Summary
Vi presenterer en metode for microfluidic analyse av bakteriell enkeltcelle overleveringslinjer eksempel på bruk av Bacillus subtilis . Metoden overvinner svakhetene i tradisjonelle analytiske metoder i mikrobiologi ved observasjon av hundrevis av cellen generasjoner vilkår tett kontrollerbar og ensartet vekst.
Abstract
Microfluidic teknologi overvinner mange av begrensningene til tradisjonelle analytiske metoder i mikrobiologi. I motsetning til bulk-kultur metoder tilbyr encellede oppløsning og lang observasjon ganger som består av hundrevis av generasjoner; i motsetning agarose pad-baserte mikroskopi har det jevn vekst forhold som kan være strengt kontrollert. Fordi kontinuerlig flyten av vekstmediet isolerer cellene i en microfluidic enhet fra uforutsigbare variasjoner i det lokale kjemiske miljøet forårsaket av cellevekst og metabolisme, autentisk endringer i genuttrykk og cellevekst svar bestemt stimuli kan observeres mer trygt. Bacillus subtilis brukes her som en modell bakterie-art å demonstrere en "mor machine"-type metode for mobilnettet analyse. Vi viser hvordan å konstruere og lodde en microfluidic enhet, laste den med celler, starte mikroskopiske bildebehandling og utsette en stimulans celler ved å bytte fra én oppblomstringen medium til et annet. Stress-responsive reporter brukes som et eksempel for å avsløre hvilken datatype som kan oppnås av denne metoden. Vi også kort diskutere videre søknader av denne metoden for andre typer eksperimenter, som analyse av bakteriell sporulation.
Introduction
En av de mest slående funksjonene for livet på jorden er den store elastisitet og utvalg. Molekylærbiologi sentrale mål er å forstå logikken som cellene bruke gener og proteiner for å maksimere deres vekst og fitness under en rekke forhold. For å oppnå dette målet, forskere må kunne trygt observere hvordan enkelte cellene vokse, dele og uttrykke sine gener under et gitt sett med vilkår, merke hvordan cellene reagerer senere endringer i miljøet. Men har tradisjonelle analytiske metoder i mikrobiologi tekniske begrensninger som påvirker spørsmålstyper som kan løses. For eksempel bulk kultur-baserte analyser har vært svært nyttig gjennom årene, men de tilbyr bare befolkningsnivå data som kan maskere meningsfull celle til celle variasjoner eller atferd av mindre Sub-populasjoner av celler i befolkningen. Encellede analyser av levende bakterier basert på * lys avsløre encellede atferd, men er også teknisk begrenset. Bakterier er vanligvis immobilisert på agarose pads som inneholder vekst medium, men celle vekst og divisjon folkemengder mikroskopiske visningen og reduserer tilgjengelig næringsstoffer etter kun cellen sykluser, vesentlig begrenser observasjon time1, 2. Videre forandrer lokale uttømming av næringsstoffer og samtidig opphoping av metabolske biprodukter på grunn av cellevekst lokale celle vekst miljøet på måter som er vanskelige å måle eller forutsi. Slike miljøendringer benytter agarose pads utgjør en utfordring til studier av stabil eller cellular svar på spesifikke endringer i vekst forhold3.
Microfluidic-teknologi, som et flytende medium er kontinuerlig sirkulerer gjennom microfabricated enheter, tilbyr en løsning til klassiske eksperimentelle begrensninger. En microfluidic enhet kan holde enkeltceller i posisjon for live-celle mikroskopi mens flyten av vekstmediet stadig gir cellene frisk næringsstoffer og vasker bort metabolske biprodukter og overflødig celler, og dermed skape en svært ensartet vekst miljø. Under konstant vekst forhold, kan celle atferd observeres i isolasjon fra påvirkning av miljømessige faktorer, tillater en uhindret utsikt over den indre logikken i celler. Som strømning hindrer microfluidic enheten i å bli overfylt med celler, blir observasjon av enkeltcelle overleveringslinjer for titalls eller hundrevis av generasjoner mulig4,5. Så lang tid tillater påvisning av ellers undetectable langsiktige eller sjeldne celle atferd. Til slutt, sammensetningen av mediet som renner gjennom enheten kan endres på vilje, slik at cellene å bli observert som de reagerer starten på en stress eller til introduksjon eller fjerning av et bestemt sammensatt.
MicroFluidics har allerede hatt en rekke viktige programmer. For eksempel er det brukt i vev, orgel- eller kroppen på-chip enheter, der flere menneskelige celletyper er co kultivert å simulere en i vivo tilstand6; for studier av Rundormer bevegelse i microstructured miljøer7; undersøke interaksjon mellom bakteriell biofilm (f.eks, 8); og for innkapsling og manipulering av små mengder celler eller kjemikalier (f.eks, 9). Microfluidic enheter har også blitt stadig mer populært i feltet for mikrobiologi (for gode anmeldelser, se 10 og 11), særlig ettersom deres fysiske flytegenskaper er godt matchet naturlig mikrobiell nisjer12. For eksempel har microfluidics vært nylig ansatt av microbiologists slike formål som nøyaktig måling av celle vekst og divisjon13,14,15, analysere patogen movement16, overvåking quorum sansing17 og fysiologiske overganger18og for protein telle19, blant mange andre eksempler. Metoden som presenteres her er spesielt utformet for analyse av bakteriell enkeltcelle linjene i stedet for kombinasjoner av stammer eller arter. Microfluidic enheten demonstrert her benytter en variasjon av "mor machine" design4, der celler er vokst enkeltfiler i en microfluidic grøft med en lukket ende og én åpen ende; cellevekst og divisjon presser avkom celler opp og ut av den åpne enden i væske flyten. Våre analyser vanligvis fokusere bare på "mor" cellen som er begrenset i lukket slutten av grøften. Vi anser denne metoden som en fremgang over forrige lys mikroskopi-baserte encellede analytiske teknikker, for eksempel celle immobilisering på agarose pads. Mens B. subtilis brukes som modell her, metoden gjelder også for andre bakterie-art (Escherichia coli er en annen vanlig modell, noen arter med ulike celle størrelser eller morphologies kan kreve fabrikasjon av nye enheter med ulike dimensjoner). Bruk av fluorescerende journalister å merke celler og visualisere endringer i genuttrykk krever bruk av genetisk medgjørlig arter; analyser av cellevekst og morfologi er imidlertid mulig selv uten fluorescerende markører.
Nåværende protokollen utelukker prosessen med fabrikasjon silisium master med klima og jordsmonn, som har blitt grundig beskrevet andre steder5; maler kan også være enkelt outsourcet fra microfabrication fasiliteter. Det inkluderer forming av en PDMS enhet fra en forsterket silisium master; liming enheten til et stykke dekke glass; montering microfluidic innløp og utløp avløp, ventiler inkludert knipe for å tillate middels bytte; passivating enheten forbereder bakterielle celler og lasting enheten med bakterielle celler. feste avløp til enheten og equilibrating celler. og lasting enheten til fluorescens mikroskop for bildebehandling. Fordi mange forskjellige bildeopptak og prosessering programvare verktøy kan brukes til å visualisere og analysere ulike data rundt4,5, eksempel bilder vises, men ta avbildninger metoder er ikke inkludert i denne protokollen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. PDMS enheten støping
- I et støvfritt miljø, bland PDMS polymer og herding agent i 10:1 forholdet og degas under vakuum for minst 10 min.
- Plass en silicon master (eller en epoxy eller polyuretan replika derav) på et ubrutt aluminiumsfolie i en polystyren Petri plate. Hell degassed PDMS blandingen over originalfiguren til en dybde på ca 5 mm. Degas Petri platen i minst 10 min. Bruk en svak strøm av luften å bryte overflaten bobler.
Merk: Dimensjoner av tolags apparat er gitt i tilhørende CAD fil5 (se utfyllende fil 1). En plast replika master kan delvis flyte under avgassing; Hvis dette skjer, trykk ned replikaen med en ren plast applikatoren. - Kur PDMS for minst 1 time i en ovn ved 60 ° C og avkjøles til romtemperatur. Fjerne aluminiumsfolie som inneholder master og herdet PDMS fra Petri plate. Nøye skrelle av aluminiumsfolie fra baksiden av master, og nøye skrelle PDMS fra master.
Merk: Alternativt PDMS kan kureres over natten i romtemperatur. Relativ skjørhet av en silisium-wafer kan overvinnes med epoxy lim å permanent bånd wafer til en 1/16 tommers-tykk aluminium plate av samme størrelse som kjeks. - Som en wafer inneholder vanligvis flere microfluidic enheter med litt forskjellige dimensjoner (se utfyllende fil 1), kutte én enhet til størrelsen bruker rene, skarpe skalpell.
Merk: For rutine B. subtilis arbeid, bruke enheter med 1.0-µm bred celle grøfter, som er merket med C eller F i tilhørende CAD-filen.
2. enheten klipping og liming
- Sted et stykke gjennomskinnelig office tape (se Tabell for materiale) over mønstret side av enheten, for å øke synligheten av funksjonene mønstret. Innløp og utløp portene identifiseres som sirkulær områder på motsatte ender av synlig fluidic kanaler (figur 1). For å forbedre synligheten når boksesekk hull i enheten for innløp og utløp pinnene, markerer du inn- og utløp med prikker med en tynn markør.
Merk: For å sikre at innløp og utløp pinnene ikke overfylt, hver annen kanal er hullet, begynner med kanalen like under alfabetisk betegnelsen for enheten. - Vende PDMS enheten slik at den mønstrede siden er nede, og slå gjennom enheten til de merkede prikkene ved en 0,75 mm biopsi punch; Kast punchings.
Merk: Enheter slo med mønstret side ned fordi hullet generert av biopsi slag er vanligvis litt blusset der slag inn i polymer. Punching enheten i en omvendt retning sikrer at hullet på mønstret side har en skarp kant. - Bruker en stereomicroscope, sikre at hullene overlapper med innløp og utløp områdene av enheten. Bruk en tynn pinsett fjerne noen overflødige fragmenter av PDMS fra hullene.
- Bruke teip for å fjerne støv fra begge sider av enhet og sted i en ren polystyren Petri plate. Forbered en 22 x 40 mm cover glass ved wetting med 100% isopropyl alkohol og gni med renrom tømming; tørr med en strøm av støv-fri luft eller nitrogen.
- Plass hullet PDMS enheten funksjonen siden opp sammen med det rensede cover glasset i en oksygen plasma renere.
- Plasma-treat enheten med følgende innstillinger: vakuum, 70 mTorr; O2 trykk, 200 mTorr; varighet, 15 s; makt, 30 W. straks plasma behandlingsperioden er ferdig, Fjern enheten og dekke glass fra plasma renere.
- Invertere PDMS og plassere den på midten av dekselet glasset slik at siden mønstret kontakter glass; Kontroller at fôring kanalene (kjører mellom innløp og utløp områder) er på linje med den lange aksen av dekket glasset. Trykk ned veldig forsiktig for å sikre at PDMS sel mot glasset.
- Bake montert enheten i en ovn minst 1 h på 60 ° C. Etter baking, bekrefte manuelt at PDMS er limt til glasset ved å trykke forsiktig på et hjørne av enheten.
Merk: Når enheten er limt, den bør brukes innen 24 timer, som polymer blir stadig hydrofobe med økende etter plasma behandling.
3. Microfluidic avløp forberedelse
- Kuttet lengder av polymer rør (indre diameter (ID) 0.02 tommer, ytre diameter (OD) 0,06 tommer) til riktig lengde tilgjengelig fra sprøytepumpen til bytter apparatet (hvis den benyttes) og enheten når montert på mikroskopet. Kuttet så mange lengder som det er microfluidic baner.
- Montere Y veikryss for knipe ventiler (hvis) ved skjærende og knytter 2 cm lengder fleksibel silikon rør (0,03 tommers ID, 0.065 tommers OD) topp mothaker av "Y" og 1 cm lengder silikon rør til bunnen barb av det "Y".
- Kutte 10 cm (eller aktuelle) lengder polymer rør; koble dem i den ene enden til bryteren krysset ved å sette dem inn 1 cm silikon rør segmentene på bunnen barb av det "Y". Koble dem på den andre enden til 21G pinner som er fjernet fra deres plastsprøyte adaptere og bøyd ca 90 ° ca 9 mm fra nålen slutten.
- Koble 21G sløv nåler til den ene enden av slangen segmentene som kjøres fra sprøyter til bryteren apparatet ved innsetting av nåler i slangen. Andre endene av hver lengde rør inn silikon rør segmentene på innløpet mothaker av Y veikryss.
Merk: Bruk en slags apparater til knipe ventiler og veikryss på plass. Dette kan enkelt gjøres fra en brønnene tips boks (figur 2D). - Kuttet lengder polymer slangen å bære avfall fra utløpet av enheten til et avfall beger. Koble dem i den ene enden til bøyd 21G nåler forberedt som beskrevet ovenfor. Tape den andre enden av rørene i et avfall beger.
- Forberede passende mengder mediet som inneholder 0,1 mg/mL bovin serum albumin (BSA) og fyll ønsket størrelse og antall sprøyter. Koble BSA lastet sprøyter til forberedt 21G nålene knyttet til inntak rør og laste sprøyter i sprøyten pumper.
Merk: For vanlige eksperimenter 5 kanaler av enheten brukes, hver med en 20 mL sprøyte. Et eksperiment der mediet er slått krever 2 banker av 5 sprøyter hver. Her pumpen som inneholder den første banken kalles fase 1 pumpen, og pumpen som inneholder andre banken, med den etter bytte mediet, kalles fase-2 pumpen. - Rense luften fra innløpet avløp ved å kjøre sprøyte pumpene på en høy flow rate (> 500 µL/min), begynner ved orientere sprøyte pumpene vertikalt og tappe sprøyter for å bringe luftbobler til toppen. Når luften er fjernet fra sprøyter, plassere sprøytepumpen vannrett og gradvis trykk eller sveiper polymer linjene fra sprøyter gjennom bryteren apparatet å fjerne og fjerne luftbobler. Gjenta denne prosessen for den andre bredden av sprøyter (hvis bytte media).
- Når luftbobler er renset, angi fase-2 sprøytepumpen (dvs.med mediet som brukes andre, etter bryteren) på 1,5 µL/minutt, stans flyten. Plasser små bindemiddel klipp på delene av fleksible rør på grenen av Y knutepunktene tilsvarer middels fase. Fortsette å kjøre fase 1 sprøytepumpen en beskjeden flow rate (f.eks, 10 µL/min) i minst 30 min å tømme den andre mediet fra innløpet slangen nedstrøms Y krysset.
4. celle kultur forberedelse
- Vokse en preculture av belastningen av interesse i ønsket medium natten til stasjonære fase. Bakterielle belastningen bør inneholde en mutasjon som gjengir cellene immobile, slik at cellene ikke svømme av kanaler for enheten.
Merk: I denne protokollen, bakterielle belastningen er B. subtilis 3610 inneholder en heksA233V substitusjon (denne mutasjonen fører flagell å være rett i stedet spiralformede hindre cellen motilitet), en PrsbV- mNeonGreen reporter celle stress, og konstituerende Phyperspank- mNeptune (rød) reporter for å utheve celler. LB Lennox mediet brukes i eksempel-protokollen. Typisk stammer for microfluidics eksperimenter inneholder én eller flere fluorescerende transcriptional journalister og et constitutively produsert, cytoplasmatiske fluorescerende protein for å lette Automatisert påvisning av celler. Vekst feil var ikke observert når LB Lennox rik mediet ble brukt, men B. subtilis vekst i minimal media kan bli hemmet under microfluidic forhold fordi utskilles siderophores er vasket bort av middels flyten. Under slike omstendigheter, kan vekst gjenopprettes ved natriumsitrat og ferric chloride til medium, som rapportert for S750 mellomstore11. - Morgenen eksperimentet fortynne B. subtilis cellene 1:50 i en forvirret 250 mL kolbe inneholder 25 mL av vekst medium. Vokse celler for 5-6 h i risting kultur på 37 ° C til en optisk tetthet av større enn 1.
Merk: En tett cellekultur er å foretrekke fordi den stasjonære-fasen B. subtilis celler er mindre og mindre ofte funnet i cellen kjeder, tilrettelegge enheten lasting. Ulike bakterie-art krever andre middels eller vekst betingelser for optimal lasting. - Bruker en sprøyte som er utstyrt med en 5 µm pore-størrelse filter, filtrere ca 15 mL cellekultur i en 15-mL konisk tube fjerne B. subtilis celle kjeder (det er ikke nødvendig for E. coli og ikke være nødvendig med andre arter).
Merk: Relativt få celler bør fjernes; filtratet skal grumset. - Sentrifuge filtrerte kulturen i 10 min 4000 x g ved romtemperatur. Hell av nedbryting og resuspend celle pellet i gjenværende supernatant væske i røret, legger til ca 500 µL av fersk medium om nødvendig å lette pipettering celle suspensjon.
5. enheten lasting
- Forsiktig plassere tomme tynn gel-lasting brønnene tips (se Tabell for materiale) hullene utløp av den microfluidic enheten.
- Bruker tynn gel-lasting tips med P200 brønnene, passivate enheten ved å injisere medium som inneholder 1 mg/mL BSA i innløp hull, observere tipsene i stikkontakt hullene overvåke fylling av microfluidic kanaler (figur 2A). Inkuber enheten ved romtemperatur i ca 5 min.
Merk: BSA brukes vanligvis som blokkerer eller passivation agent som vil binde til hydrofobe overflaten av PDMS polymer, øke sin hydrophilicity og redusere bindingen av andre proteiner eller celler (via cellen overflaten molekyler). - Bruke tynn gel-lasting tips, laste hver kanal med resuspended celler (fra punkt 4), bruke tipsene i stikkontakt kanalen for å overvåke fremdriften av celler gjennom enheten (figur 2B).
Merk: Lasting er tilrettelagt av angir P200 brønnene til maksimalt 200-µL volumet og deretter aspirating en pute av luft før aspirating en liten mengde (ca halve volumet av tynne delen av pipette spissen) celler. Volumet av resuspended celler trenger ikke være presis, det PDMS volumet er liten i forhold til brønnene. Vi vet av ingen øvre grense for tetthet av resuspended celler, så lenge cellen suspensjon kan være pipetted i enheten. Cellen klumper kan tette enheten og bør unngås grundig pipettering og/eller vortex miksing. - Fjern gel-lasting tips fra uttaket hullene, arbeider en for å hindre skade på enheten.
- Sentrifuge enheten i en benk-toppen microcentrifuge i en passende rotoren adapter ca 6000 x g i 10 min (figur 2C).
Merk: En egendefinert-maskinert aluminium rotoren adapter som var utformet for å passe inn i en microcentrifuge rotor (figur 2C) ble brukt; forskjellige sentrifuge modeller kan brukes med riktig rotoren adaptere. Det viktige av adapteren er at det gir kraft i retning av lukket celle skyttergravene, og dermed tvinge celler inn i de side. - Bekrefte vellykket lasting under mikroskopet (Figur 3), men uten påføring enheten til å skyve holderen/scenen sette.
Merk: I denne protokollen, en 60 X, 1,4 NA Ph3 oljeneddyp målet brukes for begge bekreftelse på dette stadiet og påfølgende bildebehandling.
6. enheten Assembly, balanse og montering
- Nøye montere lastet enheten på en scene setter ved taping cover glass på hver side av PDMS til bunnen av scenen sette (i.e.Inverter scenen innsatsen monterer enheten). Invertere samlingen scenen insert-enheten slik at PDMS vender og plasser på en myk overflate, for eksempel en støvfritt tørke (figur 2D).
- Justere infusjonshastigheten for fase 1 sprøytepumpe til 35 µL/min. arbeider med ett kjørefelt samtidig, sette nålen innløp og utløp nålen (dvs.kjører til avfall begeret; Figur 2E).
- Tørk bort eventuelle overskytende medium med en ren støvfritt tørke og visuelt inspisere enheten for lekkasjer. Undersøk slangen uttaket for utseendet av overflødig celler (vanligvis vises som en grumset stripe) og den mellomstore meniscus, som vil sakte beveger seg mot avfall begeret.
- Tillat enheten å kjøre på 35 µL/min i ca 15-30 min, inntil alle tilkoblede banene er drenert til avfall begeret.
- Angi sprøytepumpen fase 1 til 1,5 µL/min og stanse flyten. Ta hele pumpen og enheten apparatet til mikroskopet (denne prosessen blir hjulpet ved å plassere den på en rullende handlevogn) og starte fase-1 middels flyt på 1,5 µL/min. montere nøye scenen innsatsen med enheten på en invertert fluorescens mikroskop, bruker tapen nødvendig rute innløp og utløp rør.
- Finn ønsket plassering på enheten for bildebehandling og begynne bildebehandling som ønsket. Merk at celler krever vanligvis et par timer (ca 10 generasjoner) å nå stabil eksponentiell-fase vekst, og utbruddet av bildeopptak utsettes som ønsket slik at bildebehandling begynner etter perioden balanse.
Merk: Stabil vekst av celler i eksponentiell fase skal bekreftes under påfølgende bildeanalyser ved sporing celledeling ganger og sikre at de har nådd en konstant minimumsverdi.
7. middels bytte
- Mellom påfølgende rundene av imaging, stoppe flyten av fase 1 sprøytepumpen. Nøye unclip bindemiddel klipp fra fase-2 silikon rør, flytte til silikon slangen på fase 1 grenen av Y krysset. Un-pause flyten av fase-2 sprøyte pumpe (som var satt til 1,5 µL minuttet i trinn 3.8) og fortsette bildebehandling.
Merk: på 1,5 µm/min med 10 cm lengde på polymer rør nedstrøms av Y veikryss, andre-fase mediet når enheten i ca 50 min. Tiden til enheten kan testes empirisk bruke medier som inneholder fluorescerende tracer partikler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vellykket første celle lasting, som vurdert av kontrast mikroskopi monterer microfluidic avløp til enheten, vil bli vurdert som å ha alle eller nesten alle microfluidic siden kanalene som inneholder én eller flere bakterieceller ( Figur 3A). Optimal lasting ville viser flere celler i hver enkelt kanal, men kanaler vil likevel fylle med på grunn av cellevekst i balanse perioden (figur 3B). Baner med dårlig lasting, der relativt få (< 50%) siden kanaler er lastet med celler, kan brukes, men den resulterende Datatetthet vil bli lavere grunnet færre celle linjene blir fotografert i hver tenkelig posisjon.
Når enheten er først lastet, er det equilibrated feste microfluidic avløp og strømmer medium gjennom enheten på en relativt høy flow rate på 35 µL/min. Balanse trinnet serverer å fjerne luftbobler og overflødig celler i fôring kanalen fra enheten, og å oppmuntre cellene i siden kanalene å starte vokse. Cellene som er fjernet fra enheten på middels flyt kan ofte bli observert med det blotte øye som et lys beveger seg gjennom slangen uttaket mot avfallsbeholderen; bevegelsen av band fungerer som en visuell indikator som væske strømmer normalt gjennom avløp og enheten. Mikroskopiske inspeksjon av en equilibrated enhet skal avsløre noen celler i én fil i de fleste side kanalene (figur 3B, 0 minutter).
Når en equilibrated enheten plasseres på mikroskopet under flyt på 1,5 µL/min på 37 ° C, vil celler gjenoppta uniform og konstant eksponentiell-fase vekst i løpet av ca 2 timer (figur 3B). Konstant eksponentiell vekst må bekreftes direkte etter bildeanalyse av utseendet på et platå i generasjonstid cellene. På dette punktet, er cellene klar for fluorescens og/eller brightfield imaging som ønsket. En vellykket lastet og equilibrated enhet kan vanligvis pålitelig avbildes i perioder på minst 24 timer (figur 4A, C). Vi presenterer en middels bryteren (figur 4A-C) utvider utvalget av eksperimenter som kan gjennomføres, men også øker frekvensen av katastrofale celledød hendelser (Figur 4 d), antagelig gjennom innføring av luft bobler som ikke ble vellykket renset fra slangen. En annen hendelse som kan føre til katastrofale celledød er at klynger av celler på innløpet kan bli forskyves og passerer gjennom fôring kanalen, som vist i Figur 4 d. Vi forstår i dag ikke hvorfor dette forårsaker katastrofale celledød i enheten, og vi har ikke ennå utviklet en metode for å forhindre slike hendelser oppstår.
Figur 1: skjematisk av microfluidic enheten. En enheten vises ca å skalere. Alfabetisk betegnelsen er merket med innløp og utløp sonene som slo for å koble blunt endte nålene. Vanligvis halvparten av mønstret kanalene brukes (skyggelagt grå). Cellen skyttergravene er orientert mot betegnelsen. Medfølgende CAD-filen viser (se utfyllende fil 1) alle funksjonene på enheten. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Microfluidic enhet passivation celle lasting og balanse. (A) A tilknyttet enhet etter passivation med BSA inneholder medium. Gel-lasting tips holdes i stikkontakt hullene overvåke passering av medium og celler gjennom innretningen. Den mellomstore meniscus er synlig i den tynne delen av gel-lasting tips (pil). (B) enhet etter celle lasting. Cellene vises som et gjennomsiktig hvit lag i gel-lasting tips (pil). (C) gel-lasting tips fjernes før sentrifugering i en tilpasset fremstille sentrifuge adapter. Medisinsk bånd (blå) plasseres på aluminium deler å kvele enheten. (D) etter sentrifugering og verifisering av lasting, enheten er teipet til en mikroskop scenen setter og knyttet til innløp og utløp pinnene. I bildet som vises, er middels bytte gjort mulig ved å knipe ventiler og Y-kontakter som er ordnet i et apparat fra en brønnene Verktøytips-boksen. (E) skjematisk visning av en hel montert enhet, fra sprøyten pumper til avfallsbeholderen. Stikkontakt slangen går til et lite avfall beger. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: lasting og vekst i microfluidic enheten. (A) fra venstre til høyre, kontrast micrographs på en enhet som inneholder mediet bare før cellen lasting, den samme enheten etter celler har blitt lagt via pipettering men før sentrifugering og samme enhet etter sentrifugal lasting. (B) tid selvfølgelig celle tilpasning og vekst i enheten (LB, 37 ° C, gjennomstrømning 1,5 µL/min). I begynnelsen av tilpasning er stasjonære-fase cellene relativt korte og smale. Cellene tilpasse og gå tilbake til eksponentiell-fase vekst (60-120 min), vedta de en lengre og bredere morfologi. Etter 120 min, alle celler i enheten er gjenoppta uniform eksponentiell-fase vekst, og enheten er klart til avbilding. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: vekst og middels bytte i microfluidic enheten. (A) Kymographs viser 550 min vekst før og 1000 min veksten etter en middels bryter (grå stiplet linje) til 2% etanol som en stressor. Bildene ble tatt i 10 minutters intervaller. Toppanelet viser transcriptional mNeonGreen reporter (grønne kanalen) for en stress-indusert genet. Det nedre panelet viser grunnleggende mNeptune reporter (rød kanal) som brukes i dette tilfellet for automatisert celle segmentering. (B) nærbilde vise av delene av kymographs i boksen stiplede i panelet A, viser en forbigående respons i den grønne kanalen etter medium bryteren. Merk at veksten fortsetter gjennom bryteren, selv om tilstedeværelsen av etanol fører til at cellene blir kortere og vokse med litt lavere tempo. Tidsskalaen er vist ved den vannrette linjen, og avstanden er vist med en loddrett strek. (C) eksempel spor av analysert fluorescens data i en enkelt celle avstamning fra eksperimentet vises i panelet A. De vertikale stiplede linjene angir bryteren middels til 2% etanol som en stressor. (D) eksempel på en mislykket middels bryter. Når andre medium når cellene, er cellene i kanalene lysed. Bryteren er ledsaget av et stort antall celler som passerer i viktigste kanalen, forårsaker en lys fluorescerende signal (et nytt skalert image tilsvarer utvasket regionen vises like over det). Etter bryteren, er ingen ytterligere celler observert, selv om svakt fluorescerende celle rusk forblir i kanaler. Tidsskalaen er vist ved den vannrette linjen, og avstanden er vist med en loddrett strek. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne microfluidics protokollen er fleksibel i at mange av disse trinnene kan endres for å optimalisere bruken med bestemt arter eller stamme eller for et bestemt formål. Faktisk i denne protokollen har vi gjort endringer i den opprinnelige "mor machine" konsept4 å optimalisere bruken med B. subtilis. Ofte utgjør skyttergravene som cellene er begrenset en enkeltlags-funksjonen, mens i denne protokollen bruker vi to-lags celle skyttergravene, med en grunne kanal rundt cellene. To-lags design ble introdusert som en måte å maksimere fluks av næringsstoffer til og metabolitter fra B. subtilis celler, særlig i lange (> 75 µm) skyttergravene5; men enkeltlags-funksjoner ofte nok for optimal cellevekst og brukes vanligvis for E. coli, spesielt når de er kortere (~ 25 µm)4. Vi bruker vanligvis lengre skyttergravene, som de redusere frekvensen som B. subtilis celle kjeder, som oppstår stochastically, er trukket ut av sine skyttergravene av middels flyten i viktigste fôring kanal5.
Ytterligere kan endringer, som bruker enheter med forskjellige funksjonen dimensjoner (f.eks, kanal bredder) eller egenskaper (f.eksform, antall åpne ender) bli erstattet etter behov. For eksempel er bruk av cellen skyttergravene som er åpne i begge ender (i stedet for på en ende, som den nåværende protokollen) brukt i andre studier1,20,21. Skyttergravene som er åpne i begge ender unngå celle aldring fordi de er stadig blir fylt med nyfødte celler (i motsetning til mor maskiner, der eldste cellen spores og nyere celler blir skjøvet ut av kanalen), selv om det faktum at eldre celler er skjøvet ut begge ender vanligvis begrenser deres observasjonsstudier vindu til færre enn 10 generasjoner1,21. Vi vanligvis søker lenger observasjonsstudier vinduene (hundrevis av generasjoner) som en mor maskin, som gjør det mulig å måle selv memoryless prosesser som ventetid er eller hundrevis av generasjoner lange5. Vi har også brukt mor maskindesign for å observere celler som ikke vokser eksponentielt, som våre analyser av sporulation22. I slike tilfeller analysert flere celler gjennom veksten skyttergraver kan være meningsfullt22.
Mange av trinnene i protokollen er relativt tilgivende ved at de kan endres vesentlig påvirke protokollen utfallet. For eksempel, en tidligere versjon av protokollen kalles for rengjøring dekket glasset sekvensiell 10-min bad sonication trinn i 10 M KOH og deretter rent vann, men vi fant at god enhet bånd og drift ble oppnådd med det enklere isopropanol-basert rengjøringsprosessen beskrevet her. Hvis en binding problemet oppsto som cast mistanke on renslighet av dekket glasset, anbefales gå tilbake til en mer strenge rengjøring protokoll. Tilsvarende mens vi bruker et sentrifugering skritt for å maksimere celle lastes inn i cellen skyttergravene, kan rimelig full lasting oppnås selv uten dette trinnet forutsatt at svært konsentrert celler brukes for lessing steg. Dette alternativ strategi kan være spesielt nyttig for forskerne som ikke har en lett tilgjengelig sentrifuge adapter å spinne enheten. Igjen, ulike konsentrasjoner av passivating/smøring agent (BSA i denne protokollen) kan brukes; Vi bruk rutinemessig konsentrasjoner så høyt som 1 mg/mL. I tilfeller der en kan være følsomme for BSA kan akseptable resultater oppnås selv i fravær av en passivating agent. Faktisk, da vi bruker en microfluidic enhet for å undersøke sporulation, som krever celle sult, vi var bekymret at BSA kan fungere som en potensiell næringsstoffer til cellene, og så vi utelatt det fra middels strømmen uten observere noen betydelig bivirkninger22.
Spesielt, kan kontinuerlige flyten av middels gjennom innretningen framprovosere litt Norge sammenlignet med cellevekst i et lukket system, for eksempel en kolbe. For eksempel kan næringsstoffer eller sammensatte uttømming være utfordrende, som cellene kan ofte renovere spor forbindelser fra middels flyten. Ja, vi har observert at inducing celle sporulation via sult krever lengre tid i en microfluidic enhet enn i en bolle. På samme måte, vi har observert at induksjon energi stress bruker oxidative fosforylering decoupler karbonyl cyanid m-klorofenyl hydrazone (CCCP) krever several-fold høyere konsentrasjoner i microfluidic enheten enn rapportert i kolbe kultur 23. derfor noen optimalisering kan være nødvendig å oppnå tilfredsstillende resultater med ulike medium tilsetningsstoffer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette prosjektet ble finansiert av National Institutes of Health under GM018568. Denne protokollen ble utført delvis ved Center for nanoskala systemer (CNS), medlem av det nasjonale nanoteknologi koordinert infrastruktur nettverk (NNCI), som støttes av National Science Foundation under NSF prisen nr. 1541959. CNS er del av Harvard University. Mange takk er Thomas Norman og Nathan Lord for sitt arbeid med graviditet og fabrikasjon master malen som brukes for enhetene som vises her, og bygge den opprinnelige versjonen av apparatet. Vi takker Johan Paulsson for sine verdifulle samarbeidende råd og takke medlemmer av hans lab for råd og kontinuerlige forbedringer til bakteriell microfluidic apparatene.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | (240)4019862 | This is referred to as PDMS in the protocol. There are 2 components that are mixed at a 10:1 ratio |
| 0.75-mm biopsy punch | World Precision Instruments | 504529 | |
| 22 x 40 mm No. 1.5 cover glass | VWR | 48393 172 | |
| Plasma Etch PE-50 | Plasma Etch Inc. | PE-50 | Instrument used to bond PDMS to glass using oxygen plasma treatment |
| Tygon flexible tubing ID 0.02", OD 0.06" | Saint-Gobain PPL Corp. | AAD04103 | For the main part of the tubing, e.g. attached to the needles |
| Silicone Tubing, 0.04" ID, 0.085" OD | HelixMark Standard Silicone Tubing | 60-795-05 | For pinch valves and Y-junction connection |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100G | Used as passivation agent |
| ART Gel Pipet Tips (P200) | Molecular BioProducts | 2155 | For loading the device with medium and cells |
| Acrodisc 32-mm syringe filter with 5-μm Supor membrane | Pall Life Sciences | 4560 | For filtering cultures before device loading |
| 21-ga blunt needles, 1" | McMaster-Carr | 75165A681 | |
| Y connector with 200-series barbs, 1/16" ID tubing, polypropylene | Nordson Medical | Y210-6005 | The company is AKA Value Plastics |
| Eclipse Ti-E inverted microscope | Nikon | This unit has been discontinued by the manufacturer and is replaced by the Ti 2 E. | |
| LB Lennox | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Microfuge 18 | Beckman Coulter | 367160 | |
| Bacillus subtilis strain NCIB3610 | Bacillus Genetic Stock Center | 3A1 | wild-type parental strain modified for use in the experiments shown in this protocol |
| Gravity convection oven | VWR | 414005-106 | for curing PDMS and baking assembled devices |
| Scotch-Weld Epoxy Kit | 3M | 2216 B/A | may be used to bond a silicon wafer to an aluminum backing plate |
| Scotch Magic tape, 3/4" width | 3M | to clean dust from PDMS devices and to place over features to increase visibility (denoted "office tape" or "adhesive tape" in protocol) | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ800N | listed here as an example; nearly any stereomicroscope will do |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907 | To clean cover glass |
| Syring pump, 6 channel | New Era Pump Systems Inc. | NE-1600 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34120 | a brand of dust-free wipes |
References
- Moffitt, J. R., Lee, J. B., Cluzel, P. The single-cell chemostat: an agarose-based, microfluidic device for high-throughput, single-cell studies of bacteria and bacterial communities. Lab Chip. 12 (8), 1487-1494 (2012).
- Young, J. W., et al. Measuring single-cell gene expression dynamics in bacteria using fluorescence time-lapse microscopy. Nat Protoc. 7 (1), 80-88 (2011).
- Dusny, C., et al. Technical bias of microcultivation environments on single-cell physiology. Lab Chip. 15 (8), 1822-1834 (2015).
- Wang, P., et al. Robust growth of Escherichia coli. Curr Biol. 20 (12), 1099-1103 (2010).
- Norman, T. M., Lord, N. D., Paulsson, J., Losick, R. Memory and modularity in cell-fate decision making. Nature. 503 (7477), 481-486 (2013).
- Perestrelo, A. R., Aguas, A. C., Rainer, A., Forte, G. Microfluidic Organ/Body-on-a-Chip Devices at the Convergence of Biology and Microengineering. Sensors. 15 (12), Basel. 31142-31170 (2015).
- Johari, S., Nock, V., Alkaisi, M. M., Wang, W. On-chip analysis of C. elegans muscular forces and locomotion patterns in microstructured environments. Lab Chip. 13 (9), 1699-1707 (2013).
- Liu, J., et al. Coupling between distant biofilms and emergence of nutrient time-sharing. Science. 356 (6338), 638-642 (2017).
- Choi, C. H., et al. One-step generation of cell-laden microgels using double emulsion drops with a sacrificial ultra-thin oil shell. Lab Chip. 16 (9), 1549-1555 (2016).
- Weibel, D. B., Diluzio, W. R., Whitesides, G. M. Microfabrication meets microbiology. Nat Rev Microbiol. 5 (3), 209-218 (2007).
- Taheri-Araghi, S., Brown, S. D., Sauls, J. T., McIntosh, D. B., Jun, S. Single-Cell Physiology. Annu Rev Biophys. 44, 123-142 (2015).
- Karimi, A., Karig, D., Kumar, A., Ardekani, A. M. Interplay of physical mechanisms and biofilm processes: review of microfluidic methods. Lab Chip. 15 (1), 23-42 (2015).
- Yu, F. B., et al. Long-term microfluidic tracking of coccoid cyanobacterial cells reveals robust control of division timing. BMC Biol. 15 (1), 11 (2017).
- Campos, M., et al. A constant size extension drives bacterial cell size homeostasis. Cell. 159 (6), 1433-1446 (2014).
- Taheri-Araghi, S., et al. Cell-size control and homeostasis in bacteria. Curr Biol. 25 (3), 385-391 (2015).
- Siryaporn, A., Kim, M. K., Shen, Y., Stone, H. A., Gitai, Z. Colonization, competition, and dispersal of pathogens in fluid flow networks. Curr Biol. 25 (9), 1201-1207 (2015).
- Connell, J. L., et al. Probing prokaryotic social behaviors with bacterial "lobster traps". MBio. 1 (4), (2010).
- Long, Z., et al. Measuring bacterial adaptation dynamics at the single-cell level using a microfluidic chemostat and time-lapse fluorescence microscopy. Analyst. 139 (20), 5254-5262 (2014).
- Okumus, B., et al. Mechanical slowing-down of cytoplasmic diffusion allows in vivo counting of proteins in individual cells. Nat Commun. 7, 11641 (2016).
- Teng, S. W., Mukherji, S., Moffitt, J. R., de Buyl, S., O'Shea, E. K. Robust circadian oscillations in growing cyanobacteria require transcriptional feedback. Science. 340 (6133), 737-740 (2013).
- Baker, J. D., et al. Programmable, Pneumatically Actuated Microfluidic Device with an Integrated Nanochannel Array To Track Development of Individual Bacteria. Anal Chem. 88 (17), 8476-8483 (2016).
- Russell, J. R., Cabeen, M. T., Wiggins, P. A., Paulsson, J., Losick, R. Noise in a phosphorelay drives stochastic entry into sporulation in Bacillus subtilis. EMBO J. 36 (19), 2856-2869 (2017).
- Cabeen, M. T., Russell, J. R., Paulsson, J., Losick, R. Use of a microfluidic platform to uncover basic features of energy and environmental stress responses in individual cells of Bacillus subtilis. PLoS Genet. 13 (7), e1006901 (2017).
