Summary
Riprogrammazione neuronale diretto genera neuroni che mantengono l'età della cellula somatica partenza. Qui, descriviamo un metodo basato su vettori per generare neuroni indotti dai fibroblasti cutanei ottenuti da donatori umani adulti.
Abstract
Neuroni indotti (iNs), il prodotto delle cellule somatiche direttamente convertito in neuroni, sono un modo per ottenere neuroni paziente-derivato dal tessuto che è facilmente accessibile. Attraverso questo percorso, neuroni maturi possono essere ottenuti nel giro di poche settimane. Qui, descriviamo un protocollo semplice e rapida One-Step per ottenere iNs da fibroblasti cutanei ottenuti attraverso campioni di biopsia da donatori umani adulti. Spieghiamo ogni fase del processo, compreso il mantenimento dei fibroblasti cutanei, le modalità di congelamento per costruire un magazzino della linea cellulare, semina di cellule per la riprogrammazione, nonché le condizioni di cultura durante il processo di conversione. In più, descriviamo la preparazione dei vetrini coprioggetti per registrazioni elettrofisiologiche, condizioni a lungo termine del rivestimento e delle cellule attivate la fluorescenza che ordinano (FACS). Illustriamo anche esempi dei risultati da aspettarselo. Il protocollo descritto qui è facile da eseguire e possono essere applicata all'essere umano fibroblasti derivati dalle biopsie di pelle umana da pazienti con varie diagnosi diverse e di età. Questo protocollo genera una quantità sufficiente di iNs che può essere utilizzato per una vasta gamma di applicazioni biomediche, tra cui malattia di modellazione, lo screening di stupefacenti e convalida di destinazione.
Introduction
Sviluppo di trattamenti efficaci per i disturbi neurologici sono stati ostacolati dall'accesso limitato alle cellule di cervello umano vivente per eseguire studi meccanicistici e saggi funzionali. Circa un decennio fa, questa situazione è cambiata radicalmente con lo sviluppo di pluripotenti indotte (iPSCs) sulle cellule staminali tecnologia1,2. Questo, combinato con una migliore comprensione dei meccanismi di differenziazione neurale che si verificano durante il normale sviluppo umano, ha permesso per la generazione di definiti e diversi sottotipi neuronali da materiale specifico paziente e malattia. Con tale materiale, è ora possibile studiare meccanismi intracellulari malattie neurologiche e il potenziale di diversi composti per alleviare quelle caratteristiche patologiche3.
Mentre iPSCs sono stati rivoluzionario nel campo delle neuroscienze, uno svantaggio principale di queste cellule è che loro firma di invecchiamento è cancellato durante il processo di riprogrammazione in modo tale che il neurone ringiovanito non mantiene la vulnerabilità associata invecchiamento4,5,6. Questa particolare caratteristica dei neuroni che sono prodotte può finire per essere critico per ricapitolare molti aspetti della cascata patogeno intracellulare, particolarmente nel caso di malattie per le quali la vecchiaia è un importante fattore di rischio.
Diretta riprogrammazione neurale è una tecnologia in cui una cellula somatica viene convertita direttamente in una a senza passare attraverso un pluripotenti intermedio della fase. Questo consente per la generazione rapida di neuroni umani in vitro che può essere sia paziente e malattia specifica. Una caratteristica notevole di riprogrammazione diretta è che l'età d'inizio della cellula donatrice viene mantenuta, e con questo, sua vulnerabilità ai processi di invecchiamento come aumento della produzione di stress ossidativo4,7. Di conseguenza, iNs da pazienti con malattie neurologiche associate con l'invecchiamento, come il morbo di Alzheimer e morbo di Parkinson, sono adatti per un'ampia gamma di applicazioni biomediche, compreso la malattia di modellazione, analisi e studi tossicologici di screening di stupefacenti .
L'avvertenza principale che ha impedito l'iNs di pazienti con patologie neurodegenerative essendo ampiamente usati è che essi non sono facili da riprogrammare, e questo diventa ancora più difficile con l'espansione dei fibroblasti. Di conseguenza, la generazione di cellule in quantità necessaria per questi tipi di applicazioni non è stato raggiunto fino al recente8. Ora abbiamo sviluppato un metodo semplice per riprogrammare i fibroblasti da donatori di tutte le età in un modo molto efficiente. Questo metodo combina l'espressione forzata dei fattori di trascrizione di un neurone Ascl1 e Brn2 con un atterramento del proteina RE1-silenziamento repressore (resto) utilizzando un singolo vettore. Qui, descriviamo le diverse fasi che portano alla generazione di iNs convertito da fibroblasti della pelle biopsiati da donatori anziani.
Protocol
Adulti fibroblasti cutanei sono sono ottenuti dalle ricerche sulla malattia di Parkinson e la malattia di Huntington cliniche presso il centro di John van Geest per Brain Repair (Cambridge, UK) e utilizzati sotto approvazione etica locale (REC 09/H0311/88). Per informazioni dettagliate sulla procedura di prelievo bioptico di pelle, vedere riferimento8.
1. preparazione dei fibroblasti della pelle per la riprogrammazione
- Utilizzando una cella automatizzata scongelamento sistema o bagnomaria a 37 ° C, scongelare i fibroblasti cutanei umani adulti (aHDFs) e piastra di 200.000 per T75 fiaschetta (conteggio con un contatore di cellule automatizzato) in 10 mL di terreno del fibroblasto (Vedi tabella 1) a 37 ° C in 5% CO2.
- Eseguire un completo cambiamento medio con il mezzo del fibroblasto il giorno successivo.
- Modificare il mezzo del fibroblasto ogni 3 – 4 giorni fino a raggiungono le cellule confluency di 95%.
Nota: Una boccetta confluente conterrà circa 1.000.000 cellule. Il aHDFs può essere bloccato per costruire un magazzino della linea cellulare (sezione 2) o direttamente ri-placcato pronto per la riprogrammazione (sezione 3).
2. congelamento dei fibroblasti della pelle
- Posizionare un contenitore di congelamento controllato-tasso in una scatola con ghiaccio o in frigorifero a 4 ° C.
- Dissociare le cellule con tripsina 0,05% (1,5 mL per fiaschetta T75) a 37 ° C per 3 – 5 min.
- Aggiungere il terreno del fibroblasto (contenente siero bovino fetale (FBS)) per neutralizzare la tripsina (3 mL per ogni svuotamento per T75 fiaschetta) e raccogliere le cellule indipendenti in una provetta da 15 mL di stanare le cellule nel pallone due volte.
- Contare le celle utilizzando il contatore di cellule automatizzato; freeze (consigliato) aHDFs circa 500.000 per flaconcino.
- Rotazione verso il basso le cellule a 400 x g per 5 min.
- Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di medium di congelamento (Vedi tabella 1) e il trasferimento nel tubo criogenico. Posizionare i tubi direttamente nel contenitore di congelamento controllato-tasso.
- Memorizzare la velocità controllata congelamento apparato a-80 ° C durante la notte. Il giorno seguente, i tubi di trasferimento per un congelatore-140 ° C e memorizzare fino a quando necessario.
3. placcatura per riprogrammazione (− 1 giorno)
Nota: Si consiglia di utilizzare un rivestimento di gelatina per esperimenti di breve termine (fino a 30 giorni); in alternativa, per gli esperimenti a lungo termine è consigliabile avviare il poli-L-ornitina, fibronectina e laminina (PFL) rivestimento.
- 60 min prima di placcatura del aHDFs per la riprogrammazione, ricoprire una piastra a 24 pozzetti con gelatina di 0,1% (250 µ l/pozzetto) e incubare a 37 ° C.
- Aspirare il mezzo del fibroblasto sulla aHDFs. Lavare una volta con DPBS. Dissociare le cellule con tripsina 0,05% (1,5 mL per fiaschetta T75) a 37 ° C per 3 – 5 min.
- Aggiungere il terreno del fibroblasto per neutralizzare la tripsina (3 mL per ogni svuotamento per T75 fiaschetta) e raccogliere le cellule indipendenti in una provetta da 15 mL di stanare le cellule nel pallone due volte.
- Rotazione verso il basso le cellule a 400 x g per 5 min. Discard supernatante e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di terreno del fibroblasto.
- Contare le celle utilizzando un contatore di cellule automatizzato (per garantire un controllo di conversione di buona qualità che l'attuabilità delle cellule è superiore al 90% con trypan blu colorazione).
- Per una completa piastra a 24 pozzetti, preparare una sospensione di 1.320.000 cellule in 13,2 mL di terreno del fibroblasto per ottenere una sospensione di 100.000 cellule/mL di terreno (o 55.000 cellule/pozzetto in 550 µ l di terreno di fibroblasto moltiplicato per il numero di pozzetti necessari).
- Aspirare la gelatina dalla piastra e lavare due volte con DPBS. Aggiungere 500 µ l di sospensione cellulare in ogni pozzetto e incubare per una notte a 37 ° C in 5% CO2.
4. virale trasduzione (giorno 0)
Nota: Lavorare con particelle lentivirali richiede apparecchiature di categoria 2 e l'uso di un agente per neutralizzare il virus. Indossa doppie paia di guanti è inoltre fortemente raccomandato.
- Scaldare a 13,2 mL di terreno del fibroblasto a 37 ° C.
- Scongelare un vettore lentivirale contenente i fattori di trascrizione Ascl1 e Brn2 con due short hairpin RNA (shRNA) targeting riposo a temperatura ambiente.
Nota: Fare riferimento per fare riferimento a8; il costrutto è disponibile in un repository di plasmide. Per informazioni dettagliate sulla procedura per produrre lentivirus consultare riferimento9. - Aggiungere il volume necessario di lentivirus per infettare il aHDFs alle molteplicità di infezione (MOI) di 20 al mezzo senza alcun esaltatori di trasduzione.
- Sostituire il mezzo della piastra a 24 pozzetti con mezzo del fibroblasto contenente il vettore lentivirale (500 µ l/pozzetto) e incubare per una notte a 37 ° C in 5% CO2.
- Il giorno successivo, sostituire il mezzo nei pozzetti con medium fresco del fibroblasto senza il vettore lentivirale.
Nota: Il mezzo è considerato contagioso per 7 giorni e in quanto tale, un'adeguata protezione e gestione delle procedure devono essere usate durante la prima settimana dopo la trasduzione virale.
5. manutenzione delle cellule conversione
Nota: Una volta che la conversione comincia le cellule sono suscettibili di sollevamento; prendersi cura di ribaltare la piastra e utilizzare una pipetta µ l 1.000 quando rimuovere i media per evitare le celle lo scollegamento.
- Il giorno 3, rimuovere il supporto del fibroblasto e aggiungere 500 µ l di inizio medio di conversione neuronale (Vedi tabella 1).
- Due o tre volte a settimana, prendere 225 µ l di terreno vecchio dal pozzo e aggiungere-in 250 µ l di terreno di un neurone conversione inizio nuovo.
- Il giorno 18, rimuovere tutti i media da ogni pozzetto e sostituire con 500 µ l di ritardo medio di conversione neuronale (Vedi tabella 1).
- Continuare a modificare la metà del mezzo come sopra con ritardo medio di conversione un neurone ogni 2 – 3 giorni fino al giorno 25 o esperimento endpoint (Figura 1A).
Nota: Se le cellule non sono placcate in ogni pozzetto per l'esperimento, riempire il vuoti pozzetti con PBS o acqua per evitare l'evaporazione evidente del mezzo e minimizzare la variazione tra pozzetti.
| Concentrazione d'archivio | Concentrazione di lavoro | |
| Medio del fibroblasto | ||
| Basale medio | N/A | N/A |
| Penicillina/streptomicina | 10.000 U/mL | 100 mg/mL |
| FBS | N/A | 10% |
| Mezzo di congelamento | ||
| Medio del fibroblasto | N/A | 45% |
| FBS | N/A | 45% |
| DMSO | N/A | 10% |
| Medio di un neurone conversione precoce (ENM) | ||
| Mezzo di differenziazione neurale | N/A | N/A |
| Penicillina/streptomicina | 10.000 U/mL | 100 mg/mL |
| CHIR99021 | 10 mM | 2 ΜM |
| SB-431542 | 20 mM | 10 ΜM |
| Zucca | 100 µ g/mL | 0,5 µ g/mL |
| LDN-1931189 | 10 mM | 0,5 ΜM |
| VPA | 2. | 1 mM |
| LM-22A4 | 20 mM | 2 ΜM |
| GDNF | 20 µ g/mL | 2 ng/mL |
| NT3 | 10 µ g/mL | 10 ng / µ l |
| DB-cAMP | 50 mM | 0,5 mM |
| Ritardo medio di conversione neuronale (LNM) | ||
| Mezzo di differenziazione neurale | N/A | N/A |
| Penicillina/streptomicina | 10.000 U/mL | 100 mg/mL |
| LM-22A4 | 20 mM | 2 ΜM |
| GDNF | 20 µ g/mL | 2 ng/mL |
| NT3 | 10 µ g/mL | 10 ng / µ l |
| DB-cAMP | 50 mM | 0,5 mM |
| FACS Buffer | ||
| HBSS 1 x [- calcio, - magnesio, - fenolo rosso] | N/A | N/A |
| BSA | N/A | 1% |
| Dnaasi | N/A | 0.05% |
Tabella 1: composizione dei diversi media utilizzati. Descrizione completa della composizione per tutti i supporti necessari in questo protocollo tra media del fibroblasto, congelamento medio, primi neuronale conversione media, ritardo medio di conversione neuronale e buffer di FACS.
6. vetrini coprioggetti per registrazioni elettrofisiologiche
Nota: È consigliabile indossare un camice da laboratorio, occhiali, doppio guanti e completare tutto il lavoro in una cappa aspirante. Questo protocollo è adattato da 10.
- Mettere vetrini coprioggetti sul fondo di un piatto di vetro senza sovrapposizione.
- Aggiungere laboratorio generale pulizia detergente per sommergere tutte le lamelle senza rischiare troppo pieno durante agitazione (circa 30 mL). Posto su un agitatore orbitale a bassa velocità per 2 h.
- Lavare sei volte (ogni 30 min.) con acqua deionizzata in autoclave.
- Aggiungere etanolo al 95% per 2 h.
- Rimuovere l'etanolo e attendere fino a quando le lamelle sono asciutte.
- Una volta asciutto, trasferire i coprioggetti in un becher di vetro e aggiungere acido nitrico al 70%, fino a quando le lamelle sono sommerso.
- Porre il becher di vetro in un bagno sonicatore per 60 min.
- Rimuovere l'acido nitrico e lavare tre volte con acqua deionizzata in autoclave.
Attenzione: Aggiungere sempre l'acido all'acqua, mai l'altro senso intorno come questo può portare ad una reazione violenta. - Togliere quanta più acqua dal becher possibile e aggiungere concentrate di acido cloridrico (HCI) fino a quando le lamelle sono sommerso; roteare il bicchiere e coprire con pellicola di paraffina.
- Sonicare per 60 min (50 – 60 Hz, 30 W).
- Rimuovere tanto HCI da vetrini coprioggetti possibile e posto in una collocazione appropriata dei rifiuti. Risciacquare con acqua deionizzata in autoclave due volte.
- Prendere i coprioggetti fuori della cappa e sciacquare 20 volte (o più) con acqua deionizzata in autoclave fino a quando tutta l'HCI viene rimosso.
- Una volta asciutto, posizionare i vetrini coprioggetti in piastre da 24 pozzetti sterili.
- Posizionare le piastre sotto ultravioletto (UV) luce durante la notte. Il giorno successivo le lamelle sono pronte all'uso.
Nota: Se vengono utilizzate lamelle di vetro, si consiglia di utilizzare il rivestimento di PFL. È sufficiente posizionare un coprioggetto in ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti (utilizzando pinze sterili) e seguire il protocollo come di seguito.
7. PFL rivestimento per la cultura a lungo termine
- Rivestire la piastra a 24 pozzetti con poli-L-ornitina (500 µ l/pozzetto) e lasciare per una notte a 37 ° C in 5% CO2.
- Aspirare il poli-L-ornitina e attendere fino a quando è abbastanza asciutto a forma di gocce sulla parte superiore.
- Fare un drop (circa 60 µ l) di laminin al centro di ogni bene e si sono diffuse per coprire l'intera superficie del coprivetrino. Lasciare per 2 h 45 min a 37 ° C in 5% CO2.
- Lavare tre volte con DPBS.
- Aggiungere fibronectina (500 µ l/pozzetto) e lasciare per una notte a 37 ° C in 5% CO2.
- Lavare una volta con DPBS prima di aggiungere le cellule.
Nota: Il rivestimento di PFL può essere utilizzato per le impostazioni cultura a lungo termine di iNs (oltre 100 giorni), anche se la morte progressiva delle cellule è da aspettarselo da giorno 30.
8. FACS
Nota: Per ri-piastra le cellule dopo FACS ordinamento preparare una piastra rivestite con PFL 48h in anticipo. Le cellule possono essere ordinate utilizzando un anticorpo di molecola (NCAM) di adesione neurale delle cellule dal giorno 20 in poi seguito di trasduzione.
- Rimuovere il supporto con una pipetta di 1.000 µ l (non lavare per evitare di staccare le cellule).
- Aggiungere la cella dissociando agente (250 µ l/pozzetto), lasciare per 10 – 20 min fino all'ascensore di cellule e galleggiante come singole cellule.
- Durante questo tempo preparare il tampone di FACS.
- Triturare delicatamente con una pipetta di 1.000 µ l. Se rimangono alcuni ciuffi, incubare un altro po'.
- Una volta ottenuta una sospensione unicellulare, rimuoverlo dal pozzo e posto in una provetta da 1,5 mL.
- Stanare il pozzo due volte con ritardo medio di conversione neuronale e posto nella stessa provetta da 1,5 mL.
- Rotazione verso il basso a 400 x g per 5 min e scartare il surnatante.
- Risospendere il pellet cellulare in 200 µ l di tampone di FACS.
- Rotazione verso il basso le cellule a 400 x g per 5 min e scartare il surnatante.
- Ripetere i passaggi da 8.8 e 8.9 due volte.
- Risospendere il pellet cellulare in 50 µ l di tampone di FACS contenente anticorpo umano CD56 (NCAM) ad una concentrazione di 01:50 per 15 min sul ghiaccio. Proteggere dalla luce.
- Rotazione verso il basso le cellule a 400 x g per 5 min.
- Risospendere in 200 µ l di tampone di FACS per lavare e rotazione verso il basso le cellule a 400 x g per 5 min.
- Ripetere il passaggio 8.13.
- Risospendere in 200 µ l di tampone di FACS contenente ioduro di propidio (PI; 10 µ g/mL). Ordinare i NCAM positivo (iNs) e PI negativo (dal vivo) cellule usando FACS di gating sulla base del livello di intensità di fluorescenza dei campioni di controllo che non sono stati macchiati con l'anticorpo NCAM o PI.
- Raccogliere le cellule positive di NCAM in un tubo contenente tardo medio di conversione di un neurone.
- Contare le celle utilizzando un contatore di cellule automatizzato e ri-piastra le cellule ad un'alta densità (50.000 cellule/cm2) nel mezzo di un neurone conversione tardiva in un piatto PFL rivestito.
- Continuano a cambiare la metà del mezzo 2 – 3 volte a settimana con ritardo medio di conversione un neurone fino all'endpoint di esperimento (Figura 1A).
Representative Results
Un netto cambiamento nella morfologia delle cellule dovrebbe essere visibile dal giorno 5 in poi (Figura 1B). Alcuni la morte delle cellule è prevedibile dopo trasduzione virale, anche se non apertamente. Da ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti dovrebbe essere previsto un rendimento totale delle cellule delle cellule di 20.000-40.000 di giorno 25, di cui circa la metà dovrebbe diventare neuroni. È importante notare che la resa e la purezza può variare tra linea cellulare, così come con lotti di virus e stato di malattia.
Le cellule saranno esprimono marcatori neuronali più standard tra cui MAP2 e TAU (Figura 1) nel giorno 25 oltre che esibiscono una morfologia neuronale matura. È possibile ottenere un puro nella popolazione facendo FACS basato sul marcatore NCAM (vedi riferimenti8,11). Le cellule possono successivamente essere neanche ri-piastrate su rivestimento triplice PFL (Vedi riferimento10) o direttamente congelato per analisi biomolecolari.
Se le cellule non sono ordinate, immunofluorescenza etichettatura con MAP2 o TAU dovrebbe essere eseguita per identificare le cellule convertite e co-identificato con la proteina di interesse.
Figura 1: evoluzione della conversione nel corso del tempo. Timeline (A) l'esperimento e la mappa del costrutto confezionato in un lentivirus utilizzato per riprogrammare i fibroblasti cutanei umani adulti. Ogni freccia nera rappresenta un cambiamento medio. (B) immagini a contrasto di fase rappresentativa raffigurante i cambiamenti nella morfologia delle cellule durante il processo di conversione tra giorno 0 al giorno 22 (come indicato nell'angolo superiore destro di ogni pannello). Immagini scattate con un microscopio di contrasto di fase utilizzando l'obiettivo 10x. (C) immagine di immunofluorescenza di doppia TAU e MAP2 macchiatura alla post-trasduzione giorno 35. Le cellule erano fissi in paraformaldeide al 4% e permeabilizzate con 0,1% Triton in DPBS per 10 minuti le cellule sono state bloccate per 30 minuti in una soluzione di 5% di siero in DPBS. Gli anticorpi sono stati diluiti in soluzione di blocco e applicati durante la notte a 4 ° C. Anticorpi secondari coniugati fluoroforo erano diluiti in soluzione di blocco e applicati per 2 h. cellule erano controcolorate con DAPI per 15 min seguita da 3 lavaggi con DPBS. Immagini scattate con un microscopio a fluorescenza invertito usando l'obiettivo X 20. Scala bar = 100 µm (B, C). Abbreviazioni: ENM: presto un neurone medio; LNM: tardo medio neuronale. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussion
Questo vettore di one-step/one riprogrammazione metodo fornisce un modo efficace per ottenere iNs da fibroblasti umani adulti. Fibroblasti umani adulti sono normalmente molto più difficili a covert di fibroblasti fetali, con limitati studi precedentemente reporting efficienze di circa 5-10%12,13. Tuttavia, con questo nuovo protocollo è possibile raggiungere una resa di un neurone (misurata come cellule MAP2 +) di circa 50%8. Inoltre, il nostro protocollo può essere utilizzato sui fibroblasti cutanei che sono stato attraversati più volte senza perdere in efficienza di conversione. Finora abbiamo usato le cellule attraversate fino a 14 volte senza rilevare alcuna diminuzione nell'efficienza di conversione. Inoltre, non esiste alcuna differenza nella riprogrammazione efficienza nelle nostre mani con i fibroblasti da donatori di età compresa tra 52 e 87. Per maggiori dettagli sull'età e la malattia di altre linee cellulari testati con questo costrutto Vedi riferimento8. Altri studi non hanno anche riferito alcuna differenza di efficienza di conversione utilizzando un protocollo basato su vettori lentivirali e piccolo molecola-enhanced con donatori tra 0 e 89 anni4. Inoltre, applicabilità coerente con riprogrammazione neuronale basato su miRNA è stata segnalata nei fibroblasti di tutte le età, con donatori tra 0 e7di 86 anni. Attraverso questo percorso, neuroni maturi possono essere ottenuti in circa 12 – 15 settimane in vitro o circa 8 settimane dopo trapianto in vivo8. Questo è vantaggioso perché dà accesso sia la malattia che il paziente in specifici umana dal tessuto che è facilmente accessibile. Anche se questo protocollo è efficiente, non produrrà un rendimento di un neurone di 100%, e come tale è necessaria una fase di purificazione mediante FACS per esempio.
Il punto più critico all'interno di questo protocollo è trasduzione virale (protocollo sezione 4). È fondamentale che il titolo del virus è preciso, oltre ad aver placcato un numero preciso di aHDFs per la conversione. Il titolo consigliato per l'uso con questo protocollo è tra 4 x 108 e 4 x 109. Utilizzando un titolo di nulla di sotto di 1 x 108 non sarebbe consigliabile come l'aggiunta di grandi volumi di virus sarà tossici per le cellule. Inoltre, come i fibroblasti cominciano a covert a iNs diventeranno più fragile e suscettibile di sollevamento. È essenziale essere gentile quando si modificano i media per non disturbare troppo le celle. Questo può essere fatto rimuovendo il liquido lentamente con una pipetta di 1.000 µ l. Infine, quando placcatura per riprogrammazione (protocollo sezione 3) è importante garantire una popolazione sana del fibroblasto prima di iniziare un esperimento; Questo è indicato da una vitalità cellulare di superiore al 90% con la macchiatura blu di trypan. Il aHDFs dovrebbe sempre essere attraversate prima di raggiungere confluency di 95%.
Se c'è la morte delle cellule evidente prima di trasduzione virale, non iniziare la conversione: doppio controllo che l'attuabilità delle cellule è superiore al 90% e che ci sono stati problemi con il rivestimento della piastra. Si prevede di avere una piccola quantità di morte delle cellule dopo la trasduzione virale, tuttavia, questo non dovrebbe essere significativo. In questo caso, confermare la semina precisa di 50.000 aHDFs/pozzetto e controllare il titolo del virus. Se c'è evidente incoerenza tra pozzi durante la conversione, in primo luogo verificare che ogni pozzo contiene una quantità uguale di media e palesi evaporazione non è in corso presso i bordi (se necessari supporti supplementari possono essere aggiunti ai pozzetti bordo). In alternativa, controllare passo 4.4 e garantire la miscelazione appropriato per una sospensione omogenea quando trasducendo. È fondamentale aggiungere il lentivirus al medium in primo luogo, prima di aggiungere questo nei pozzetti. Aggiunta diretta di lentivirus nei pozzetti aumenterà la variabilità di un pozzetto a altro e rischia anche di essere tossico per le cellule. Infine, controllare sempre che il mezzo è riscaldato a 37 ° C prima dell'aggiunta alle cellule.
Questo protocollo comprende le sezioni facoltative per condizioni di rivestimento per lungo termine cultura di iNs e FACS ordinamento per aumentare la purezza di un neurone. Per gli esperimenti che desiderano approfondire la caratterizzazione funzionale di iNs, un protocollo per la preparazione dei vetrini coprioggetti per elettrofisiologia è stato anche incluso. Il protocollo di conversione qui è impostato per l'utilizzo con una piastra a 24 pozzetti; Se lo si desidera può essere modificato a 6, 12, 48-, piastra a 96 pozzetti o boccette. In questo caso, si prega di regolare tutti i volumi per l'area della superficie della piastra o pallone utilizzato.
Questo protocollo utilizza l'espressione forzata di Ascl1 e Brn2 in combinazione con un atterramento di resto tutti confezionati in un singolo vettore8 per generare aggiuntivi di un fenotipo pan-neuronale. La generazione di eventuali sottotipi gliali con questo metodo, tuttavia, non è stata valutata. Questo metodo così avrebbe bisogno di essere modificati per l'utilizzo con altri fattori di riprogrammazione per ottenere sottotipo neuroni specifici. Riprogrammazione diretta precedentemente ha indicato la possibilità di generare motoneuroni, neuroni sensoriali, fotorecettori, neuroni medi spinosi striatali e neuroni dopaminergici10,14. Questo sarà utile quando studia le malattie neurologiche in quale specifico sottotipo di un neurone sono preferenzialmente colpite, per esempio la malattia del Parkinson e neuroni dopaminergici.
Fino a poco tempo fa, tecnologia di riprogrammazione neurale diretta non ha permesso per la produzione di iNs in modo standardizzato ed efficiente — ad un livello che è necessario per tossicologia e saggi su larga scala di screening di stupefacenti. Questo nuovo metodo è molto efficiente e può essere utilizzato sui fibroblasti che sono state attraversate molte volte, tale che ora rimuove tali restrizioni e si apre per una vasta gamma di studi, non solo in un sistema neurale umano, ma anche in un sistema che può essere paziente specifico. La semplicità di questo approccio rende accessibile per eventuali gruppi che vogliono eseguire studi simili in-House iN tecnologia e può essere facilmente utilizzata non solo per applicazioni biomediche su larga scala, come lo screening di stupefacenti e le analisi di tossicologia, ma anche per sostenere dati derivati da modelli animali e campioni di tessuto umano post-mortem .
Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo Marie Persson Vejgården per l'assistenza tecnica. La ricerca che porta a questi risultati ha ricevuto finanziamenti dalla Fondazione cellule staminali New York, il Consiglio europeo della ricerca nell'ambito del settimo programma quadro dell'Unione europea: FP/2007-2013 Neuro cellule staminali riparazione (No. 602278) e la convenzione di sovvenzione CER no. 30971, Consiglio di ricerca svedese (di sovvenzione 521-2012-5624, 2016-00873 e 70862601 / Bagadilico), Fondazione Parkinson svedese (Parkinsonfonden) e l'Area di ricerca strategica presso Lund University Multipark (ricerca multidisciplinare in Morbo di Parkinson). Janelle Drouin-Ouellet è supportato da una borsa di studio di istituti canadesi di ricerca di salute (CIHR) (#358492) e Roger Barker è supportata da una sovvenzione di NIHR Biomedical Research Centre per l'Università di Cambridge/Addenbrooke Hospital. Malin Parmar è un investigatore di Robertson Foundation di New York sulle cellule staminali. Shelby Shrigley è finanziato dal programma di Unione europea orizzonte 2020 (H2020-MSCA-ITN-2015) sotto la rete di formazione innovativo di Marie Skłodowska-Curie e Grant contratto n. 676408.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Lines | |||
| Adult human dermal fibroblasts | [C2 passage #7] Donor was a 67 year old female. Cells obtained from the Parkinson’s Disease Research and Huntington’s disease clinics at the John van Geest Centre for Brain Repair (Cambridge, UK). | ||
| Reagents for Fibroblast Culture, Transduction and Conversion | |||
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) [-CaCl2, -MgCl2] | Gibco | 14190094 | |
| Trypsin-EDTA [0.5%] | Gibco | 15400-054 | Dilute to 0.05% in DPBS. |
| Virkon (agent used to neutralize virus) | Viroderm | 7511 | Dilute to 1% solution with warm water. |
| Milli-Q Water | Millipore | ||
| Basal medium - Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) + GlutaMax | Gibco | 61965059 | |
| Penicillin/Streptomycin [10,000 U/mL] | Gibco | 15140-122 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| CryoMACS® dimethyl sulfoxide (DMSO) 10 | Miltenyi | 170-076-303 | |
| Neural differentiation medium - NDiff 227 | Takara-Clontech | Y40002 | |
| LM-22A4 | Tocris | 4607 | Dilute 10 mg in 1450 µL DMSO. Stock concentration: 20 mM. |
| Glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) [recombinant human] | R&D systems | 212-GD-010 | Dilute 10 ug in 500 µL 0,1% BSA in DPBS. Stock concentration: 20 µg/mL. |
| NT3 [recombinant human] | R&D systems | 267-N3-025 | Dilute 25 µg in 2,5 mL 0,1% BSA in DPBS. Stock concentration: 10 µg/mL. |
| db-cAMP | Sigma Aldrich | D0627 | Dilute 1 g in 40,7 mL Milli-Q water. Filter and make 500 µL aliquots or stock tubes of 10 mL. Stock concentration: 50 mM. |
| CHIR99021 | Axon | 1386 | Dilute 2 µg in 429,8 µL DMSO. Stock concentration: 10 mM. |
| SB-431542 | Axon | 1661 | Dilute 5 mg in 595 µL DMSO. Stock concentration: 20 mM. |
| Noggin [recombinant human] | Miltenyi | 130-103-456 | Dilute 100 µg in 100 µL of Milli-Q water + 900 µL 0,1% BSA in DPBS. Stock concentration: 100 µg/mL. |
| LDN-193189 | Axon | 1509 | Dilute 2 mg in 360 µL DMSO. Stock concentration: 10 mM. |
| Valproic acid sodium salt (VPA) | Merck Millipore | 676380 | Dilute 5 g in Milli-Q water to acheive a stock concentration of 1 M. CAUTION: Avoid ingestion, contact with skin, and breathing dust formation. |
| Reagents for Coatings | |||
| Gelatin | Sigma Aldrich | G2500 | Dilute to 0.1% in Milli-Q water. |
| Poly-L-ornithine | Sigma Aldrich | P3655 | Dissolve in Milli-Q water. Use at 15µg/mL. |
| Fibronectin | ThermoFisher Scientific | 33010-018 | 2 mL of Milli-Q water + 70 µL 0,25 M NaOH. Use at 5 µg/mL. |
| Laminin | ThermoFisher Scientific | 23017-015 | Store at -80°C. Thaw on ice, keep cool and aliquot 30 µL. Use at 5 µg/mL. |
| Reagents for Fluorescence Activated Cell Sorting | |||
| Cell dissociation agent - Accutase (Stem Pro) | ThermoFisher Scientific | A1110501 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) 1X [-calcium, -magnesium, - phenol red] | ThermoFisher Scientific | 14175-046 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153 | Use at 1% concentration for Anti-Human CD56 (NCAM). |
| DNAase | Sigma Aldrich | DN-25 | Use at 0.05% concentration. |
| Anti-Human CD56 (NCAM) Antibody [Mouse] | BD Pharmingen | 555518 | Use at 1 : 50. |
| Propidium iodide | Sigma Aldrich | P4170 | Dilute to 1mg/mL in PBS and keep sterile. Use at 1:1000 to achieve a concentration of 10µg/mL. |
| Reagents for Glass Coverslips | |||
| Autoclaved deionized water | |||
| Alconox detergent | Sigma Aldrich | Z273228 | |
| Ethanol 95% | |||
| Nitric Acid | Sigma Aldrich | 438073-M | CAUTION: Concentrated nitric acid is highly corrosive, and its vapours are potentially harmful. |
| Concentrated hydrochloric acid (HCI) | CAUTION: Concentrated hydrochloric acid is highly corrosive, and its vapours are potentially harmful. | ||
| Reagents for Immunocytochemistry | |||
| Paraformaldehyde (PFA) | Merck Millipore | 1040051000 | Use at a concentration of 4%. CAUTION: PFA is a potent fixative. Avoid ingestion and contact with skin |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | 10254640 | Use at a concentration of 0.1%. |
| Serum [Donkey] | Merck Millipore | S30-100ML | |
| Anti-MAP2 Antibody [Chicken] | Abcam | ab5392 | Use at a concentration of 1 : 5,000. |
| Tau HT7 Monoclonal Antibody [Mouse] | ThermoFisher Scientific | MN1000 | Use at a concentration of 1 : 500. |
| Cy3 Anti-Chicken Antibody [Donkey] | Jackson ImmunoResearch | 703-165-155 | Use at a concentration of 1 : 400. |
| Alexa Fluor488 Anti-Mouse Antibody [Donkey] | Jackson ImmunoResearch | 715-545-150 | Use at a concentration of 1 : 400. |
| 4′,6-Diamidine-2′-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma Aldrich | D9542 | Reconstitute the powder in Milli-Q water to 1 mg/mL. Aliquot and store at -20°C, light sensitive. Use at a concentration of 1 : 500. |
| Equipment | |||
| T75 flask [Nunclon Delta Surface] | ThermoFisher Scientific | 156499 | |
| 24-well plate [Nunc] | ThermoFisher Scientific | 142485 | |
| 1.5 mL polypropylene tube | Sigma Aldrich | Z336769 | |
| 15 mL falcon tube | Sarstedt | 62.554.502 | |
| 50 mL falcon tube | Sarstedt | 62.547.254 | |
| CryoPure tube 1.6 mL | Sarstedt | 72.380 | |
| Pippette controller | For pipetting volumes 1-25 mL. | ||
| Sterile serological pipettes: 5, 10 and 25 mL | Sarstedt | 86.1253.001, 86.1254.001, 86.1685.001 | |
| Adjustable volume pipettors: 5, 20, 200, and 1,000 µL | |||
| Sterile pipette tips | For pipetting volumes of 0.5 - 1,000 µL. | ||
| Glass coverslips | NeuVitro | GG-12-1.5-oz | #1.5 thickness, 12mm diameter, 0.5oz, CE certified, fit 24 well plates. |
| Glass dish | Approximately 150mm diameter. | ||
| Glass beaker | Make sure to have an appropriate size beaker for the sonicator bath available. Water from the sonicator bath should not overflow into the glass beaker. | ||
| Parafilm M | VWR | ||
| ThawSTAR Automated Cell Thawing System | BioCision | BCS-601 | |
| Countess II Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Cell counting chambers [50 slides] and trypan blue [0.4%] | ThermoFisher Scientific | C10228 | For use with Countess II Automated Cell Counter. |
| CoolCell Cell LX Controlled-rate Freezing Container | Biocision | BCS-405 | |
| Laminar flow hood | |||
| Humidified 5% CO2 37 °C incubator | |||
| Centrifuge | Suitable for 1,5, 15 and 50 mL tubes. | ||
| Orbital shaker | |||
| Sonicator - Bransonic Model B200 cleaner | Sigma Aldrich | Z305359 | Frequency = 50-60Hz, Amplitude = 30 Watts |
| FACS Aria III cell sorter | BD Pharmingen | ||
| Phase contrast microscope | Olympus | CKX31 | |
| Inverted fluorescence microscope | Leica | DMI6000 B |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nat Rev Mol Cell Biol. 17, 170-182 (2016).
- Mertens, J., et al. Directly Reprogrammed Human Neurons Retain Aging-Associated Transcriptomic Signatures and Reveal Age-Related Nucleocytoplasmic Defects. Cell Stem Cell. 17, 705-718 (2015).
- Hashizume, O., et al. Epigenetic regulation of the nuclear-coded GCAT and SHMT2 genes confers human age-associated mitochondrial respiration defects. Sci Rep. 5, 10434 (2015).
- Lapasset, L., et al. Rejuvenating senescent and centenarian human cells by reprogramming through the pluripotent state. Genes Dev. 25, 2248-2253 (2011).
- Huh, C. J., et al. Maintenance of age in human neurons generated by microRNA-based neuronal conversion of fibroblasts. Elife. 5, (2016).
- Drouin-Ouellet, J., et al. REST suppression mediates neural conversion of adult human fibroblasts via microRNA-dependent and -independent pathways. EMBO Mol Med. , (2017).
- Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. Production and purification of lentiviral vectors. Nat Protoc. 1, 241-245 (2006).
- Richner, M., Victor, M. B., Liu, Y., Abernathy, D., Yoo, A. S. MicroRNA-based conversion of human fibroblasts into striatal medium spiny neurons. Nat Protoc. 10, 1543-1555 (2015).
- Lau, S., Rylander Ottosson, D., Jakobsson, J., Parmar, M. Direct neural conversion from human fibroblasts using self-regulating and nonintegrating viral vectors. Cell Rep. 9, 1673-1680 (2014).
- Pfisterer, U., Wood, J., Nihlberg, K., Hallgren, O., Bjermer, L., Westergren -Thorsson, G., Lindvall, O., Parmar, M. Efficient induction of functional neurons from adult human fibroblasts. Cell Cycle. 10, 3311-3316 (2011).
- Caiazzo, M., Dell'Anno, M. T., Dvoretskova, E., Lazarevic, D., Taverna, S., Leo, D., Sotnikova, T. D., Menegon, A., Roncaglia, P., Colciago, G., Russo, G., Carninci, P., Pezzoli, G., Gainetdinov, R. R., Gustincich, S., Dityatev, A., Broccoli, V. Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts. Nature. 476, 224-227 (2011).
- Masserdotti, G., Gascón, S., Götz, M. Direct neuronal reprogramming: learning from and for development. Development. 143, 2494-2510 (2016).
- Pereira, M., Pfisterer, U., Rylander, D., Torper, O., Lau, S., Lundblad, M., Grealish, S., Parmar, M. Highly efficient generation of induced neurons from human fibroblasts that transplantation into the adult rat brain. Sci Rep. 4, 6330 (2014).
