Summary
Se presenta un método para el análisis de microfluídica de linajes de células bacterianas individuales utilizando Bacillus subtilis como ejemplo. El método supera las deficiencias de los tradicionales métodos analíticos en Microbiología por lo que permite la observación de cientos de generaciones de celular bajo condiciones de crecimiento muy uniforme y controlable.
Abstract
Tecnología de microfluidos supera muchas de las limitaciones a los métodos analíticos tradicionales en Microbiología. A diferencia de los métodos de cultivo a granel, ofrece resolución de unicelular y observación larga épocas que abarca cientos de generaciones; a diferencia de agarosa microscopia basada en pad, tiene condiciones de crecimiento uniforme que pueden ser bien controladas. Porque el continuo flujo de medio de cultivo aísla las células en un dispositivo de microfluidos de variaciones impredecibles en el ambiente químico local causado por el crecimiento celular y metabolismo, auténticos cambios en la expresión génica y crecimiento celular en respuesta a estímulos específicos pueden observarse con más confianza. Bacillus subtilis se utiliza aquí como una especie bacteriana de modelo para demostrar una "máquina de la madre"-tipo de método para el análisis celular. Mostramos cómo construir vertical un dispositivo de microfluidos, cargar con las células, iniciar la proyección de imagen microscópica y exponer las células a un estímulo por la conmutación de un medio a otro. Un reportero sensible al estrés se utiliza como ejemplo para revelar el tipo de datos que pueden obtenerse por este método. También discutimos brevemente más aplicaciones de este método para otros tipos de experimentos, tales como análisis de esporulación bacteriana.
Introduction
Una de las características más llamativas de la vida en la tierra es su gran resistencia y variedad. Una meta central de la biología molecular es comprender la lógica por la que las células utilizan genes y proteínas para maximizar su crecimiento y aptitud bajo una amplia variedad de condiciones ambientales. Para lograr este objetivo, los científicos deben ser capaces de observar con confianza cómo las células individuales crecen, dividirán y expresan sus genes en un conjunto dado de condiciones, observando cómo las células responden a los cambios posteriores en su entorno. Sin embargo, los métodos analíticos tradicionales en Microbiología tienen limitaciones técnicas que afectan los tipos de preguntas que pueden abordarse. Por ejemplo, a granel los análisis basados en la cultura han sido muy útiles en los años, sin embargo, ofrecen sólo datos a nivel de población que pueden enmascarar variaciones significativas de célula a célula o los comportamientos de las subpoblaciones más pequeñas de las células en una población total. Análisis unicelular de bacteria viva basada en microscopía de luz revelan comportamiento unicelular pero también técnicamente limitados. Las bacterias generalmente son inmovilizadas sobre soportes de agarosa que contienen medio de cultivo, pero multitudes de crecimiento y la división de la célula Vista microscópica y agotan los nutrientes disponibles después de pocos ciclos de célula, limitando sustancialmente el tiempo de observación1, 2. Por otra parte, la depleción local de nutrientes y la acumulación concomitante de subproductos metabólicos debido al crecimiento de la célula cambian constantemente el ambiente de crecimiento de célula local en formas que son difíciles de medir o predecir. Tales cambios ambientales usando teclas de agarosa representan un desafío a los estudios de comportamiento de estado estacionario o de respuestas celulares a cambios específicos en las condiciones de crecimiento3.
Tecnología de microfluidos, en el que un medio líquido continuamente es atravesado recientemente dispositivos, ofrece una solución a las limitaciones experimentales clásicos. Un dispositivo microfluídico puede mantener células individuales en posición para microscopía de células vivas, mientras que el flujo del medio de cultivo constante proporciona células con nutrientes frescos y remueve exceso células, creando así un crecimiento más uniforme y subproductos metabólicos medio ambiente. En condiciones de constante crecimiento, se observan comportamientos celulares en aislamiento de la influencia de factores ambientales, que permite una vista sin obstáculos de la lógica interna de las células. Como el fluido evita que el dispositivo de microfluidos cada vez lleno de células, observación de los linajes de la célula para decenas o cientos de generaciones se convierte en posible4,5. Los tiempos de observación largos permiten la detección de comportamientos de otra manera imperceptible celular a largo plazo o rara. Finalmente, la composición del medio que fluye a través del dispositivo puede modificarse a voluntad, permitiendo que las células a observar como responden a la aparición de un estrés o a la introducción o extracción de un compuesto particular.
Microfluídica ya ha disfrutado de una serie de aplicaciones importantes. Por ejemplo, se ha utilizado en tejido, órgano o cuerpo-en-un-chip de dispositivos, en el que varios tipos de células humanas se cultivan conjuntamente para simular un en vivo condición6; para el estudio de nematodos movimiento en entornos microestructurada7; examinar las interacciones entre biopelículas bacterianas (p. ej., 8); y para la encapsulación y la manipulación de volúmenes pequeños de las células o sustancias químicas (p. ej., 9). Dispositivos microfluídicos también han hecho cada vez más populares en el campo de la microbiología (por excelentes críticas, véase 10 y 11), especialmente como su físico y las propiedades de flujo son bien emparejados a nichos microbianos naturales12. Por ejemplo, microfluídica ha sido recientemente empleada por microbiólogos para tales fines como célula crecimiento y la división13,14,15, análisis de movimiento del patógeno16, que mide precisamente control de detección de quórum17 y18de las transiciones fisiológicas y para la proteína contando19, entre muchos otros ejemplos. El método presentado aquí está diseñado específicamente para el análisis de los linajes de la célula bacteriana en lugar de combinaciones de cepas o especies. El dispositivo de microfluidos demostrado aquí utiliza una variación de la "máquina de la madre" diseño4, en el cual las células se cultivan solo archivo dentro de una zanja de microfluidos con un extremo cerrado y un extremo abierto; División y crecimiento celular empuja a las células de la progenie arriba y hacia afuera el extremo abierto en el fluido. Los análisis suelen centran sólo en la célula "madre" que se limita en el extremo cerrado de la zanja. Consideramos este método como un adelanto sobre anteriores luz basadas en microscopia sola célula técnicas analíticas, tales como inmovilización de células en agarosa almohadillas. Mientras que B. subtilis se utiliza como un modelo, el método es también aplicable a otras especies bacterianas (Escherichia coli es otro modelo común, algunas especies con células diferentes tamaños y morfologías pueden requerir la fabricación de nuevos dispositivos con diferentes dimensiones). El uso de reporteros fluorescentes para marcar las células y visualizar los cambios en la expresión génica requiere el uso de especies genéticamente manejables; sin embargo, los análisis de morfología y crecimiento de la célula son posibles incluso sin marcadores fluorescentes.
El presente Protocolo excluye el proceso de fabricación del maestro de silicio mediante Fotolitografía, que ha sido ampliamente descrito en otra parte5; maestros también pueden ser fácilmente subcontratados de microfabricación instalaciones. Incluye el moldeado de un dispositivo PDMS de un maestro de silicio reforzada; vinculación el dispositivo a un pedazo de vidrio de la cubierta; montaje de la entrada de microfluidos y tubería de salida, válvulas de pellizco incluido para permitir el cambio de medio; apaciguando el dispositivo, preparar células bacterianas y cargar el dispositivo con las células bacterianas; al conectar las tuberías para el dispositivo y equilibra las células; y cargar el dispositivo en un microscopio de fluorescencia para la proyección de imagen. Porque muchos de imagen diferente de adquisición y procesamiento software herramientas pueden utilizarse para visualizar y analizar diferentes datos de interés4,5, se muestran imágenes de ejemplo, pero los métodos de captura de imagen no están incluidos en este protocolo.
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Protocol
1. PDMS dispositivo Casting
- En un ambiente libre de polvo, mezclar polímeros PDMS y agente endurecedor en una proporción 10:1 y desgasificación bajo vacío durante al menos 10 minutos.
- Coloque un maestro de silicio (o una réplica de epoxy o de poliuretano mismo) en un pedazo de papel de aluminio intacto en una placa de Petri de poliestireno. Vierta la mezcla desgasificada de PDMS sobre el amo a una profundidad de aproximadamente 5 mm. Degas la placa de Petri durante al menos 10 min uso un chorro suave de aire para romper burbujas superficiales.
Nota: Las dimensiones de los dos niveles del dispositivo utilizado son proporcionadas de los CAD archivo5 (véase la archivo adicional 1). Una réplica de plástico master puede flotar parcialmente durante la desgasificación; Si esto ocurre, presione hacia abajo la réplica con un aplicador de plástico. - Cura la PDMS para al menos 1 h en una estufa a 60 ° C y enfriar a temperatura ambiente. Quitar la lámina de aluminio que contiene el PDMS maestro y curado de la placa de Petri. Retire cuidadosamente el papel de aluminio de la parte posterior del maestro, luego Pelar cuidadosamente el PDMS del maestro.
Nota: Como alternativa, PDMS puede curar durante la noche a temperatura ambiente. La relativa fragilidad de un maestro de la oblea de silicio se puede superar mediante el uso de adhesivo epoxi para unir permanentemente la oblea a un 1/16 de pulgada-disco de aluminio de espesor de la misma medida de la oblea. - Como una oblea por lo general incluye varios dispositivos microfluídicos con dimensiones ligeramente diferentes (véase la archivo adicional 1), corte de un solo dispositivo a la medida utilizando un bisturí limpio y afilado.
Nota: Para la rutina de trabajo B. subtilis , utilizar dispositivos con trincheras de 1.0 μm de toda célula, que están marcados con una C o F en el archivo de CAD.
2. dispositivo de perforación y de la vinculación
- Lugar un pedazo de oficina translúcida de la cinta (véase Tabla de materiales) sobre el lado del estampado del dispositivo para mejorar la visibilidad de las características modeladas. Los puertos de entrada y salida se identifican como áreas circulares en los extremos opuestos de los canales fluídicos visibles (figura 1). Para mejorar su visibilidad al perforar los agujeros en el dispositivo para los pines de entrada y de salida, marque las entradas y salidas con puntos con un marcador de punta fina.
Nota: Para asegurarse de que los pines de entrada y salida no se llena de gente, todos los otros canales es perforado, empezando con el canal justo debajo el designador alfabético para el dispositivo. - El dispositivo PDMS del tirón por lo que es la parte estampada hacia abajo y perforar a través del dispositivo a los puntos marcados con un punzón de biopsia de 0,75 mm; descartar la rotura.
Nota: Los dispositivos se perforan con el estampado hacia abajo porque el agujero generado por el punzón de biopsia típicamente ligeramente acampanado en el punzón entra en el polímero. El dispositivo en una orientación invertida de perforación asegura que el agujero en el lado estampado tiene un borde afilado. - Mediante un estereomicroscopio, asegúrese de que los orificios perforados se traslapan con las áreas de entrada y salida del dispositivo. Utilice unas pinzas de punta fina para quitar cualquier fragmentos extraños de PDMS de los agujeros perforados.
- Utilice cinta adhesiva para quitar el polvo de ambos lados del dispositivo y coloque en una placa de Petri Poliestireno limpio. Preparar un vaso de tapa 22 x 40 mm mojando con 100% de alcohol isopropílico y frotando con un trapo para salas blancas; seca con un chorro de aire libre de polvo o de nitrógeno.
- Colóquela perforado PDMS dispositivo característica lo para arriba junto con el cristal limpio en un plasma de oxígeno.
- Plasma-tratar el dispositivo con los ajustes siguientes: vacío, mTorr 70; O presión de2 , 200 mTorr; duración, 15 s; potencia 30 w. inmediatamente después de que termine el período de tratamiento de plasma, quite el dispositivo y la cubierta de vidrio del plasma limpiador.
- Invierta el PDMS y coloque en el centro del vidrio de cubierta de modo que el lado estampado contacto con el vidrio; Asegúrese de que los canales de alimentación (corriente entre la entrada y salida) están alineados con el eje largo del cubierta de vidrio. Presione muy suavemente para asegurar los sellos PDMS contra el vidrio.
- Hornear el dispositivo montado en un horno por al menos 1 h a 60 ° C. Después de la cocción, verificar manualmente que el PDMS es adheridos al vidrio presionando suavemente en una esquina del dispositivo.
Nota: Una vez que el dispositivo se enlaza, se debe utilizar dentro de 24 h, como el polímero será cada vez más hidrofóbico con el aumento de tiempo después del tratamiento de plasma.
3. Preparación-Plomería de microfluidos
- Cortar tiras de polímero (diámetro interno (ID) 0.02 pulgadas, diámetro exterior (OD) 0.06 pulgadas) de la tubería en longitudes apropiadas para llegar a de la bomba de jeringa al aparato de conmutación (si se utiliza) y el dispositivo cuando se monta en el microscopio. Cortar tantas tiras como carriles de microfluidos.
- Ensamblar a uniones Y válvulas de manguito (si se usa) por el corte y colocación longitudes de 2 cm de silicona flexible tubo (0,03 pulgadas ID, 0,065 pulgada OD) las lengüetas superiores de la "Y" y longitudes de 1 cm de tubo de silicona a la lengüeta de la parte inferior de la "Y".
- Cortar tiras de 10 cm (o adecuados) de tubería de polímero; unirlos en un extremo para el interruptor de cruce, insertándolos en los segmentos de tubo de silicona de 1 cm de la lengüeta de la parte inferior de la "Y". Conectar en el otro extremo las agujas 21G que se han quitado de sus adaptadores de jeringa de plástico y doblado aproximadamente 90 ° aproximadamente 9 mm desde el extremo de la aguja.
- Conectar agujas embotadas 21G a uno de los extremos de los segmentos de tubería que se desarrollará desde las jeringas al aparato interruptor insertando las agujas en la tubería. Inserte los otros extremos de cada tramo de tubería en los segmentos de tubo de silicona en las barbas de la entrada de las ensambladuras Y.
Nota: Usar a algún tipo de aparato para fijar las válvulas de manguito y uniones; Esto puede hacerse fácilmente de una caja de punta de micropipeta (Figura 2D). - Corte longitudes de tubería de polímero para llevar residuos desde la salida del dispositivo de un vaso de precipitados de residuos. Conecte en un extremo para doblado agujas de 21G, preparado como se describió anteriormente. Con cinta adhesiva el otro extremo de los tubos en un vaso de residuos.
- Preparar volúmenes apropiados de los medios de comunicación que contiene 0,1 mg/mL albúmina sérica bovina (BSA) y llenar el tamaño y el número de jeringuillas. Conectar las jeringas cargadas de BSA para las agujas de 21G preparado adjunta a las jeringuillas de la tubería y la carga de entrada en las bombas de jeringa.
Nota: para los experimentos típicos se utilizan 5 canales del dispositivo, cada uno con una jeringa de 20 mL. Un experimento en el que esté en el medio requiere 2 bancos de 5 jeringas. Aquí, la bomba que contiene el primer banco se conoce como la bomba de la fase 1 y la bomba que contiene el segundo banco, con el interruptor posterior al medio, se conoce como la bomba de la fase 2. - Purgar el aire de las tuberías de entrada mediante la ejecución de las bombas de jeringa a una velocidad de flujo alta (> 500 μl/min), comenzando por las bombas de jeringa de orientación vertical y golpeando ligeramente la jeringa para hacer burbujas de aire en la parte superior. Una vez que ha sido purgar el aire de las jeringas, coloque la bomba de jeringa horizontalmente y progresivamente tap u hojear las líneas de polímeros de las jeringuillas hasta el aparato conmutador para desalojar las burbujas de aire. Repita este proceso para el segundo banco de jeringas (si el cambio de los medios de comunicación).
- Después se purgan las burbujas de aire, ajustar la bomba de jeringa de fase-2 (es decir, con el medio que se utilizará en segundo lugar, después el interruptor) a 1,5 μl/min, luego hacer una pausa en el flujo. Colocar clips de carpeta pequeño en los segmentos de tubería flexible en la rama de las ensambladuras Y correspondiente a la segunda fase media. Continuar funcionando la bomba de la jeringuilla de la fase 1 con un modesto caudal (por ejemplo, 10 μl/min) durante al menos 30 minutos purgar el segundo medio de la tubería de entrada aguas abajo de la intersección Y.
4. célula cultura preparación
- Crecen durante la noche, planas de la cepa de interés en el medio deseado para la fase estacionaria. La cepa bacteriana debe contener una mutación que hace que las células inmóviles, por lo que las células no bañarse fuera de los canales del dispositivo.
Nota: En el presente Protocolo, la cepa bacteriana es B. subtilis 3610 que contiene un hagA233V sustitución (esta mutación hace que el flagelo sea recto en lugar de motilidad celular helicoidal, prevención), un PrsbV- mNeonGreen reportero de células estresadas y constitutiva Phyperspank- mNeptune (rojo) reportero para resaltar celdas. Medio de Lennox LB se utiliza en el protocolo de ejemplo. Las cepas típicas para experimentos de microfluídica contienen uno o más reporteros transcripcionales fluorescentes y una proteína fluorescente constitutivamente producida, citoplásmica para facilitar la detección automatizada de las células. Defectos de crecimiento no fueron observados cuando se utilizó medio rico LB Lennox, pero puede inhibir crecimiento de B. subtilis en medio mínimo bajo condiciones de microfluidos porque secretan sideróforos son arrastrados por el flujo medio. En tales circunstancias, crecimiento puede restaurarse mediante la adición de citrato de sodio y cloruro férrico en el medio, según lo divulgado para S750 medio11. - La mañana del experimento, diluir las células B. subtilis 1:50 a un desconcertado matraz de 250 mL conteniendo 25 mL de medio de cultivo. Crecen las células para 5-6 h en agitación cultivo a 37 ° C a una densidad óptica de más de 1.
Nota: Un cultivo denso celular es preferible porque la fase estacionaria B. subtilis células son más pequeñas y menos con frecuencia encontrados en células cadenas, facilitando la carga de dispositivo. Diferentes especies bacterianas pueden requerir otras condiciones medio o crecimiento de carga óptima. - Utilizando una jeringa equipada con un filtro de 5 μm tamaño de poro, filtro de aproximadamente 15 mL de cultivo de células en un tubo cónico de 15 mL para eliminar cadenas de células B. subtilis (no es necesaria para e. coli y puede no ser necesario con otras especies).
Nota: Deben removerse relativamente pocas células; el filtrado debe ser turbio. - Centrifugar el filtrado cultura durante 10 min a 4.000 x g a temperatura ambiente. Retirar el sobrenadante y resuspender el precipitado de células en el líquido sobrenadante residual restante en el tubo, agregar aproximadamente 500 μl de medio fresco si es necesario para facilitar el pipeteo de la suspensión de células.
5. dispositivo carga
- Suavemente Coloque vacíela fina micropipeta de carga de gel tips (véase Tabla de materiales) en los orificios de salida del dispositivo de microfluidos.
- Utilizando finas puntas de carga de gel con una micropipeta de P200, apaciguar el dispositivo mediante la inyección de medio que contiene 1 mg/mL BSA en los orificios de entrada, observando las puntas en los orificios de salida para controlar el relleno de los canales de microfluidos (figura 2A). Incubar el dispositivo a temperatura ambiente durante aproximadamente 5 minutos.
Nota: BSA se utiliza comúnmente como un agente bloqueando o estabilización que se unen a la superficie del polímero PDMS, aumentando su hidrofilicidad y reduciendo la fijación de otras proteínas o de células (a través de moléculas de superficie celular). - Utilizando finas puntas de gel-cargamento, carga cada canal con el resuspendido células (sección 4), con las puntas en el canal de salida para monitorear el progreso de las células a través del dispositivo (figura 2B).
Nota: Carga facilita el ajuste de las Micropipetas P200 a su volumen máximo 200 μl y luego aspirando un cojín de aire antes de aspirar un volumen pequeño (aproximadamente la mitad el volumen de la sección fina de la punta de la pipeta) de las células. El volumen de las células resuspendidos no necesita ser exacto, como el volumen del dispositivo PDMS es pequeño en relación a la de la micropipeta. Conocemos ningún límite superior a la densidad de las células resuspendidas, como la suspensión de células se puede pipetearse en el dispositivo. Grupos de células pueden obstruir el y deben evitarse por pipeteo cuidadoso o vórtice de mezcla. - Retire suavemente las puntas de carga de gel de los orificios de salida, uno a la vez para evitar daños en el dispositivo de trabajo.
- Centrifugue el dispositivo en una microcentrífuga de sobremesa en un adaptador rotor correspondiente a aproximadamente 6.000 x g por 10 min (figura 2).
Nota: Se utilizó un adaptador de rotor de aluminio trabajados a máquina de encargo que fue diseñado para caber en un rotor de microcentrífuga (figura 2); modelos diferentes centrífuga pueden utilizarse con los adaptadores correspondientes del rotor. La característica importante del adaptador es que proporciona fuerza lateral en la dirección de los extremos cerrados de las trincheras de la célula, obligando así a las células en los canales laterales. - Verificar carga exitosa bajo el microscopio (figura 3) pero sin poner el dispositivo a la escena titular diapositiva insertar.
Nota: En este protocolo, un 60 X, 1.4 objetivo de inmersión en aceite NA Ph3 se utiliza para la verificación de ambos en esta etapa y para la proyección de imagen posterior.
6. montaje, equilibrado y montaje de dispositivo
- Montar cuidadosamente el dispositivo cargado en una etapa de inserción con una cinta del vidrio de cubierta en ambos lados de PDMS en la parte inferior de la inserción de la etapa (es decir, invertir el inserto de fase antes de conectar el dispositivo). Invierta la Asamblea de insertar dispositivo de etapa para que el PDMS es hacia arriba y coloque sobre una superficie blanda, como un paño libre de polvo (Figura 2D).
- Ajustar el caudal de la bomba de la jeringuilla de la fase 1 a 35 μl/min trabajando con un carril a la vez, inserte la aguja de entrada y luego la aguja de salida (es decir, que el vaso de precipitados de residuos; Figura 2E).
- Limpie cualquier medio exceso con un trapo limpio libre de polvo y visualmente Inspeccione el dispositivo para fugas. Examinar el tubo de salida para la aparición de células exceso (normalmente aparece como una franja turbia) y el menisco medio, que se moverá lentamente hacia el vaso de precipitados de residuos.
- Permitir que el dispositivo para ejecutar a 35 μl/min durante aproximadamente 15-30 min, hasta que todos los carriles conectados se drenan en el vaso de precipitados de residuos.
- Ajustar la bomba de jeringa de fase 1 a 1,5 μl/min y el flujo de la pausa. Traer todo el aparato de bomba y dispositivo para el microscopio (este proceso es ayudado por colocar todo en un carro rodante) y reiniciar la fase-1 flujo medio en 1,5 μl/min montar cuidadosamente el inserto de la etapa con el dispositivo en un microscopio de fluorescencia invertido, utilizando cinta cuando sea necesario para la entrada y la tubería de salida de la ruta.
- Busque posiciones deseadas en el dispositivo para la proyección de imagen y comienza la proyección de imagen deseada. Tenga en cuenta que las células normalmente requieren unas horas (aproximadamente 10 generaciones) hasta llegar a estado estable fase exponencial crecimiento y puede retrasarse el inicio de la adquisición de la imagen como deseada para que la proyección de imagen comienza después del periodo de equilibrio.
Nota: El crecimiento de estado estacionario de células en fase exponencial debe verificarse durante el análisis de la imagen posterior seguimiento tiempos de división celular y asegurando que han alcanzado un valor mínimo constante.
7. medio de conmutación
- Entre las rondas sucesivas de proyección de imagen, hacer una pausa en el flujo de la bomba de la jeringuilla de la fase 1. Cuidadosamente retire los clips de la carpeta de la fase-2 silicona tubo, moviendo cada uno de los tubos de silicona en la rama de fase 1 de la ensambladura Y. Pausa el flujo de la fase 2 la jeringuilla de la bomba (que se estableció en 1,5 μl/min en el paso 3.8) y continuar la proyección de imagen.
Nota: A 1,5 μm/min con una longitud de 10 cm de polímero de la tubería aguas abajo de las uniones Y, el medio de la segunda fase llega el dispositivo en aproximadamente 50 minutos. El tiempo para el dispositivo puede probarse empíricamente utilizando los medios que contienen partículas trazadoras fluorescentes.
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Representative Results
Acertado de la célula inicial de carga, según lo determinado por microscopía de contraste de fase antes de conectar las tuberías de microfluidos al dispositivo, se consideraría que todos o casi todos los canales laterales de microfluidos que contiene una o más células bacterianas ( Figura 3A). Carga óptima mostraría varias células en cada canal y canales, sin embargo, se llenarán de células debido al crecimiento de la célula durante el período de equilibrio (figura 3B). Carriles con pobre carga, en la que relativamente pocos (< 50%) lado canales se cargan con las células, pueden utilizarse, pero la densidad de datos resultante será menor debido a menos linajes de la célula se va a examinar en cada posición de la imagen.
Una vez que el dispositivo se carga inicialmente, es equilibrado mediante la conexión de la plomería de microfluidos y flujo medio a través del dispositivo con un caudal relativamente alto de 35 μl/min. El paso de equilibrio sirve para eliminar burbujas de aire y células exceso en el canal de alimentación del dispositivo y a las células en los canales secundarios para comenzar a cultivar. Las células que se eliminan del dispositivo al flujo medio a menudo se observan a simple vista como una banda de color claro a través de la tubería de salida hacia el depósito de residuos; el movimiento de tales bandas sirve como un indicador visual que líquido fluye normalmente a través de la plomería y el dispositivo. Inspección microscópica de un dispositivo equilibrado debe revelar algunas células confinadas en solo archivo, en la mayoría de los canales laterales (figura 3B, 0 min).
Una vez que un dispositivo equilibrado se coloca en el microscopio bajo flujo a 1,5 μl/min a 37 ° C, las células reanudarán crecimiento fase exponencial uniforme y constante a lo largo de aproximadamente 2 h (figura 3B). Crecimiento exponencial constante debe ser verificado directamente después de análisis de imagen por el aspecto de una meseta en el tiempo de generación de las células. En este punto, las células están listas para fluorescencia o brightfield imágenes como se desee. Un dispositivo equilibrado y cargado con éxito por lo general puede ser confiablemente reflejado por períodos de al menos 24 h (Figura 4A, C). Introducción de un medio del interruptor (Figura 4A–C) amplía la gama de experimentos que pueden llevarse a cabo sino que también aumenta la frecuencia de eventos catastróficos de muerte celular (figura 4), probablemente mediante la introducción de aire burbujas que no purgó con éxito de la tubería. Otro evento que puede causar muerte celular catastrófico es que grupos de células situadas en la entrada pueden desplazarse y pasan por el canal de alimentación, como se muestra en la figura 4. No en la actualidad entendemos por qué esto causa muerte celular catastrófico en el dispositivo, y aún no hemos ideado un método para impedir este tipo de eventos.
Figura 1: esquema del dispositivo microfluídico. Un dispositivo esquemático se muestra aproximadamente a escala. El designador alfabético se etiqueta junto con las zonas de entrada y salida que se perforan para conectar las agujas de punta Roma. Normalmente, la mitad de los canales de modelado se utilizan (gris sombra). Las trincheras de la célula están orientadas hacia el indicador. El archivo de CAD (véase la archivo adicional 1) muestra todas las características del dispositivo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: microfluídicos dispositivo pasivación, carga de celular y equilibrado. (A) A servidumbre dispositivo después de la pasivación con medio que contiene BSA. Carga de gel tips estén en los orificios de salida para controlar el paso de células y el medio a través del dispositivo. El menisco medio es visible en la parte delgada de las puntas de carga de gel (flecha). (B) dispositivo después de la carga de la célula. Las células son visibles como una capa translúcida blanco en las puntas de carga de gel (flecha). Consejos (C) la carga de gel se quitan antes de centrifugación en un adaptador de centrífuga fabricados por encargo. Cinta médica (azul) se coloca en las partes de aluminio para amortiguar el dispositivo. (D) después de centrifugación y verificación de la carga, el dispositivo es pegado a un inserto de etapa del microscopio y conectado a los pines de entrada y salida. En la imagen que se muestra, medio de conmutación es posible por válvulas de manguito y conectores Y que están dispuestos en un aparato de una caja de punta de la micropipeta. (E) vista esquemática de un dispositivo montado todo, de las bombas de jeringa en el contenedor de residuos. El tubo de salida se ejecuta un pequeño vaso de precipitados de residuos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: la célula de carga y crecimiento en el dispositivo de microfluidos. (A) de izquierda a derecha, imágenes de contraste de fase de un dispositivo que contiene el medio sólo antes de la carga de la célula, el mismo dispositivo después de que las células se han añadido mediante pipeteo pero antes de la centrifugación y el mismo dispositivo después de la carga centrífuga. (B) curso del tiempo de adaptación de la célula y el crecimiento en el dispositivo (LB, 37 ° C, flujo 1.5 μl/min). Al principio de la adaptación, las células en fase estacionaria son relativamente corto y estrecho. Como las células se adaptan y volver a la fase exponencial de crecimiento (60-120 min), adoptan una morfología más largo y más ancha. Después de 120 minutos, todas las células en el dispositivo son reanudar crecimiento uniforme de la fase exponencial, y el dispositivo está listo para la proyección de imagen. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: la célula de crecimiento y el medio en el dispositivo de microfluidos. Kymographs (A) mostrando 550 min de crecimiento antes y 1.000 min de crecimiento después de un medio del interruptor (línea gris punteada) en etanol al 2% como un factor estresante. Imágenes fueron capturadas a intervalos de 10 minutos. El panel superior muestra un reportero mNeonGreen transcripcional (canal verde) para un gen inducida por estrés. El panel inferior muestra un reportero mNeptune constitutiva (canal rojo) que se utiliza en este caso para la segmentación de la célula automatizada. Ve el primer plano (B) de las porciones de las kymographs en el cuadro de puntos en el panel A, mostrando una respuesta transitoria en el canal verde siguiendo el medio del interruptor. Tenga en cuenta que el crecimiento continúa a través del interruptor, aunque la presencia del etanol hace que las células se convierten en más cortas y crecen a un ritmo ligeramente más lento. Escala de tiempo se muestra en la barra horizontal, y la distancia se muestra en la barra vertical. Ejemplo (C) traza de datos analizados de la fluorescencia de un linaje de la célula del experimento que se muestra en el panel A. Las líneas punteadas verticales indican el medio del interruptor en etanol al 2% como un factor estresante. (D) ejemplo de un error medio del interruptor. Cuando el segundo medio, alcanza las células, las células en los canales son sometidas a lisis. El interruptor es acompañado por un gran número de células que pasan en el canal principal, causando una señal fluorescente brillante (una imagen a escala correspondientes a la región descolorida se muestra justo encima de él). Después el interruptor, no hay más células se observan, aunque restos de células débilmente fluorescente sigue siendo en los canales. Escala de tiempo se muestra en la barra horizontal, y la distancia se muestra en la barra vertical. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este protocolo de la microfluídica es flexible en que muchos de los pasos pueden ser modificados para optimizar su uso con una determinada especie o cepa o para un propósito específico. De hecho, en este protocolo hemos hecho modificaciones a la "máquina de la madre" original concepto de4 para optimizar su uso con B. subtilis. A menudo, las trincheras que se limitan las células constituyen una característica de una sola capa, mientras que en el presente Protocolo utilizan zanjas de dos capas celulares, con un canal poco profundo que rodea las células. El diseño de dos capas se introdujo como una forma de maximizar el flujo de nutrientes y metabolitos desde las células B. subtilis , especialmente en largo (> 75 μm) trincheras5; sin embargo, características de una capa a menudo es suficiente para el crecimiento óptimo de la célula y son utilizados para e. coli, especialmente cuando son más cortas (~ 25 μm)4. Normalmente utilizamos más trincheras, ya que reducen la frecuencia con que las cadenas de células B. subtilis , que surgen estocástico, se tiran fuera de sus trincheras por el caudal medio de la alimentación principal canal5.
Otras modificaciones, tales como el uso de dispositivos con dimensiones diferentes característica (e.g., anchuras del canal) o características (por ejemplo, forma, número de extremos abiertos) pueden sustituirse según corresponda. Por ejemplo, el uso de trincheras que son abiertos en ambos extremos (y no en solamente un extremo, como en el presente Protocolo) de la célula se ha utilizado en otros estudios1,20,21. Zanjas abiertas en ambos extremos evitan envejecimiento celular porque constantemente se llenan con las células del recién nacidas (a diferencia de madre máquinas, donde la célula más antigua se realiza un seguimiento y nuevas células se empujan fuera del canal), aunque el hecho de que las células más viejas son empujadas por ambos extremos por lo general limitan su ventana de observación a menos de 10 generaciones1,21. Por lo general buscamos el más observacional windows (cientos de generaciones) ofrecido por una máquina de la madre, que permite medir procesos aún sin memoria para que tiempos de espera son decenas o cientos de generaciones de largo5. También hemos usado el diseño de la máquina madre para observar las células que no están creciendo exponencialmente, al igual que en nuestros análisis de esporulación22. En tales casos, las células adicionales durante todo su crecimiento trincheras pueden ser significativo analizadas22.
Muchos de los pasos en el protocolo son relativamente perdonar en que puede ser modificadas sin afectar sustancialmente los resultados del protocolo. Por ejemplo, una versión anterior del protocolo llamado para limpiar el vidrio de cubierta por pasos de sonicación secuencial de 10 minutos de baño en 10 M KOH y agua entonces pura, pero encontramos que buen dispositivo vinculación y operación fue alcanzada usando el más simple basado en isopropanol paso de limpieza descrito aquí. Si un problema de vinculación surgió esa suspicacia fundido en la limpieza de la cubierta de vidrio, volviendo a un protocolo de limpieza más estrictas se recomienda. Del mismo modo, mientras que utilizar un paso de centrifugación para maximizar la carga en las trincheras de la célula de la célula, carga razonablemente completa se logra incluso sin este paso, siempre que las células muy concentradas se utilizan para el paso de carga. Esta estrategia alternativa podría ser especialmente útil para los investigadores que no tienen un adaptador disponible centrífuga para girar el dispositivo. Otra vez, pueden utilizarse diferentes concentraciones de agente pasivado/lubricantes (BSA en este protocolo); habitualmente se utilizan concentraciones tan altas como 1 mg/mL. En casos donde una cepa puede ser sensible a la BSA, se pueden lograr resultados aceptables incluso en la ausencia de un agente de pasivación. De hecho, cuando estábamos usando un dispositivo de microfluidos para examinar la esporulación, que requiere el hambre celular, nos preocupaba que BSA puede actuar como una fuente potencial de nutrientes para las células, y así nos lo omitido en el flujo medio sin observar ningún substancial efectos adversos22.
En particular, el flujo continuo del medio a través del dispositivo puede producir fenotipos ligeramente diferentes en comparación con el crecimiento de la célula en un sistema cerrado, como un matraz. Por ejemplo, agotamiento de nutrientes o compuesto puede ser un desafío, como las células a menudo pueden compactar los compuestos traza de flujo medio. De hecho, hemos observado que induce la esporulación la célula vía hambre requiere más tiempo en un dispositivo de microfluidos que en un matraz. Asimismo, hemos observado que la inducción de la tensión de la energía mediante la fosforilación oxidativa desacoplamiento carbonilo cianuro m-clorofenil hidrazona (CCCP) requiere múltiples concentraciones más altas en el dispositivo de microfluidos que registrados en la cultura de matraz 23. por lo tanto, se requiera alguna optimización para conseguir resultados satisfactorios con diversos añadidos medio.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este proyecto fue financiado por los institutos nacionales de salud en GM018568. Este protocolo fue realizado en parte en el centro de sistemas de nanoescala (CNS), un miembro de la nacional nanotecnología coordinada infraestructura red (NNCI), que es apoyado por la National Science Foundation bajo premio NSF no. 1541959. CNS es parte de la Universidad de Harvard. Muchas gracias son debido a Thomas Norman y Nathan Lord por su trabajo en la concepción y fabricación de la plantilla principal utilizada para los dispositivos que se muestra aquí y en la construcción de la versión original del aparato. También agradecemos sus valiosos consejos de colaboración de Johan Paulsson y gracias a los miembros de su laboratorio para su asesoramiento y mejoras continuas para aparatos de microfluidos bacteriana.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | (240)4019862 | This is referred to as PDMS in the protocol. There are 2 components that are mixed at a 10:1 ratio |
| 0.75-mm biopsy punch | World Precision Instruments | 504529 | |
| 22 x 40 mm No. 1.5 cover glass | VWR | 48393 172 | |
| Plasma Etch PE-50 | Plasma Etch Inc. | PE-50 | Instrument used to bond PDMS to glass using oxygen plasma treatment |
| Tygon flexible tubing ID 0.02", OD 0.06" | Saint-Gobain PPL Corp. | AAD04103 | For the main part of the tubing, e.g. attached to the needles |
| Silicone Tubing, 0.04" ID, 0.085" OD | HelixMark Standard Silicone Tubing | 60-795-05 | For pinch valves and Y-junction connection |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100G | Used as passivation agent |
| ART Gel Pipet Tips (P200) | Molecular BioProducts | 2155 | For loading the device with medium and cells |
| Acrodisc 32-mm syringe filter with 5-μm Supor membrane | Pall Life Sciences | 4560 | For filtering cultures before device loading |
| 21-ga blunt needles, 1" | McMaster-Carr | 75165A681 | |
| Y connector with 200-series barbs, 1/16" ID tubing, polypropylene | Nordson Medical | Y210-6005 | The company is AKA Value Plastics |
| Eclipse Ti-E inverted microscope | Nikon | This unit has been discontinued by the manufacturer and is replaced by the Ti 2 E. | |
| LB Lennox | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Microfuge 18 | Beckman Coulter | 367160 | |
| Bacillus subtilis strain NCIB3610 | Bacillus Genetic Stock Center | 3A1 | wild-type parental strain modified for use in the experiments shown in this protocol |
| Gravity convection oven | VWR | 414005-106 | for curing PDMS and baking assembled devices |
| Scotch-Weld Epoxy Kit | 3M | 2216 B/A | may be used to bond a silicon wafer to an aluminum backing plate |
| Scotch Magic tape, 3/4" width | 3M | to clean dust from PDMS devices and to place over features to increase visibility (denoted "office tape" or "adhesive tape" in protocol) | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ800N | listed here as an example; nearly any stereomicroscope will do |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907 | To clean cover glass |
| Syring pump, 6 channel | New Era Pump Systems Inc. | NE-1600 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34120 | a brand of dust-free wipes |
References
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