Summary
Biz örnek olarak Bacillus subtilis kullanarak bireysel bakteri hücre soy mikrosıvısal çözümlenmesi için bir yöntem mevcut. Yöntemi gözlem, hücre nesiller sıkı bir şekilde kontrol edilebilir ve düzgün büyüme koşullar altında yüzlerce izin vererek Mikrobiyoloji geleneksel analitik yöntemleri eksikliklerin üstesinden gelir.
Abstract
Mikrosıvısal teknoloji birçok Mikrobiyoloji geleneksel analitik yöntemleri için kısıtlamaları üstesinden gelir. Toplu-kültür yöntemlerinden farklı olarak, tek hücreli çözünürlük ve nesiller yüzlerce spanning kez uzun gözlem sunar; Özel yastık tabanlı mikroskobu sıkı kontrol Tekdüzen büyüme koşullarına sahiptir. Çünkü bir mikrosıvısal aygıt neden olduğu hücre büyümesi ve metabolizma, otantik değişiklikler gen ekspresyonu ve hücre büyümesini yanıt olarak yerel kimyasal ortamdaki öngörülemeyen varyasyonlarından hücrelerde büyüme ortamının sürekli akışı ayırır belirli uyaranlara daha güvenle görülebilmektedir. Bacillus subtilis kullanılır burada bir "ana makine" göstermek için bir model bakteriyel türler olarak-yazın için hücresel analiz yöntemi. Biz oluşturmak ve bir mikrosıvısal aygıt çekül, hücrelerle yüklemek, mikroskobik görüntüleme başlatmak ve bir büyüme ortamından diğerine geçiş yaparak bir uyarana yapan hücreleri göstermek nasıl göstereceğim. Stres-duyarlı bir muhabir bu yöntemle elde edilen veri türü ortaya çıkarmak için bir örnek olarak kullanılır. Da kısaca uygulamaları deneyler, bakteriyel sporulation analizi gibi diğer türleri için bu yöntemin daha fazla tartışmak.
Introduction
Dünya'daki yaşam en çarpıcı özelliklerinden biri onun büyük esneklik ve çeşitlilik olduğunu. Moleküler Biyoloji merkezi amacı tarafından hücreleri genler ve proteinler onların büyüme ve fitness çok çeşitli çevresel koşullar altında en üst düzeye çıkarmak için kullanılan mantığı anlamaktır. Bu hedefe ulaşmak için bilim adamları güvenle gözlemlemek mümkün olmalıdır nasıl, tek tek hücreleri büyümek, bölmek ve onların genler belirli bir koşullar kümesi altında hızlı hücre kendi ortamlarında sonraki değişiklikler nasıl yanıt verdiklerini kaydetti. Ancak, Mikrobiyoloji geleneksel analitik yöntemleri ele alınabileceği soru türleri etkiler teknik kısıtlamalar bulunmaktadır. Örneğin, toplu kültür tabanlı analizler yıllar içinde çok yararlı olmuştur henüz anlamlı hücre hücre çeşitleri veya daha küçük alt nüfus toplam nüfusunun hücrelerinin davranışlarını maske yapabilirsiniz nüfus düzeyinde veri sundukları. Tek hücreli analizleri üzerinde ışık mikroskobu göre yaşayan bakterilerin tek hücreli davranışı ortaya ama aynı zamanda teknik olarak sınırlıdır. Bakteri genellikle büyüme orta, içeren özel yastıkları immobilize ama büyüme ve bölünme kalabalıklar mikroskobik görünümü hücre ve gözlem zaman1önemli ölçüde sınırlayan bir kaç hücre döngüsünden sonra kullanılabilir besin tüketir, 2. Ayrıca, besin yerel tükenmesi ve hücre büyümesi nedeniyle metabolik yan eşlik eden birikimini sürekli yerel hücre büyüme çevre değişiyor yollarla ölçmek ya da tahmin etmek zordur. Özel pedleri kullanarak bu tür çevresel değişiklikler için çalışmalar kararlı durum davranışları veya hücresel yanıt büyüme koşulları3belirli değişiklikler için bir sorun teşkil.
Bir sıvı orta sürekli microfabricated cihazlar aracılığıyla akıtılana mikrosıvısal, klasik deneysel sınırlamalar bir çözüm sunar. Büyüme orta akış sürekli hücreleri ile taze besin sağlar ve metabolik yan ve aşırı hücreleri, böylece son derece düzgün bir büyüme oluşturma uzak yıkar bir mikrosıvısal aygıt tek tek hücreler pozisyon için yaşamak-cep mikroskobu saklayabilirsiniz çevre. Sürekli büyüme koşullar altında çevresel faktörler, hücre iç mantık Engelsiz bir görünümünü izin etkisi düşük yalıtım modunda hücre davranışlar görülebilir. Hücrelerle kalabalık olma mikrosıvısal cihaz sıvı akışını engeller, tek hücre soy onlarca veya yüzlerce nesiller için gözlem olası4,5olur. Böyle uzun gözlem kez aksi takdirde belirlenemeyen uzun vadeli veya nadir cep davranışları tespiti izin. Son olarak, aygıt akıyor, değiştirilebilir orta bileşimi olacak, onlar bir stres başlangıcı veya giriş veya belirli bir bileşik kaldırılması için yanıt olarak uyması gereken hücreler izin.
Havacilik zaten önemli uygulamaları bir dizi kazanmıştır. Örneğin, doku, organ- veya vücut-on-a-chip aygıt, birden fazla insan hücre türü bir vivo içinde durumu6benzetimini yapmak için işbirliği kültürlü olduğu içinde kullanılmıştır; microstructured ortamlar7nematodunun hareketi incelenmesi için; Bakteriyel biyofilmler (örneğin, 8); arasındaki etkileşimler incelemek için ve için saklama ve işleme küçük hacimli hücreleri veya kimyasal maddeler (örneğin, 9). Mikrosıvısal cihazlar da özellikle onların fiziksel olarak (için mükemmel yorumları, bkz: 10 ve 11), Mikrobiyoloji alanında giderek daha popüler hale gelmiştir ve akış özellikleri doğal mikrobiyal nişler12' ye uyumlu. Örneğin, havacilik son zamanlarda microbiologists tarafından bu tür amaçlar için tam olarak patojen hareketi16analiz hücre büyüme ve bölüm13,14,15, ölçüm olarak istihdam edilmiştir, çekirdek algılama17 ve fizyolojik geçişler18izleme ve protein için sayma19, birçok diğer örnekler arasında. Burada sunulan yöntem suşları ya türü birleşimlerini yerine tek bakteri hücre soy analizi için özel olarak tasarlanmıştır. "Ana makine" tasarım4hangi hücreleri tek dosya büyüdü, bir varyasyon aşağıda gösterildiği mikrosıvısal aygıt kullanır içinde bir mikrosıvısal siper bir kapalı ucu ve bir açık uçlu; hücre büyümesi ve bölünme iter döl hücreleri yukarı ve dışarı açık ucu sıvı akışı. Bizim analizler genellikle yalnızca açmanın kapalı sonunda sınırlı "anne" hücre odaklanmak. Biz bu yöntemi önceki ışık mikroskobu tabanlı tek hücreli analitik teknikler, Hücre immobilizasyon üzerinde özel yastıkları gibi üzerinde bir gelişme düşünün. B. subtilis bir model olarak kullanılırken, yöntem aynı zamanda diğer bakteriyel türler için geçerlidir (Escherichia coli başka bir ortak modeli, farklı hücre boyutlarını veya türleri morfoloji ile bazı türler yeni cihazlar imalatı gerektirebilir farklı boyutları ile). Floresan gazetecilere hücreleri işaretlemek için ve gen ekspresyonu değişimler görselleştirmek için kullanımı genetik olarak uysal türlerin kullanımını gerektirir; Ancak, hücre büyümesi ve Morfoloji bile floresan işaretleri mümkün analizlerdir.
Mevcut iletişim kuralı fotolitografi, başka bir yerde yaygın olarak tanımlanmıştır5kullanarak silikon asıl imalatı işlemi hariç; ustalar da microfabrication tesislerinden kolayca dış kaynaklı olabilir. Güçlendirilmiş silikon ana PDMS aygıttan kalıplama içerir; kapak cam parçası aygıta bağlar; mikrosıvısal giriş ve çıkış sıhhi tesisat montaj, orta geçiş izin vermek için de dahil olmak üzere çimdik vanalar; Cihazın pasivasyon, bakteri hücreleri hazırlamak ve bakteri hücreleri ile aygıt yükleme; su tesisatı için aygıt ekleme ve hücreleri sıcaklığına; ve üzerine floresan mikroskop için düşsel aygıt yükleme. Çünkü birçok farklı resim alma ve işleme yazılımı araçları görselleştirmek ve faiz4,5farklı veri analiz etmek için kullanılabilir, örnek resimler gösterilir, ama görüntü yakalama yöntemleri bu protokol için dahil değildir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. PDMS aygıt döküm
- Tozsuz bir ortamda mix PDMS polimer ve kür Ajan 10:1 oranında ve en az 10 dk için vakum altında degas.
- Kırılmamış alüminyum folyo parçası üzerinde bir silikon ana (veya bunların bir epoksi veya poliüretan yineleme) polistren bir Petri tabağına yerleştirin. Degassed PDMS karışımı bir derinlik, yaklaşık 5 mm. Degas Petri tabağı en az 10 dk. kullanım için asıl yüzey kabarcık kırmak için hava yumuşak akışı dökün.
Not: Kullanılan iki katmanlı cihazın boyutları eşlik eden CAD5 dosya sağlanır (bkz. ek dosya 1). Bir plastik çoğaltma ana gaz giderme sırasında kısmen savrulabilir; Bu durumda, çoğaltma temiz plastik bir aplikatör ile itin. - 60 ° c fırında en az 1 h için PDMS tedavi ve oda sıcaklığında serin. Ana ve tedavi PDMS Petri plaka içeren alüminyum folyo kaldırın. Alüminyum folyo asıl arkasından dikkatle akasındaki sonra dikkatli bir şekilde ana PDMS soyma.
Not: Alternatif olarak, PDMS gecede oda sıcaklığında giderildi. Bir silikon gofret ustanın göreli kırılganlık kalıcı olarak 1/16 inç gofret bağ için epoksi yapıştırıcı kullanarak aşmak-kalın alüminyum disk gofret olarak aynı boyutta. - Bir gofret genellikle birkaç mikrosıvısal aygıt (bkz. ek dosya 1) biraz farklı boyutları ile içerir gibi temiz, keskin neşter kullanarak boyutlandırmak için tek bir aygıt kesti.
Not: B. subtilis iş alışılmış çalışma yöntemi için C veya F eşlik eden CAD dosyası ile işaretlenmiş 1.0 µm çapında hücre siperleri ile cihazlar kullanın.
2. aygıt Delme ve bağlama
- Yer biteviye-in yarı saydam office desenli özellikleri görünürlüğünü artırmak için aygıt desenli yan tarafa teyp ( Tablo malzemelerigörmek). Giriş ve çıkış bağlantı noktaları görünür sıvı kanalları (şekil 1) ters ucunda dairesel alanları olarak tanımlanır. Ne zaman içinde belgili tanımlık aygıt giriş ve çıkış pins için delik delme onların görünürlüğünü artırmak için ince uçlu bir işaretleyici kullanarak nokta ile giriş ve çıkışları işaretleyin.
Not: giriş ve çıkış sabitleyicileri kalabalık değildir emin olmak için her kanal, kanal hemen altında aygıtın alfabetik göstergesi ile başlayan yumruk. - Böylece desenli yan aşağı PDMS aygıt flip ve aygıt için bir 0,75 mm biyopsi yumruk kullanarak işaretli nokta üzerinden yumruk; punchings atın.
Not: biyopsi yumruk tarafından oluşturulan delik genellikle biraz nerede yumruk polimer girer alevlendi çünkü belgili tanımlık aygıt desenli tarafı yumrukladı. Cihazın bir ters yönde Delme desenli tarafında delik keskin bir kenarlığı vardır sağlar. - Bir stereomicroscope kullanarak, delikli delik cihazın giriş ve çıkış alanları ile üst üste emin olun. İnce uçlu cımbız PDMS herhangi bir yabancı parçaları delikli delik kaldırmak için kullanın.
- Yapışkan bant toz yeri ve aygıt her iki tarafından bir temiz polistren Petri plaka kaldırmak için kullanın. 22 mm x 40 mm kapak cam % 100 izopropil alkol ile ıslatma ve temiz oda temizleme işlemi ile sürtünme hazırlayın; Kuru bir dere tozsuz hava veya azot ile.
- Delikli PDMS aygıt özelliği yan birlikte temizlenir cam bir oksijen plazma temizleyici yerleştirin.
- Plazma-aşağıdaki ayarları cihazla tedavi: vakum, 70 mTorr; O2 basınç, 200 mTorr; süresi, 15 s; Hemen plazma tedavi süresi sona erdikten sonra güç, 30 W. aygıt ve cam plazma temizleyici çıkarın.
- PDMS ters çevir ve desenli yan cam rehber kapak cam ortasına yerleştirin; (giriş ve çıkış alanları arasında çalışan) besleme kanalları kapak cam uzun ekseni ile hizalandığından emin olun. Çok yavaşça PDMS mühürler cama emin olmak için bastırın.
- Bir fırın montajı aygıt için en az 1 h 60 ° C'de pişirin Pişirme sonra el ile PDMS cam cihazın bir köşede hafifçe iterek gümrüklü doğrulayın.
Not: bir kez belgili tanımlık aygıt bağlı, polimer ile artan yaşam süresi plazma tedaviden sonra giderek hidrofobik hale olarak 24 saat içinde kullanılmalıdır.
3. mikrosıvısal sıhhi tesisat hazırlık
- Polimer (kullanılıyorsa) anahtarlama cihazları şırınga pompa ulaşmak için uygun uzunlukta ve mikroskobunun monte edildiğinde cihaz (iç çap (ID) 0,02 inç, dış çap (OD) 0,06 inç) boru uzunlukları kesti. Mikrosıvısal yolları gibi birçok uzunlukları kesti.
- Y kavşak çimdik vanalar için kesme ve esnek silikon üst barbs "G" ve "G" alt barb için silikon tüp uzunlukları 1 cm (0.03 inç kimliği, 0,065 inç OD) boru uzunlukları 2 cm ekleme tarafından (kullanılıyorsa) monte
- Polimer boru uzunlukları 10 cm (veya uygun) kesme; "G" alt barb 1 cm silikon tüp kesimlerinde içine ekleyerek anahtarı Kavşağı için bir ucunda bağlamak Bunları plastik şırınga adaptörleri ve bent yaklaşık 90 ° yaklaşık 9 mm iğne sonundan itibaren kaldırılmıştır 21 G iğneler için diğer ucunda bağlayın.
- 21 G künt iğneler şırınga iğneleri boru içine ekleyerek anahtarı aparatı çalışır boru parçaları bir ucunu bağlayın. Y kavşak giriş barbs silikon tüp kesimlerinde her boru uzunluğu diğer ucunu takın.
Not: bir tür cihazlar çimdik vanalar ve kavşak tutmak için kullanmak; Bu micropipette uç kutusu (şekil 2B) kolayca yapılabilir. - Cihazın prizinden atık atık bir ölçek için yürütmek için polimer boru uzunlukları kesti. Onları yukarıda açıklandığı gibi hazırlanan bükülmüş 21 G iğneler için bir ucunda bağlayın. Tüpler diğer ucunu atık bir ölçek teyp.
- 0.1 mg/mL sığır serum albumin (BSA) içeren ortama uygun miktarda hazırlamak ve şırınga sayısını ve istediğiniz boyuta doldurun. BSA yüklü şırınga giriş boru ve yük şırınga şırınga pompa bağlı hazırlanan 21 G iğneler bağlayın.
Not: cihazın 5 kanalları kullanılır, tipik deneyler için her biri 20 mL şırınga. Hangi orta açık olduğundan bir deney 5 şırıngaların 2 bankalar gerektirir. Burada, içeren ilk banka pompa Faz-1 pompa olarak adlandırılır ve içeren sonrası anahtarı orta ile ikinci banka pompa Faz-2 pompa olarak adlandırılır. - Hava giriş sıhhi tesisat üzerinden bir yüksek akış hızı enjektör pompaları çalıştırarak tasfiye (> 500 µL/dak), başlangıç şırınga pompalar dikey yönlendirme ve üst hava kabarcığı getirmeyi şırıngaları dokunarak. Bir kez hava şırınga temizlendi, şırınga pompa yatay konuma getirin ve aşamalı olarak dokunun veya şırıngaları polimer satırlarından çıkarmak ve hava kabarcıkları tasfiye anahtarı aparatı flick. Eğer (medya anahtarlama) şırınga ikinci banka için bu işlemi yineleyin.
- Hava kabarcıkları temizlenir sonra Faz-2 şırınga pompa ayarla (Yani, kullanılacak olan orta ile anahtarından sonra ikinci) 1,5 µL/dk, sonra akışını duraklatır. İkinci orta aşamasına karşılık gelen Y kavşak kolu küçük bağlayıcı klipleri esnek boru parçaları üzerine yerleştirin. İkinci orta giriş boru üzerinden temizlemek en az 30 dakika için bir mütevazı akış hızı (örneğin, 10 µL/dak), faz-1 enjektör pompa çalışmaya devam aşağı Y kavşak.
4. hücre kültür hazırlama
- Bir preculture büyük ilgi istenen orta yük gecede, durağan faz için büyümek. Bakteriyel zorlanma böylece hücreleri cihazın kanalları dışında yüzmem hücreleri hareketsiz, işler bir mutasyon içermelidir.
Not: Bu protokol için bakteriyel yük B. subtilis 3610 olduğunu bir cadıA233V ikame, (Bu mutasyon neden düz Helisel, önleme hücre hareketliliği yerine olmak kamçı) içeren bir PrsbV- mNeonGreen muhabiri hücre stres ve bir kurucu Phyperspank- mNeptune (kırmızı) muhabir hücreleri vurgulamak için. LB Lennox orta örnek protokolü kullanılır. Tipik suşları havacilik deneyler için bir veya daha fazla floresan transkripsiyon gazetecilere ve yapısal üretilen, sitoplazmik floresan protein hücrelerinin otomatik algılama kolaylaştırmak için içerir. Büyüme kusurları LB Lennox zengin Orta kullanılmıştır, ancak en az medya B. subtilis büyüme mikrosıvısal koşullar altında salgılanan çünkü inhibe siderophores uzağa tarafından orta akış yıkanır tespit edildi değil. Bu durumda, büyüme sodyum sitrat ve orta ferrik klorid eklenmesiyle S750 orta11için rapor olarak geri yüklenebilir. - Deneme, sabah B. subtilis hücreler büyüme ortamının 25 mL içeren bir şaşkın 250 mL şişe 1:50 oranında seyreltin. 1'den büyük bir optik yoğunluğunun 37 ° C'de kültür sallayarak içinde 5-6 h için hücreleri büyümek.
Not: sabit faz B. subtilis vardır daha küçük ve daha az sık sık bulunan hücre hücreleri çünkü yoğun hücre kültürü tercih edilir zincirleri, aygıt yükleme kolaylaştırmak. Farklı bakteri türleri diğer Orta veya büyüme koşulları için en uygun yükleme gerektirebilir. - 5-µm gözenek boyutu filtre ile donatılmış bir şırınga kullanarak, hücre kültürü yaklaşık 15 mL ( E. coli için gereksizdir ve diğer türler ile gerekli olmayabilir) B. subtilis hücre zincirleri kaldırmak için bir 15 mL konik tüp içine filtre uygulama.
Not: Görece az sayıda hücre kaldırılması gerektiğini; filtrate bulanık olmalıdır. - Filtre uygulanmış kültür için 4.000 x g oda sıcaklığında 10 dakika santrifüj kapasitesi. Eğer hücre süspansiyon pipetting kolaylaştırmak için gerekli taze orta yaklaşık 500 µL ekleme tüpte kalan kalan süpernatant sıvı hücre Pelet resuspend ve süpernatant dökün.
5. aygıt yükleme
- Yavaşça boş ince jel-yükleme micropipette koyun mikrosıvısal cihazın çıkış deliklere İpuçları ( Tablo malzemelerigörmek).
- İnce jel-yükleme ipuçları P200 micropipette ile kullanarak, aygıt 1 mg/mL BSA giriş deliklere dolum mikrosıvısal kanal (şekil 2A) izlemek için çıkış delikleri ipuçlarında gözlemleyerek içeren orta enjekte edilerek passivate. Cihazın oda sıcaklığında yaklaşık 5 min için kuluçkaya.
Not: BSA genellikle onun hydrophilicity artan ve diğer proteinlerin veya hücre (hücre yüzey molekülleri) üzerinden bağlama azaltarak PDMS polimer hidrofobik yüzeye bağlayan bir engelleme veya pasivasyon ajan olarak kullanılır. - İnce jel-yükleme ipuçlarını kullanarak, aygıt (şekil 2B) hücreleri ilerlemesini izlemek için çıkış kanalda ipuçlarını kullanarak her kanal ile resuspended hücrelerden (Bölüm 4), yük.
Not: Yükleme P200 micropipette en fazla 200-µL hacmi ayarlayıp sonra hücre küçük hacimli (yaklaşık yarım hacmi pipet ucu ince bölümünü) aspirating önce hava yastığı aspirating kolaylaştırılmıştır. PDMS aygıt hacmi micropipette göre küçük olduğu resuspended hücre hacmi kesin, olması gerekmez. Hücre süspansiyon cihazın içine pipetted sürece resuspended hücre yoğunluğu için üst sınır yoktur biliyoruz. Hücre kümeleri cihazın yapışmasına neden olabilir ve tam pipetting ve/veya girdap karıştırma tarafından kaçınılmalıdır. - Yavaşça jel-yükleme ipuçları teker teker cihaza zarar önlemek için çalışma çıkış delikleri kaldırın.
- Santrifüj kapasitesi yaklaşık 6.000 x g de bir uygun rotor adaptör bir tezgah üstü microcentrifuge cihazda 10 dk (şekil 2C).
Not: bir microcentrifuge rotor (şekil 2C) uyacak şekilde tasarlanmış bir özel işlenmiş alüminyum rotor adaptör kullanılan; farklı santrifüj modelleri uygun rotor adaptörler ile kullanılabilir. Önemli özelliğidir adaptörü, böylece hücreleri yan kanallarına zorlama hücre siperler, kapalı uçları yönünde yanal kuvvet sağlamasıdır. - (Şekil 3) mikroskop altında başarılı yükleme doğrulayın ancak cihazın slayt tutucu/sahneye yapıştırılması olmadan eklemek.
Not: Bu protokol için bir 60 X, 1.4 NA Ph3 petrol-daldırma amaç bu aşamada her iki doğrulama için sonraki görüntüleme için kullanılır.
6. cihaz montaj, denge ve montaj
- Dikkatle PDMS sahne Ekle alt tarafındaki kapak cam taping tarafından yüklenen aygıt sahne Ekle üzerine monte (Yani, aygıtı eklemeden önce sahne Ekle ters çevir). Böylece PDMS karşı karşıya olduğu sahne Ekle-aygıt montaj ters çevir ve tozsuz mendil (şekil 2B) gibi yumuşak bir yüzeye yerleştirin.
- 35 µL/dak Faz-1 enjektör pompa akış hızı ayarlamak bir yol, bir anda çalışıyor, giriş iğne ve sonra çıkış iğne ekleyin (Yani, çalışan atık kabı için; Şekil 2E).
- Uzak aşırı herhangi bir ortamda temiz tozsuz mendil ile silin ve cihazın kaçakları kontrol edin. Aşırı hücreleri (genellikle bulanık bir çizgi görünür) ve yavaş yavaş atık kabı doğru hareket edecek orta Menisküs görünümünü çıkış boruları inceleyin.
- Cihazın 35 µL/dk için yaklaşık 15-30 dakika, tüm bağlı yolları atık kabı boşaltılmasına kadar çalıştırmak için izin verir.
- Faz-1 enjektör pompa 1,5 µL/dak için ayarla ve akışını duraklatır. Tüm pompa ve aygıt aparatı (Bu işlem destekli tüm çalışırken bir at arabası yerleştirerek) mikroskop getirmek ve Faz-1 1,5 µL/dak, Orta Akış dikkatle cihazın üzerine bir ters Floresans mikroskobu ile sahne Ekle mount yeniden kullanma giriş ve çıkış boru yönlendirmek için gereken bant.
- İstenilen pozisyonlar için düşsel aygıt bulun ve istediğiniz gibi görüntüleme başlar. Not hücreleri genellikle gerektirir kararlı durum üssel faz büyüme ulaşmak için birkaç saat (yaklaşık 10 nesil) ve resim alma başlangıcı olarak gecikebilir görüntüleme denge döneminden sonra başlamasını istediğiniz.
Not: Kararlı durum büyüme üstel aşamasında düzenlenen hücre sonraki görüntü analizi sırasında hücre bölünmesi kez izleme ve sürekli en az değeri ulaştınız sağlanması doğrulanması gerekir.
7. orta arasında geçiş yapma
- Arasında art arda gelen mermi görüntüleme Faz-1 enjektör pompa akış duraklatın. Dikkatle boru, Y kavşak Faz-1 Şubesi her silikon tüp hareketli Faz-2 silikon üzerinden bağlayıcı klipleri çöz. BM-pause Faz-2 akışını (Bu adım 3.8 1,5 µL/min ayarlandı) pompa şırınga ve görüntüleme devam.
Not: polimer aşağı boru, 10 cm uzunluğunda 1,5 µm/min, Y kavşak ikinci aşama orta cihazın yaklaşık 50 dakika içinde ulaşır. Cihazın vakti floresan izleyici parçacıkları içeren medyayı kullanarak ampirik olarak test edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yükleme, faz kontrast mikroskopi tarafından aygıta mikrosıvısal sıhhi tesisat eklemeden önce değerlendirildi gibi başarılı ilk hücre veya neredeyse tümünü içeren bir veya daha fazla bakteri hücreleri ( mikrosıvısal yan Kanallar sahip olarak düşünülebilir Şekil 3A). En uygun yükleme her kanalda birkaç hücreyi gösterir ama kanalları yine de hücreleri hücre büyüme denge döneminde (şekil 3B) nedeniyle değeriyle doldurur. Zavallı, hangi nispeten yükleme ile şerit kaç (< % 50) yan kanalları içeren hücreleri, yüklü kullanılabilir, ancak elde edilen veri yoğunluğu daha az sayıda hücre soy görüntüleme her konumda görüntüsü nedeniyle düşük olacaktır.
Cihazın başlangıçta yüklendikten sonra mikrosıvısal sıhhi tesisat ekleyerek ve orta cihazın 35 µL/dk'ya nispeten yüksek akım hızında akan tarafından equilibrated. Denge adım hava kabarcıklarının ve aşırı hücreleri besleme kanalda aygıttan kaldırmak ve büyüyen başlamak için yan kanalları hücrelerde teşvik etmek için hizmet vermektedir. Orta Akış üzerine aygıttan kaldırılır hücreleri kez çıkış boru atık konteyner doğru hareket bir açık renkli grup olarak çıplak gözle görülebilir; Böyle bir grup hareket sıvı normalde sıhhi tesisat ve cihaz akan görsel bir gösterge olarak hizmet vermektedir. Dengelenmiş bir aygıt mikroskobik incelenmesi birkaç hücreleri yan kanallar (şekil 3B, 0 dk) çoğunda tek dosyada sınırlı ortaya çıkarmak.
Dengelenmiş bir aygıt mikroskop altında akışı 1,5 µL/dk 37 ° C'de yerleştirilir sonra hücreleri yaklaşık 2 h (şekil 3B) boyunca düzgün ve sürekli aşama üstel büyüme devam edecek. Sürekli üstel büyüme doğrudan görüntü analizi sonra bir plato görünümünde hücrelerin oluşturma süresi tarafından doğrulanması gerekir. Bu noktada, hücreleri floresan ve/veya istediğiniz gibi görüntüleme aydınlık alan için hazırsınız. Başarıyla yüklenen ve denge aygıt genellikle güvenilir bir şekilde en az 24 saat (şekil 4A, C) süre yansıması. Orta düğmesi (şekil 4A-C) tanıtımı yapılabilir, ancak aynı zamanda felaket hücre-ölüm olayları (şekil 4 d), muhtemelen hava başlanarak sıklığı artar deneyler aralığını genişletir başarılı bir şekilde boru üzerinden tasfiye edildi değil kabarcıklar. Felaket hücre ölümüne neden olabilir başka bir olay girişi bulunan hücre kümeleri yerinden olmak ve besleme kanalı ile geçmek şekil 4 diçinde gösterildiği gibidir. Neden bu cihazda felaket hücre ölümüne neden olur ve biz henüz bu tür olayların oluşmasını önlemek için bir yöntem icat değil şu anda anlamıyorum.
Şekil 1: mikrosıvısal cihazın şematik. Şematik bir cihaz yaklaşık olarak ölçeklemek için gösterilir. Alfabetik göstergesi künt uçlu iğneler bağlanmak için yumruk giriş ve çıkış bölgeleri ile birlikte etiketlenir. Genellikle, desenli kanalları yarısı kullanılır (gölgeli gri). Hücre siperler göstergesi doğru yönlendirilmiş. Beraberindeki CAD dosyası (bkz. ek dosya 1) tüm özelliklerini aygıt üzerinde gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: mikrosıvısal aygıt pasivasyon, hücre yükleme ve denge. (A) A bağlı aygıt pasivasyon BSA içeren orta ile sonra. Jel-yükleme ipuçları orta ve hücreleri geçiş aygıtı üzerinden izlemek için çıkış delikleri tutulur. Orta Menisküs jel-yükleme İpuçları (ok) ince kısmında görülür. (B) aygıt hücre yükledikten sonra. Hücreleri bir yarı saydam beyaz katman jel-yükleme İpuçları (ok) olarak görülebilir. (C) jel yükleme ipuçları özel fabrikasyon santrifüj adaptör Santrifüjü önce kaldırılır. Tıbbi bant (mavi) cihazın rahatlatmak için alüminyum parçalar üzerinde yer alıyor. (D) aralıklarla ve doğrulama yükleme, aygıtın bir mikroskop sahne Ekle'nin üzerine bantlanmış ve giriş ve çıkış sabitleyicileri bağlı. Gösterilen görüntünün içinde orta geçiş çimdik vanalar ve Y-konektörler bir micropipette ipucu kutusundan yapılan bir aparat düzenlenen mümkün olmaktadır. (E) şematik şırınga pompalar atık konteyner için tüm bir monte cihaz. Çıkış hortumu küçük bir atık kabı için çalışır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: hücre yükleme ve mikrosıvısal aygıt büyüme. (A)soldan sağa doğru faz kontrast Filmler orta sadece hücre yüklemeden önce pipetting üzerinden ama Santrifüjü önce hücreleri eklendikten sonra aynı aygıt ve aynı cihaz santrifüj yükledikten sonra içeren bir cihazın. (B) saat ders hücre adaptasyon ve büyüme içinde belgili tanımlık aygıt (LB, 37 ° C, Debi 1.5 µL/dak). Adaptasyon başında, nispeten kısa ve dar sabit fazlı hücrelerdir. Hücreler uyum ve üssel faz büyüme (60-120 dakika) dönmek gibi daha uzun ve daha geniş Morfoloji evlat edinmek. 120 dakika sonra cihazın tüm hücrelerde Tekdüzen üssel faz büyüme sürdürme ve aygıtı görüntüleme için hazırdır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: hücre büyüme ve orta mikrosıvısal cihazda anahtarlama. Büyüme 550 dk önce ve 1000 dk bir tetikleyici olarak % 2 etanol içine orta geçiş (gri Kesikli çizgi) sonrası büyüme gösteren(a)Kymographs. Görüntüleri 10 dk aralıklarla ele geçirildi. Üst paneldeki bir stres kaynaklı gen için transkripsiyon mNeonGreen muhabir (yeşil kanal) gösterir. Alt paneli bu durumda otomatik hücre bölümleme için kullanılan bir bünye mNeptune muhabir (kırmızı kanalı) gösterir. (B) yakın çekim görüntülemek kymographs Masası A kesik kutusunda bölümlerini geçici bir yanıt orta anahtarı izleyen yeşil kanalda gösterilen. Etanol varlığı hücrelere daha kısa olmak ve biraz daha yavaş bir hızda büyümeye neden olur, ancak anahtarı devam büyüme dikkat edin. Zaman ölçeği yatay çubukla gösterilir ve mesafe dikey çubukla gösterilir. (C) örnek bir tek hücre soydan A. panel gösterilen deneme analiz Floresans verisinin izler Dikey kesik çizgilerle orta anahtarı %2 etanol bir tetikleyici gösterilir. (D) örneği başarısız bir orta anahtarı. İkinci orta hücreleri ulaştığında, kanallar hücrelerde lysed. Geçiş (solmuş bölgesine karşılık gelen bir yeniden küçültülen resmin sadece gösterilen) parlak bir floresan sinyal neden ana kanaldaki geçip hücreleri çok sayıda eşlik ediyor. Her ne kadar loş floresan hücre artıkları kanal içinde kalır anahtarından sonra hiçbir daha fazla hücre, gözlenir. Zaman ölçeği yatay çubukla gösterilir ve mesafe dikey çubukla gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Adımlardan kullanımı belirli türler veya zorlanma veya belirli bir amaç için en iyi duruma getirmek için değiştirilebilir bu havacilik Protokolü esnek olmamasıdır. Nitekim, bu protokol için kullanımı B. subtilisile optimize etmek için orijinal "ana makine" kavramı4 değişiklikler yapılmış. Çoğu zaman, bu protokol için hücreleri çevreleyen sığ bir kanal ile iki katlı hücre siperler, kullanın, ancak hangi hücrelerin sınırlı olan siperler bir tek katmanlı özelliği oluşturmaktadır. İki katmanlı tasarım özellikle uzun akı besin ve metabolitleri B. subtilis hücrelerden en üst düzeye çıkarmak için bir yol olarak kullanılmaya başlandı (> 75 µm) hatasına5; Ancak, tek katmanlı özellikleri sık sık optimum hücre büyümesi için yeterli ve özellikle olduklarında daha kısa (~ 25 µm)4 E. coliiçin yaygın olarak kullanılır. Onlar hangi ile stochastically ortaya çıkan, B. subtilis hücre zincirleri onların siperlerden ana besleme kanal5orta akış tarafından çekilmiş frekans azaltmak gibi genellikle daha uzun siperler, kullanın.
Daha da farklı özellik boyutları (örneğin, kanal genişlikleri) veya (örneğin, şekli, açık biter sayısı) özellikleri ile cihazların kullanımı gibi değişiklikleri uygun şekilde yerine olabilir. Örneğin, her iki ucundaki (yerine mevcut Protokolü olduğu gibi sadece bir ucunda) olan siperleri açmak hücre kullanımı diğer çalışmalar1,20,21' kullandı. Her iki ucunda açık olan siperler kaçının hücre yaşlanma çünkü onlar sürekli (aksine nerede en eski hücre izlenir ve daha yeni hücreleri kanal dışına itti anne makineleri,), Yenidoğan hücreleri ile dolu, ancak gerçeği büyük hücreleri itilir Her iki uçtan genellikle az 10 nesil1,21' den gözlemsel onların penceresine sınırlar. Biz genellikle bekleme süreleri onlarca olan ölçü birimi bile memoryless işlemleri için mümkün kılan bir ana makine tarafından sunulan artık bu gözlem pencereleri (nesiller yüzlerce) aramak veya5nesiller yüzlerce uzun. Biz de katlanarak büyüyen değil, hücre sporulation22bizim analizleri gibi gözlemlemek için ana makine tasarım kullandık. Bu gibi durumlarda, siperler anlamlı olabilir büyüme boyunca ek hücreleri22analiz.
Protokol sonucu önemli ölçüde etkilemeden değiştirilebilir Bu adımlardan protokolündeki nispeten bağışlayıcı. Örneğin, protokol önceki bir sürümü olarak adlandırılan 10 M KOH ve daha sonra saf su içinde sıralı 10dk banyo sonication adımları tarafından kapak Kablar yıkamak için ama iyi cihaz bağ ve operasyon elde daha basit kullanarak bulduk isopropanol tabanlı Burada açıklanan adım temizleme. Eğer kapak cam temizliği o dökme şüphesiyle bir bağ sorunu ortaya çıktığında, daha sıkı bir temizlik iletişim kuralına geri alınacak önerilir. Biz hücre hücre siperlerin yükleme en üst düzeye çıkarmak için bir Santrifüjü adım kullanırken, koşuluyla çok konsantre hücrelerin yükleme adımı için kullanılan benzer şekilde, makul tam yükleme bile bu adım, elde edilebilir. Bu alternatif strateji cihazın dönmeye hazır santrifüj bağdaştırıcıya sahip olmadığınızdan araştırmacılar için özellikle yararlı olabilir. Yine, farklı konsantrasyonlarda pasivasyon/yağlama aracı (BSA bu protokolü) kullanılabilir; Biz rutin konsantrasyonu 1 mg/mL yüksek olarak kullanın. Nerede bir yük BSA için hassas olabilir durumlarda, passivating bir ajan olmadığında da kabul edilebilir sonuçlar elde edilebilir. Nitekim, biz BSA hücreleri için potansiyel bir besin kaynağı olarak hareket ve bu yüzden biz bu orta akış herhangi bir önemli gözlem olmadan ihmal endişe vardı biz bir mikrosıvısal aygıtı hücre açlık gerektirir, sporulation incelemek için kullanırken yan etkileri22.
Özellikle, orta aygıt aracılığıyla sürekli akışı kapalı bir sistem, bir şişesi gibi hücre büyümesi ile karşılaştırıldığında biraz farklı fenotipleri temin. Hücreleri izleme bileşikleri orta akış kez kayıt atmak gibi örneğin, besin veya bileşik tükenmesi, zor olabilir. Gerçekten de, hücre sporulation açlık ile inducing bir şişeye bir mikrosıvısal cihazda daha uzun bir sürede gerektirir gözlemledim. Benzer şekilde, indüksiyon enerji stres oksidatif fosforilasyon decoupler karbonil siyanür m-klorofenil hydrazone (CCCP) kullanarak daha yüksek konsantrasyonlarda several-fold şişesi kültüründe bildirdi daha mikrosıvısal aygıt gerektirir gözlemledim 23. bu nedenle, bazı en farklı orta katkı maddeleri ile tatmin edici sonuçlar elde etmek için gerekli.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu proje GM018568 altında Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından finanse edildi. Bu iletişim kuralı için Nano sistemleri (CNS), bir üye, ulusal nanoteknoloji koordine altyapı ağı (NSF Ödülü No 1541959 altında Ulusal Bilim Vakfı tarafından desteklenen NNCI), kısmen merkezinde gerçekleştirildi. CNS Harvard Üniversitesi bir parçasıdır. Çok teşekkürler Thomas Norman ve Nathan Lord nedeniyle hamile kalma ve burada ve orijinali cihazları binada gösterilen aygıtlar için kullanılan ana şablon imalatı işlerini içindir. Biz de Johan Paulsson onun değerli ortak tavsiyeler için teşekkür ederiz ve üyeleri laboratuarına onların tavsiye ve bakteriyel mikrosıvısal için aygıtlar için sürekli iyileştirmeler için teşekkür ederim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | (240)4019862 | This is referred to as PDMS in the protocol. There are 2 components that are mixed at a 10:1 ratio |
| 0.75-mm biopsy punch | World Precision Instruments | 504529 | |
| 22 x 40 mm No. 1.5 cover glass | VWR | 48393 172 | |
| Plasma Etch PE-50 | Plasma Etch Inc. | PE-50 | Instrument used to bond PDMS to glass using oxygen plasma treatment |
| Tygon flexible tubing ID 0.02", OD 0.06" | Saint-Gobain PPL Corp. | AAD04103 | For the main part of the tubing, e.g. attached to the needles |
| Silicone Tubing, 0.04" ID, 0.085" OD | HelixMark Standard Silicone Tubing | 60-795-05 | For pinch valves and Y-junction connection |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-100G | Used as passivation agent |
| ART Gel Pipet Tips (P200) | Molecular BioProducts | 2155 | For loading the device with medium and cells |
| Acrodisc 32-mm syringe filter with 5-μm Supor membrane | Pall Life Sciences | 4560 | For filtering cultures before device loading |
| 21-ga blunt needles, 1" | McMaster-Carr | 75165A681 | |
| Y connector with 200-series barbs, 1/16" ID tubing, polypropylene | Nordson Medical | Y210-6005 | The company is AKA Value Plastics |
| Eclipse Ti-E inverted microscope | Nikon | This unit has been discontinued by the manufacturer and is replaced by the Ti 2 E. | |
| LB Lennox | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Microfuge 18 | Beckman Coulter | 367160 | |
| Bacillus subtilis strain NCIB3610 | Bacillus Genetic Stock Center | 3A1 | wild-type parental strain modified for use in the experiments shown in this protocol |
| Gravity convection oven | VWR | 414005-106 | for curing PDMS and baking assembled devices |
| Scotch-Weld Epoxy Kit | 3M | 2216 B/A | may be used to bond a silicon wafer to an aluminum backing plate |
| Scotch Magic tape, 3/4" width | 3M | to clean dust from PDMS devices and to place over features to increase visibility (denoted "office tape" or "adhesive tape" in protocol) | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ800N | listed here as an example; nearly any stereomicroscope will do |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907 | To clean cover glass |
| Syring pump, 6 channel | New Era Pump Systems Inc. | NE-1600 | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 34120 | a brand of dust-free wipes |
References
- Moffitt, J. R., Lee, J. B., Cluzel, P. The single-cell chemostat: an agarose-based, microfluidic device for high-throughput, single-cell studies of bacteria and bacterial communities. Lab Chip. 12 (8), 1487-1494 (2012).
- Young, J. W., et al. Measuring single-cell gene expression dynamics in bacteria using fluorescence time-lapse microscopy. Nat Protoc. 7 (1), 80-88 (2011).
- Dusny, C., et al. Technical bias of microcultivation environments on single-cell physiology. Lab Chip. 15 (8), 1822-1834 (2015).
- Wang, P., et al. Robust growth of Escherichia coli. Curr Biol. 20 (12), 1099-1103 (2010).
- Norman, T. M., Lord, N. D., Paulsson, J., Losick, R. Memory and modularity in cell-fate decision making. Nature. 503 (7477), 481-486 (2013).
- Perestrelo, A. R., Aguas, A. C., Rainer, A., Forte, G. Microfluidic Organ/Body-on-a-Chip Devices at the Convergence of Biology and Microengineering. Sensors. 15 (12), Basel. 31142-31170 (2015).
- Johari, S., Nock, V., Alkaisi, M. M., Wang, W. On-chip analysis of C. elegans muscular forces and locomotion patterns in microstructured environments. Lab Chip. 13 (9), 1699-1707 (2013).
- Liu, J., et al. Coupling between distant biofilms and emergence of nutrient time-sharing. Science. 356 (6338), 638-642 (2017).
- Choi, C. H., et al. One-step generation of cell-laden microgels using double emulsion drops with a sacrificial ultra-thin oil shell. Lab Chip. 16 (9), 1549-1555 (2016).
- Weibel, D. B., Diluzio, W. R., Whitesides, G. M. Microfabrication meets microbiology. Nat Rev Microbiol. 5 (3), 209-218 (2007).
- Taheri-Araghi, S., Brown, S. D., Sauls, J. T., McIntosh, D. B., Jun, S. Single-Cell Physiology. Annu Rev Biophys. 44, 123-142 (2015).
- Karimi, A., Karig, D., Kumar, A., Ardekani, A. M. Interplay of physical mechanisms and biofilm processes: review of microfluidic methods. Lab Chip. 15 (1), 23-42 (2015).
- Yu, F. B., et al. Long-term microfluidic tracking of coccoid cyanobacterial cells reveals robust control of division timing. BMC Biol. 15 (1), 11 (2017).
- Campos, M., et al. A constant size extension drives bacterial cell size homeostasis. Cell. 159 (6), 1433-1446 (2014).
- Taheri-Araghi, S., et al. Cell-size control and homeostasis in bacteria. Curr Biol. 25 (3), 385-391 (2015).
- Siryaporn, A., Kim, M. K., Shen, Y., Stone, H. A., Gitai, Z. Colonization, competition, and dispersal of pathogens in fluid flow networks. Curr Biol. 25 (9), 1201-1207 (2015).
- Connell, J. L., et al. Probing prokaryotic social behaviors with bacterial "lobster traps". MBio. 1 (4), (2010).
- Long, Z., et al. Measuring bacterial adaptation dynamics at the single-cell level using a microfluidic chemostat and time-lapse fluorescence microscopy. Analyst. 139 (20), 5254-5262 (2014).
- Okumus, B., et al. Mechanical slowing-down of cytoplasmic diffusion allows in vivo counting of proteins in individual cells. Nat Commun. 7, 11641 (2016).
- Teng, S. W., Mukherji, S., Moffitt, J. R., de Buyl, S., O'Shea, E. K. Robust circadian oscillations in growing cyanobacteria require transcriptional feedback. Science. 340 (6133), 737-740 (2013).
- Baker, J. D., et al. Programmable, Pneumatically Actuated Microfluidic Device with an Integrated Nanochannel Array To Track Development of Individual Bacteria. Anal Chem. 88 (17), 8476-8483 (2016).
- Russell, J. R., Cabeen, M. T., Wiggins, P. A., Paulsson, J., Losick, R. Noise in a phosphorelay drives stochastic entry into sporulation in Bacillus subtilis. EMBO J. 36 (19), 2856-2869 (2017).
- Cabeen, M. T., Russell, J. R., Paulsson, J., Losick, R. Use of a microfluidic platform to uncover basic features of energy and environmental stress responses in individual cells of Bacillus subtilis. PLoS Genet. 13 (7), e1006901 (2017).
