Summary
Directe neuronale herprogrammering genereert neuronen die de leeftijd van de begincel van somatische handhaven. Hier beschrijven we een enkele vector-gebaseerde methode voor het genereren van geïnduceerde neuronen van dermale fibroblasten van volwassen menselijke donors verlangde.
Abstract
Geïnduceerde neuronen (iNs), het product van somatische cellen direct omgezet in neuronen, zijn een manier om de patiënt afkomstige neuronen te verkrijgen van weefsel dat is gemakkelijk te bereiken. Via deze route, kunnen volwassen neuronen worden verkregen in een kwestie van een paar weken. Hier beschrijven we een eenvoudige en snelle one-step-protocol om iNs verkrijgen dermale fibroblasten verkregen via biopsie monsters van volwassen menselijke donoren. We leggen elke stap van het proces, met inbegrip van het onderhoud van de dermale fibroblasten, de bevriezing procedure om te bouwen van een voorraad van de cellijn, zaaien van de cellen voor herprogrammering, evenals de kweekomstandigheden tijdens het conversieproces. Daarnaast beschrijven we de voorbereiding van glas coverslips elektrofysiologische opnamen, op lange termijn coating voorwaarden en fluorescentie geactiveerd cell sorting (FACS). We illustreren ook voorbeelden van de resultaten te verwachten. Het protocol hier beschreven is gemakkelijk uit te voeren en kunnen worden toegepast op menselijke fibroblasten afgeleid van menselijke huid Biopten van patiënten met verschillende leeftijden en verschillende diagnoses. Dit protocol genereert een voldoende hoeveelheid iNs die kan worden gebruikt voor een breed scala van biomedische toepassingen, waaronder ziekte modellering, drug screening, en target validatie.
Introduction
Ontwikkeling van doeltreffende behandelingen voor neurologische stoornissen hebben belemmerd door de beperkte toegang tot levende cellen van het menselijk brein mechanistisch onderzoek en functionele tests uit te voeren. Ongeveer een decennium geleden, deze situatie radicaal veranderd met de ontwikkeling van geïnduceerde pluripotente stamcel (iPSCs) technologie1,2. Dit, gecombineerd met een beter inzicht in de mechanismen van de neurale differentiatie die zich voordoen tijdens normale menselijke ontwikkeling, heeft toegestaan voor de generatie van gedefinieerde en diverse neuronale subtypen van patiënt en ziekte specifieke materiaal. Met dergelijk materiaal is het nu mogelijk om te studeren van intracellulaire mechanismen ten grondslag liggen aan neurologische ziekten en het potentieel van de verschillende verbindingen te verlichten die pathologische kenmerken3.
Terwijl iPSCs revolutionair op het gebied van de neurowetenschappen zijn, is één groot nadeel van deze cellen dat hun handtekening vergrijzing is gewist tijdens het herprogrammering op zodanige wijze dat de verjongd neuron het beveiligingslek is gekoppeld niet behouden veroudering4,5,6. Deze bijzondere functie van de neuronen die worden geproduceerd kan uiteindelijk essentieel voor Recapitulerend vele aspecten van de intracellulaire pathogene cascade, met name in het geval van ziekten waarvoor ouderdom een belangrijke risicofactor is.
Directe neurale herprogrammering is een techniek waar een aantal somatische cellen wordt direct omgezet in een tussentijdse fase zonder tussenkomst van een pluripotente iN. Dit zorgt voor snelle menselijke neuronen in vitro dat zowel de patiënt als de ziekte specifieke kunnen generatie. Een opmerkelijk kenmerk van directe herprogrammering is dat de eerste leeftijd van de donor-cel wordt gehandhaafd, en daarmee de kwetsbaarheid voor vergrijzing processen zoals productie van oxidatieve stress4,7 verhoogde. Dientengevolge, iNs van patiënten met neurologische aandoeningen in verband met de vergrijzing, zoals Alzheimer en Parkinson, zijn geschikt voor een brede waaier van biomedische toepassingen met inbegrip van ziekte modellering, drug screening tests, en toxicologische studies .
Het belangrijkste voorbehoud dat heeft verhinderd iNs patiënten met neurodegeneratieve aandoeningen wordt wijd gebruikt is dat ze niet gemakkelijk zijn te herprogrammeren, en dit nog moeilijker met uitbreiding van de fibroblasten wordt. Generatie iN cellen in de hoeveelheden die nodig zijn voor dit soort toepassingen is daardoor niet tot pas onlangs8bereikt. We hebben nu een eenvoudige methode om te herprogrammeren fibroblasten van donoren van elke leeftijd in een zeer efficiënte wijze ontwikkeld. Deze methode combineert de gedwongen uitdrukking van de neuronale transcriptiefactoren, Ascl1 en Brn2 met een knockdown van de onderdrukker eiwit RE1-tot zwijgen brengen transcriptiefactor (rust) met behulp van een enkele vector. Hier beschrijven we de verschillende stappen die leiden naar de generatie van iNs uit de huid fibroblasten biopsied van ouderen donoren worden omgezet.
Protocol
Volwassen dermale fibroblasten verkregen is van het onderzoek van de ziekte van Parkinson en de ziekte van Huntington klinieken in het centrum van John van Geest voor hersenen reparatie (Cambridge, UK) en onder lokale ethische goedkeuring (09/H0311/88 van de REC) gebruikt. Zie voor meer informatie over de huid biopsie weergegeven monstertrekkingsprocedure, verwijzing8.
1. voorbereiding van de huid fibroblasten herprogrammering
- Met behulp van een geautomatiseerde cel ontdooien systeem of een waterbad 37 ° C, ontdooien van de volwassen menselijke dermale fibroblasten (aHDFs) en plaat van 200.000 per T75 kolf (count en voorzien van een geautomatiseerde cel teller) in 10 mL fibroblast voedingsbodem (Zie tabel 1) bij 37 ° C in 5% CO2.
- Voer een volledige middellange verandering met fibroblast medium op de volgende dag.
- Het medium van de fibroblast elke 3-4 dagen de cellen tot 95% confluentie wijzigen.
Opmerking: Één confluente kolf zal ongeveer 1.000.000 cellen bevatten. De aHDFs kan worden bevroren om te bouwen van een voorraad van de cellijn (sectie 2) of direct opnieuw vergulde klaar voor herprogrammering (sectie 3).
2. de bevriezing van de huid fibroblasten
- Plaats van een gecontroleerde-tarief bevriezing container in een doos met ijs of in de koelkast bij 4 ° C.
- Distantiëren van de cellen met 0,05% trypsine (1,5 mL per T75 kolf) bij 37 ° C gedurende 3-5 min.
- Fibroblast opslagmedium (met foetale runderserum (FBS)) te neutraliseren de trypsine (3 mL per spoeling per T75 kolf) en het verzamelen van de vrijstaande cellen in een tube van 15 mL door te spoelen uit de cellen in de kolf tweemaal toevoegen.
- Met behulp van de geautomatiseerde cel counter; cellen tellen (aanbevolen) bevriezing ongeveer 500.000 aHDFs per flacon.
- Spin down de cellen bij 400 x g gedurende 5 min.
- Resuspendeer de cel pellet in 1 mL van bevriezing medium (Zie tabel 1) en overdracht in de cryogene buis. De buizen direct in de gecontroleerde-tarief bevriezing container plaatsen.
- Bewaar het gecontroleerde percentage bevriezing apparatuur op-80 ° C's nachts. De volgende dag, de buizen overbrengen in een vriezer-140 ° C en op te slaan totdat het nodig is.
3. plating voor herprogrammering (dag-1)
Opmerking: Het is aanbevolen om gebruik van een coating van gelatine voor korte termijn experimenten (maximaal 30 dagen); Als alternatief voor de lange termijn experimenten verdient het om te beginnen op een poly-L-ornithine, fibronectin en laminin (PFL) coating.
- 60 min voordat plating de aHDFs voor herprogrammering, een 24-well plaat met 0,1% gelatine (250 µL per putje) jas en Incubeer bij 37 ° C.
- Het medium van de fibroblast op de aHDFs gecombineerd. Een keer wassen met DPBS. Distantiëren van de cellen met 0,05% trypsine (1,5 mL per T75 kolf) bij 37 ° C gedurende 3-5 min.
- Fibroblast medium om te neutraliseren de trypsine (3 mL per spoeling per T75 kolf) en het verzamelen van de vrijstaande cellen in een tube van 15 mL door te spoelen uit de cellen in de kolf tweemaal toevoegen.
- Spin down de cellen bij 400 x g gedurende 5 min. Discard supernatant en resuspendeer de cel pellet in 1 mL fibroblast voedingsbodem.
- Met behulp van een geautomatiseerde cel prestatiemeteritem (zorgen voor een goede conversie kwaliteitscontrole die de levensvatbaarheid van de cellen is boven de 90% met trypan blauw kleuring) cellen tellen.
- Voor een volledige 24-well plaat, maak een suspensie van 1,320,000 cellen in 13.2 mL fibroblast voedingsbodem om een opschorting van 100.000 cellen/mL medium (of 55.000 cellen per putje in 550 µL van fibroblast medium vermenigvuldigd met het aantal putten nodig).
- Gecombineerd de gelatine van de plaat en spoel tweemaal met DPBS. Voeg 500 µL van de celsuspensie aan elk putje en na een nacht bebroeden bij 37 ° C in 5% CO2.
4. virale transductie (dag 0)
Opmerking: Werken met lentivirale deeltjes vereist categorie 2-apparatuur en het gebruik van een agent om te neutraliseren het virus. Het dragen van dubbele paren van handschoenen is ook sterk aangeraden.
- Opwarmen 13.2 milliliters fibroblast middellange tot 37 ° C.
- Een lentivirale vector met de transcriptiefactoren, Ascl1 en Brn2 met twee korte haarspeld RNAs (shRNA) REST targeting op kamertemperatuur ontdooien.
Opmerking: Verwijzen als u verwijst naar8; de constructie is beschikbaar in een plasmide repository. Raadpleeg voor meer informatie over de procedure voor het produceren van lentivirussen verwijzen naar9. - Voeg de nodige hoeveelheid lentivirus te infecteren de aHDFs op de veelheid van infectie (MOI) van 20 aan het medium zonder elk transductie versterkers.
- Vervang het medium in de 24-well plaat met fibroblast medium dat het lentivirale vector (500 µL per putje) en na een nacht bebroeden bij 37 ° C in 5% CO2.
- De volgende dag, wordt het medium in de putjes vervangen door verse fibroblast medium zonder de lentivirale vector.
Opmerking: Het medium wordt beschouwd als besmettelijk voor 7 dagen en als zodanig, adequate bescherming en veilige omgang tijdens de eerste week na virale transductie moeten worden gebruikt.
5. onderhoud van de omzetten cellen
Opmerking: Zodra de conversie begint de cellen zijn gevoelig voor opheffing; Zorg voor het uiteinde van de plaat omhoog en een 1.000 µL pipet gebruiken bij het verwijderen van media om te voorkomen dat cellen loskoppelen.
- Op dag 3, verwijder het medium van de fibroblast en voeg 500 µL van vroege neuronale conversie medium (Zie tabel 1).
- Twee tot drie keer per week, neem 225 µL van een oud medium uit de put en invoegtoepassing 250 µL van verse vroege neuronale conversie medium.
- Op dag 18, verwijdert u alle van het medium uit elk putje en vervangen 500 µL van late neuronale conversie medium (Zie tabel 1).
- Blijven de helft van het medium als hierboven met late neuronale conversie medium veranderen elke 2-3 dagen tot de dag 25 of experiment eindpunt (figuur 1A).
Opmerking: Als cellen zijn niet verguld in elke put voor het experiment, vullen lege putten met PBS of water ter voorkoming van openlijke verdamping van het medium en het minimaliseren van de variatie tussen putten.
| Voorraad concentratie | Werken concentratie | |
| Fibroblast medium | ||
| Basaal medium | N/B | N/B |
| Penicilline/streptomycine | 10.000 U/mL | 100 mg/mL |
| FBS | N/B | 10% |
| Bevriezing van medium | ||
| Fibroblast medium | N/B | 45% |
| FBS | N/B | 45% |
| DMSO | N/B | 10% |
| Vroege neuronale conversie medium (ENM) | ||
| Neurale differentiatie medium | N/B | N/B |
| Penicilline/streptomycine | 10.000 U/mL | 100 mg/mL |
| CHIR99021 | 10 mM | 2 ΜM |
| SB-431542 | 20 mM | 10 ΜM |
| Bekertje | 100 µg/mL | 0,5 µg Mo/mL |
| LDN-1931189 | 10 mM | 0,5 ΜM |
| VPA | 1 M | 1 mM |
| LM-22A4 | 20 mM | 2 ΜM |
| GDNF | 20 µg Mo/mL | 2 ng/mL |
| NT3 | 10 µg Mo/mL | 10 ng/µL |
| DB-cAMP | 50 mM | 0.5 mM |
| Laat neuronale conversie medium (LNM) | ||
| Neurale differentiatie medium | N/B | N/B |
| Penicilline/streptomycine | 10.000 U/mL | 100 mg/mL |
| LM-22A4 | 20 mM | 2 ΜM |
| GDNF | 20 µg Mo/mL | 2 ng/mL |
| NT3 | 10 µg Mo/mL | 10 ng/µL |
| DB-cAMP | 50 mM | 0.5 mM |
| FACS Buffer | ||
| HBSS 1 x [- calcium, magnesium, - fenol rood] | N/B | N/B |
| BSA | N/B | 1% |
| DNAase | N/B | 0,05% |
Tabel 1: samenstelling van de verschillende gebruikte media. Volledige beschrijving van de compositie voor alle media in dit protocol, met inbegrip van de fibroblast medium, bevriezing van medium, vroege neuronale conversie medium, laat neuronale conversie medium en FACS buffer nodig.
6. glas Coverslips voor elektrofysiologische opnamen
Opmerking: Het is aanbevolen om een laboratoriumjas, bril dragen, dubbele handschoenen, en al het werk in een zuurkast te voltooien. Dit protocol is aangepast van 10.
- Plaats glas coverslips bij de bodem van een glazen schotel zonder elkaar overlappen.
- Voeg algemene lab schoonmaken wasmiddel te dompelen aller de coverslips zonder riskeren overloop tijdens het schudden (ongeveer 30 mL). Plaats op een roteerschudapparaat op lage snelheid gedurende 2 uur.
- Wassen zesmaal (elke 30 min) met gesteriliseerde met autoclaaf gedeïoniseerd water.
- Toevoegen van 95% ethanol voor 2 h.
- Verwijder de ethanol en wachten tot coverslips droog zijn.
- Eenmaal droog, de coverslips Breng in een bekerglas van glas en 70% salpeterzuur toevoegen totdat de coverslips zijn ondergedompeld.
- Plaats het bekerglas van glas in een ultrasoonapparaat bad voor 60 min.
- Verwijder de salpeterzuur en spoel driemaal met gesteriliseerde met autoclaaf gedeïoniseerd water.
Let op: Altijd toevoegen zuur aan water, nooit andersom omdat dit tot een gewelddadige reactie leiden kan. - Verwijder zo veel water uit het bekerglas mogelijk en geconcentreerd zoutzuur (HCI) totdat de coverslips zijn ondergedompeld; Swirl het bekerglas en dek met paraffine film.
- Bewerk ultrasone trillingen ten voor 60 min (50-60 Hz, 30 W).
- Verwijder zoveel HCI uit coverslips mogelijk en plaats in een geschikte afval opslaglocatie. Spoel tweemaal met gesteriliseerde met autoclaaf gedeïoniseerd water.
- Neem de coverslips uit de motorkap en 20 keer (of meer) met gesteriliseerde met autoclaaf gedeïoniseerd water spoelen, totdat alle van de HCI is verwijderd.
- Eenmaal droog, coverslips plaats in steriele 24-Wells-platen.
- Plaats de platen onder ultraviolet (UV) licht 's nachts. De volgende dag de coverslips zijn klaar voor gebruik.
Opmerking: Als glas coverslips worden gebruikt, is het aanbevolen om het gebruik van de PFL-coating. Gewoon een dekglaasje aan plaats in elk putje van de plaat van een 24-well (met behulp van steriele verlostang) en volg het protocol zoals hieronder.
7. PFL Coating voor lange termijn cultuur
- De 24-well plaat met poly-L-ornithine (500 µL per putje) jas en laat 's nachts bij 37 ° C in 5% CO2.
- Gecombineerd de poly-L-ornithine en wacht tot het droog genoeg aan formulier druppels op bovenkant is.
- Maak een druppel (ongeveer 60 µL) laminin in het midden van elk goed en verspreid ter dekking van het hele oppervlak van het dekglaasje aan. Laat gedurende 2 h 45 minuten bij 37 ° C in 5% CO2.
- Spoel driemaal met DPBS.
- Voeg fibronectine (500 µL per putje) en laat 's nachts bij 37 ° C in 5% CO2.
- Een keer wassen met DPBS voordat u cellen toevoegt.
Opmerking: De PFL coating kan worden gebruikt voor de lange termijn culturen van iNs (meer dan 100 dagen), hoewel progressieve celdood is naar verwachting vanaf dag 30.
8. FACS
Opmerking: Om opnieuw de cellen plaat na FACS sorteren bereiden een PFL beklede plaat 48u op voorhand. Cellen kunnen worden gesorteerd met behulp van een antilichaam neurale cel adhesie molecuul (NCAM) vanaf dag 20 vanaf na transductie.
- Verwijder het medium met een 1.000 µL Pipet (niet wassen om te voorkomen dat cellen los).
- Cel distantiëren van de agent (250 µL per putje) toevoegen, laat gedurende 10-20 minuten totdat de cellen lift, en zweven als afzonderlijke cellen.
- Gedurende deze tijd de FACS buffer te bereiden.
- Triturate voorzichtig met een 1.000 µL pipet. Als sommige bosjes blijven, incubeer een beetje langer.
- Zodra een eencellige opschorting is verkregen, verwijderen uit de put en plaatsen in een 1,5 mL-buis.
- Spoelen uit de put tweemaal met late neuronale conversie medium en plaats in de dezelfde 1,5 mL-buis.
- Spin down bij 400 x g gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant.
- Resuspendeer de pellet cel in 200 µL van FACS buffer.
- Spin down de cellen bij 400 x g gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant.
- Herhaal stap 8,8 en 8,9 tweemaal.
- Resuspendeer de pellet cel in 50 µL van FACS buffer met menselijke CD56 (NCAM) antilichaam bij een concentratie van 1:50 gedurende 15 minuten op het ijs. Beschermen tegen licht.
- Spin down de cellen bij 400 x g gedurende 5 min.
- Resuspendeer in 200 µL FACS buffer te wassen en spin down de cellen bij 400 x g gedurende 5 min.
- Herhaal stap 8.13.
- Resuspendeer in 200 µL van FACS buffer met propidium jodide (PI; 10 µg/mL). Sorteren de NCAM-positieve (iNs) en negatieve (live) cellen PI FACS via gating op basis van de fluorescentie intensiteitsniveau controlemonsters die waren niet gekleurd met de NCAM antilichaam of PI.
- Verzamelen van de NCAM-positieve cellen in een buis met late neuronale conversie medium.
- De cellen met behulp van een geautomatiseerde cel teller en opnieuw plaat de cellen bij een hoge dichtheid (50.000 cellen/cm2) tellen in late neuronale conversie medium in een schotel PFL bekleed.
- Blijven veranderen de helft van het medium 2 tot 3 keer per week met late neuronale conversie medium tot het experiment eindpunt (figuur 1A).
Representative Results
Een duidelijke wijziging in cel morfologie moet zichtbaar vanaf dag 5 vanaf (figuur 1B). Sommige celdood is naar verwachting na virale signaaltransductie, hoewel niet openlijk. Van elk putje in een 24-well-plaat worden een cel Totaal rendement van 20,000-40,000 cellen per dag 25, waarvan ongeveer de helft moet zijn geworden neuronen verwacht. Het is belangrijk op te merken dat de opbrengst en de zuiverheid over cellijn, alsook met staat en virus batches van de ziekte kunnen variëren.
Cellen zullen de meeste standaard neuronale markeringen waaronder MAP2 en TAU (Figuur 1 c) ten dage 25 naast het tentoonstellen van een volwassen neuronale morfologie uitspreken. Het is mogelijk om een zuivere iN bevolking door het doen van FACS op basis van de markering NCAM (Zie verwijst naar8,,11). Cellen kunnen daarna worden ofwel opnieuw verguld op PFL triple coating (zie referentie10) of rechtstreeks bevroren voor biomoleculaire analyses.
Als de cellen niet zijn gesorteerd, moet immunofluorescentie labelen met MAP2 of TAU worden uitgevoerd om het met succes geconverteerde cellen opsporen en mede voorzien van de proteïne van belang.
Figuur 1: evolutie van de iN conversie mettertijd. (A) tijdlijn van het experiment en de kaart van de constructie verpakt in een lentivirus gebruikt om te herprogrammeren van de volwassen menselijke dermale fibroblasten. Elke zwarte pijl betekent een middellange verandering. (B) representatieve fase contrast foto's beeltenis van de veranderingen in de morfologie van cellen tijdens de conversie tussen dag 0 tot dag 22 (zoals aangegeven op de hogere juiste hoek van elke plaat). Beelden werden genomen op een fasecontrastmicroscoop met behulp van de 10 X doelstelling. (C) immunofluorescentie beeld van een dubbele van het TAU en MAP2 tot vlekken op dag 35 na transductie. Cellen werden vastgesteld in 4% paraformaldehyde en permeabel met 0,1% Triton in DPBS voor 10 min. cellen werden geblokkeerd gedurende 30 min. in een oplossing van 5% serum in DPBS. De antistoffen waren in het blokkeren van de oplossing verdund en toegepast 's nachts bij 4 ° C. Fluorophore-geconjugeerde secundaire antilichamen werden in het blokkeren van de oplossing verdund en toegepast voor 2 h. cellen werden counterstained met DAPI gedurende 15 minuten gevolgd door 3 wasbeurten met DPBS. Beelden werden genomen op een omgekeerde fluorescentie Microscoop met behulp van de 20 X doelstelling. Schaal bars = 100 µm (B, C). Afkortingen: ENM: vroege neuronale drager wordt vastgelegd; LNM: laat neuronale medium. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Discussion
Deze one-One-Step/één vector herprogrammering methode biedt een efficiënte manier voor het verkrijgen van iNs uit menselijke volwassen fibroblasten. Menselijke volwassen fibroblasten zijn normaal gesproken veel moeilijker aan dekking dan foetale fibroblasten, met beperkte studies eerder efficiëntie van ongeveer 5-10%12,13te rapporteren. Met dit nieuwe protocol is het echter mogelijk om een neuronale rendement (gemeten als MAP2 + cellen) van ongeveer 50%8. Bovendien, kan onze protocol worden gebruikt op dermale fibroblasten, die hebben al meerdere keren gepasseerd zonder verlies van efficiëntie van conversie. Tot nu toe hebben we gepasseerd tot 14 keer zonder opsporing van een afname van de omzettingsefficiëntie cellen gebruikt. Ook, is er geen verschil in de herprogrammering van efficiëntie in onze handen met fibroblasten van donoren van leeftijd tussen 52 en 87. Zie verwijzing8voor meer details over de leeftijd en de ziekte van andere cellijnen getest met deze constructie. Andere studies hebben ook geen verschil in conversie-efficiëntie met behulp van een lentivirale gebaseerde en kleine molecuul-enhanced protocol met donoren tussen 0 en 89 jaar4gemeld. Bovendien is consistent toepasbaarheid met miRNA gebaseerde neuronale herprogrammering gemeld in fibroblasten van alle leeftijden, met donoren tussen 0 en 86 jaar7. Via deze route, kunnen volwassen neuronen worden verkregen in ongeveer 12 tot 15 weken in vitro of ongeveer 8 weken na transplantatie in vivo8. Dit is voordelig omdat het geeft toegang tot zowel de ziekte en de patiënt specifieke menselijke iNs uit weefsel dat is gemakkelijk te bereiken. Hoewel dit protocol efficiënt is, het zal niet produceren een neuronale rendement van 100%, en als zodanig een zuivering via FACS bijvoorbeeld is vereist.
De meest kritische stap in dit protocol is virale transductie (protocol punt 4). Het is cruciaal dat de titer van het virus precies naast hebben vergulde een nauwkeurige aantal aHDFs voor conversie. De aanbevolen titer voor gebruik met dit protocol is tussen de 4 x 10,8 en 4 x 109. Met behulp van een titer van iets minder dan 1 x 108 zou niet worden aanbevolen als het toevoegen van grote hoeveelheden virus zal worden giftig voor de cellen. Bovendien, als de fibroblasten te converteren naar iNs beginnen zullen ze meer kwetsbaar en gevoelig voor opheffing. Het is essentieel om te zacht bij het wijzigen van de media niet te storen van de cellen te veel. Dit kan gebeuren door het verwijderen van de vloeistof langzaam met een 1.000 µL pipet. Tot slot, wanneer plating voor herprogrammering (protocol sectie 3) is het belangrijk om een gezonde fibroblast bevolking voordat u begint met een experiment; Dit wordt aangegeven door een levensvatbaarheid van de cellen van boven de 90% met trypan blauw kleuring. De aHDFs moet altijd vóór het bereiken van 95% confluentie worden gepasseerd.
Als er merkbaar celdood voordat virale signaaltransductie, conversie niet beginnen: dubbel te controleren dat de levensvatbaarheid van de cellen boven de 90 is % en dat er geen problemen met de coating van de plaat waren. Verwacht wordt dat het hebben van een kleine hoeveelheid virale transductie na de dood van de cel, maar dit mag geen significante. In dit geval bevestig nauwkeurig zaaien van 50.000 aHDFs/put en controleren van de titer van het virus. Als er merkbaar inconsistentie tussen putten tijdens de conversie, controleer dan eerst dat elke put een gelijke hoeveelheid van media bevat en openlijke verdamping is niet die zich aan de randen (indien nodig extra media kunnen worden toegevoegd aan de putten rand). Als alternatief, Controleer stap 4.4 en zorgen voor passende mengen tot een homogene opschorting als transducing. Het is van cruciaal belang de lentivirus eerst, aan het medium toevoegen voordat het toevoegen van deze in de putjes. Direct toevoegen lentivirus in de putjes goed tot goed variabiliteit zal toenemen en is ook waarschijnlijk giftig voor de cellen. Ten slotte, Controleer altijd dat het medium wordt opgewarmd tot 37 ° C alvorens toe te voegen aan de cellen.
Dit protocol bevat optionele secties voorwaarden coating voor lange termijn cultuur van iNs en FACS sorteren te verhogen van neuronale zuiverheid. Voor experimenten willen onderzoeken van functionele karakterisering van iNs, is een protocol voor bereiding van glas coverslips voor electrofysiologie ook opgenomen. Het protocol van conversie hier is ingesteld voor gebruik met een 24-well plaat; Indien gewenst kan dit worden gewijzigd tot een 6 - 12-, 48-, 96-wells-plaat of kolven. Wijzig in dit geval alle volumes op het oppervlak van de plaat of kolf gebruikt.
Dit protocol maakt gebruik van de gedwongen uitdrukking van Ascl1 en Brn2 in combinatie met een REST knockdown alle verpakt in één enkele vector8 voor het genereren van iNs van een pan-neuronale fenotype. De generatie van alle gliale subtypen met deze methode echter is niet beoordeeld. Deze methode zou dus moeten worden aangepast voor gebruik met andere herprogrammering factoren te verkrijgen subtype specifieke neuronen. Directe herprogrammering, heeft de mogelijkheid voor het genereren van motorische neuronen, sensorische neuronen, researchdieren, striatale middellange Maxomys neuronen en Dopaminerge neuronen10,14, eerder getoond. Dit zal gunstig zijn bij het onderzoeken van neurologische ziekten in welke specifieke neuronale subtype netcongestieproblemen ondervinden, voor voorbeeld van Parkinson en Dopaminerge neuronen.
Tot voor kort deed direct neurale herprogrammering technologie niet toestaan voor de productie van iNs op een gestandaardiseerde en efficiënte wijze — tot een niveau dat is vereist voor Toxicologie en drug screening tests op grote schaal. Deze nieuwe methode is zeer efficiënt en kan worden gebruikt op de fibroblasten die hebben al gepasseerd vele malen, zodat het nu deze beperkingen verwijdert en voor een breed scala van studies, ontsluit niet alleen in een menselijke zenuwstelsel, maar ook in een systeem dat kan worden patiënt specifieke. De eenvoud van deze aanpak maakt het iN technologie toegankelijk voor groepen die willen uitvoeren van soortgelijke studies in-house en kan gemakkelijk worden gebruikt niet alleen voor grote schaal biomedische applicaties, zoals drug screening en toxicologie vitrotests, maar ook ter ondersteuning van gegevens afgeleid van diermodellen en menselijke post-mortem weefselmonsters.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Marie Persson Vejgården voor technische bijstand. Het onderzoek leidt tot deze resultaten heeft financiering ontvangen van de New York stamcel Foundation, de Europese Onderzoeksraad onder het zevendekaderprogramma van de Europese Unie: FP/2007-2013 Neuro stamcel reparatie (nr. 602278) en EOR-Subsidieovereenkomst geen. 30971, de Zweedse Onderzoeksraad (subsidieovereenkomst 521-2012-5624, 2016-00873 en 70862601 / Bagadilico), Zweedse Parkinson Foundation (Parkinsonfonden) en de strategische onderzoeksruimte op Lund Universiteit Multipark (multidisciplinair onderzoek in Ziekte van Parkinson). Janelle Drouin-Ouellet wordt ondersteund door een fellowship van de Canadese instituten van gezondheid onderzoek (CIHR) (#358492), en Roger Barker wordt ondersteund door een toekenning van de NIHR Biomedical Research Centre aan de Universiteit van Cambridge/Addenbrooke van ziekenhuis. Malin Parmar is een New York stamcel Stichting Robertson-Detective. Shelby Shrigley wordt gefinancierd door de Europese Unie Horizon 2020-programma (H2020-MSCA-ITN-2015) onder de Marie Skłodowska-Curie opleidingsnetwerk innovatieve en Grant overeenkomst nr. 676408.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Lines | |||
| Adult human dermal fibroblasts | [C2 passage #7] Donor was a 67 year old female. Cells obtained from the Parkinson’s Disease Research and Huntington’s disease clinics at the John van Geest Centre for Brain Repair (Cambridge, UK). | ||
| Reagents for Fibroblast Culture, Transduction and Conversion | |||
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) [-CaCl2, -MgCl2] | Gibco | 14190094 | |
| Trypsin-EDTA [0.5%] | Gibco | 15400-054 | Dilute to 0.05% in DPBS. |
| Virkon (agent used to neutralize virus) | Viroderm | 7511 | Dilute to 1% solution with warm water. |
| Milli-Q Water | Millipore | ||
| Basal medium - Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) + GlutaMax | Gibco | 61965059 | |
| Penicillin/Streptomycin [10,000 U/mL] | Gibco | 15140-122 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| CryoMACS® dimethyl sulfoxide (DMSO) 10 | Miltenyi | 170-076-303 | |
| Neural differentiation medium - NDiff 227 | Takara-Clontech | Y40002 | |
| LM-22A4 | Tocris | 4607 | Dilute 10 mg in 1450 µL DMSO. Stock concentration: 20 mM. |
| Glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) [recombinant human] | R&D systems | 212-GD-010 | Dilute 10 ug in 500 µL 0,1% BSA in DPBS. Stock concentration: 20 µg/mL. |
| NT3 [recombinant human] | R&D systems | 267-N3-025 | Dilute 25 µg in 2,5 mL 0,1% BSA in DPBS. Stock concentration: 10 µg/mL. |
| db-cAMP | Sigma Aldrich | D0627 | Dilute 1 g in 40,7 mL Milli-Q water. Filter and make 500 µL aliquots or stock tubes of 10 mL. Stock concentration: 50 mM. |
| CHIR99021 | Axon | 1386 | Dilute 2 µg in 429,8 µL DMSO. Stock concentration: 10 mM. |
| SB-431542 | Axon | 1661 | Dilute 5 mg in 595 µL DMSO. Stock concentration: 20 mM. |
| Noggin [recombinant human] | Miltenyi | 130-103-456 | Dilute 100 µg in 100 µL of Milli-Q water + 900 µL 0,1% BSA in DPBS. Stock concentration: 100 µg/mL. |
| LDN-193189 | Axon | 1509 | Dilute 2 mg in 360 µL DMSO. Stock concentration: 10 mM. |
| Valproic acid sodium salt (VPA) | Merck Millipore | 676380 | Dilute 5 g in Milli-Q water to acheive a stock concentration of 1 M. CAUTION: Avoid ingestion, contact with skin, and breathing dust formation. |
| Reagents for Coatings | |||
| Gelatin | Sigma Aldrich | G2500 | Dilute to 0.1% in Milli-Q water. |
| Poly-L-ornithine | Sigma Aldrich | P3655 | Dissolve in Milli-Q water. Use at 15µg/mL. |
| Fibronectin | ThermoFisher Scientific | 33010-018 | 2 mL of Milli-Q water + 70 µL 0,25 M NaOH. Use at 5 µg/mL. |
| Laminin | ThermoFisher Scientific | 23017-015 | Store at -80°C. Thaw on ice, keep cool and aliquot 30 µL. Use at 5 µg/mL. |
| Reagents for Fluorescence Activated Cell Sorting | |||
| Cell dissociation agent - Accutase (Stem Pro) | ThermoFisher Scientific | A1110501 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) 1X [-calcium, -magnesium, - phenol red] | ThermoFisher Scientific | 14175-046 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153 | Use at 1% concentration for Anti-Human CD56 (NCAM). |
| DNAase | Sigma Aldrich | DN-25 | Use at 0.05% concentration. |
| Anti-Human CD56 (NCAM) Antibody [Mouse] | BD Pharmingen | 555518 | Use at 1 : 50. |
| Propidium iodide | Sigma Aldrich | P4170 | Dilute to 1mg/mL in PBS and keep sterile. Use at 1:1000 to achieve a concentration of 10µg/mL. |
| Reagents for Glass Coverslips | |||
| Autoclaved deionized water | |||
| Alconox detergent | Sigma Aldrich | Z273228 | |
| Ethanol 95% | |||
| Nitric Acid | Sigma Aldrich | 438073-M | CAUTION: Concentrated nitric acid is highly corrosive, and its vapours are potentially harmful. |
| Concentrated hydrochloric acid (HCI) | CAUTION: Concentrated hydrochloric acid is highly corrosive, and its vapours are potentially harmful. | ||
| Reagents for Immunocytochemistry | |||
| Paraformaldehyde (PFA) | Merck Millipore | 1040051000 | Use at a concentration of 4%. CAUTION: PFA is a potent fixative. Avoid ingestion and contact with skin |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | 10254640 | Use at a concentration of 0.1%. |
| Serum [Donkey] | Merck Millipore | S30-100ML | |
| Anti-MAP2 Antibody [Chicken] | Abcam | ab5392 | Use at a concentration of 1 : 5,000. |
| Tau HT7 Monoclonal Antibody [Mouse] | ThermoFisher Scientific | MN1000 | Use at a concentration of 1 : 500. |
| Cy3 Anti-Chicken Antibody [Donkey] | Jackson ImmunoResearch | 703-165-155 | Use at a concentration of 1 : 400. |
| Alexa Fluor488 Anti-Mouse Antibody [Donkey] | Jackson ImmunoResearch | 715-545-150 | Use at a concentration of 1 : 400. |
| 4′,6-Diamidine-2′-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma Aldrich | D9542 | Reconstitute the powder in Milli-Q water to 1 mg/mL. Aliquot and store at -20°C, light sensitive. Use at a concentration of 1 : 500. |
| Equipment | |||
| T75 flask [Nunclon Delta Surface] | ThermoFisher Scientific | 156499 | |
| 24-well plate [Nunc] | ThermoFisher Scientific | 142485 | |
| 1.5 mL polypropylene tube | Sigma Aldrich | Z336769 | |
| 15 mL falcon tube | Sarstedt | 62.554.502 | |
| 50 mL falcon tube | Sarstedt | 62.547.254 | |
| CryoPure tube 1.6 mL | Sarstedt | 72.380 | |
| Pippette controller | For pipetting volumes 1-25 mL. | ||
| Sterile serological pipettes: 5, 10 and 25 mL | Sarstedt | 86.1253.001, 86.1254.001, 86.1685.001 | |
| Adjustable volume pipettors: 5, 20, 200, and 1,000 µL | |||
| Sterile pipette tips | For pipetting volumes of 0.5 - 1,000 µL. | ||
| Glass coverslips | NeuVitro | GG-12-1.5-oz | #1.5 thickness, 12mm diameter, 0.5oz, CE certified, fit 24 well plates. |
| Glass dish | Approximately 150mm diameter. | ||
| Glass beaker | Make sure to have an appropriate size beaker for the sonicator bath available. Water from the sonicator bath should not overflow into the glass beaker. | ||
| Parafilm M | VWR | ||
| ThawSTAR Automated Cell Thawing System | BioCision | BCS-601 | |
| Countess II Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Cell counting chambers [50 slides] and trypan blue [0.4%] | ThermoFisher Scientific | C10228 | For use with Countess II Automated Cell Counter. |
| CoolCell Cell LX Controlled-rate Freezing Container | Biocision | BCS-405 | |
| Laminar flow hood | |||
| Humidified 5% CO2 37 °C incubator | |||
| Centrifuge | Suitable for 1,5, 15 and 50 mL tubes. | ||
| Orbital shaker | |||
| Sonicator - Bransonic Model B200 cleaner | Sigma Aldrich | Z305359 | Frequency = 50-60Hz, Amplitude = 30 Watts |
| FACS Aria III cell sorter | BD Pharmingen | ||
| Phase contrast microscope | Olympus | CKX31 | |
| Inverted fluorescence microscope | Leica | DMI6000 B |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nat Rev Mol Cell Biol. 17, 170-182 (2016).
- Mertens, J., et al. Directly Reprogrammed Human Neurons Retain Aging-Associated Transcriptomic Signatures and Reveal Age-Related Nucleocytoplasmic Defects. Cell Stem Cell. 17, 705-718 (2015).
- Hashizume, O., et al. Epigenetic regulation of the nuclear-coded GCAT and SHMT2 genes confers human age-associated mitochondrial respiration defects. Sci Rep. 5, 10434 (2015).
- Lapasset, L., et al. Rejuvenating senescent and centenarian human cells by reprogramming through the pluripotent state. Genes Dev. 25, 2248-2253 (2011).
- Huh, C. J., et al. Maintenance of age in human neurons generated by microRNA-based neuronal conversion of fibroblasts. Elife. 5, (2016).
- Drouin-Ouellet, J., et al. REST suppression mediates neural conversion of adult human fibroblasts via microRNA-dependent and -independent pathways. EMBO Mol Med. , (2017).
- Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. Production and purification of lentiviral vectors. Nat Protoc. 1, 241-245 (2006).
- Richner, M., Victor, M. B., Liu, Y., Abernathy, D., Yoo, A. S. MicroRNA-based conversion of human fibroblasts into striatal medium spiny neurons. Nat Protoc. 10, 1543-1555 (2015).
- Lau, S., Rylander Ottosson, D., Jakobsson, J., Parmar, M. Direct neural conversion from human fibroblasts using self-regulating and nonintegrating viral vectors. Cell Rep. 9, 1673-1680 (2014).
- Pfisterer, U., Wood, J., Nihlberg, K., Hallgren, O., Bjermer, L., Westergren -Thorsson, G., Lindvall, O., Parmar, M. Efficient induction of functional neurons from adult human fibroblasts. Cell Cycle. 10, 3311-3316 (2011).
- Caiazzo, M., Dell'Anno, M. T., Dvoretskova, E., Lazarevic, D., Taverna, S., Leo, D., Sotnikova, T. D., Menegon, A., Roncaglia, P., Colciago, G., Russo, G., Carninci, P., Pezzoli, G., Gainetdinov, R. R., Gustincich, S., Dityatev, A., Broccoli, V. Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts. Nature. 476, 224-227 (2011).
- Masserdotti, G., Gascón, S., Götz, M. Direct neuronal reprogramming: learning from and for development. Development. 143, 2494-2510 (2016).
- Pereira, M., Pfisterer, U., Rylander, D., Torper, O., Lau, S., Lundblad, M., Grealish, S., Parmar, M. Highly efficient generation of induced neurons from human fibroblasts that transplantation into the adult rat brain. Sci Rep. 4, 6330 (2014).
