Kimwipes Kimberly-Clark 34120 a brand of dust-free wipes

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References

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Cabeen, M. T., Losick, R. Single-cell Microfluidic Analysis of Bacillus subtilis. J. Vis. Exp. (131), e56901, doi:10.3791/56901 (2018).

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