Summary
Apresentamos um método de análise microfluidic de linhagens de células bacterianas individuais usando Bacillus subtilis como exemplo. O método supera deficiências dos métodos tradicionais de análise em microbiologia, permitindo a observação de centenas de gerações de células sob condições de crescimento firmemente controlável e uniforme.
Abstract
Microfluidic tecnologia supera muitas das limitações que os métodos analíticos tradicionais em microbiologia. Ao contrário de métodos de cultura de massa, oferece resolução de célula única e longa observação vezes abrangendo centenas de gerações; ao contrário de agarose baseada em almofada microscopia, tem condições de crescimento uniforme que podem ser rigidamente controladas. Porque o fluxo contínuo de meio de cultura isola as células em um dispositivo microfluidic de variações imprevisíveis no ambiente químico local causada pelo crescimento celular e metabolismo, autênticas alterações na expressão gênica e crescimento celular em resposta a estímulos específicos podem ser observados com mais confiança. Bacillus subtilis é usado aqui como uma espécie de bactéria modelo para demonstrar uma máquina de"mãe"-digite o método para análise de celular. Mostramos como construir e interpretar um dispositivo microfluidic, carregá-lo com células, iniciar a geração de imagens microscópica e expor as células a um estímulo, passando de um meio para outro. Um repórter de stress-responsivo é usado como um exemplo para revelar o tipo de dados que podem ser obtidos por esse método. Nós também brevemente discutir aplicações desse método para outros tipos de experimentos, tais como análise de esporulação bacteriana.
Introduction
Uma das características mais marcantes da vida na terra é sua grande resiliência e variedade. Um objetivo central da biologia molecular é entender a lógica pela qual células usam genes e proteínas para maximizar seu crescimento e aptidão sob uma ampla variedade de condições ambientais. Para atingir este objetivo, os cientistas devem ser capazes de observar com confiança como células individuais crescem, dividem e expressam seus genes sob um determinado conjunto de condições, observando como as células respondem às alterações subsequentes no seu ambiente. No entanto, os métodos analíticos tradicionais em microbiologia têm limitações técnicas que afetam os tipos de perguntas que podem ser abordados. Por exemplo, em massa baseada em cultura análises foram muito úteis ao longo dos anos, ainda oferecem somente os dados de nível populacional que podem mascarar variações significativas de célula para célula ou os comportamentos de menores sub-populações de células na população total. Análises de célula única de bactérias de vida baseadas em microscopia de luz revelam o comportamento de célula única, mas também são tecnicamente limitadas. Bactérias normalmente são imobilizadas em almofadas de agarose contendo meio de crescimento, mas multidões de crescimento e divisão de pilha a visão microscópica e esgota os nutrientes disponíveis após poucos ciclos de célula, limitando substancialmente o tempo de observação1, 2. Além disso, a local depleção de nutrientes e o concomitante acúmulo de subprodutos metabólicos devido ao crescimento celular estão mudando constantemente o ambiente de crescimento celular local de maneiras que são difíceis de medir ou prever. Tais mudanças ambientais usando almofadas de agarose representam um desafio para estudos de comportamentos de estado estacionário ou de respostas celulares para alterações específicas nas condições de crescimento3.
Microfluidic tecnologia, no qual um meio líquido é continuamente fluiu através de dispositivos microfabricated, oferece uma solução para limitações experimentais clássicas. Um dispositivo microfluidic pode manter células individuais em posição para microscopia de viver-pilha quando o fluxo do meio de crescimento constantemente fornece as células com nutrientes frescos e lava subprodutos metabólicos e células em excesso, criando assim um crescimento altamente uniforme meio ambiente. Sob condições de constante crescimento, observam-se comportamentos de célula isolada da influência de fatores ambientais, permitindo uma vista desimpedida da lógica interna das células. Como o fluxo de fluido impede que o dispositivo microfluidic tornando-se repleto de células, observação de linhagens de célula única para dezenas ou centenas de gerações torna-se possível4,5. Estes tempos de longa observação permitam a detecção de comportamentos de célula a longo prazo ou raro caso contrário indetectável. Finalmente, a composição do meio que flui através do dispositivo pode ser alterados no Irão, permitindo que as células a serem observados como eles respondem ao aparecimento de um estresse ou para a introdução ou remoção de um determinado composto.
Microfluídica já tem desfrutado de um número de aplicações importantes. Por exemplo, ela tem sido usada em tecido, órgão ou dispositivos de corpo-em-um-microplaqueta, em que vários tipos de células humanas são co cultivados para simular na vivo condição6; para o estudo do movimento de nematoides em ambientes microstructured7; para examinar as interações entre biofilmes bacterianos (e.g., 8); e para o encapsulamento e a manipulação de pequenos volumes de células ou de produtos químicos (por exemplo, 9). Dispositivos microfluídicos também tornaram-se cada vez mais populares no campo da microbiologia (para excelentes críticas, ver 10 e 11), especialmente como seu físico e propriedades de fluxo são bem-acompanhado para nichos microbianos naturais12. Por exemplo, microfluídica foi recentemente empregada por microbiologistas para tais fins como medir precisamente celular crescimento e divisão13,14,15, analisando o patógeno movimento16, monitoramento de sensoriamento de quórum17 e transições fisiológica18e para proteína contando com19, entre muitos outros exemplos. O método apresentado aqui é projetado especificamente para a análise de linhagens única célula bacteriana, ao invés de combinações de cepas ou espécies. O dispositivo microfluidic demonstrado aqui utiliza uma variação do "máquina de mãe" projeto4, em que as células são cultivadas arquivo único dentro de uma trincheira microfluidic com uma extremidade fechada e uma aberta; divisão e crescimento celular empurra as células descendentes cima e para fora a extremidade aberta para o fluxo de fluido. Nossas análises geralmente se concentram apenas na célula "mãe" que está confinada na extremidade fechada da trincheira. Consideramos este método como um avanço sobre anteriores leves baseado em microscopia célula única técnicas analíticas, tais como imobilização de células em almofadas de agarose. Enquanto b. subtilis é usado como um modelo aqui, o método também é aplicável a outras espécies de bactérias (Escherichia coli é um outro modelo comum; algumas espécies com tamanhos diferentes de célula ou morfologias podem exigir a fabricação de novos dispositivos com dimensões diferentes). O uso de repórteres fluorescentes para marcar células e visualizar as alterações na expressão gênica requer o uso de espécies geneticamente tractable; no entanto, análises de crescimento celular e morfologia são possíveis mesmo sem marcadores fluorescentes.
O presente protocolo exclui o processo de fabricar o mestre de silício usando photolithography, que tem sido amplamente descrito em outra parte5; mestres também podem ser facilmente terceirizados de microfabrication instalações. Ele inclui o molde de um dispositivo PDMS de um mestre de silicone reforçado; ligação do dispositivo com um pedaço de vidro de tampa; montando o microfluidic entrada e saída encanamento, incluindo pitada válvulas para permitir a comutação médio; passivação do dispositivo, preparando as células bacterianas e carregar o aparelho com as células bacterianas; anexar o encanamento para o dispositivo e desenroscada as células; e carregar o dispositivo em um microscópio de fluorescência para a imagem latente. Porque muitos imagem diferente de aquisição e processamento de software ferramentas podem ser usadas para visualizar e analisar dados diferentes de interesse4,5, imagens de exemplo são mostradas, mas os métodos de captura de imagem não estão incluídos neste protocolo.
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Protocol
1. PDMS dispositivo Casting
- Em um ambiente livre de poeira, mistura de polímero PDMS e agente de cura, na proporção de 10:1 e desgaseificar sob vácuo durante pelo menos 10 minutos.
- Coloque um mestre de silício (ou mesmo uma réplica de epóxi ou poliuretano) num pedaço de papel alumínio ininterrupta em uma placa de Petri de poliestireno. Despeje a mistura PDMS a desgaseificado sobre o mestre a uma profundidade de aproximadamente 5 mm. Degas a placa de Petri de pelo menos 10 min. Use uma ligeira corrente de ar para quebrar as bolhas de superfície.
Nota: As dimensões do dispositivo dois-tiered utilizados são fornecidas no acompanha arquivo CAD.5 (Veja o arquivo complementar 1). Um mestre de réplica de plástico pode flutuar parcialmente durante a desgaseificação; Se isso ocorrer, pressione a réplica com um aplicador de plástico limpo. - Cura de PDMS para pelo menos 1 h em estufa a 60 ° C e esfriar até a temperatura ambiente. Retire o papel alumínio contendo o PDMS mestre e curado da placa de Petri. Com cuidado, retire a folha de alumínio na parte de trás do mestre e, em seguida, Retire cuidadosamente o PDMS com o mestre.
Nota: Como alternativa, PDMS podem ser curadas durante a noite à temperatura ambiente. A relativa fragilidade de um mestre de bolacha de silicone pode ser superada usando adesivo epóxi de vínculo permanentemente o wafer de uma polegada de 1/16-disco de alumínio de espessura do mesmo tamanho como a bolacha. - Como uma bolacha normalmente inclui vários dispositivos microfluídicos com dimensões ligeiramente diferentes (ver arquivo complementar 1), corta um único dispositivo de tamanho usando um bisturi limpo e afiado.
Nota: Para a rotina de trabalho de b. subtilis , use dispositivos com trincheiras de célula 1.0-µm de largura, que são marcadas com um C ou F no arquivo CAD que acompanha.
2. dispositivo de perfuração e de ligação
- Lugar um pedaço de escritório translúcido fita (ver Tabela de materiais) sobre lado padrão do dispositivo para aumentar a visibilidade das características padronizadas. As portas de entrada e saída são identificadas como áreas circulares em lados opostos dos canais fluídico visíveis (Figura 1). Para melhorar a sua visibilidade quando fazendo buracos no dispositivo para os pinos de entrada e de saída, marque as entradas e saídas com pontos usando um marcador de ponta fina.
Nota: Para garantir que os pinos de entrada e saída não estão lotados, todos os outros canais é um soco, começando com o canal sob o designador alfabética para o dispositivo. - Inverter o dispositivo PDMS para que lado padrão é baixo e perfurar o dispositivo para os pontos marcados usando um soco biópsia 0.75 mm; Descarte o punchings.
Nota: Os dispositivos são perfurados com lado padrão para baixo porque o buraco gerado pelo soco biópsia normalmente é ligeiramente queimado onde o soco entra o polímero. Socar o dispositivo em uma orientação invertida garante que o buraco no lado padrão possui uma borda afiada. - Usando um estereomicroscópio, certifique-se que os furos perfurados se sobrepõem com as áreas de entrada e saída do dispositivo. Use uma pinça de ponta fina para remover quaisquer fragmentos alheios de PDMS dos furos perfurados.
- Use fita adesiva para remover poeira de ambos os lados do dispositivo e local em uma placa de Petri limpa poliestireno. Prepare um vidro de tampa 22 x 40 mm, molhando com 100% de álcool isopropílico e esfregando com uma limpeza de salas limpas; seco com um fluxo de ar livre de poeira ou de azoto.
- Coloque o perfurado PDMS dispositivo recurso lado acima juntamente com o vidro limpo em um plasma de oxigênio líquido de limpeza.
- Plasma-tratar o dispositivo com as seguintes configurações: vácuo, mTorr 70; Ó2 pressão, mTorr 200; duração, 15 s; poder, 30 w. imediatamente depois que termina o período de tratamento de plasma, remover o dispositivo e a tampa de vidro do plasma líquido de limpeza.
- Inverta o PDMS e colocá-lo no centro da tampa de vidro, para que lado padrão entra em contato com o vidro; Certifique-se de que os canais de alimentação (correndo entre as áreas de entrada e saída) estão alinhados com o eixo longo do vidro tampa. Pressione suavemente para garantir que os selos PDMS contra o vidro.
- Asse o dispositivo montado em um forno pelo menos 1 h a 60 ° C. Após o cozimento, verificar manualmente que o PDMS é ligadas ao vidro, empurrando suavemente em um canto do dispositivo.
Nota: Uma vez que o dispositivo é ligado, ele deve ser usado em 24h, como o polímero se tornará cada vez mais hidrofóbico com o aumento de tempo após o tratamento de plasma.
3. Microfluidic encanamento preparação
- Corte comprimentos de polímero (diâmetro interno (ID) 0,02 polegadas, diâmetro externo (OD) 0.06 polegadas) de tubos de comprimentos adequados a partir da bomba de seringa ao aparelho de comutação (se usado) e o dispositivo quando montado no microscópio. Corte como muitos comprimentos como existem microfluidic lanes.
- Montar Y entroncamentos para válvulas de pressão (se estiver usando), corte e anexando 2-cm comprimentos de silicone flexível, tubulação (0,03 polegadas ID, 0,065 polegada OD) para as farpas superiores do "Y" e comprimentos de 1 cm de tubo de silicone para o barb inferior do "Y".
- Corte de 10 cm (ou apropriados) comprimentos de tubagem de polímero; conectá-los em uma extremidade para a junção de interruptor inserindo-os para os segmentos de tubulação do silicone 1 cm sobre o barb inferior do "Y". Conectá-los na outra extremidade para agulhas de 21G que foram removidos de seus adaptadores de seringa plástica e dobrados aproximadamente 90 ° aproximadamente 9 mm da extremidade da agulha.
- Agulhas sem corte 21G Conecte uma das extremidades dos segmentos de tubulação que será executado a partir as seringas ao aparelho de interruptor, inserindo as agulhas para o tubo. Insira as outras extremidades de cada comprimento de tubo dos segmentos de tubulação do silicone sobre as farpas de entrada dos cruzamentos a Y.
Nota: Use algum tipo de aparelho para segurar as válvulas de pressão e as junções no lugar; Isto pode facilmente ser feito de uma caixa de dica micropipeta (Figura 2D). - Comprimentos de tubo de polímero para transportar resíduos da tomada do dispositivo para um copo de resíduos de corte. Conectá-los em uma extremidade para agulhas torcidas de 21G preparado como descrito acima. Fita a outra extremidade dos tubos para um copo de resíduos.
- Preparar volumes adequados de meios contendo 0,1 mg/mL albumina de soro bovino (BSA) e preencher o tamanho desejado e o número de seringas. Conecte as seringas BSA-carregado para as agulhas de 21G preparado anexadas para as seringas de tubos e carga de entrada em bombas de seringa.
Nota: para o típicos experimentos 5 canais do dispositivo são usadas, cada um com uma seringa de 20 mL. Um experimento em que o meio é comutado exigirá 2 bancos de 5 seringas cada. Aqui, a bomba que contém o primeiro banco é referida como a bomba de fase-1, e a bomba que contém o segundo banco, com o pós-interruptor médio, é conhecida como a bomba de fase-2. - Purgue o ar do encanamento a entrada executando as bombas de seringa em uma taxa de fluxo elevada (> 500 µ l/min), começando orientando as bombas de seringa verticalmente e tocando as seringas para trazer as bolhas de ar no topo. Uma vez que o ar tem sido purgado das seringas, coloque a bomba de seringa na horizontal e, progressivamente, toque ou folhear as linhas de polímero de seringas de aparato interruptor para desalojar e remover bolhas de ar. Repita este processo para o segundo banco de seringas (se a mídia de comutação).
- Depois que as bolhas de ar são limpos, defina a bomba de seringa de fase-2 (ou seja, com o meio que será usado segundo, após o interruptor) de 1,5 µ l/min, então pausar o fluxo. Coloque clips de fichário pequeno para os segmentos de tubulação flexível no ramo das junções de Y correspondente à segunda fase média. Continuar a funcionar a bomba de seringa de fase-1 a uma taxa de fluxo modesto (por exemplo, 10 µ l/min) durante pelo menos 30 min limpar o meio segundo da tubagem de entrada a jusante da junção Y.
4. preparação de cultura de células
- Cresce um preculture da estirpe de interesse a médio desejado durante a noite, a fase estacionária. A estirpe bacteriana deve conter uma mutação que processa as células imóveis, para que as células não nadar fora dos canais do dispositivo.
Nota: No presente protocolo, a estirpe bacteriana é b. subtilis 3610 contendo uma bruxaA233V substituição (esta mutação faz com que o flagelo ser em linha reta ao invés de motilidade celular helicoidal, impedindo), um PrsbV- mNeonGreen repórter para estresse celular e constitutiva repórter Phyperspank- mNeptune (vermelho) para destacar células. Meio de Lennox LB é usado no protocolo de exemplo. Estirpes típicas para experimentos de microfluídica contêm um ou mais repórteres transcriptional fluorescentes e uma proteína fluorescente citoplasmática, constitutivamente produzida para facilitar a detecção automatizada de células. Defeitos de crescimento não foram observados quando rico meio LB Lennox foi usado, mas crescimento de b. subtilis em media mínimos pode ser inibido sob condições microfluidic porque secretado sideróforos são lavados pelo fluxo médio. Sob tais circunstâncias, crescimento pode ser restaurado pela adição de citrato de sódio e cloreto férrico ao meio, conforme relatado por S750 médio11. - A manhã do experimento, dilua as células de b. subtilis 01:50 para um perplexo balão de 250 mL contendo 25 mL do meio de crescimento. Crescem as células para 5-6 h em sacudir a cultura a 37 ° C, com uma densidade óptica de maior que 1.
Nota: Uma cultura de células densas é preferível porque estacionária-fase b. subtilis células são menores e menos célula muitas vezes encontrada em cadeias, facilitando o carregamento do dispositivo. Diferentes espécies bacterianas podem exigir outras condições médio ou crescimento de carregamento ideal. - Usando uma seringa, equipada com um filtro de tamanho dos poros de 5 µm, filtre cerca de 15 mL de cultura de células para um tubo cônico de 15 mL para remover cadeias de célula b. subtilis (é desnecessário para Escherichia coli e pode não ser necessário com outras espécies).
Nota: Relativamente poucas células devem ser removidas; o filtrado deve ser turvo. - Centrifugar a cultura filtrada por 10 min a 4.000 x g, à temperatura ambiente. Decantar o sobrenadante e ressuspender as células no fluido sobrenadante residual remanescente no tubo, adicionando aproximadamente 500 µ l de meio fresco, se necessário, para facilitar a pipetagem a suspensão de eritrócitos.
5. dispositivo carregamento
- Coloque delicadamente vazia fina gel-carregamento micropipeta dicas (ver Tabela de materiais) para os orifícios de saída do dispositivo microfluidic.
- Usando pontas finas de gel de carregamento com uma micropipeta P200, passivate o dispositivo através da injeção de meio contendo 1 mg/mL BSA dentro dos orifícios de entrada, observando as dicas os orifícios de saída para monitorar o enchimento dos canais microfluídicos (Figura 2A). Incube o dispositivo à temperatura ambiente por cerca de 5 min.
Nota: BSA é comumente usado como um bloqueio ou passivação agente que associará a superfície hidrofóbica do polímero PDMS, aumentando sua Hidrofilia e reduzindo a vinculação de outras proteínas ou células (através de moléculas de superfície celular). - Usando pontas finas de gel de carregamento, carrega cada canal com as ressuspensa células (secção 4), usando as dicas no canal de saída para monitorar o progresso das células através do dispositivo (Figura 2B).
Nota: O carregamento é facilitado definindo a P200 micropipeta para seu volume máximo 200 µ l e depois aspirar um coxim de ar antes de aspirar um pequeno volume (aproximadamente metade do volume da seção fina da ponta da pipeta) de células. O volume de ressuspensão células não precisa ser preciso, como o volume do dispositivo PDMS é pequeno em comparação com o da micropipeta. Sabemos de nenhum limite superior para a densidade das células ressuspensa, enquanto a suspensão de eritrócitos pode ser pipetada dentro do aparelho. Aglomerados de células podem obstruir o dispositivo e devem ser evitados por pipetagem completa e/ou mistura de vórtice. - Remova suavemente as gel de carregamento dicas dos orifícios de saída, trabalhando um de cada vez para evitar danos ao dispositivo.
- Centrifugue o dispositivo numa bancada microcentrifuga em um adaptador apropriado do rotor a aproximadamente 6.000 x g durante 10 minutos (Figura 2).
Nota: Utilizou-se um adaptador de rotor de alumínio usinadas personalizado que foi projetado para caber em um rotor de microcentrifuga (Figura 2); centrífuga de diferentes modelos pode ser usadas com adaptadores apropriados do rotor. A característica importante do adaptador é que ele fornece força lateral na direção das extremidades fechadas de trincheiras a célula, forçando as células nos canais de lado. - Verificar carregamento bem sucedido sob o microscópio (Figura 3), mas sem a aposição do dispositivo para o slide titular/estágio inserir.
Nota: No presente protocolo, um 60 X, 1.4 at Ph3 objectivo de imersão de óleo é usado para ambos verificação nesta fase e para a imagem latente subsequente.
6. dispositivo montagem, equilibrio e montagem
- Cuidadosamente, montar o dispositivo carregado para uma inserção de palco gravando o vidro de cobertura em ambos os lados do PDMS para a parte inferior da inserção da fase (ou seja, inverter a fase de inserção antes de fixar o dispositivo). Inverter o assembly de inserção-dispositivo de palco para que o PDMS é voltada para cima e coloque sobre uma superfície macia, como uma limpeza livre de poeira (Figura 2D).
- Ajustar a vazão da bomba de seringa de fase-1 a 35 µ l/min. trabalhando com uma faixa de cada vez, inserir a agulha de entrada e, em seguida, a agulha de tomada (i.e., a correr para o recipiente de resíduos; Figura 2E).
- Limpe qualquer excesso de meio com uma toalhita de limpeza livre de poeira e inspecione visualmente o dispositivo para detectar possíveis vazamentos. Examine a tubulação de saída para o aparecimento de células em excesso (geralmente aparece como uma listra turva) e o menisco médio, que lentamente se moverá para o recipiente de resíduos.
- Permita que o dispositivo para executar em 35 µ l/min por aproximadamente 15-30 min, até que todas as pistas conectadas estão drenando para o copo de resíduos.
- Conjunto da bomba de seringa de fase-1 a 1,5 µ l/min e pausar o fluxo. Traga todo o aparelho bomba e dispositivo para o microscópio (este processo é auxiliado por colocá-lo todo em um carrinho de rolamento) e reiniciar o fluxo médio de 1,5 µ l/min. montar cuidadosamente a inserção do palco com o dispositivo em um microscópio de fluorescência invertido, fase-1 usando fita conforme necessário para rotear os tubos de saída e de entrada.
- Localizar posições desejadas no dispositivo para tratamento de imagens e começar a imagem conforme desejado. Observe que células tipicamente requerem algumas horas (aproximadamente 10 gerações) para atingir o estado estacionário fase exponencial de crescimento, e o início da aquisição de imagens pode ser retardado como desejado para que a imagem começa após o período de equilíbrio.
Nota: O crescimento de estado estacionário de células em fase exponencial deve ser verificado durante a análise de imagem posterior acompanhamento de tempos de divisão celular e assegurando que eles chegaram a um valor mínimo constante.
7. médias de comutação
- Entre as sucessivas rodadas de imagiologia, pause o fluxo da bomba de seringa de fase-1. Com cuidado, solte os grampos da pasta de silicone fase 2 tubulação, movendo-se a cada um para o tubo do silicone na fase-1 filial da junção Y. Un-pausa o fluxo da fase-2 seringa da bomba (que foi definida como 1,5 µ l/min na etapa 3.8) e continuar a imagem latente.
Nota: A 1,5 µm/min com um comprimento de 10 cm de polímero tubulação a jusante dos cruzamentos do Y, o meio da segunda fase atinge o dispositivo em aproximadamente 50 min. O tempo para o dispositivo pode ser empiricamente testado usando meios que contêm partículas de marcador fluorescente.
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Representative Results
Bem sucedida célula inicial de carregamento, avaliada por microscopia de contraste de fase, antes de fixar o encanamento microfluidic o dispositivo, seria considerada como tendo todos ou quase todos os canais do lado microfluidic contendo uma ou mais células bacterianas ( Figura 3A). Carga ideal mostraria várias células em cada canal, mas canais, no entanto, vão encher de células devido a crescimento celular durante o período de equilíbrio (Figura 3B). Pistas com carregamento pobre, em que relativamente poucos (< 50%) lado canais são carregados com células, pode ser usado, mas a densidade de dados resultante será menor devido ao menos linhagens de células, sendo fotografadas em cada posição de imagem.
Uma vez que o dispositivo é inicialmente carregado, ela é equilibrada, anexando o encanamento microfluídicos e meio que circula o dispositivo a uma taxa relativamente alta vazão de 35 µ l/min. A etapa de equilibração serve para remover as bolhas de ar e as células em excesso no canal de alimentação do dispositivo e encorajar as células nos canais de lado para começar a crescer. As células que são removidas do dispositivo em cima do fluxo médio, muitas vezes podem ser observadas a olho nu como uma banda de cor clara, movendo-se através da tubulação de saída para o recipiente de resíduos; o movimento de bandas serve como um indicador visual de que o fluido está fluindo normalmente através do encanamento e o dispositivo. Inspeção microscópica de um dispositivo equilibrada deve revelar algumas células confinadas em um único arquivo na maioria dos canais de lado (Figura 3B, 0 min).
Uma vez que um dispositivo equilibrado é colocado no microscópio sob fluxo em 1,5 µ l/min a 37 ° C, as células retomará uniforme e constante crescimento exponencial-fase ao longo de cerca de 2 h (Figura 3B). Constante crescimento exponencial deve ser verificado diretamente após a análise de imagem com a aparência de um platô no tempo de geração das células. Neste ponto, as células estão prontas para fluorescência e/ou brightfield imagem conforme desejado. Um dispositivo com êxito carregado e equilibrado pode normalmente ser fiavelmente fotografado por períodos de pelo menos 24 h (Figura 4A, C). Introduzir um interruptor médio (Figura 4A–C) expande a gama de experiências que pode ser realizado, mas também aumenta a frequência de eventos catastróficos-morte celular (Figura 4), presumivelmente através da introdução de ar bolhas que não foram removidas com êxito da tubagem. Outro evento que pode causar morte celular catastrófico é que aglomerados de células localizadas na entrada podem tornar-se desalojado e passam através do canal de alimentação, como mostrado na Figura 4. Não neste momento entendemos porque isso faz com que a morte celular catastrófica no dispositivo, e nós ainda não inventaram um método para evitar a ocorrência de tais eventos.
Figura 1: esquemático do dispositivo microfluidic. Um dispositivo esquemático é mostrado aproximadamente à escala. O designador alfabético é rotulado juntamente com as zonas de entrada e saída que são perfuradas para conectar as agulhas sem corte-terminado. Normalmente, metade dos canais estampados são usados (sombreada cinza). As trincheiras da célula são orientadas para o designador. O arquivo CAD que acompanha (ver arquivo complementar 1) mostra todos os recursos do dispositivo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Microfluidic passivação do dispositivo, carregamento de célula e equilibração. (A) A dispositivo ligado após passivação com meio contendo BSA. Dicas de gel de carregamento são mantidas nos orifícios de saída para monitorar a passagem do meio e as células através do dispositivo. O menisco médio é visível na parte fina das dicas de gel de carregamento (seta). (B) dispositivo após o carregamento do celular. As células são visíveis como uma camada branca translúcida em gel-carregamento dicas (seta). (C) o gel de carregamento dicas são removidas antes da centrifugação em um adaptador personalizado-fabricadas centrífuga. Esparadrapo (azul) é colocado sobre as peças de alumínio para amortecer o dispositivo. (D) após centrifugação e verificação do carregamento, o dispositivo é gravado para uma inserção de palco do microscópio e encaixado nos pinos de entrada e saída. Na imagem mostrada, comutação médio é tornada possível por válvulas de pressão e Y-conectores que estão dispostos em um aparelho feito de uma caixa de ponta da micropipeta. (E) visão esquemática de um dispositivo montado inteiro, desde as bombas de seringa para o recipiente de resíduos. O tubo de saída é executado para um copo pequeno de resíduos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: célula de carga e crescimento no dispositivo microfluidic. (A) da esquerda para a direita, micrografias de contraste de fase de um dispositivo contendo meio apenas antes do carregamento do celular, o mesmo dispositivo depois que as células foram adicionadas via pipetagem, mas antes de centrifugação e o mesmo dispositivo após o carregamento de centrífugo. (B) curso de tempo de adaptação celular e crescimento do dispositivo (LB, 37 ° C, vazão de 1,5 µ l/min). No início da adaptação, as células em fase estacionária são relativamente curta e estreita. Como as células se adaptar e voltar à fase exponencial de crescimento (60-120 min), adoptarem uma morfologia mais longa e mais larga. Após 120 min, todas as células no dispositivo estão retomando o uniforme-fase exponencial de crescimento, e o dispositivo está pronto para a imagem latente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: crescimento e meio de comutação no dispositivo microfluidic celular. (A) Kymographs mostrando 550 min de crescimento antes e 1.000 min de crescimento após a mudança de média (linha tracejada cinza) em 2% de etanol como um fator de estresse. Imagens foram capturadas em intervalos de 10 minutos. O painel superior mostra um repórter mNeonGreen transcriptional (canal verde) para um gene induzida por estresse. O painel inferior mostra um repórter mNeptune constitutiva (canal vermelho) que é usado neste caso de segmentação de célula automatizada. Ver os (B) close-up das parcelas dos kymographs na caixa tracejada no painel A, mostrando uma resposta transitória no canal da mancha verde, seguindo o médio do interruptor. Observe que o crescimento continua através do interruptor, embora a presença do etanol faz com que as células tornam-se mais curtos e crescer a um ritmo ligeiramente mais lento. Escala de tempo é mostrada pela barra horizontal e distância é mostrada pela barra vertical. (C) exemplo rastreia de dados analisados fluorescência de uma linhagem de célula única do experimento mostrado no painel A. As linhas verticais tracejadas indicam o médio do interruptor em 2% de etanol como um fator de estresse. (D) exemplo de um falhado médio do interruptor. Quando o segundo médio atinge as células, as células nos canais lysed. O interruptor é acompanhado por um grande número de células que passam no canal principal, causando um sinal fluorescente brilhante (uma imagem em re-escala correspondente à região desbotada é mostrada logo acima). Após a mudança, não há mais células são observadas, embora os restos da célula palidamente fluorescente permanece nos canais. Escala de tempo é mostrada pela barra horizontal e distância é mostrada pela barra vertical. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este protocolo de microfluídica é flexível, em que muitos dos passos podem ser modificados para otimizar o seu uso com uma determinada espécie ou cepa ou para uma finalidade específica. Com efeito, neste protocolo, fizemos modificações para o original de "máquina de mãe" conceito4 para otimizar seu uso com b. subtilis. Muitas vezes, as trincheiras em que as células estão confinadas constituem um recurso de camada única, Considerando que neste protocolo usamos trincheiras da dois-camada celular, com um canal raso em torno das células. O projeto da dois-camada foi introduzido como uma forma de maximizar o fluxo de nutrientes e metabólitos de células b. subtilis , especialmente em longo (> 75 µm) trincheiras5; no entanto, muitas vezes características de camada única é suficiente para o crescimento da célula ideal e são comumente usadas para Escherichia coli, especialmente quando eles são mais curtos (~ 25 µm)4. Normalmente usamos mais trincheiras, como reduzem a frequência com que cadeias de célula b. subtilis , que surgem estocàstica, são puxadas fora suas trincheiras pelo fluxo médio na alimentação principal canal5.
Outras modificações, tais como o uso de dispositivos com recurso de diferentes dimensões (por exemplo, larguras de canal) ou características (por exemplo, forma, número de extremidades abertas) podem ser substituídas conforme apropriado. Por exemplo, o uso de celulares que trincheiras que estão abrir em ambas as extremidades (em vez de apenas um fim, como no presente protocolo) tem sido utilizado em outros estudos,1,20,21. Trincheiras abertas em ambas as extremidades evitam envelhecimento celular, porque eles estão constantemente sendo preenchidos com células recém-nascido (em oposição a mãe máquinas, onde a célula mais antiga é controlada e novas células são empurradas fora do canal), embora o fato de que as células mais velhas são empurradas Se ambas as extremidades normalmente limita sua janela observacional para menos de 10 gerações1,21. Normalmente buscamos o mais observacional windows (centenas de gerações) oferecido por uma máquina de mãe, que tornam possível a medida nem memoryless processos para os quais os tempos de espera são dezenas ou centenas de gerações muito tempo5. Também usamos o design da máquina mãe observar células que não estão crescendo exponencialmente, como em nossas análises de esporulação22. Em tais casos, células adicionais durante o crescimento de trincheiras podem ser significativamente analisaram22.
Muitos dos passos no protocolo são relativamente indulgente em que eles podem ser modificados sem afetar substancialmente o resultado do protocolo. Por exemplo, uma versão anterior do protocolo chamado para limpeza do vidro de tampa por etapas de sonication sequencial de 10 min de banho em 10 M KOH e água pura em seguida, mas achamos que dispositivo boa ligação e operação foi conseguido usando o mais simples baseada em isopropanol limpeza passo descrito aqui. Se um problema de ligação se levantou essa suspeita de elenco sobre a limpeza do vidro tampa, revertendo para um protocolo de limpeza mais rígidas é recomendado. Da mesma forma, enquanto nós usamos uma centrifugação para maximizar a célula em trincheiras célula de carga, carregamento razoavelmente cheio pode ser alcançado mesmo sem este passo, desde que muito concentrado de células é usado para a etapa de carregamento. Esta estratégia alternativa pode ser especialmente útil para pesquisadores que não têm um adaptador de centrífuga prontamente disponível para girar o dispositivo. Mais uma vez, podem ser utilizadas diferentes concentrações do agente de passivação/lubrificação (BSA neste protocolo); rotineiramente usamos concentrações tão elevadas quanto 1 mg/mL. Em casos onde uma cepa pode ser sensível a BSA, resultados aceitáveis podem ser alcançados mesmo na ausência de um agente protector. Com efeito, quando estávamos a usar um dispositivo microfluidic para examinar a esporulação, que exige a fome celular, nós estávamos preocupados que BSA pode agir como uma potencial fonte de nutrientes para as células, e então nós omitidos, o fluxo médio sem observar qualquer substancial efeitos adversos22.
Notavelmente, o fluxo contínuo de mídia através do dispositivo pode provocar fenótipos ligeiramente diferentes em comparação com o crescimento de células em um sistema fechado, como um balão. Por exemplo, depleção de nutrientes ou composta pode ser um desafio, como células muitas vezes podem eliminar compostos de rastreamento do fluxo médio. Com efeito, temos observado que induzir a esporulação de célula através de fome exige mais tempo em um dispositivo microfluidic do que num balão. Da mesma forma, temos observado que a indução de estresse de energia usando a fosforilação oxidativa decoupler Carbonilcianeto m-clorofenil-hidrazona (CCCP) requer several-fold umas concentrações mais elevadas no dispositivo microfluidic de relatado na cultura de balão 23. portanto, alguma otimização pode ser necessária para obter resultados satisfatórios com diferentes aditivos médios.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este projecto foi financiado pelo National Institutes of Health, sob GM018568. Este protocolo foi realizado em parte no centro para sistemas de nanoescala (CNS), um membro do nacional nanotecnologia coordenada infra-estrutura de rede (NNCI), que é apoiado pela Fundação Nacional de ciência sob prêmio NSF n º 1541959. CNS é parte da Universidade de Harvard. Muitos agradecimentos são devidos a Thomas Norman e Nathan Senhor por seu trabalho em conceber e fabricar o modelo mestre, usado para os dispositivos mostrados aqui e na construção da versão original do aparelho. Também agradecemos a Johan Paulsson por sua valiosa colaboração assessoria e agradecer aos membros de seu laboratório para seus conselhos e melhorias contínuas para aparelhos microfluidic bacteriana.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | (240)4019862 | This is referred to as PDMS in the protocol. There are 2 components that are mixed at a 10:1 ratio |
| 0.75-mm biopsy punch | World Precision Instruments | 504529 | |
| 22 x 40 mm No. 1.5 cover glass | VWR | 48393 172 | |
| Plasma Etch PE-50 | Plasma Etch Inc. | PE-50 | Instrument used to bond PDMS to glass using oxygen plasma treatment |
| Tygon flexible tubing ID 0.02", OD 0.06" | Saint-Gobain PPL Corp. | AAD04103 | For the main part of the tubing, e.g. attached to the needles |
| Silicone Tubing, 0.04" ID, 0.085" OD | HelixMark Standard Silicone Tubing | 60-795-05 | For pinch valves and Y-junction connection |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100G | Used as passivation agent |
| ART Gel Pipet Tips (P200) | Molecular BioProducts | 2155 | For loading the device with medium and cells |
| Acrodisc 32-mm syringe filter with 5-μm Supor membrane | Pall Life Sciences | 4560 | For filtering cultures before device loading |
| 21-ga blunt needles, 1" | McMaster-Carr | 75165A681 | |
| Y connector with 200-series barbs, 1/16" ID tubing, polypropylene | Nordson Medical | Y210-6005 | The company is AKA Value Plastics |
| Eclipse Ti-E inverted microscope | Nikon | This unit has been discontinued by the manufacturer and is replaced by the Ti 2 E. | |
| LB Lennox | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Microfuge 18 | Beckman Coulter | 367160 | |
| Bacillus subtilis strain NCIB3610 | Bacillus Genetic Stock Center | 3A1 | wild-type parental strain modified for use in the experiments shown in this protocol |
| Gravity convection oven | VWR | 414005-106 | for curing PDMS and baking assembled devices |
| Scotch-Weld Epoxy Kit | 3M | 2216 B/A | may be used to bond a silicon wafer to an aluminum backing plate |
| Scotch Magic tape, 3/4" width | 3M | to clean dust from PDMS devices and to place over features to increase visibility (denoted "office tape" or "adhesive tape" in protocol) | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ800N | listed here as an example; nearly any stereomicroscope will do |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907 | To clean cover glass |
| Syring pump, 6 channel | New Era Pump Systems Inc. | NE-1600 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34120 | a brand of dust-free wipes |
References
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