Summary
Nous présentons une méthode pour l’analyse de la microfluidique de lignées de cellules bactériennes individuelles à l’aide de Bacillus subtilis à titre d’exemple. La méthode surmonte les lacunes des méthodes traditionnelles d’analyse en microbiologie en permettant l’observation de centaines de générations de cellules dans des conditions de croissance étroitement contrôlable et uniforme.
Abstract
La technologie Microfluidic surmonte beaucoup des restrictions aux méthodes traditionnelles d’analyse en microbiologie. Contrairement aux méthodes de culture en vrac, il offre une résolution de cellule unique et longue observation times s’étendant sur des centaines de générations ; à la différence d’agarose microscopie axée sur le pavé, il a des conditions de croissance uniforme qui peuvent être contrôlées. Parce que le flux continu de milieu de croissance isole les cellules dans un dispositif microfluidique de variations imprévisibles dans l’environnement chimique local causée par la croissance des cellules et du métabolisme, authentiques changements dans l’expression des gènes et la croissance des cellules en réponse à des stimuli spécifiques peuvent être observés avec plus de confiance. Bacillus subtilis est utilisé ici comme une espèce de bactérie modèle afin de démontrer une « machine de la mère »-méthode d’analyse cellulaire de type. Nous montrons comment construire et sonder un dispositif microfluidique, chargez-le avec cellules, initier l’imagerie microscopique et exposer des cellules à un stimulus en passant d’un milieu à l’autre. Un journaliste sensibles aux stress est utilisé comme un exemple de révéler le type de données qui pourraient être obtenus par cette méthode. Nous discutons également brièvement plus loin les applications de cette méthode pour d’autres types d’expériences, telles que l’analyse de la sporulation bactérienne.
Introduction
Une des caractéristiques plus frappantes de la vie sur terre est sa grande résistance et sa variété. Un objectif central de la biologie moléculaire est de comprendre la logique par lequel les cellules utilisent gènes et protéines pour maximiser leur croissance et leur condition physique sous une grande variété de conditions environnementales. Pour atteindre cet objectif, les scientifiques doivent pouvoir observer en toute confiance comment les cellules individuelles se développent, divisent et expriment leurs gènes sous un ensemble donné de conditions, notant comment les cellules réagissent aux changements ultérieurs dans leur environnement. Toutefois, des méthodes analytiques traditionnelles en microbiologie ont des limitations techniques qui affectent les types de questions qui peuvent être abordées. Par exemple, les analyses axées sur la culture en vrac ont été très utiles au cours des années, mais ils offrent uniquement des données au niveau des populations qui peuvent masquer des variations significatives de cellule-cellule ou le comportement des petites sous-populations de cellules dans la population totale. Analyses de cellule unique de bactéries vivantes, basés sur la microscopie photonique révèlent unicellulaires comportement mais sont également limités techniquement. Bactéries sont généralement immobilisées sur agarose tampons contenant le milieu de croissance, mais la vue au microscope de cellules croissance et division des foules et épuise les nutriments disponibles après quelques cycles cellulaires, limitant considérablement l’observation heure1, 2. En outre, l’appauvrissement local de nutriments et de l’accumulation concomitante de sous-produits métaboliques en raison de la croissance des cellules changent constamment le milieu de croissance des cellules locales de manières qui sont difficiles à mesurer ou à prévoir. Ces changements environnementaux à l’aide de tampons d’agarose posent un défi aux études de comportements stationnaire ou des réponses cellulaires aux changements spécifiques dans des conditions de croissance3.
Technologie de microfluidique, dans lequel un milieu liquide est a coulé en continu au moyen de dispositifs microfabriques offre une solution aux limitations expérimentales classiques. Un dispositif microfluidique peut garder les cellules individuelles en position pour la microscopie des cellules vivantes tandis que la circulation de milieu de croissance constamment fournit des cellules avec des aliments frais et lave les sous-produits métaboliques et les cellules excédentaires, créant ainsi une croissance très homogène environnement. Dans des conditions de croissance constant, comportements cellulaires peuvent être observés dans l’isolement de l’influence des facteurs environnementaux, permettant une vue dégagée de la logique interne des cellules. Car l’écoulement du fluide empêche le dispositif microfluidique de devenir bondé de cellules, observation des lignées de cellules du même pour des dizaines ou des centaines de générations devient possible4,5. Ces périodes d’observation longue de permettre la détection des comportements autrement indécelables cellules rares ou à long terme. Enfin, la composition du milieu qui traverse l’appareil peut être modifié à volonté, permettant aux cellules à observer car ils réagissent à l’apparition d’un stress ou à l’introduction ou la suppression d’un composé particulier.
Microfluidique jouit déjà d’un certain nombre d’applications importantes. Par exemple, il a été utilisé dans les tissus, orgue ou dispositifs de corps-on-a-chip, dans laquelle plusieurs types de cellules humaines sont conjointement cultivés pour simuler un en vivo condition6; pour l’étude du mouvement de nématodes dans les environnements microstructurées7; pour examiner les interactions entre les biofilms bactériens (par exemple, 8) ; et pour l’encapsulation et la manipulation de petits volumes de cellules ou de produits chimiques (p. ex., 9). Dispositifs microfluidiques sont également devenus plus en plus populaires dans le domaine de la microbiologie (pour les excellentes critiques, voir 10 et 11), surtout que leur physique et les propriétés d’écoulement sont bien assorties aux niches microbiennes naturelles12. Par exemple, microfluidique a été récemment employée par microbiologistes à de telles fins comme mesure précisément cellule croissance et division13,14,15, analyse de mouvement pathogène16, suivi quorum télédétection17 et physiologiques transitions18et pour la protéine comptant19, parmi beaucoup d’autres exemples. La méthode présentée ici est spécialement conçue pour l’analyse des lignages cellulaires bactérienne unique plutôt que des combinaisons de souches ou espèces. Le dispositif microfluidique démontré ici utilise une variante de la « machine à mère » design4, dans lequel les cellules croissent monofichier dans une tranchée de microfluidique avec une extrémité fermée et une extrémité ouverte ; Division et la croissance des cellules pousse les cellules de la progéniture et se détache de l’extrémité ouverte dans l’écoulement du fluide. En général, nos analyses se concentrent uniquement sur la cellule « mère » qui se limite à l’extrémité fermée de la tranchée. Nous considérons cette méthode comme une promotion au cours de la précédentes lumière axée sur la microscopie unicellulaire des techniques analytiques, telles que l’immobilisation de la cellule sur des tampons en gel d’agarose. B. subtilis est utilisé comme un modèle ici, la méthode est également applicable aux autres espèces de bactéries (Escherichia coli est un autre modèle commun ; certaines espèces avec des tailles de cellules différentes ou morphologies peuvent demander la fabrication de nouveaux dispositifs avec des dimensions différentes). L’utilisation de reporters fluorescentes pour marquer les cellules et de visualiser les changements dans l’expression des gènes nécessite l’utilisation d’espèces génétiquement docile ; Toutefois, les analyses de la croissance cellulaire et de morphologie sont possibles même sans marqueurs fluorescents.
Le présent protocole exclut du processus de fabrication du maître de silicium à l’aide de photolithographie, qui a été largement décrite ailleurs5; maîtres peuvent également être facilement externalisées par les installations de microfabrication. Il comprend le moulage d’un dispositif PDMS issu d’un master de silicium renforcée ; collage de l’appareil à un morceau de verre ; montage de l’entrée de la microfluidique et la plomberie de sortie, y comprises pincée vannes afin de permettre la commutation moyenne ; passivation de l’appareil, la préparation des cellules bactériennes et charger l’appareil avec des cellules bactériennes ; fixation de la plomberie pour le périphérique et équilibration des cellules ; et le chargement de l’appareil sur un microscope à fluorescence pour l’imagerie. Parce que beaucoup d’acquisition d’images différentes et traitement logiciel outils peuvent être utilisés pour visualiser et analyser les différentes données d’intérêt4,5, exemple image sont affichées, mais les méthodes de capture d’image ne sont pas inclus dans le présent protocole.
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Protocol
1. PDMS dispositif Casting
- Dans un environnement sans poussière, mélange polymère PDMS et salaison à un ratio de 10:1 et dégazer sous vide pendant au moins 10 min.
- Placer un maître de silicium (ou une réplique époxy ou polyuréthane) sur un morceau de papier d’aluminium ininterrompue dans un polystyrène de Pétri. Versez le mélange PDMS dégazé sur le maître à une profondeur d’environ 5 mm. Degas le Pétri pendant au moins 10 mn utilisation un léger courant d’air pour casser les bulles de surface.
Remarque : Les dimensions de l’appareil à deux niveaux utilisé sont fournies en l’accompagnant CAD dossier5 (voir fichier complémentaire 1). Un maître de la réplique en plastique peut-être flotter partiellement au cours de dégazage ; dans ce cas, abaissez la réplique avec un applicateur plastique propre. - Guérir le PDMS pendant au moins 1 h dans un four à 60 ° C et laisser refroidir à température ambiante. Retirer le papier d’aluminium contenant le PDMS maître et soigné de la plaque de Petri. Décollez délicatement le papier d’aluminium à l’arrière du maître, puis peler soigneusement le PDMS du maître.
Remarque : Vous pouvez également PDMS peut être guérie du jour au lendemain à température ambiante. La fragilité relative d’un maître plaquette de silicium peut-être être surmontée à l’aide de colle époxy pour coller en permanence l’hostie à un 1/16 de pouce-disque en aluminium épais de la même taille que la plaquette. - Comme une plaquette comprend généralement plusieurs dispositifs microfluidiques avec des dimensions légèrement différentes (voir 1 de fichier supplémentaire), coupe un seul appareil à la taille à l’aide d’un scalpel propre et net.
NOTE : Pour la routine de travail de b. subtilis , utiliser périphériques avec tranchées 1,0 µm-échelle cellulaire, qui sont marquées avec un C ou F dans le fichier CAD.
2. dispositif de poinçonnage et de collage
- Place un morceau de bureau translucide ruban adhésif (voir Table des matières) sur le côté motif de l’appareil pour améliorer la visibilité des motifs caractéristiques. Les ports d’entrée et de sortie sont identifiées comme zones circulaires aux extrémités des canaux fluidiques visibles (Figure 1). Afin d’améliorer leur visibilité en perçant des trous dans le dispositif pour les broches d’entrée et de sortie, marquer les entrées et sorties avec des points à l’aide d’un marqueur à pointe fine.
Remarque : Pour s’assurer que les broches d’entrée et de sortie ne sont pas bondés, tous les autre canaux sont perforé, commençant par la chaîne juste sous la désignation alphabétique pour le périphérique. - Retournez l’appareil PDMS afin que le côté motif est en panne et percer le dispositif pour les points marqués à l’aide d’un poinçon de biopsie de 0,75 mm ; jeter les poinçonnages.
Remarque : Les appareils sont gravées avec le côté motif vers le bas car le trou généré par le punch biopsie est généralement légèrement évasé où le poinçon pénètre dans le polymère. Poinçonnage de l’appareil dans une orientation inversée veille à ce que le trou sur le côté motif a une frontière nette. - À l’aide d’un stéréomicroscope, veiller à ce que les perforations se chevauchent avec les zones d’entrée et de sortie de l’appareil. Utiliser une pince à épiler à pointe fine pour enlever des fragments extrinsèques du PDMS des perforations.
- Utilisez un ruban adhésif pour enlever la poussière des deux côtés de l’appareil et le place dans une assiette de Petri propre en polystyrène. Préparer un couvercle en verre 22 x 40 mm en mouillant avec 100 % d’alcool isopropylique et en frottant avec un chiffon de salle blanche ; sec avec un jet d’air exempt de poussière ou de l’azote.
- Placez le poinçonné PDMS dispositif caractéristique vers le haut avec le couvercle en verre nettoyé dans un plasma oxygène nettoyeur.
- Plasma-traiter l’appareil avec les paramètres suivants : vide, 70 mTorr ; O pression2 , 200 mTorr ; durée, 15 s ; puissance 30 w. immédiatement après la fin de la période de traitement plasma, retirer l’appareil et le couvercle en verre du plasma nettoyant.
- Inverser le PDMS et placez-le sur le centre de la lamelle couvre-objet, afin que le côté motif entre en contact avec le verre ; s’assurer que les canaux d’alimentation (en cours d’exécution entre les zones d’entrée et de sortie) sont alignées avec l’axe longitudinal de la lamelle couvre-objet. Appuyez très doucement pour faire en sorte que les joints PDMS contre la vitre.
- Faire cuire l’appareil assemblé dans une étuve pendant au moins 1 h à 60 ° C. Après la cuisson, vérifier manuellement que le PDMS est collée sur le verre en appuyant doucement sur un coin de l’appareil.
Remarque : Une fois que l’appareil est lié, il devrait servir sous 24h, le polymère devient plus en plus hydrophobe avec le temps après traitement au plasma.
3. microfluidique plomberie
- Couper des longueurs de polymère tube (diamètre intérieur (ID) 0,02 pouce, diamètre extérieur (OD) 0,06 pouces) à des longueurs appropriées rejoindre aisément le pousse-seringue pour les appareils de commutation (si utilisé) et de l’appareil lorsqu’il est monté sur le microscope. Couper des longueurs autant qu’il sont a voies de microfluidique.
- Assembler les Y joints pour vannes à manchon (si vous en utilisez) en coupe et en fixant les longueurs de 2 cm de silicone flexible, tube (0,03 po ID, 0,065 po OD) pour les barbes supérieurs du « Y » et des longueurs de 1 cm de tube de silicone à l’ardillon de fond du « V ».
- 10 cm (ou appropriés) longueurs de tube de polymère ; Connectez-les à une extrémité pour la jonction de l’interrupteur en les insérant dans les segments de tuyau silicone 1 cm sur l’ardillon de fond du « V ». Connectez-les à l’autre extrémité à 21G des aiguilles qui ont été retirés de leurs adaptateurs seringue en plastique et bent environ 90 ° environ 9 mm de l’extrémité de l’aiguille.
- Se connecter à 21G aiguilles émoussées à une des extrémités des segments de tubes qui se déroulera de seringues à l’appareil de commutation en insérant des aiguilles dans le tube. Insérez l’autre extrémité de chaque longueur de tube dans les segments de tube de silicone sur les barbes d’entrée des jonctions Y.
Remarque : Utilisez une sorte d’appareil pour maintenir les vannes à manchon et les jonctions en place ; Cela peut facilement être réalisé via une boîte de pointe d’une micropipette (Figure 2D). - Couper des longueurs de tuyauterie de polymère pour transporter les déchets provenant de la sortie de l’appareil dans un bécher de déchets. Connectez-les à une extrémité pour aiguilles tordues de 21G préparé comme indiqué ci-dessus. Fixez l’autre extrémité des tubes dans un bécher de déchets.
- Préparer des volumes appropriés des supports contenant 0,1 mg/mL d’albumine sérique bovine (BSA) et indiquez la taille désirée et le nombre de seringues. Connecter les seringues de BSA-chargé aux aiguilles 21G prêt fixés aux seringues de tubes et de charge d’entrée dans les pompes à seringue.
NOTE : pour des expériences typiques 5 canaux de l’appareil sont utilisés, chacun avec une seringue de 20 mL. Une expérience dans laquelle le milieu est commuté nécessitera 2 bancs de 5 seringues de chaque. Ici, la pompe contenant la première banque est dénommée la pompe de la phase 1, et la pompe contenant la deuxième banque, avec le milieu de l’interrupteur après, est dénommée la pompe de la phase 2. - Purger l’air de la tuyauterie d’aspiration en exécutant les pompes seringue à un débit élevé (> 500 µL/min), commençant en orientant les pompes seringue verticalement et en tapant les seringues pour mettre des bulles d’air vers le haut. Une fois que l’air ait été purgé de seringues, placez la pompe seringue horizontalement et progressivement tap ou feuilleter les lignes de polymère de seringues l’appareillage de commutation pour déloger et éliminer les bulles d’air. Répétez cette procédure pour la deuxième banque des seringues (si changement de médias).
- Après les bulles d’air sont purgés, mettre la pompe de seringue phase 2 (c'est-à-dire, avec le support qui sera utilisé deuxième, après le commutateur) à 1,5 µL/min, puis mettez en pause le flux. Placer des clips de petit cartable sur les segments de tuyau flexible sur la branche des jonctions Y correspondant à la deuxième phase moyenne. Continuer à faire fonctionner la pompe phase 1 seringue à un débit modeste (p. ex., 10 µL/min) pendant au moins 30 min purger le deuxième moyen de la tubulure d’admission en aval de la jonction de Y.
4. préparation de Culture cellulaire
- Atteindre une préculture de la souche d’intérêt dans le milieu désiré du jour au lendemain, phase stationnaire. La souche bactérienne doit contenir une mutation qui rend les cellules immobile, afin que les cellules ne nagent pas sur les canaux de l’appareil.
Remarque : Dans ce protocole, la souche bactérienne est b. subtilis 3610 contenant un hagA233V substitution (cette mutation entraîne le flagelle être directement plutôt que de la motilité cellulaire hélicoïdale, prévention), un PrsbV- mNeonGreen reporter pour le stress cellulaire et reporter constitutif Phyperspank- mNeptune (rouge) pour mettre en surbrillance des cellules. Milieu de Lennox LB est utilisé dans le protocole de l’exemple. Les souches typiques pour des expériences de microfluidique contiennent un ou plusieurs journalistes transcriptionnelles fluorescents et une protéine fluorescente constitutivement produite, cytoplasmique pour faciliter la détection automatisée de cellules. Défauts de croissance n’ont pas observés lorsque les riche milieu LB Lennox a été utilisé, mais b. subtilis croissance en milieu minimal peut être inhibée dans des conditions de microfluidique car sécrétée sidérophores sont emportés par le flux du fluide. Dans de telles circonstances, la croissance peut être restaurée par l’addition de citrate de sodium et le chlorure ferrique au milieu, tel qu’indiqué pour S750 moyenne11. - Le matin de l’expérience, diluer les cellules de b. subtilis 01:50 dans un flacon de 250 mL dérouté contenant 25 mL de milieu de croissance. Cultiver les cellules pendant 5-6 h en secouant la culture à 37 ° C, à une densité optique supérieure à 1.
NOTE : Une culture cellulaire dense est préférable parce que la phase stationnaire b. subtilis cellules sont plus petites et moins cellule souvent trouvée dans les chaînes, facilitant le chargement de l’appareil. Différentes espèces bactériennes peuvent exiger d’autres conditions de milieu ou de croissance pour un chargement optimal. - À l’aide d’une seringue munie d’un filtre de pores de 5 µm, filtrer environ 15 mL de culture de cellules dans un tube conique 15 mL pour supprimer des chaînes de cellules de b. subtilis (il n’est pas nécessaire pour e. coli et peut ne pas être nécessaire avec d’autres espèces).
Remarque : Relativement peu les cellules doivent être éliminés ; le filtrat doit être trouble. - Centrifuger la culture filtrée pendant 10 min à 4 000 x g à la température ambiante. Décanter le liquide surnageant et Resuspendre le culot dans le reste de liquide surnageant restant dans le tube, ajoutant environ 500 µL de milieu frais si nécessaire pour faciliter le pipetage la suspension cellulaire.
5. dispositif chargement
- Placez délicatement vide mince gel-chargement micropipette conseils (voir Table des matières) dans les orifices de sortie du dispositif microfluidique.
- À l’aide de conseils minces de gel de chargement avec une micropipette P200, passiver l’appareil en injectant du milieu contenant 1 mg/mL de BSA dans les trous d’entrée, en observant les conseils fournis dans les orifices de sortie pour surveiller le remplissage des canaux microfluidiques (Figure 2 a). Incuber le dispositif à température ambiante pendant environ 5 min.
NOTE : BSA est couramment utilisé comme un blocage ou passivation agent qui se liera à la surface hydrophobe du polymère PDMS, augmentant sa hydrophilicité et en réduisant la liaison d’autres protéines ou de cellules (par l’intermédiaire des molécules de surface cellulaire). - À l’aide de minces gel-chargement conseils, chargez chaque canal avec les cellules resuspendues (à partir de la Section 4), en utilisant les pointes dans le canal de sortie pour surveiller la progression des cellules par l’intermédiaire de l’appareil (Figure 2 b).
NOTE : Chargement est facilitée en affectant une micropipette P200 son volume maximal 200 µL et aspirer ensuite un coussin d’air avant d’aspirer une petite quantité (environ la moitié du volume de la section mince de l’embout de la pipette) de cellules. Le volume des cellules resuspendues ne doivent pas être précis, comme le volume de l’appareil PDMS est petit par rapport à celle de la micropipette. Nous ne connaissons pas de limite supérieure à la densité des cellules resuspendues, tant que la suspension de cellules peut être distribuée dans l’appareil. Amas de cellules peuvent boucher l’appareil et doivent être évitées par pipetage approfondi et/ou de mélange de vortex. - Retirez délicatement les pointes gel-chargement par les trous de sortie, travaillant à la fois pour éviter d’endommager l’appareil.
- Centrifuger l’appareil dans une micro-centrifugeuse paillasse dans un adaptateur approprié rotor à environ 6 000 x g pendant 10 min (Figure 2).
Remarque : Un adaptateur de rotor en aluminium usiné sur mesure qui a été conçu pour s’adapter à un rotor de microcentrifuge (Figure 2) a été utilisé ; centrifugeuse différents modèles peuvent être utilisés avec des adaptateurs appropriés de rotor. La caractéristique importante de l’adaptateur est qu’il fournit une force latérale dans le sens des extrémités fermées des tranchées cellulaire, permettant ainsi aux cellules dans les chenaux secondaires. - Vérifier le chargement réussi sous le microscope (Figure 3) mais sans apposition de l’appareil à la diapositive titulaire/stade insérer.
Remarque : Dans le présent protocole, un 60 X, 1,4 objectif d’immersion dans l’huile NA Ph3 est utilisé pour les deux vérification à ce stade et d’imagerie ultérieur.
6. montage, équilibrage et dispositif
- Monter soigneusement le dispositif chargé sur un encart de la scène en enregistrant le couvercle en verre sur chaque côté de la PDMS jusqu’au fond de l’insert de la scène (c.-à-d., inverser l’insert de la scène avant de fixer l’appareil). Inverser l’Assemblée insert-dispositif de scène afin que le PDMS est vers le haut et le placer sur une surface molle, comme un chiffon à poussière (Figure 2D).
- Régler le débit de la pompe à seringue de phase 1 à 35 µL/min. travaillant avec une seule voie à la fois, introduire l’aiguille d’aspiration, puis l’aiguille de sortie (c.-à-d., en cours d’exécution dans le bécher de déchets ; Figure 2E).
- Essuyer tout excès du milieu avec un chiffon propre et sans poussière et inspecter visuellement le dispositif d’étanchéité. Examiner le tube de sortie pour l’apparence des cellules excès (généralement apparaissant comme une bande de trouble) et le ménisque moyen, qui se déplace lentement vers le bécher de déchets.
- Permettre à l’appareil de fonctionner à 35 µL/min pendant environ 15-30 min, jusqu'à ce que toutes les voies connectés sont vidaient dans le bécher de déchets.
- Mettre la pompe seringue phase 1 µL/min 1,5 et interrompre la circulation. Apportez tout l’appareil pompe et appareil au microscope (ce processus est facilité en le plaçant sur un chariot roulant) et redémarrer la phase-1 débit moyen à 1,5 µL/min. monter soigneusement l’insert de la scène avec le dispositif sur un microscope à fluorescence inversé, à l’aide ruban adhésif nécessaire pour acheminer l’entrée et le tube de sortie.
- Localiser les positions souhaitées sur l’appareil d’imagerie et commencer l’imagerie comme vous le souhaitez. Notez que les cellules nécessitent habituellement quelques heures (environ 10 générations) pour atteindre la croissance exponentielle-phase stationnaire et le début de l’acquisition d’images peut être retardé tant que désiré afin que l’imagerie commence après la période de l’équilibration.
Remarque : La croissance stationnaire des cellules en phase exponentielle de croissance doit être vérifiée au cours de l’analyse d’images ultérieures en observant les temps de division cellulaire et en veillant à ce qu’ils ont atteint une valeur minimale constante.
7. moyen de commutation
- Entre les cycles successifs de l’imagerie, interrompre le débit de la pompe à seringue de phase 1. Soigneusement déclipser les attaches liant de la silicone phase 2 tubes, chacun au tuyau silicone se déplaçant sur la branche de la phase 1 de la jonction de Y. ONU-pause l’écoulement de la phase 2 seringue pompe (qui a été fixée à 1,5 µL/min à l’étape 3,8) et continuer d’imagerie.
Remarque : À 1,5 µm/min avec une longueur de 10 cm de tuyauterie de polymère en aval des jonctions Y, le milieu de la seconde phase a atteint l’appareil à environ 50 min. Le temps de l’appareil peuvent être testé empiriquement à l’aide de médias contenant des particules de traceur fluorescent.
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Representative Results
Cellule initiale réussie, chargement, tel qu’évalué par microscopie à contraste de phase avant d’attacher la plomberie microfluidique à l’appareil, serait considéré comme ayant la totalité ou la quasi-totalité des canaux microfluidiques côté contenant une ou plusieurs cellules bactériennes ( Figure 3 a). Chargement optimal présentera plusieurs cellules dans chaque canal, mais les canaux remplira néanmoins avec des cellules en raison de la croissance des cellules au cours de la période d’équilibration (Figure 3 b). Voies avec mauvais chargement, où relativement peu (< 50 %) côté canaux est chargés avec des cellules, peuvent être utilisés, mais la densité de données qui en résulte sera moindre à cause de moins lignages cellulaires étant imagés dans chaque position d’imagerie.
Une fois que le périphérique est chargé au départ, elle est équilibrée en joignant la plomberie de la microfluidique et traversant l’appareil à un débit relativement élevé de 35 µL/min de moyenne. L’étape d’équilibration sert à retirer les bulles d’air et les cellules excédentaires dans le canal d’alimentation de l’appareil et à encourager les cellules dans les chenaux secondaires à commencer de plus en plus. Les cellules qui sont retirés de l’appareil à débit moyen peuvent souvent être observés à l’oeil nu comme une bande de couleur pâle se déplaçant à travers le tube de sortie vers le conteneur à déchets ; le mouvement de ces bandes sert un indicateur visuel qui le fluide s’écoule normalement par le biais de la plomberie et de l’appareil. L’inspection microscopique d’un dispositif équilibré devrait révéler quelques cellules confinés en file indienne dans la plupart des canaux latéraux (Figure 3 b, 0 min).
Une fois qu’un dispositif équilibré est placé sur le microscope dans un écoulement à 1,5 µL/min à 37 ° C, les cellules reprendra sa croissance exponentielle-phase uniforme et constante au cours de 2 h environ (Figure 3 b). Croissance exponentielle constante doit être vérifiée directement après analyse de l’image par l’apparition d’un plateau dans le temps de génération des cellules. À ce stade, les cellules sont prêts pour la fluorescence et/ou fond clair d’imagerie comme vous le souhaitez. Un appareil correctement chargé et équilibré peut généralement être photographié fiable pour des périodes au moins 24 heures (Figure 4 a, C). Introduisant un interrupteur moyen (Figure 4 a–C) élargit l’éventail des expériences qui peuvent être menées, mais augmente aussi la fréquence des événements catastrophiques mort cellulaire (Figure 4), probablement par le biais de l’introduction d’air bulles qui n’étaient pas correctement purgés de la tubulure. Un autre événement qui peut provoquer la mort cellulaire catastrophique est qu’amas de cellules situés à l’entrée peuvent se déplacer et passent à travers la chaîne alimentaire, comme le montre la Figure 4. Nous avons à l’heure actuelle comprends pas pourquoi cela provoque la mort cellulaire catastrophique dans l’appareil, et nous n’avons pas encore élaboré une méthode pour prévenir de tels événements ne se produisent.
Figure 1 : schéma du dispositif microfluidique. Un dispositif schématique montre approximativement à l’échelle. La désignation alphabétique est étiquetée avec les zones d’entrée et de sortie sont perforés pour connecter les aiguilles émoussé-terminée. En général, la moitié des chaînes à motifs sont utilisée (gris ombré). Les tranchées de la cellule sont axées sur l’indicateur. Le fichier CAD (voir supplémentaire 1 fichier) montre toutes les fonctionnalités du périphérique. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : microfluidique passivation de dispositif, de chargement de la cellule et équilibration. (A) A cautionné de l’appareil après passivation avec milieu contenant du BSA. Conseils de chargement du gel sont conservés dans les orifices de sortie pour surveiller le passage du milieu et de cellules à travers le dispositif. Le ménisque moyen est visible dans la partie mince des gel-chargement conseils (flèche). Appareil (B) après le chargement de la cellule. Les cellules sont visibles comme une couche blanche translucide dans les conseils de chargement du gel (flèche). (C) le gel-chargement conseils sont retirés avant la centrifugation dans un adaptateur centrifugeuse fabriqués sur mesure. Sparadrap (bleu) est placé sur les pièces en aluminium pour amortir l’appareil. (D) après centrifugation et vérification du chargement, l’appareil est collée sur un encart de scène de microscope et attaché aux broches d’entrée et de sortie. Dans l’image affichée, le moyen de commutation est rendue possible par les valves de pincement et Y-connecteurs qui sont disposés dans un appareil issu d’une boîte de pointe d’une micropipette. (E) de vue schématique d’un dispositif assemblé ensemble, depuis les pompes de la seringue à la poubelle. Le tube de sortie s’exécute dans un bécher de petit déchets. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : cellule de chargement et la croissance dans le dispositif microfluidique. (A) de gauche à droite, microscopie à contraste de phase un dispositif contenant le milieu uniquement avant le chargement de la cellule, le même appareil après que les cellules ont été ajoutés par pipetage, mais avant la centrifugation et le même appareil après chargement centrifuge. (B) cours temps d’adaptation cellulaire et la croissance dans le dispositif (LB, 37 ° C, débit 1,5 µL/min). Au début de l’adaptation, les cellules en phase stationnaire sont relativement courtes et étroites. Comme les cellules de s’adapter et revenir en phase exponentielle de croissance (60-120 mn), ils adoptent une morphologie plus longue et plus large. Après 120 min, toutes les cellules de l’appareil sont reprise uniforme phase exponentielle de croissance, et l’appareil est prêt pour l’imagerie. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : cellules croissance et moyen de commutation dans le dispositif microfluidique. Kymographs (A) montrant 550 min de croissance avant et 1 000 min de croissance après un passage moyen (ligne en pointillés gris) dans l’éthanol à 2 % comme facteur de stress. Des images ont été capturées à intervalles de 10 min. Le panneau du haut montre un journaliste mNeonGreen transcription (couche verte) pour un gène induite par le stress. Le panneau du bas montre un journaliste mNeptune constitutive (canal rouge) qui est utilisé dans ce cas pour une segmentation cellulaire automatisée. Gros plan (B) Découvre des parties de le kymographs dans la zone en pointillés dans le groupe A, montrant une réponse transitoire dans le canal vert après le commutateur moyen. Notez que la croissance se poursuit par l’intermédiaire de l’interrupteur, même si la présence de l’éthanol entraîne les cellules à devenir plus courtes et de croître à un rythme légèrement inférieur. Échelle de temps est indiqué par la barre horizontale, et la distance est affichée par la barre verticale. (C) par exemple des traces de données analysées fluorescence d’une lignée de cellule unique de l’expérience indiquée dans Panneau de A. Les lignes verticales en pointillés indiquent le commutateur moyen dans l’éthanol à 2 % comme facteur de stress. (D) exemple d’un interrupteur moyen ayant échoué. Lorsque le deuxième moyen atteint les cellules, les cellules des canaux sont lysées. Le commutateur est accompagné d’un grand nombre de cellules qui circulent dans le chenal principal, causant un signal fluorescent lumineux (une image nouvelle échelle correspondant à la zone délavée apparaît juste au-dessus). Après l’interrupteur, aucune autre cellule n’est observées, même si les débris cellulaires faiblement fluorescent reste dans les canaux. Échelle de temps est indiqué par la barre horizontale, et la distance est affichée par la barre verticale. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Ce protocole de microfluidique est flexible car bon nombre des étapes peuvent être modifiées afin d’optimiser son utilisation avec une espèce particulière ou un souche ou dans un but précis. En effet, dans ce protocole nous avons fait des modifications apportées à l' original du concept « machine mère »4 pour optimiser son utilisation avec b. subtilis. Souvent, les tranchées où les cellules sont confinés constituent un élément de la monocouche, tandis que dans le présent protocole, nous utilisons tranchées de deux couches de cellules, avec un canal peu profond qui entoure les cellules. La conception de deux-couche a été présentée comme un moyen de maximiser le flux de nutriments et de métabolites provenant des cellules de b. subtilis , surtout à long (> 75 µm) tranchées5; Cependant, monocouche caractéristiques souvent suffisant pour la croissance cellulaire optimale et sont couramment utilisés pour e. coli, surtout lorsqu’elles sont plus courtes (~ 25 µm)4. Nous utilisons généralement plues tranchées, car ils réduisent la fréquence avec laquelle les chaînes de cellule de b. subtilis , qui surviennent de manière stochastique, sont tirés hors de leurs tranchées par le flux du fluide dans l’alimentation principale channel5.
Autres modifications, telles que l’utilisation d’appareils avec dimensions de caractéristique différente (par exemple, les largeurs de canaux) ou des caractéristiques (p. ex., forme, nombre d’extrémités ouvertes) peuvent être remplacées selon qu’il conviendra. Par exemple, l’utilisation de cellule tranchées qui sont ouvert aux deux extrémités (plutôt qu’à qu’une seule fin, comme dans le présent protocole) a été utilisée dans d’autres études1,20,21. Tranchées qui sont ouvertes aux deux extrémités éviter le vieillissement des cellules, parce qu’ils sont constamment étant remplis de cellules nouveau-né (par opposition à la mère machines, où la plus ancienne cellule de suivi et de nouvelles cellules sont poussés hors de la chaîne), bien que le fait que les cellules plus âgées sont poussés sur les deux extrémités en général limite leur fenêtre d’observation à moins de 10 générations1,21. Nous cherchons en général le plus d’observation windows (des centaines de générations) offert par une machine de la mère, qui rend possible aux processus même exponentielles de mesure pour lesquels les délais d’attente sont des dizaines ou des centaines de générations de long5. Nous avons également utilisé la conception de machine de mère d’observer des cellules qui ne sont pas en croissance exponentielle, comme dans nos analyses de la sporulation,22. Dans ce cas, les cellules supplémentaires tout au long de la croissance tranchées peuvent être utilement analysées22.
Bon nombre des étapes dans le protocole sont relativement indulgents car ils peuvent être modifiés sans affecter sensiblement le résultat du protocole. Par exemple, une version antérieure du protocole appelé pour nettoyer le couvercle en verre par étapes de sonication séquentielle 10 min bain dans 10 M KOH et eau pure ensuite, mais nous avons trouvé que collage de bon appareil et le fonctionnement a été réalisée à l’aide de la plus simple axée sur l’isopropanol étape de nettoyage décrite ici. Si une question de liaison s’est posée cette suspicion de cast sur la propreté de la lamelle couvre-objet, revenant sur un protocole de nettoyage plus strictes est recommandé. De même, bien que nous utilisions une étape de centrifugation pour maximiser la cellule de chargement dans les tranchées de la cellule, raisonnablement plein chargement est possible même sans cette étape, autant que très concentrée de cellules sont utilisés pour l’étape de chargement. Cette stratégie alternative pourrait être particulièrement utile pour les chercheurs qui n’ont pas un adaptateur centrifugeuse facilement disponible pour faire tourner l’appareil. Encore une fois, les différentes concentrations d’agent passivant/graissage (BSA dans le présent protocole) peuvent être utilisées ; Nous utilisons systématiquement des concentrations aussi élevées que 1 mg/mL. Dans les cas où une souche peut être sensible à la SAB, résultats acceptables peuvent être obtenus même en l’absence d’un agent de la passivation. En effet, lorsque nous étions en utilisant un dispositif microfluidique pour examiner la sporulation, qui exige la famine de la cellule, nous étions inquiets que BSA pourrait agir comme une source potentielle d’éléments nutritifs pour les cellules, et donc nous a omis de l’écoulement moyen sans observer aucune importante les effets indésirables22.
Notamment, le flux continu du milieu par le biais de l’appareil peut déclencher des phénotypes légèrement différentes par rapport à la croissance des cellules dans un système fermé, comme un ballon. Par exemple, épuisement des éléments nutritifs ou composé peut être difficile, car les cellules peuvent piéger souvent composés de trace de l’écoulement moyen. En effet, nous avons observé qu’induisant la sporulation cellulaire par l’intermédiaire de famine nécessite un temps plus long dans un dispositif microfluidique que dans une fiole. De même, nous avons observé que l’induction de stress énergétique à l’aide de la phosphorylation oxydative découpleur carbonyl cyanide m-Chlorophényl hydrazone (CCCP) nécessite plusieurs concentrations plus élevées dans le dispositif microfluidique que celles rapportées dans la culture de la fiole 23. par conséquent, certains optimisation peut-être devoir obtenir des résultats satisfaisants avec différents additifs moyens.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce projet a été financé par le National Institutes of Health, sous GM018568. Ce protocole a été réalisé en partie au Centre pour le systèmes nanométriques (CNS), un membre de la National Nanotechnology coordonnée Infrastructure réseau (NNCI), qui est soutenu par la National Science Foundation sous award NSF n ° 1541959. CNS appartient à l’Université Harvard. Merci beaucoup résultent de Thomas Norman et Nathan Lord pour leur travail dans la conception et la fabrication du gabarit principal utilisé pour les dispositifs des ici et dans la construction de la version originale de l’appareil. Aussi, nous remercions Johan Paulsson pour ses précieux conseils collaborative et remercier les membres de son laboratoire pour leurs conseils et améliorations continues pour appareils microfluidiques bactérienne.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | (240)4019862 | This is referred to as PDMS in the protocol. There are 2 components that are mixed at a 10:1 ratio |
| 0.75-mm biopsy punch | World Precision Instruments | 504529 | |
| 22 x 40 mm No. 1.5 cover glass | VWR | 48393 172 | |
| Plasma Etch PE-50 | Plasma Etch Inc. | PE-50 | Instrument used to bond PDMS to glass using oxygen plasma treatment |
| Tygon flexible tubing ID 0.02", OD 0.06" | Saint-Gobain PPL Corp. | AAD04103 | For the main part of the tubing, e.g. attached to the needles |
| Silicone Tubing, 0.04" ID, 0.085" OD | HelixMark Standard Silicone Tubing | 60-795-05 | For pinch valves and Y-junction connection |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100G | Used as passivation agent |
| ART Gel Pipet Tips (P200) | Molecular BioProducts | 2155 | For loading the device with medium and cells |
| Acrodisc 32-mm syringe filter with 5-μm Supor membrane | Pall Life Sciences | 4560 | For filtering cultures before device loading |
| 21-ga blunt needles, 1" | McMaster-Carr | 75165A681 | |
| Y connector with 200-series barbs, 1/16" ID tubing, polypropylene | Nordson Medical | Y210-6005 | The company is AKA Value Plastics |
| Eclipse Ti-E inverted microscope | Nikon | This unit has been discontinued by the manufacturer and is replaced by the Ti 2 E. | |
| LB Lennox | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Microfuge 18 | Beckman Coulter | 367160 | |
| Bacillus subtilis strain NCIB3610 | Bacillus Genetic Stock Center | 3A1 | wild-type parental strain modified for use in the experiments shown in this protocol |
| Gravity convection oven | VWR | 414005-106 | for curing PDMS and baking assembled devices |
| Scotch-Weld Epoxy Kit | 3M | 2216 B/A | may be used to bond a silicon wafer to an aluminum backing plate |
| Scotch Magic tape, 3/4" width | 3M | to clean dust from PDMS devices and to place over features to increase visibility (denoted "office tape" or "adhesive tape" in protocol) | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ800N | listed here as an example; nearly any stereomicroscope will do |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907 | To clean cover glass |
| Syring pump, 6 channel | New Era Pump Systems Inc. | NE-1600 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34120 | a brand of dust-free wipes |
References
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