Summary
Presenteren we een methode voor de analyse van de microfluidic van afzonderlijke bacteriële cel lineages met behulp van Bacillus subtilis als voorbeeld. De methode overwint tekortkomingen van de traditionele analysemethoden in microbiologie doordat observatie van honderden cel generaties strak controleerbaar en uniforme groei omstandigheden.
Abstract
Microfluidic technologie overwint veel van de beperkingen van traditionele analysemethoden in de microbiologie. In tegenstelling tot bulk-kweekmethoden biedt het eencellige resolutie en lange observatie tijden verspreid over honderden generaties; in tegenstelling tot agarose pad gebaseerde microscopie heeft het uniforme groei-omstandigheden die streng gecontroleerd kunnen worden. Omdat de continue stroom van groeimedium isoleert de cellen in een microfluidic-apparaat uit onvoorspelbare variaties in de lokale chemische omgeving veroorzaakt door celgroei en metabolisme, authentieke wijzigingen in genexpressie en celgroei in reactie op specifieke stimuli kunnen meer zelfverzekerd worden waargenomen. Bacillus subtilis wordt gebruikt als een model bacteriesoorten om aan te tonen van een "moeder machine"-methode voor de analyse van de cellulaire typt. We laten zien hoe construeren en plumb een microfluidic apparaat, laad het met cellen leiden microscopische beeldvorming en cellen op een prikkel bloot door het overschakelen van ene groeimedium naar de andere. Een stress-responsieve verslaggever wordt gebruikt als een voorbeeld te onthullen van het type gegevens die door deze methode kunnen worden verkregen. We bespreken ook kort verdere toepassingen van deze methode voor andere soorten experimenten, zoals analyse van bacteriële sporevorming.
Introduction
Een van de meest opvallende kenmerken van het leven op aarde is haar grote veerkracht en verscheidenheid. Een centrale doelstelling van de moleculaire biologie is te begrijpen van de logica die cellen genen en eiwitten gebruiken om te maximaliseren hun groei en fitness onder een breed scala van milieuomstandigheden. Om dit te bereiken, moeten de wetenschappers kunnen gerust vaststellen hoe afzonderlijke cellen groeien, verdelen en hun genen onder een bepaalde reeks voorwaarden express, merkt hoe de cellen reageren op wijzigingen in hun omgeving. Traditionele analysemethoden in microbiologie echter technische beperkingen die invloed hebben op de soorten vragen die kunnen worden aangepakt. Bijvoorbeeld, bulk cultuur gebaseerde analyses door de jaren heen zeer nuttig zijn geweest, maar zij bieden alleen populatieniveau gegevens die zinvolle cel-naar-cel variaties of het gedrag van de kleinere subpopulatie van cellen in de totale bevolking kunnen maskeren. Eencellige analyses van levende bacteriën op basis van de lichte microscopie van eencellige gedrag onthullen, maar zijn ook technisch beperkt. Bacteriën zijn meestal geïmmobiliseerd op agarose pads met groeimedium, maar cel groei en deling drukte de microscopische weergave en put de beschikbare voedingsstoffen na slechts een paar cel cycli, aanzienlijk beperken de observatie tijd1, 2. Bovendien, de lokale uitputting van voedingsstoffen en de daarmee gepaard gaande opbouw van metabole bijproducten als gevolg van de celgroei voortdurend veranderen de plaatselijke cel groei omgeving op een manier die moeilijk te meten of te voorspellen. Dergelijke veranderingen in het milieu met behulp van agarose pads is een uitdaging voor studies van stationaire gedrag of van cellulaire reacties op specifieke wijzigingen in groei voorwaarden3.
Microfluidic-technologie, waarin een opgietvloeistof voortdurend via microfabricated apparaten stroomde is, biedt een oplossing voor klassieke experimentele beperkingen. Een microfluidic apparaat kunt afzonderlijke cellen in positie voor live-cel microscopie houden, terwijl de stroom van groeimedium voortdurend cellen met verse voedingsstoffen biedt en metabole bijproducten en overtollige cellen, waardoor een zeer uniforme groei wegspoelt milieu. Onder constante groei omstandigheden, kunnen de cel gedrag los van de invloed van milieufactoren, waardoor een onbelemmerde weergave van de interne logica van cellen worden waargenomen. Naarmate de vloeistofstromen voorkomt dat het apparaat microfluidic steeds vol met cellen, wordt observatie van eencellige lineages voor tientallen of honderden generaties mogelijk4,5. Zulke momenten van lange observatie toestaan de detectie van anders niet aantoonbaar op lange termijn of zeldzame cel gedrag. Ten slotte, de samenstelling van het medium dat stroomt door het apparaat kunnen worden gewijzigd op zal, waardoor cellen worden waargenomen als ze aan het begin van een stress of aan de invoering of verwijdering van een bepaalde stof reageren.
Microfluidics heeft al genoten van een aantal belangrijke toepassingen. Bijvoorbeeld, is het gebruikt in weefsel-, orgel- of lichaam-on-a-chip apparaten, waarbij meerdere soorten van de menselijke cellen mede gekweekte zijn te simuleren een in vivo voorwaarde6; voor de studie van nematode beweging in microstructured omgevingen7; te onderzoeken van interacties tussen bacteriële biofilms (b.v., 8); en voor de inkapseling en manipulatie van kleine hoeveelheden cellen of chemische stoffen (bijvoorbeeld, 9). Microfluidic apparaten zijn ook steeds populairder geworden op het gebied van de microbiologie (voor uitstekende recensies, Zie 10 en 11), vooral als hun fysieke en flow-eigenschappen zijn goed afgestemd op natuurlijke microbiële niches12. Bijvoorbeeld, heeft microfluidics onlangs gewerkt door microbiologen voor dergelijke doeleinden als het nauwkeurig meten van cel groei en afdeling13,14,15, analyseren pathogen verkeer16, monitoring quorum sensing17 en18van de fysiologische overgangen, en tellen voor eiwit19, onder vele andere voorbeelden. De methode die hier gepresenteerd is speciaal ontworpen voor de analyse van bacteriële eencellige lineages in plaats van combinaties van stammen of soorten. Het microfluidic apparaat hier gedemonstreerd maakt gebruik van een variant van de "moeder machine" design4, waarin de cellen één bestand worden gekweekt in een greppel van microfluidic met een gesloten uiteinde en een open einde; celgroei en deling duwt nakomelingen cellen en buiten het open uiteinde in de vloeistofstromen. Onze analyses meestal richten alleen op de "moeder"-cel die is beperkt aan het gesloten einde van de gracht. Wij beschouwen deze methode als een vooruitgang over vorige lichte microscopie gebaseerde eencellige analytische technieken, zoals de cel immobilisatie op agarose pads. Terwijl B. subtilis wordt gebruikt als een model, de methode is ook toepasbaar op andere bacteriesoorten (Escherichia coli is een ander gemeenschappelijk model; voor sommige soorten met verschillende cel maten of morphologies kan nodig de fabricage van nieuwe apparaten met verschillende afmetingen). Het gebruik van fluorescerend verslaggevers om te markeren van cellen en wijzigingen in genexpressie zichtbaar maken vereist het gebruik van genetisch hanteerbare vissoorten; analyses van celgroei en morfologie zijn echter mogelijk zelfs zonder fluorescente markeringen.
Dit protocol omvat niet het proces van het fabriceren van de meester van de silicon gebruikend fotolithografie, die uitgebreid beschreven elders is5; meesters kunnen ook gemakkelijk uitbestede van microfabrication faciliteiten. Het omvat de plinten van een apparaat PDMS van een versterkte silicon meester; verlijmen van het apparaat een stuk cover glas; het monteren van de microfluidic inlaat en uitlaat sanitair, kleppen inclusief snuifje zodat middellange schakelen; passiveren van het apparaat, het voorbereiden van bacteriële cellen, en het laden van de apparaat met bacteriële cellen; het sanitair aan het apparaat koppelen en zo de cellen; en het apparaat op een fluorescentie Microscoop voor afbeeldingen laden. Omdat vele verschillende Beeldacquisitie en verwerking software's kunnen worden gebruikt om te visualiseren en analyseren verschillende gegevens van belang4,5, voorbeeldafbeeldingen worden weergegeven, maar Fotolader methoden niet in dit protocol opgenomen worden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. PDMS apparaat gieten
- In een stofvrije omgeving, meng PDMS polymeer en genezen agent op een 10:1-verhouding en ontgas onder drukvermindering voor minstens 10 min.
- Plaats een silicium-model (of een epoxy of polyurethaan replica daarvan) op een stuk van ongebroken aluminiumfolie in een polystyreen plaat Petri. Giet het mengsel PDMS ontgaste de meester tot een diepte van ongeveer 5 mm. Degas de Petri-plaat voor ten minste 10 min. gebruik een zachte stroom van lucht te breken van de oppervlakte belletjes.
Opmerking: De afmetingen van het twee-voudige apparaat gebruikt vindt u in de bijbehorende CAD file5 (Zie aanvullende bestand 1). Een plastic replica meester kan gedeeltelijk zweven tijdens ontgassing; Als dit gebeurt, duw de replica met een schone kunststof applicator. - PDMS genezen voor ten minste 1 uur in een oven op 60 ° C en afkoelen tot kamertemperatuur. Verwijder de aluminiumfolie met de master en gerookte PDMS van de Petri-plaat. Zorgvuldig afschilferen van de aluminiumfolie vanaf de achterkant van de meester, en vervolgens zorgvuldig schil de PDMS van de meester.
Opmerking: U kunt ook PDMS kan worden genezen 's nachts bij kamertemperatuur. De relatieve kwetsbaarheid van een silicium-wafer-model kan worden overwonnen met behulp van epoxy lijm obligatie permanent het zegel op een 1/16-inch-dikke aluminium schijf van dezelfde grootte als de wafer. - Als een zegel bevat meestal verschillende microfluidic apparaten met verschillende afmetingen (Zie aanvullende bestand 1), snijd een enkel apparaat op maat met behulp van een schone, scherpe scalpel.
Opmerking: Gebruik voor routine werk van B. subtilis , apparaten met 1.0 µm-bestrijkende cel loopgraven, die zijn gemarkeerd met een C of F in de bijbehorende CAD-bestand.
2. inrichting voor het ponsen en lijmen
- Plaats een stukje doorzichtig office tape (Zie Tabel van materialen) over de patroon zijkant van het apparaat om de zichtbaarheid van de patroon functies. De inlaat en uitlaat poorten worden geïdentificeerd als cirkelvormige gebieden op tegenovergestelde uiteinden van de zichtbare fluidic kanalen (Figuur 1). Om hun zichtbaarheid verbeteren wanneer ponsen gaten in het apparaat voor de inlaat en uitlaat pinnen, markeren de inhammen en verkooppunten met stippen met behulp van een schone-tipped markering.
Opmerking: Om ervoor te zorgen dat de inlaat en uitlaat pinnen niet overvol, elke andere kanaal is geperforeerd, beginnend met het kanaal net onder de alfabetische aanduiding voor het apparaat. - Flip het PDMS apparaat zodat de zijde van de patroon is, en het apparaat aan de gemarkeerde punten met behulp van een punch 0,75 mm biopsie; geperforeerd Gooi de punchings weg.
Opmerking: De apparaten zijn gestanst met de patroon zijde naar beneden omdat het gat dat is gegenereerd door de biopsie punch is meestal iets laaide waar de punch betreedt het polymeer. Het apparaat in een omgekeerde richting ponsen zorgt ervoor dat het gat aan de patroon kant een scherpe rand heeft. - Met een stereomicroscoop, ervoor zorgen dat de geponste gaten met de gebieden van het inlaat en uitlaat van het apparaat overlappen. Gebruik een boete-tipped pincet te verwijderen elke vreemde fragmenten van PDMS van de geponste gaten.
- Gebruik plakband om stof te verwijderen van beide zijden van het apparaat en de plaats in een schone polystyreen plaat Petri. Bereiden van een 22 mm x 40 mm cover glas door bevochtigen met 100% isopropylalcohol en wrijven met een doekje cleanroom; droog met een stroom van stofvrije lucht of stikstof.
- Plaats de geponste PDMS apparaat functie zijde omhoog samen met de schoongemaakte glazen cover in een zuurstof-plasma reiniger.
- Plasma-traktatie het apparaat met de volgende instellingen: vacuüm, 70 mTorr; O2 druk, 200 mTorr; duur, 15 s; macht, 30 W. onmiddellijk nadat de behandelingsperiode plasma heeft voltooid, verwijder het apparaat en de cover glas uit het plasma.
- Omkeren van het PDMS en plaats deze op het midden van het glas cover zodat de patroon kant contact op met het glas; Zorg ervoor dat de voeding kanalen (uitgevoerd tussen de inlaat en uitlaat gebieden) zijn afgestemd op de lengteas van het cover-glas. Druk naar beneden heel voorzichtig om ervoor te zorgen dat de PDMS zeehonden tegen het glas.
- Bak het gemonteerde apparaat in een oven gedurende ten minste 1 uur bij 60 ° C. Na het bakken, moet u handmatig controleren of dat het PDMS is gebonden aan het glas door zachtjes te duwen op een hoek van het apparaat.
Opmerking: Zodra het apparaat is verbonden, het moet worden gebruikt binnen de 24u, het polymeer zal naarmate steeds meer hydrofobe met toenemende tijd na plasma behandeling.
3. Microfluidic sanitair voorbereiding
- Gesneden lengtes van polymeer buizen (binnendiameter (ID) 0,02 inch, buitendiameter (OD) 0.06 inch) naar de juiste lengte te bereiken vanaf de spuitpomp op de switch apparatuur (indien gebruikt) en het apparaat wanneer gemonteerd op de Microscoop. Snij zoveel lengtes als er microfluidic rijstroken.
- Y kruispunten voor snuifje kleppen monteren (als u) door uitsnijden en bijvoegen van 2 cm lengtes van flexibel siliconen slangen (0.03 inch ID, 0.065 inch OD) naar de hoogste weerhaken van de 'J' en 1-cm lengtes van silicone buis aan de onderkant Berber van de 'Y'.
- Knip 10-cm (of passende) lengtes van polymer buis; Sluit ze aan de ene kant naar de kruising van de schakelaar door het invoegen van hen in de 1-cm silicone slangen segmenten aan de onderkant Berber van de 'Y'. Sluit ze aan het andere einde 21G naalden die zijn verwijderd uit hun kunststof spuit adapters en gebogen ongeveer 90 ° ongeveer 9 mm vanaf het einde van de naald.
- 21G botte naalden verbinden met één uiteinde van de buis-segmenten die door het invoegen van de naalden in de buis van de spuiten naar het apparaat schakelaar loopt. De andere uiteinden van elke lengte van de buis in de silicone slangen segmenten aan de weerhaken van de inlaat van de Y-kruispunten invoegen.
Opmerking: Gebruik een soort apparaat te houden van de snuifje kleppen en kruispunten in plaats; Dit kan gemakkelijk worden gemaakt uit een micropipet tip doos (figuur 2D). - Gesneden lengtes van polymeer slang te voeren afvalstoffen uit de uitlaat van het apparaat naar een bekerglas van afval. Sluit ze aan het ene uiteinde aan gebogen 21G naalden bereid zoals hierboven beschreven. Tape van het andere uiteinde van de buizen in een bekerglas van afval.
- Voorbereiding van de passende hoeveelheid media met 0,1 mg/mL bovien serumalbumine (BSA) en vul de gewenste grootte en het aantal spuiten. De BSA-geladen spuiten verbinden met de bereid 21G naalden gekoppeld aan de inlaat van de buis en belasting spuiten in injectiespuit pompen.
Opmerking: voor typische experimenten 5 kanalen van het apparaat worden gebruikt, elk met een 20-mL spuit. Een experiment waarin het medium wordt overgeschakeld vergt 2 banken van elk 5 spuiten. Hier, de pomp met de eerste bank wordt aangeduid als de fase-1 pomp en de pomp met de tweede bank, met de post schakelaar medium, wordt aangeduid als de fase-2-pomp. - Zuiveren van lucht van de inlaat sanitair door het uitvoeren van de injectiespuit pompen aan een hoog stroomtarief (> 500 µL/min), begin door de injectiespuit pompen verticaal oriënteren en tik op de spuiten om luchtbellen naar de top. Zodra de lucht heeft zijn verwijderd uit de spuiten, plaats de spuitpomp horizontaal en geleidelijk tik of de lijnen van het polymeer van het spuiten van doorbladeren met het apparaat schakelaar te verjagen en verwijderen van luchtbellen. Herhaal dit proces voor de tweede bank van spuiten (als overschakelt media).
- Nadat de luchtbellen zijn verwijderd, stelt de fase-2-spuitpomp (dat wil zeggen, met het medium dat gebruikt zal worden tweede, na de schakeloptie) naar 1,5 µL/min, dan onderbreken de stroom. Kleine bindmiddel clips op de segmenten van de flexibele slang op de tak van de Y-kruispunten overeenkomt met de tweede fase van de middelgrote plaatsen. Blijven lopen de fase-1-spuitpomp op een bescheiden debiet (bijv, 10 µL/min) voor minstens 30 min voor het zuiveren van het tweede medium van de inlaat buizen stroomafwaarts van de Y-kruising.
4. cel cultuur voorbereiding
- 'S nachts, een preculture van de stam van belang in het gewenste medium aan de stationaire fase groeien. De bacteriële stam moet bevatten een mutatie die de cellen onbeweeglijk, maakt zodat de cellen niet uit de kanalen van het apparaat zwemmen doen.
Opmerking: In dit protocol, de bacteriële stam is B. subtilis 3610 een hagA233V vervangen (deze mutatie veroorzaakt het flagellum worden rechtstreeks in plaats van de beweeglijkheid van de spiraalvormige, voorkomen mobiele), met een P-rsbV- mNeonGreen verslaggever voor cel stress, en een constitutief Phyperspank- mNeptune (rood) verslaggever cellen markeren. LB Lennox voedingsbodem wordt gebruikt in het voorbeeld-protocol. Typische stammen voor microfluidics experimenten bevatten een of meer fluorescerende transcriptionele verslaggevers en een constitutively geproduceerd, cytoplasmatische fluorescent proteïne om geautomatiseerde detectie van cellen. Groei gebreken niet zijn nageleefd wanneer LB Lennox rijk medium werd gebruikt, maar B. subtilis groei in minimale media onder microfluidic omstandigheden kan worden geremd omdat uitgescheiden siderophores zijn weggewassen door de volumestroom medium. Onder dergelijke omstandigheden kan groei worden hersteld door de toevoeging van Natriumcitraat en ferrichloride aan het medium, zoals gemeld voor S750 middellange11. - De ochtend van het experiment, Verdun de B. subtilis cellen 1:50 in een verbijsterd maatkolf van 250 mL met 25 mL groeimedium. Groeien de cellen gedurende 5-6 uur in cultuur schudden bij 37 ° C tot een optische dichtheid van meer dan 1.
Opmerking: Een dichte celcultuur is beter omdat de stationaire fase B. subtilis zijn kleiner en minder vaak gevonden in cel cellen kettingen, vergemakkelijking van apparaat laden. Verschillende bacteriesoorten wellicht andere medium of groei omstandigheden voor optimale laden. - Met behulp van een injectiespuit voorzien van een 5-µm poriegrootte filter, filtreer ongeveer 15 mL celcultuur in een buis 15 mL conische verwijderen van B. subtilis cel ketens (het is niet nodig voor E. coli en wellicht niet nodig met andere soorten).
Opmerking: Relatief weinig cellen moeten worden weggenomen; het filtraat moet troebel. - Centrifugeer de gefilterde cultuur gedurende 10 minuten bij 4000 x g bij kamertemperatuur. Giet af het supernatant en resuspendeer de pellet van de cel in de resterende bovenstaande vloeistof in de buis, ongeveer 500 µL van verse medium toe te voegen als nodig is om de celsuspensie pipetteren blijft.
5. apparaat laden
- Voorzichtig plaats leeg dunne gel-laden micropipet (Zie Tabel van materialen) tips in de gaten van de uitgang van het apparaat microfluidic.
- Met behulp van dunne gel-laden tips met een P200-micropipet, passivate het apparaat door het injecteren van medium met 1 mg/mL BSA in de inlaat gaten, observeren de tips in de outlet gaatjes vullen van de microfluidic kanalen (figuur 2A) controleren. Incubeer het apparaat bij kamertemperatuur gedurende ongeveer 5 minuten.
Opmerking: BSA wordt vaak gebruikt als een blokkeren of passivering agent die wordt gebonden aan de hydrofobe oppervlak van het PDMS polymeer, verhoging van de hydrophilicity en het verminderen van de afhankelijkheid van andere proteïnen of cellen (via de cel-oppervlakte molecules). - Met behulp van dunne gel-laden tips, belasting elk kanaal met de geresuspendeerde cellen (van sectie 4), met behulp van de tips in het outlet-kanaal om de voortgang van de cellen via het apparaat (figuur 2B).
Opmerking: Laden wordt vergemakkelijkt door de P200-micropipet op het maximale 200-µL volume en vervolgens een kussen van lucht aspirating vóór het aspirating een kleine hoeveelheid (ongeveer een halve het volume van de dunne sectie van het uiteinde van de pipet) cellen. Het volume van de geresuspendeerde cellen hoeft niet te worden nauwkeurig, aangezien het volume van het PDMS apparaat klein is ten opzichte van dat van de micropipet. Wij kennen geen bovengrens aan de dichtheid van de geresuspendeerde cellen, zolang de celsuspensie kan worden pipetted in het apparaat. Cel bosjes het apparaat kunnen verstoppen en moeten worden vermeden door grondige pipetteren en/of vortex mengen. - De gel-laden tips uit de afvoer gaten, werken één filter tegelijk ter voorkoming van schade aan het apparaat voorzichtig te verwijderen.
- Centrifugeer het apparaat in een bench-top microcentrifuge in een passende rotor adapter bij ongeveer 6.000 x g gedurende 10 minuten (figuur 2C).
Opmerking: Een aangepaste-gefreesd aluminium rotor-adapter die is ontworpen om te passen in een microcentrifuge rotor (figuur 2C) werd gebruikt; verschillende centrifuge modellen kunnen worden gebruikt met passende rotor adapters. De belangrijke functie van de adapter is dat het laterale kracht in de richting van de gesloten uiteinden van de loopgraven van de cel, waardoor cellen gedwongen in de zijde-kanalen. - Verifiëren van de succesvolle laden onder de Microscoop (Figuur 3) maar zonder het aanbrengen van het apparaat naar de dia houder/fase invoegen.
Opmerking: In dit protocol, een 60 X 1.4 Ph3 nb olie-immersie doelstelling wordt gebruikt voor zowel verificatie in dit stadium en voor latere imaging.
6. apparaat vergadering, evenwichtsinstelling en montage
- Mount zorgvuldig het geladen apparaat op een etappe invoegen door taping van de cover glas aan beide zijden van het PDMS naar de onderkant van de etappe invoegen (d.w.z., het omkeren van de etappe invoegen voordat u het apparaat). Omkeren van de vergadering van de etappe invoegen-apparaat, zodat het PDMS boven ligt en plaats op een zachte ondergrond, zoals een stofvrije veeg (figuur 2D).
- Aanpassen van het debiet van de spuitpomp van de fase-1 om 35 µL/min. werken met één rijstrook tegelijk, invoegen de inlaat naald, waarna de naald van de uitlaat (dat wil zeggen, waarop wordt uitgevoerd naar het afval bekerglas; Figuur 2E).
- Veeg weg elk overtollige medium met een doekje schoon stofvrije en Inspecteer visueel of het apparaat op lekkage. Onderzoeken van de uitlaat slang voor de verschijning van overtollige cellen (meestal verschijnt als een troebel streep) en de middellange meniscus, die gaan langzaam richting het afval bekerglas.
- Het apparaat draaien op 35 µL/min gedurende ongeveer 15-30 minuten, totdat alle aangesloten rijstroken zijn drainage in het bekerglas van afval laten maken.
- De fase-1-spuitpomp ingesteld op 1,5 µL/min en de stroom te onderbreken. De hele pomp en apparaat apparaten brengen naar de Microscoop (dit proces wordt geholpen door het plaatsen van het allemaal op een glooiende kar) en herstarten van de fase-1 volumestroom medium op 1,5 µL/min. mount zorgvuldig de etappe invoegen met het apparaat op een omgekeerde fluorescentie Microscoop, met behulp van tape als dit nodig is voor het routeren van de inlaat en uitlaat buizen.
- Ga naar de gewenste positie op het apparaat voor imaging en beginnen beeldvorming zoals gewenst. Merk op dat cellen meestal een paar uur (ongeveer 10 generaties vereisen) te bereiken van de stationaire fase-exponentiële groei, en het begin van Beeldacquisitie vertraging als oplopen kan gewenst zodat imaging na de periode van evenwichtsinstelling begint.
Opmerking: De steady-state groei van cellen gehouden in exponentiële fase moet worden geverifieerd tijdens latere beeldanalyse door celdeling tijden bijhouden en ervoor te zorgen dat ze een constante minimale waarde hebben bereikt.
7. middelgrote schakelen
- Tussen de opeenvolgende rondes voor imaging, onderbreken de stroom van de fase-1-spuitpomp. Zorgvuldig unclip het bindmiddel clips van de fase-2-silicone slangen, bewegende elk aan de silicone slang op de fase-1 tak van de Y-kruising. VN-pauze de stroom van de fase-2-spuitpomp (dat was ingesteld op 1,5 µL/min in stap 3.8) en blijven imaging.
Opmerking: op 1,5 µm/min met een 10-cm lengte van het polymeer buizen stroomafwaarts van de Y-kruispunten, het medium van de tweede fase bereikt het apparaat in ongeveer 50 min. De tijd om het apparaat kan empirisch worden getest met behulp van de media die fluorescerende tracer deeltjes bevatten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Succesvolle eerste cel laden, zoals beoordeeld door fase contrast microscopie voordat u het microfluidic sanitair aan het apparaat koppelt zou worden beschouwd aangezien alle of bijna alle van de microfluidic kant kanalen met een of meer bacteriële cellen ( Figuur 3A). Optimale laden meerdere cellen in elk kanaal zou weergeven, maar kanalen zal toch vullen met cellen als gevolg van de celgroei tijdens de periode van evenwichtsinstelling (figuur 3B). Rijstroken met slechte laden, waarin relatief weinig (< 50%) kant kanalen worden geladen met cellen, kunnen worden gebruikt, maar de resulterende Gegevensdensiteit zullen lager zijn als gevolg van minder cel lineages image wordt gemaakt op elk imaging positie.
Zodra het apparaat in eerste instantie geladen is, is het geëquilibreerd door het microfluidic sanitair vast te hechten en stromend medium door het apparaat op een relatief hoog stroomtarief van 35 µL/min. De evenwichtsinstelling stap serveert luchtbellen en overtollige cellen in de voeding kanaal uit het apparaat verwijderen en ter bevordering van de cellen in de kanalen van de kant om te beginnen groeien. De cellen die worden verwijderd uit het apparaat op de volumestroom medium kunnen vaak met het blote oog worden waargenomen als een licht gekleurde band bewegen door de uitlaat slang naar de afval container; het verkeer van bands fungeert als een visuele indicator die vloeistof is stroomt normaal door middel van het sanitair en het apparaat. Microscopische inspectie van een equilibrated apparaat moet een paar cellen opgesloten in één bestand in de meeste van de kant kanalen (figuur 3B, 0 min) blijkt.
Zodra een equilibrated apparaat wordt geplaatst op de Microscoop onder stroom op 1,5 µL/min bij 37 ° C, hervat de cellen uniform en constant exponentiële-fase groei in de loop van ongeveer 2 h (figuur 3B). Voortdurende exponentiële groei moet direct na beeldanalyse worden geverifieerd door de verschijning van een plateau in de tijd voor het genereren van de cellen. De cellen zijn op dit moment klaar voor fluorescentie-en/of helderveld imaging zoals gewenst. Een succesvol geladen en geëquilibreerd apparaat kan meestal betrouwbaar beeld worden voor een periode van ten minste 24 uur (figuur 4A, C). Invoering van een middelgrote schakelaar (figuur 4A-C) breidt het bereik van experimenten die kan worden uitgevoerd, maar verhoogt ook de frequentie van katastrofisch celdood-gebeurtenissen (Figuur 4 d), vermoedelijk door invoering van lucht bubbels die werden niet met succes verwijderd uit de buis. Een andere gebeurtenis die leiden rampzalige celdood tot kan is dat clusters van cellen gelegen bij de inlaat kunnen worden verdreven en passeren van de voeding kanaal, zoals weergegeven in Figuur 4 d. Wij begrijpen op dit moment niet waarom dit veroorzaakt katastrofisch celdood in het apparaat, en we hebben nog niet bedacht een methode om dergelijke gebeurtenissen te voorkomen.
Figuur 1: schematische van het apparaat microfluidic. Een schematische apparaat wordt ongeveer aan de schaal weergegeven. De alfabetische aanduiding heet samen met de inlaat en uitlaat zones die worden geperforeerd om verbinding te maken met het botte uiteinde naalden. De helft van de patroon kanalen worden gewoonlijk gebruikt (schaduwrijke grijs). De loopgraven van de cel zijn gericht op de aanduiding. Het bijbehorende CAD-bestand bevat (Zie aanvullende bestand 1) alle functies op het apparaat. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Microfluidic apparaat passiveren, cel laden en evenwichtsinstelling. (A) A gekleefde apparaat na passivering met BSA-bevattende medium. Gel-laden tips worden bewaard in de outlet gaten te houden op de passage van medium en cellen via het apparaat. De middellange meniscus is zichtbaar in het dunne gedeelte van de gel-laden tips (pijl). (B) apparaat na het laden van de cel. De cellen zijn zichtbaar als een doorschijnende witte laag in de gel-laden tips (pijl). (C) het gel-laden tips zijn verwijderd voordat het centrifugeren in een centrifuge aangepaste-verzonnen-adapter. Medische tape (blauw) wordt geplaatst op de aluminium onderdelen op te vangen van het apparaat. (D) na centrifugeren en verificatie van lading, het apparaat is geplakt is aan een Microscoop etappe invoegen en gekoppeld aan de inlaat en uitlaat pinnen. In de afbeelding weergegeven, is middellange schakelen mogelijk gemaakt door snuifje kleppen en Y-verbindingslijnen die zijn gerangschikt in een apparaat gemaakt van een micropipet tip doos. (E) Schematische weergave van een volledige geassembleerde device, uit de injectiespuit pompen naar de afval container. De uitlaat slang loopt naar een klein bekerglas van afval. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: cel laden en groei in het apparaat microfluidic. (A) van links naar rechts, fase contrast microfoto van een apparaat met medium alleen vóór het laden van de cel, hetzelfde apparaat nadat u cellen hebt toegevoegd via pipetteren maar vóór centrifugeren en hetzelfde apparaat na centrifugaal laden. (B) tijdsverloop van cel aanpassing en groei in het apparaat (LB, 37 ° C, flow 1.5 µL/min). Aan het begin van de aanpassing zijn de stationaire fase cellen relatief kort en smal. Wanneer de cellen aan te passen en naar exponentiële-fase groei (60-120 min terugkeert), nemen zij een langere en bredere morfologie. Alle cellen in het apparaat zijn uniforme exponentiële-fase groei hervatten na 120 min, en het apparaat is klaar voor de beeldvorming. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: cel groei en medium overschakelen in het apparaat microfluidic. (A) Kymographs met 550 min groei tevoren en 1000 min van groei na een middellange schakelaar (grijze stippellijn) in 2% ethanol als een stressor. Beelden werden gevangen 10-min tussenpozen. Het hoogste paneel toont een transcriptionele mNeonGreen verslaggever (groene kanaal) voor een stress-geïnduceerde gen. Het onderste paneel toont een constitutief mNeptune verslaggever (rode kanaal) die wordt gebruikt in dit geval voor geautomatiseerde cel segmentatie. (B) Close-up bekijken van de gedeelten van de kymographs in het onderbroken vak in deelvenster A, toont een voorbijgaande reactie in het groene kanaal na de middellange schakelaar. Opmerking dat groei door de switch blijft, hoewel de aanwezigheid van de ethanol zorgt ervoor dat de cellen die moeten worden korter en groeien in een iets trager tempo. Tijdschaal wordt weergegeven door de horizontale balk, en afstand wordt weergegeven door de verticale balk. (C) voorbeeld sporen van geanalyseerde fluorescentie gegevens van een eencellige afstamming van het experiment wordt weergegeven in het deelvenster A. De verticale stippellijnen de middellange schakelaar in 2% ethanol als een stressor. (D) voorbeeld van een mislukte middellange schakelaar. Wanneer het tweede medium de cellen bereikt, worden de cellen in de kanalen lysed. De schakeloptie wordt begeleid door een groot aantal cellen die voorbij gaan in het belangrijkste kanaal, waardoor een heldere fluorescent signaal (een opnieuw geschaalde afbeelding die overeenkomt met de gewassen regio is getoond net erboven). Na de switch, worden geen verdere cellen waargenomen, hoewel zwak fluorescerende cel puin in de kanalen blijft. Tijdschaal wordt weergegeven door de horizontale balk, en afstand wordt weergegeven door de verticale balk. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol microfluidics is flexibel in dat vele van deze stappen kunnen worden gewijzigd voor het optimaliseren van het gebruik ervan met een bepaalde soort of stam of voor een bepaald doel. Inderdaad, in dit protocol hebben wij wijzigingen aan de oorspronkelijke "moeder machine" concept4 voor het optimaliseren van het gebruik ervan met B. subtilis. De loopgraven waarin de cellen worden beperkt vormen vaak een enkellaags functie, overwegende dat de in dit protocol gebruiken we twee-laag cel loopgraven, met een ondiep kanaal rondom de cellen. Het ontwerp van de twee-laag werd geïntroduceerd als een manier om te maximaliseren de flux van nutriënten aan en metabolieten van B. subtilis cellen, met name in lange (> 75 µm) loopgraven5; echter enkellaags functies vaak volstaan voor optimale celgroei en worden doorgaans gebruikt voor E. coli, vooral wanneer ze korter (~ 25 µm)4 zijn. Wij gebruiken meestal langer loopgraven, zoals ze de frequentie waarmee een B. subtilis cel ketens, die zich stochastically voordoen verminderen, worden getrokken uit hun loopgraven door de volumestroom medium in de belangrijkste voeding kanaal5.
Verdere kunnen wijzigingen, zoals het gebruik van apparaten met verschillende functiesets dimensies (bijvoorbeeld, de breedte van het kanaal) of kenmerken (bijvoorbeeldvorm, aantal open einden) zo nodig worden vervangen. Bijvoorbeeld, is het gebruik van cel loopgraven die open aan beide uiteinden (in plaats van slechts één eind, zoals in dit protocol) gebruikt in andere studies1,20,21. Loopgraven die geopend op beide uiteinden zijn cel veroudering voorkomen omdat ze zijn voortdurend wordt gevuld met pasgeboren cellen (in tegenstelling tot moeder machines, waar de oudste cel wordt bijgehouden en nieuwere cellen zijn geduwd uit het kanaal), hoewel het feit dat oudere cellen zijn geduwd uit beide uiteinden meestal beperkt hun observationele venster naar minder dan 10 generaties1,21. We proberen meestal de meer observationele windows (honderden generaties) aangeboden door de machine van een moeder, die het mogelijk maken tot zelfs geheugenloze processen maatregel waarvoor wachttijden tientallen zijn of honderden generaties lang5. Wij hebben het ontwerp van de machine moeder ook gebruikt aan het observeren van cellen die exponentieel niet groeit zijn, zoals in onze analyses van sporevorming22. In dergelijke gevallen extra cellen in de loopgraven kunnen zinvol zijn groei geanalyseerd22.
Veel van de stappen in het protocol zijn relatief vergeven in die zin dat ze zonder de uitkomst van het protocol aanzienlijk kunnen worden gewijzigd. Bijvoorbeeld, een eerdere versie van het protocol genaamd voor het reinigen van het glas cover door sequentiële 10-min Bad ultrasoonapparaat stappen in 10 M KOH en dan zuiver water, maar we vonden dat goed apparaat hechting en operatie werd bereikt met behulp van de eenvoudiger isopropanol gebaseerde schoonmaak stap hier beschreven. Als een hechting probleem ontstaan dat vermoeden gegoten op de reinheid van het cover-glas, wordt terug te keren naar een aangescherpte schoonmaak protocol aanbevolen. Ook, terwijl wij een stap centrifugeren gebruiken om te maximaliseren van de cel in de loopgraven van de cel te laden, redelijk vol laden kan worden bereikt zelfs zonder deze stap, mits heel geconcentreerd cellen worden gebruikt voor het laden stap. Deze alternatieve strategie kan vooral nuttig zijn voor onderzoekers die niet over een adapter beschikbaar centrifuge beschikken te draaien van het apparaat. Nogmaals, verschillende concentraties van passiveren/smeerolie agent (BSA in dit protocol) kunnen worden gebruikt; We gebruiken routinematig concentraties zo hoog als 1 mg/mL. In gevallen waar een stam gevoelig voor BSA kan zijn, kunnen aanvaardbare resultaten gebeuren zelfs in de afwezigheid van een passivating agent. Inderdaad, toen waren we met behulp van een microfluidic apparaat te onderzoeken van de sporevorming, waarvoor cel honger, waren we bang dat BSA als een potentiële nutriënten bron voor de cellen fungeren kan, en dus we hebben nagelaten het van de volumestroom medium zonder inachtneming van eventuele substantiële bijwerkingen22.
Met name kan de continue stroom van medium via het apparaat uitlokken lichtjes verschillende fenotypes vergeleken met de celgroei in een gesloten systeem, zoals een kolf. Bijvoorbeeld, kan nutriënten of samengestelde uitputting lastig zijn, zoals cellen vaak trace stoffen uit de volumestroom medium kunnen opruimen. Inderdaad, wij hebben geconstateerd dat een langere tijd in een microfluidic apparaat dan in een kolf inducerende cel sporevorming via honger vereist. Ook hebben wij geconstateerd dat de inductie van energie stress met behulp van de oxidatieve fosforylatie decoupler carbonyl cyanide m-chlorofenyl hydrazon (CCCP) several-fold hogere concentraties in het microfluidic apparaat vereist dan gemeld in de kolf cultuur 23. daarom wat optimalisatie kan worden verlangd dat het bevredigende resultaten met verschillende middellange additieven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit project werd gefinancierd door de National Institutes of Health onder GM018568. Dit protocol werd gedeeltelijk uitgevoerd in het midden voor nanoschaal systemen (CNS), een lid van de nationale nanotechnologie gecoördineerde infrastructuur netwerk (NNCI), die wordt ondersteund door de National Science Foundation onder NSF award nr. 1541959. CNS is onderdeel van de Harvard-universiteit. Veel dank gaat uit naar Thomas Norman en Nathan heer voor hun werk in het concipiëren en fabriceren van de hoofdsjabloon gebruikt voor de apparaten getoond hier en bij de opbouw van de oorspronkelijke versie van het apparaat. Wij ook wij Johan Paulsson danken voor zijn waardevolle samenwerking advies en leden van zijn lab voor hun advies en voortdurende verbeteringen van bacteriële microfluidic toestellen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | (240)4019862 | This is referred to as PDMS in the protocol. There are 2 components that are mixed at a 10:1 ratio |
| 0.75-mm biopsy punch | World Precision Instruments | 504529 | |
| 22 x 40 mm No. 1.5 cover glass | VWR | 48393 172 | |
| Plasma Etch PE-50 | Plasma Etch Inc. | PE-50 | Instrument used to bond PDMS to glass using oxygen plasma treatment |
| Tygon flexible tubing ID 0.02", OD 0.06" | Saint-Gobain PPL Corp. | AAD04103 | For the main part of the tubing, e.g. attached to the needles |
| Silicone Tubing, 0.04" ID, 0.085" OD | HelixMark Standard Silicone Tubing | 60-795-05 | For pinch valves and Y-junction connection |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100G | Used as passivation agent |
| ART Gel Pipet Tips (P200) | Molecular BioProducts | 2155 | For loading the device with medium and cells |
| Acrodisc 32-mm syringe filter with 5-μm Supor membrane | Pall Life Sciences | 4560 | For filtering cultures before device loading |
| 21-ga blunt needles, 1" | McMaster-Carr | 75165A681 | |
| Y connector with 200-series barbs, 1/16" ID tubing, polypropylene | Nordson Medical | Y210-6005 | The company is AKA Value Plastics |
| Eclipse Ti-E inverted microscope | Nikon | This unit has been discontinued by the manufacturer and is replaced by the Ti 2 E. | |
| LB Lennox | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Microfuge 18 | Beckman Coulter | 367160 | |
| Bacillus subtilis strain NCIB3610 | Bacillus Genetic Stock Center | 3A1 | wild-type parental strain modified for use in the experiments shown in this protocol |
| Gravity convection oven | VWR | 414005-106 | for curing PDMS and baking assembled devices |
| Scotch-Weld Epoxy Kit | 3M | 2216 B/A | may be used to bond a silicon wafer to an aluminum backing plate |
| Scotch Magic tape, 3/4" width | 3M | to clean dust from PDMS devices and to place over features to increase visibility (denoted "office tape" or "adhesive tape" in protocol) | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ800N | listed here as an example; nearly any stereomicroscope will do |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907 | To clean cover glass |
| Syring pump, 6 channel | New Era Pump Systems Inc. | NE-1600 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34120 | a brand of dust-free wipes |
References
- Moffitt, J. R., Lee, J. B., Cluzel, P. The single-cell chemostat: an agarose-based, microfluidic device for high-throughput, single-cell studies of bacteria and bacterial communities. Lab Chip. 12 (8), 1487-1494 (2012).
- Young, J. W., et al. Measuring single-cell gene expression dynamics in bacteria using fluorescence time-lapse microscopy. Nat Protoc. 7 (1), 80-88 (2011).
- Dusny, C., et al. Technical bias of microcultivation environments on single-cell physiology. Lab Chip. 15 (8), 1822-1834 (2015).
- Wang, P., et al. Robust growth of Escherichia coli. Curr Biol. 20 (12), 1099-1103 (2010).
- Norman, T. M., Lord, N. D., Paulsson, J., Losick, R. Memory and modularity in cell-fate decision making. Nature. 503 (7477), 481-486 (2013).
- Perestrelo, A. R., Aguas, A. C., Rainer, A., Forte, G. Microfluidic Organ/Body-on-a-Chip Devices at the Convergence of Biology and Microengineering. Sensors. 15 (12), Basel. 31142-31170 (2015).
- Johari, S., Nock, V., Alkaisi, M. M., Wang, W. On-chip analysis of C. elegans muscular forces and locomotion patterns in microstructured environments. Lab Chip. 13 (9), 1699-1707 (2013).
- Liu, J., et al. Coupling between distant biofilms and emergence of nutrient time-sharing. Science. 356 (6338), 638-642 (2017).
- Choi, C. H., et al. One-step generation of cell-laden microgels using double emulsion drops with a sacrificial ultra-thin oil shell. Lab Chip. 16 (9), 1549-1555 (2016).
- Weibel, D. B., Diluzio, W. R., Whitesides, G. M. Microfabrication meets microbiology. Nat Rev Microbiol. 5 (3), 209-218 (2007).
- Taheri-Araghi, S., Brown, S. D., Sauls, J. T., McIntosh, D. B., Jun, S. Single-Cell Physiology. Annu Rev Biophys. 44, 123-142 (2015).
- Karimi, A., Karig, D., Kumar, A., Ardekani, A. M. Interplay of physical mechanisms and biofilm processes: review of microfluidic methods. Lab Chip. 15 (1), 23-42 (2015).
- Yu, F. B., et al. Long-term microfluidic tracking of coccoid cyanobacterial cells reveals robust control of division timing. BMC Biol. 15 (1), 11 (2017).
- Campos, M., et al. A constant size extension drives bacterial cell size homeostasis. Cell. 159 (6), 1433-1446 (2014).
- Taheri-Araghi, S., et al. Cell-size control and homeostasis in bacteria. Curr Biol. 25 (3), 385-391 (2015).
- Siryaporn, A., Kim, M. K., Shen, Y., Stone, H. A., Gitai, Z. Colonization, competition, and dispersal of pathogens in fluid flow networks. Curr Biol. 25 (9), 1201-1207 (2015).
- Connell, J. L., et al. Probing prokaryotic social behaviors with bacterial "lobster traps". MBio. 1 (4), (2010).
- Long, Z., et al. Measuring bacterial adaptation dynamics at the single-cell level using a microfluidic chemostat and time-lapse fluorescence microscopy. Analyst. 139 (20), 5254-5262 (2014).
- Okumus, B., et al. Mechanical slowing-down of cytoplasmic diffusion allows in vivo counting of proteins in individual cells. Nat Commun. 7, 11641 (2016).
- Teng, S. W., Mukherji, S., Moffitt, J. R., de Buyl, S., O'Shea, E. K. Robust circadian oscillations in growing cyanobacteria require transcriptional feedback. Science. 340 (6133), 737-740 (2013).
- Baker, J. D., et al. Programmable, Pneumatically Actuated Microfluidic Device with an Integrated Nanochannel Array To Track Development of Individual Bacteria. Anal Chem. 88 (17), 8476-8483 (2016).
- Russell, J. R., Cabeen, M. T., Wiggins, P. A., Paulsson, J., Losick, R. Noise in a phosphorelay drives stochastic entry into sporulation in Bacillus subtilis. EMBO J. 36 (19), 2856-2869 (2017).
- Cabeen, M. T., Russell, J. R., Paulsson, J., Losick, R. Use of a microfluidic platform to uncover basic features of energy and environmental stress responses in individual cells of Bacillus subtilis. PLoS Genet. 13 (7), e1006901 (2017).
