Summary
직접 신경 프로그래밍 시작 체세포의 나이 유지 하는 신경 세포 생성 합니다. 여기, 우리는 성인 인간 기증자 로부터 얻은 피부 섬유 아 세포에서 유도 된 신경 세포를 생성 하는 단일 벡터 기반 방법을 설명 합니다.
Abstract
유도 신경 (iNs), 뉴런으로 직접 변환 하는 체세포의 제품을 쉽게 액세스할 수 있는 조직에서 뉴런 환자 파생 방법입니다. 이 경로 통해 성숙한 뉴런은 몇 주만 얻어질 수 있다. 여기, 우리는 성인 인간 기증자에서 생 검 견본을 통해 얻은 피부 섬유 아 세포에서 기능을 얻기 위해 간단 하 고 빠른 단계 프로토콜을 설명 합니다. 피부 섬유 아 세포, 셀 라인의 재고를 만들려고 냉동 절차의 유지 보수를 포함 하 여 프로세스의 각 단계를 설명 하는 우리 문화 조건 뿐 아니라, 프로그래밍에 대 한 셀의 변환 프로세스 동안 시드. 또한, 우리는 electrophysiological 녹음, 장기 코팅 조건 및 형광 활성화 셀 정렬 (FACS)에 대 한 유리 coverslips의 준비를 설명 합니다. 우리는 또한 예상 결과의 예를 보여 줍니다. 여기에 설명 된 프로토콜 실행 하기 쉬운 이며, 다양 한 다른 진단 및 세 환자에서 인간의 피부 생 검에서 인간의 적용된 fibroblasts 파생 될 수 있다. 이 프로토콜 기능 질병 모델링, 약물 검사, 및 대상 유효성 검사를 포함 하 여 생물 의학 응용 프로그램의 광범위 한 사용 될 수 있는 충분 한 양의 생성 합니다.
Introduction
신경 성 질환에 대 한 효과가 치료의 개발 기계 연구와 기능 분석을 수행 하기 위해 살아있는 인간의 뇌 세포에 제한 접근에 의해 방해 되어 있다. 약 10 년 전,이 상황이 근본적으로 유도 만능 줄기 세포 (Ipsc) 기술1,2의 개발으로 변경. 이것, 정상적인 인간 개발 중 발생 하는 신경 분화 메커니즘의 더 나은 이해로 결합 된 환자와 질병 특정 한 자료에서 정의 하 고 다양 한 신경 하위의 세대에 대 한 허용 했다. 이러한 자료를 그건 이제 신경 질환 및 다른 화합물의 가능성이 그 병 적인 기능3완화 기본 세포내 기계 장치를 공부 하.
Ipsc 신경 과학의 분야에 혁명 되었습니다, 이러한 세포의 1 개의 주요 결점은 노화 서명을 rejuvenated 신경 관련 된 취약점을 유지 하지 않는 같은 방식으로 재활 과정에서 삭제 됩니다. 4,,56을 노화. 생성 되는 신경 세포의 특정 기능이 업과는 나이 중요 한 위험 요소는 질병의 경우 특히 세포내 병원 성 캐스케이드의 여러 측면에 대 한 중요 한 될 수 있습니다.
직접 신경 프로그래밍 기술 한 체세포로 직접 변환 되는에 만능을 통하지 않고 하는 중간 단계. 인간의 신경 세포에 생체 외에서 환자와 질병 특정 될 수 있는의 신속한 생성을 위한 수 있습니다. 직접 프로그래밍 한 현저한 특성은 기증자 셀의 시작 나이 유지 되 고, 그와 같은 프로세스를 노화에 대 한 취약성 증가 산화 스트레스4,7의 생산. 그 결과, 신경 질환을 가진 환자에서 기능 연관 노화과 같은 Alzheimer와 Parkinson의 질병, 질병 모델링, 약물 독성 연구 및 분석, 심사를 포함 하는 생물 의학 응용 프로그램의 광범위 한 적합 .
널리 이용 되 고 신경 퇴행 성 질환을 가진 환자에서 기능을 방해 하고있다 주요 경고는 그들은, 프로그램을 쉽게 고이 섬유 아 세포의 확장을 더욱 어렵게 된다. 결과적으로, 이러한 종류의 응용 프로그램에 필요한 수량에 셀에의 생성 하지 최근에8까지 달성 되었습니다. 우리는 지금 매우 효율적인 방식으로 어떤 나이의 기증자 로부터 섬유 아 세포를 재 설 정할 하는 간단한 방법을 개발 했습니다. 이 방법은 신경 녹음 방송 요인 Ascl1 및 Brn2 의 강제 식의 진압 단백질 RE1 침묵 녹음 방송 요인 (나머지) 단일 벡터를 사용 하 여 최저 결합 합니다. 여기, 우리 노인 기증자 로부터 biopsied 피부 섬유 아 세포에서 변환의 세대는 다른 단계를 설명 합니다.
Protocol
성인 피부 섬유 아 세포 두뇌 수리 (케임브리지, 영국)에 대 한 존 반 Geest 센터에서 파 킨 슨 병 연구 및 Huntington의 질병 클리닉에서 얻은 고 로컬 윤리적인 승인 (REC 09/H0311/88)에서 사용. 피부 생 검 샘플링 절차에 자세한 참조8을 참조 하십시오.
1입니다. 프로그래밍을 위한 피부 섬유 아 세포의 준비
- 시스템 또는 37 ° C 물 목욕 재개 된 자동화 된 셀을 사용 하는 성인 인간 피부 섬유 아 세포 (aHDFs)를 녹여 및 T75 플라스 크 (자동된 셀 카운터 카운트) 섬유 매체의 10 ml에서 당 200000 접시 ( 표 1참조) 5% CO2에서 37 ° C에서.
- 다음 날에 섬유 매체와 완전 한 중간 변화를 수행 합니다.
- 셀 95 %confluency 도달할 때까지 매 3-4 일 섬유 매체를 변경 합니다.
참고: 하나의 confluent 플라스 크 약 1000000 셀이 포함 됩니다. aHDFs 셀 라인 (제 2)의 주식 또는 (제 3) 프로그래밍에 대 한 직접 다시 도금된 준비를 동결 수 있습니다.
2입니다. 피부 섬유 아 세포의 동결
- 얼음 상자 또는 4 ° c.에 냉장고에서 제어 속도 냉동 컨테이너를 놓습니다
- 3-5 분 동안 37 ° C에서 0.05 %trypsin (T75 플라스 크 당 1.5 mL)와 세포 분열
- 트립 신 (T75 플라스 크 당 플러시 당 3 mL)을 중화 하 고 두 번 플라스 크에 세포 밖으로 홍 조에 의해 분리 된 셀 15 mL 튜브에 수집을 (포함 소 태아 혈 청 (FBS)) 섬유 매체를 추가 합니다.
- 자동된 셀 카운터;를 사용 하 여 셀의 개수 (권장된) 동결 바이 알 당 약 500000 aHDFs.
- 5 분에 대 한 400 x g에서 셀 아래로 회전 합니다.
- 냉동 매체의 1 mL에 셀 펠 릿 resuspend ( 표 1참조) 및 저온 관으로 전송. 제어 속도 냉동 컨테이너에 직접 튜브를 놓습니다.
- 밤새-80 ° C에서 장치 냉동 제어 속도 저장 합니다. 다음 날, 튜브-140 ° C 냉장고를 전송 하 고 필요할 때까지 저장 합니다.
3. 도금 (하루 − 1) 프로그래밍에 대 한
참고: 것이 좋습니다 젤라틴 코팅을 사용 하 여 짧은 기간 실험 (최대 30 일); 또는 장기 실험에 대 한이 좋습니다 폴 리-L-ornithine, fibronectin에 laminin (PFL) 코팅 시작 하.
- 프로그래밍을 위한 aHDFs를 도금 하기 전에 60 분 0.1% 젤라틴 (250 µ L/잘)와 24-잘 접시 코트 고 37 ° c.에 품 어
- aHDFs에 섬유 중간 발음 한 번 DPBS 씻어. 3-5 분 동안 37 ° C에서 0.05 %trypsin (T75 플라스 크 당 1.5 mL)와 세포 분열
- 트립 신 (T75 플라스 크 당 플러시 당 3 mL)을 중화 하 고 두 번 플라스 크에 세포 밖으로 홍 조에 의해 분리 된 셀 15 mL 튜브에 수집에 섬유 매체를 추가 합니다.
- 5 분 삭제 상쾌한에 대 한 400 x g에서 셀 아래로 회전 시키십시오 그리고 섬유 매체의 1 mL에 셀 펠 릿 resuspend.
- (세포 생존 능력은 trypan 블루와 90% 이상 착 색 하는 좋은 품질 변환 검사를 위해) 자동된 셀 카운터를 사용 하 여 셀을 계산 합니다.
- 완전 한 24-잘 접시 13.2 ml 매체의 100, 000 셀/mL의 정지 (또는 55000 셀/잘 필요한 우물의 수를 곱한 섬유 매체의 550 µ L)를 달성 하기 위해 섬유 매체의 1,320,000 세포의 현 탁 액을 준비 합니다.
- 접시에서 젤라틴을 발음 하 고 DPBS와 두 번 씻어. 각 우물에 세포 현 탁 액의 500 µ L을 추가 하 고 5% CO2에서 37 ° C에서 밤새 품 어.
4. 바이러스 성 변환 (0 일)
참고: lentiviral 입자 작업 범주 2 장비와 바이러스를 중화 하는 에이전트의 사용을 요구 한다. 장갑 두 쌍을 입고도 좋습니다.
- 37 ° c 섬유 매체의 13.2 mL 워밍업
- 포함 하는 녹음 방송 요인 Ascl1 및 실 온에서 나머지를 대상으로 두 개의 짧은 헤어핀 RNAs (shRNA)와 Brn2 lentiviral 벡터 녹여
참고:8; 참조를 참조 하십시오 구조는 플라스 미드 저장소에서 사용할 수 있습니다. 생산 하는 lentiviruses 절차에 대 한 내용은9참조를 참조 하십시오. - 20의 모든 변환 증강 없이 매체 lentivirus 감염 감염 (MOI)의 다양성에서 aHDFs의 필요한 볼륨을 추가 합니다.
- Lentiviral 벡터 (500 µ L/잘)를 포함 하는 섬유 매체와 24-잘 접시에 매체를 장착 하 고 5% CO2에서 37 ° C에서 밤새 품 어.
- 다음 날, 우물에서 매체를 lentiviral 벡터 없이 신선한 섬유 매체 바꿉니다.
참고: 매체 간주 됩니다 감염 7 일 동안 하 고 적절 한 보호 및 처리 절차를 바이러스 성 변환 다음 첫 번째 주 동안 사용 해야 같은.
5입니다. 변환 세포의 유지 보수
참고: 변환 시작 되 면 셀을 따르게 됩니다 해제; 접시 도움말과 1000 µ L 피 펫을 사용 하 여 분리 하는 것을 세포을 피하기 위해 미디어를 제거 하는 경우 주의 하십시오.
- 3 일에 섬유 매체를 제거 하 고 초기 신경 변환 매체의 500 µ L 추가 ( 표 1참조).
- 일주일에 2 ~ 3 배, 225 µ L 우물에서 오래 된 매체의 및 추가 기능에서 250 µ L 신선한 초기 신경 변환 매체의 꺼내 주세요.
- 18 일에 각 우물에서 매체의 모든을 제거 하 고 늦은 신경 변환 매체의 500 µ L를 바꿉니다 ( 표 1참조).
- 늦은 신경 변환 매체 이상으로 매체의 절반 하루 25 또는 실험 끝점 (그림 1A)까지 2-3 일 마다 변경 하려면 계속.
참고: 셀에 실험에 대 한 모든 잘 하지 도금은, 경우 채울 빈 우물 PBS 또는 물 매체의 명백한 증발을 방지 하기 위해 웰 스 사이 변이 최소화.
| 사진 농도 | 작업 농도 | |
| 섬유 매체 | ||
| 기저 매체 | N/A | N/A |
| 페니실린/스 | 10000 U/mL | 100 mg/mL |
| FBS | N/A | 10% |
| 매체를 동결 | ||
| 섬유 매체 | N/A | 45% |
| FBS | N/A | 45% |
| DMSO | N/A | 10% |
| 이른 신경 변환 매체 (ENM) | ||
| 신경 감 별 법 매체 | N/A | N/A |
| 페니실린/스 | 10000 U/mL | 100 mg/mL |
| CHIR99021 | 10 m m | 2 Μ M |
| SB-431542 | 20 mM | 10 Μ M |
| 머리 | 100 µ g/mL | 0.5 µ g/mL |
| LDN-1931189 | 10 m m | 0.5 Μ M |
| VPA | 1 M | 1mm |
| LM-22A4 | 20 mM | 2 Μ M |
| GDNF | 20 µ g/mL | 2 ng/mL |
| NT3 | 10 µ g/mL | 10 ng / µ l |
| db-캠프 | 50 mM | 0.5 m m |
| 늦은 신경 변환 매체 (LNM) | ||
| 신경 감 별 법 매체 | N/A | N/A |
| 페니실린/스 | 10000 U/mL | 100 mg/mL |
| LM-22A4 | 20 mM | 2 Μ M |
| GDNF | 20 µ g/mL | 2 ng/mL |
| NT3 | 10 µ g/mL | 10 ng / µ l |
| db-캠프 | 50 mM | 0.5 m m |
| FACS 버퍼 | ||
| HBSS 1 x [-칼슘, 마그네슘,-페 놀 레드] | N/A | N/A |
| BSA | N/A | 1% |
| DNAase | N/A | 0.05% |
표 1: 구성 사용 하는 다른 미디어의. 섬유 매체를 포함 하 여, 매체, 초기 신경 변환 매체, 늦은 신경 변환 매체, 및 FACS 버퍼 동결이 프로토콜에 필요한 모든 미디어에 대 한 구성의 전체 설명입니다.
6. 유리 Coverslips Electrophysiological 녹음에 대 한
참고: 그것은 실험실 코트, 고글 착용, 장갑, 더블 모든 증기 두건에서 작업을 완료 하 고 좋습니다. 이 프로토콜은 10에서 적응.
- 유리 coverslips 오버랩 없이 유리 접시의 하단에 배치 합니다.
- 일반 실험실 청소 세제 (약 30ml)를 동요 하는 동안 위험 오버플로 없이 coverslips의 모든 잠수함을 추가 합니다. 2 시간에 대 한 느린 속도로 궤도 통에 놓습니다.
- 6 번 (각 30 분) 압력가 이온된 물으로 씻으십시오.
- 2 시간에 대 한 95% 에탄올을 추가 합니다.
- 에탄올을 제거 하 고 coverslips는 건조 때까지 기다립니다.
- 일단 건조, 유리 비 커에는 coverslips를 전송 하 고는 coverslips 잠긴 때까지 70% 질 산을 추가 합니다.
- 60 분 sonicator 욕조에 유리 비 커를 놓습니다.
- 질소 산을 제거 하 고 압력가 이온을 제거 된 물으로 세 번 세척.
주의: 항상 추가할 산 물, 결코 다른 방법으로 주위에이 격렬 한 반응으로 이어질 수 있습니다. - 가능한 비 커에서 물을 제거 하 고는 coverslips; 잠긴 때까지 집중된 한 염 산 (HCI) 추가 비 커와 파라핀 필름 커버 소용돌이 친다.
- 60 분 sonicate (50-60 Hz, 30 W).
- 적절 한 폐기물 저장소로 가능한 곳으로 coverslips에서 많은 HCI를 제거 합니다. 두 번 압력가 이온을 제거 된 물으로 씻어.
- 후드에서 coverslips를가지고 고는 HCI의 모든 제거 될 때까지 20 시간 (또는 이상) 압력가 이온된 물으로 린스.
- 일단 건조, 살 균 24-잘 접시로 coverslips 장소.
- 자외선 (UV) 아래 접시 장소 하룻밤 빛. 다음 날은 coverslips 사용 준비가 되어 있습니다.
참고: 유리 coverslips 사용 중인 경우이 좋습니다 PFL 코팅을 사용 하 여. 단순히 하나의 coverslip (를 사용 하 여 살 균 겸) 24-잘 접시의 각 음에 놓고 아래와 같이 프로토콜을 따릅니다.
7. PFL 코팅 장기 문화에 대 한
- 폴 리-L-ornithine (500 µ L/잘)와 24-잘 접시 코트와 5% CO2에서 37 ° C에서 하룻밤 둡니다.
- 폴 리-L-ornithine 발음 하 고 위에 형태로 상품을 충분히 건조 될 때까지 기다립니다.
- 한 방울 (약 60 µ L) 각각의 센터에서 laminin의 잘 그리고는 coverslip의 전체 표면을 커버를 확인 합니다. 5% CO2에서 37 ° C에서 2 h 45 분 동안 둡니다.
- DPBS 세 번 씻어.
- Fibronectin (500 µ L/잘)을 추가 하 고 5% CO2에서 37 ° C에서 하룻밤 둡니다.
- 씻어 한번 DPBS 셀을 추가 하기 전에.
참고: PFL 코팅 진보적인 세포 죽음 하루 30에서에서 예상 되는 기능 (100 일 이상), 긴 기간 문화에 대 한 사용할 수 있습니다.
8입니다. FACS
참고: FACS 후 셀을 다시 접시를 정렬 PFL 코팅 판 48 h에 사전 준비. 변환에 따라 이후 하루 20에서에서 신경 세포 접착 분자 (여) 항 체를 사용 하 여 셀을 정렬할 수 있습니다.
- 1000 µ L 피 펫으로 미디어를 제거 (세척 하지 세포 분리를 피하기 위해).
- 에이전트 (250 µ L/잘) 해리 셀 추가, 단일 셀으로 셀 리프트를 플 로트 때까지 10-20 분 동안 둡니다.
- 이 시간 동안 FACS 버퍼를 준비 합니다.
- 부드럽게 1000 µ L 피 펫으로 triturate. 일부 수 풀 남아 있으면 조금 더를 품 어.
- 단일 세포 현 탁 액을 얻은 우물에서 그것을 제거 하 고 1.5 mL 튜브에 배치.
- 동일한 1.5 mL 튜브에 늦은 신경 변환 매체와 장소 두 번 우물 밖으로 플러시.
- 5 분에 대 한 400 x g에 아래로 회전 하 고는 상쾌한 삭제.
- FACS 버퍼의 200 µ L에서 셀 펠 릿을 resuspend.
- 5 분에 대 한 400 x g에서 셀 아래로 회전 시키십시오 그리고 삭제는 상쾌한.
- 8.8-8.9 단계를 두 번 반복 합니다.
- 얼음에 15 분 동안 1시 50분의 농도에 인간 CD56 (여) 항 체를 포함 하는 FACS 버퍼의 50 µ L에서 셀 펠 릿을 resuspend. 빛 으로부터 보호 합니다.
- 5 분에 대 한 400 x g에서 셀 아래로 회전 합니다.
- 세척 하 고 5 분 동안 400 x g에서 셀 아래로 회전 200 µ L FACS 버퍼에 resuspend.
- 8.13 단계를 반복 합니다.
- FACS 버퍼를 포함 하는 propidium 요오드 화물 (PI; 10 µ g/mL)의 200 µ L에서 resuspend. 여 긍정적인 (iNs) 및 PI 부정적인 (라이브) 셀 FACS 보안 항 체 또는 PI 얼룩이 않을 했다 제어 샘플의 형광 강도 수준에 따라 게이팅 하 여 정렬 합니다.
- 튜브 늦은 신경 변환 매체를 포함 하 여 긍정적인 세포를 수집 합니다.
- PFL 코팅 접시에 늦은 신경 변환 매체에 사용 하는 자동화 된 셀 카운터 및 다시 접시 셀 고밀도 (50, 000 셀/cm2)에 셀을 계산.
- 계속 실험 끝점 (그림 1A)까지 2-3 회 말 신경 변환 매체와 매체의 절반을 변경 합니다.
Representative Results
셀 형태에 명확한 변경 일 이후 5 (그림 1B)에서 표시 되어야 합니다. 비록 명백 하지 일부 세포 죽음 바이러스 성 변환 후 예상 될 것입니다. 24-잘 접시에 각 우물에서 20000-40, 000 셀의 요약 셀 항복 하루 25의 약 절반 해야 되고있다 뉴런에 의해 예상 되어야 한다. 그것은 중요 수율 및 순도 질병 상태와 바이러스 일괄 처리 뿐만 아니라 셀 라인에서 달라질 수 있습니다.
셀 것 이다 성숙한 신경 원 형태학을 전시 뿐만 아니라 25 날에 MAP2와 타우 (그림 1C)을 포함 하 여 대부분의 표준 신경 마커를 표현 하 고. FACS 마커 보안에 기반 하 여 인구에 있는 순수한 얻을 수 있다 (참조8,11참조). 셀 그 후 도금 될 수 있다도 다시 PFL 트리플 코팅에 (참조10참조) 또는 직접 바이오 분석 냉동.
셀 정렬 되지 않습니다, 만약 MAP2 또는 타우 면역 형광 라벨 해야 될 수행 성공적으로 변환된 셀을 식별 하 고 공동 관심사의 단백질 표시.
그림 1: 진화 시간이 지남에 변환의. (A) 실험 및 lentivirus 성인 인간 피부 섬유 아 세포를 다시 프로그래밍 하는 데 사용에 패키지 구성의 지도의 타임 라인. 각 검은 화살표 중간 변화를 나타냅니다. (B) 0 하루에 22 (각 패널의 오른쪽 상단 모서리에 표시) 한 대로 하루 사이 변환 과정에서 세포의 형태학에 있는 변화를 묘사 하는 대표적인 단계 대조 이미지. 이미지 10 X 목표를 사용 하 여 단계 대조 현미경에 찍은. (C)는 타우와 MAP2 더블 얼룩이 지기의 하루 35 후 변환에서 면역 형광 이미지. 셀 4 %paraformaldehyde 고정 되었고 permeabilized 0.1 %10 분 셀 DPBS에 트리톤 DPBS에서 5% 혈 청 솔루션에서 30 분 차단 했다. 항 체 솔루션을 차단에 희석 되었고 4 ° c.에 하룻밤 적용 이차 항 체 Fluorophore 활용 솔루션을 차단에 희석 되었고 적용을 위한 2 헤 셀 DPBS와 3 세척 뒤 15 분 DAPI와 counterstained 했다. 이미지 20 X 목표를 사용 하 여 거꾸로 형광 현미경에 찍은. 바 규모 = 100 µ m (B, C). 약어: ENM: 초기 신경 매체; LNM: 늦은 중간 신경 집. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
방법 프로그래밍이 한 스텝/한 벡터 인간 성인 섬유 아 세포에서 기능을 얻을 수 있는 효율적인 방법을 제공 합니다. 인간 성인 섬유 아 세포는 일반적으로 훨씬 더 어렵다 은밀한 태아 섬유 아 세포 보다 이전 약 5-1012,13의 효율을 보고 하는 제한 된 연구와 함께. 그러나,이 새로운 프로토콜의 약 508(MAP2 + 셀으로 측정 되는) 신경 수익률 달성 가능 하다. 또한, 우리의 프로토콜 변환의 효율성의 손실 없이 여러 번을 passaged 되어 피부 섬유 아 세포에 사용할 수 있습니다. 지금까지 셀 변환 효율의 감소를 감지 하지 않고 14 번까지 passaged 사용 했습니다. 또한, 우리 손에 52과 87 사이 나이의 기증자 로부터 섬유 아 세포와 효율성을 프로그래밍에 차이가 있다. 나이 및이 구조와 테스트 다른 셀 라인의 질병에 대 한 자세한 내용은 참조8을 참조 하십시오. 다른 연구는 또한 0과 89 년4사이의 기증자와 lentiviral 기반 및 작은 분자 향상 된 프로토콜을 사용 하 여 변환 효율에 차이가 보고. 또한, miRNA 기반 신경 프로그래밍으로 일관 된 적용 0과 86 년7사이의 기증자와 모든 연령대의 섬유 아 세포에 보고 되었습니다. 이 경로 통해 성숙한 뉴런은 약 12-15 주 동안에서 생체 외에서 또는 vivo에서이식8다음 약 8 주에 얻어질 수 있다. 이것은 유리한 질병과 환자에 대 한 액세스를 제공 하기 때문에 쉽게 액세스할 수 있는 조직에서 특정 인간의 기능. 이 프로토콜은 효율적입니다, 하지만 그것은 100% 신경 수확량을 생산 하지 않습니다 그리고 같은 예를 들어 FACS를 사용 하 여 정화 단계는 필요.
이 프로토콜 내에서 가장 중요 한 단계는 바이러스 성 변환 (프로토콜 섹션 4) 이다. 그것은 바이러스 titer 정확한 변환에 대 한 aHDFs의 정확한 수를 도금 하는 데 이외에 중요 합니다. 이 프로토콜 사용 하기 위해 권장된 titer 4 × 108 4 x 109사이입니다. 1 x 108 아래 아무것도 titer를 사용 하 여 대량의 바이러스는 세포에 독성 것 추가 권장 하지 것 이다. 또한,는 섬유 아 세포 기능에는 비밀을 시작으로 그들은 더 허약 하 고 운동에 취약 될 것입니다. 셀을 너무 많이 방해를 미디어 변경할 때 부드러운 것이 필수적입니다. 이 천천히 1000 µ L 피 펫으로 액체를 제거 하 여 수행할 수 있습니다. 마지막으로, (프로토콜 섹션 3) 프로그래밍에 대 한 도금 하는 경우 그것은; 실험을 시작 하기 전에 건강 한 섬유 아 세포 인구를 보장 하는 것이 중요 이 trypan 푸른 얼룩과 90%의 세포 생존 능력에 의해 표시 됩니다. aHDFs 95 %confluency 도달 하기 전에 항상 passaged 한다.
바이러스 성 변환 하기 전에 눈에 띄는 세포 죽음 경우 변환 시작 하지 마십시오: 더블 체크는 세포 생존 능력 90% 이상 이며 접시의 코팅으로 아무런 문제가 됐다. 그러나 그것 바이러스 성 변환에 따라 세포 죽음의 작은 금액을가지고 것으로 예상 된다,,이 해서는 안 중요 합니다. 이 경우에, 정확한 시드 50000 aHDFs/잘 확인 하 고 바이러스 titer를 확인 하십시오. 변환 하는 동안 우물 사이 눈에 띄는 불일치가 있는 경우 먼저 미디어의 동일한 금액을 포함 하는 모든 잘 및 명백한 증발 가장자리에서 발생 하지 (해당 되는 경우 필요한 추가 미디어 지 웰 스를 추가할 수 있습니다) 확인 합니다. 또는 단계 4.4, 확인 하 고 시험 유형이 같은 서 스 펜 션에 대 한 적절 한 혼합을 보장. 그것은 우물에 이것을 추가 하기 전에 먼저,는 lentivirus 매체에 추가 중요 합니다. 직접 lentivirus 우물에 추가 잘 잘 가변성 증가 되며 또한 세포에 독성이 있을 가능성이 있습니다. 마지막으로, 항상 확인 매체는 셀에 추가 하기 전에 37 ° C로 예 열 합니다.
이 프로토콜 기능 및 신경 순도 높이기 위해 정렬 FACS의 긴 기간 문화에 대 한 코팅 조건에 대 한 옵션 섹션을 포함 되어 있습니다. 실험의 기능 특성을 조사 하고자, 전기 생리학에 대 한 유리 coverslips의 준비에 대 한 프로토콜도 포함 되었다. 여기 변환 프로토콜; 24-잘 접시와 함께 사용 하기 위해 설정 이 6, 12, 48, 수정할 수 있습니다 원하는 경우 96 잘 접시 또는 플라스 크. 이 경우에, 격판덮개 또는 활용 하는 플라스 크의 표면에 모든 볼륨을 조정 하십시오.
이 프로토콜 사용 하 여 조합에 Ascl1 와 Brn2 의 강제 식 나머지 최저와 모든 패키지에 하나의 단일 벡터8 팬 신경 표현 형의 기능을 생성. 그러나이 방법으로 어떤 폐해의 세대, 있다 하지 되었습니다 평가. 이 방법은 따라서 다른 재활 요소 하위 특정 신경 세포를 사용 하기 위해 수정할 필요가 있다. 직접 프로그래밍 이전 모터 신경, 감각 신경, 대뇌, striatal 중형 가시 신경 세포와 dopaminergic 신경10,14생성 하는 가능성을 보이고 있다. 이 특정 신경 하위 우선적으로 영향을, 예를 들어 파 킨 슨 병 및 dopaminergic 신경 신경 질환을 조사할 때 유리할 것 이다.
아주 최근까지, 직접 신경 재활 기술 허용 하지 않았다 기능의 생산에 대 한 표준화 되 고 효율적인 방식으로-독성 및 약물 대규모 분석 심사에 필요한 수준에. 이 새로운 방법은 매우 효율적 이며 그것은 지금 이러한 제한을 제거 하 고 환자가 특정 될 수 있는 시스템에 뿐만 아니라 인간의 신경 시스템에 뿐만 아니라, 연구의 광대 한 배열에 대 한 열립니다 되도록 여러 번 passaged 되었습니다가지고 fibroblasts에 사용할 수 있습니다. 이 방법의 단순 사내 비슷한 연구를 수행 하고자 하는 어떤 그룹에 대 한 접근에 기술을 렌더링 하 고 쉽게 사용 될 수 뿐만 아니라 마약 검사 및 독성 분석 실험, 등 대규모 생물 의학 응용 프로그램에 대 한 뿐만 아니라 지원 하기 위해 데이터 모델 동물 및 인간의 사후 조직 샘플에서 파생.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리는 기술 지원에 대 한 마리 페르손 Vejgården 감사합니다. 이러한 결과 연구 뉴욕 줄기 세포 재단, 유럽 연합의 7 차 프레임 워크 프로그램에서 유럽 연구 위원회에서에서 자금 받았다: FP/2007-2013 신경 줄기 세포 수리 (no. 602278) 및 ERC 부여 계약 없음. 30971, 스웨덴 연구 위원회 (부여 계약 521-2012-5624, 2016-00873 및 70862601 / Bagadilico), 스웨덴 파 킨 슨 병 재단 (Parkinsonfonden), 그리고 룬 드 대학 Multipark (종합 연구에서 전략적 연구 분야 파 킨 슨 병의 질병)입니다. 쟈 넬 드루-Ouellet 캐나다 연구소의 건강 연구 (CIHR) 친교 (#358492)에 의해 지원 됩니다 그리고 로저 바 커 지원 되는 대학의 케임브리지/Addenbrooke의 병원에는 NIHR 생물 의학 연구 센터 그랜트에 의해. 마린 Parmar 뉴욕 줄기 세포 재단 로버트 슨 탐정입니다. 셸 비 Shrigley Marie Skłodowska 퀴리 혁신적인 교육 네트워크 및 부여 계약 번호 676408에서 유럽 연합 수평선 2020 프로그램 (H2020-MSCA-ITN-2015)에 의해 자금이 다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Lines | |||
| Adult human dermal fibroblasts | [C2 passage #7] Donor was a 67 year old female. Cells obtained from the Parkinson’s Disease Research and Huntington’s disease clinics at the John van Geest Centre for Brain Repair (Cambridge, UK). | ||
| Reagents for Fibroblast Culture, Transduction and Conversion | |||
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) [-CaCl2, -MgCl2] | Gibco | 14190094 | |
| Trypsin-EDTA [0.5%] | Gibco | 15400-054 | Dilute to 0.05% in DPBS. |
| Virkon (agent used to neutralize virus) | Viroderm | 7511 | Dilute to 1% solution with warm water. |
| Milli-Q Water | Millipore | ||
| Basal medium - Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) + GlutaMax | Gibco | 61965059 | |
| Penicillin/Streptomycin [10,000 U/mL] | Gibco | 15140-122 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| CryoMACS® dimethyl sulfoxide (DMSO) 10 | Miltenyi | 170-076-303 | |
| Neural differentiation medium - NDiff 227 | Takara-Clontech | Y40002 | |
| LM-22A4 | Tocris | 4607 | Dilute 10 mg in 1450 µL DMSO. Stock concentration: 20 mM. |
| Glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) [recombinant human] | R&D systems | 212-GD-010 | Dilute 10 ug in 500 µL 0,1% BSA in DPBS. Stock concentration: 20 µg/mL. |
| NT3 [recombinant human] | R&D systems | 267-N3-025 | Dilute 25 µg in 2,5 mL 0,1% BSA in DPBS. Stock concentration: 10 µg/mL. |
| db-cAMP | Sigma Aldrich | D0627 | Dilute 1 g in 40,7 mL Milli-Q water. Filter and make 500 µL aliquots or stock tubes of 10 mL. Stock concentration: 50 mM. |
| CHIR99021 | Axon | 1386 | Dilute 2 µg in 429,8 µL DMSO. Stock concentration: 10 mM. |
| SB-431542 | Axon | 1661 | Dilute 5 mg in 595 µL DMSO. Stock concentration: 20 mM. |
| Noggin [recombinant human] | Miltenyi | 130-103-456 | Dilute 100 µg in 100 µL of Milli-Q water + 900 µL 0,1% BSA in DPBS. Stock concentration: 100 µg/mL. |
| LDN-193189 | Axon | 1509 | Dilute 2 mg in 360 µL DMSO. Stock concentration: 10 mM. |
| Valproic acid sodium salt (VPA) | Merck Millipore | 676380 | Dilute 5 g in Milli-Q water to acheive a stock concentration of 1 M. CAUTION: Avoid ingestion, contact with skin, and breathing dust formation. |
| Reagents for Coatings | |||
| Gelatin | Sigma Aldrich | G2500 | Dilute to 0.1% in Milli-Q water. |
| Poly-L-ornithine | Sigma Aldrich | P3655 | Dissolve in Milli-Q water. Use at 15µg/mL. |
| Fibronectin | ThermoFisher Scientific | 33010-018 | 2 mL of Milli-Q water + 70 µL 0,25 M NaOH. Use at 5 µg/mL. |
| Laminin | ThermoFisher Scientific | 23017-015 | Store at -80°C. Thaw on ice, keep cool and aliquot 30 µL. Use at 5 µg/mL. |
| Reagents for Fluorescence Activated Cell Sorting | |||
| Cell dissociation agent - Accutase (Stem Pro) | ThermoFisher Scientific | A1110501 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) 1X [-calcium, -magnesium, - phenol red] | ThermoFisher Scientific | 14175-046 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153 | Use at 1% concentration for Anti-Human CD56 (NCAM). |
| DNAase | Sigma Aldrich | DN-25 | Use at 0.05% concentration. |
| Anti-Human CD56 (NCAM) Antibody [Mouse] | BD Pharmingen | 555518 | Use at 1 : 50. |
| Propidium iodide | Sigma Aldrich | P4170 | Dilute to 1mg/mL in PBS and keep sterile. Use at 1:1000 to achieve a concentration of 10µg/mL. |
| Reagents for Glass Coverslips | |||
| Autoclaved deionized water | |||
| Alconox detergent | Sigma Aldrich | Z273228 | |
| Ethanol 95% | |||
| Nitric Acid | Sigma Aldrich | 438073-M | CAUTION: Concentrated nitric acid is highly corrosive, and its vapours are potentially harmful. |
| Concentrated hydrochloric acid (HCI) | CAUTION: Concentrated hydrochloric acid is highly corrosive, and its vapours are potentially harmful. | ||
| Reagents for Immunocytochemistry | |||
| Paraformaldehyde (PFA) | Merck Millipore | 1040051000 | Use at a concentration of 4%. CAUTION: PFA is a potent fixative. Avoid ingestion and contact with skin |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | 10254640 | Use at a concentration of 0.1%. |
| Serum [Donkey] | Merck Millipore | S30-100ML | |
| Anti-MAP2 Antibody [Chicken] | Abcam | ab5392 | Use at a concentration of 1 : 5,000. |
| Tau HT7 Monoclonal Antibody [Mouse] | ThermoFisher Scientific | MN1000 | Use at a concentration of 1 : 500. |
| Cy3 Anti-Chicken Antibody [Donkey] | Jackson ImmunoResearch | 703-165-155 | Use at a concentration of 1 : 400. |
| Alexa Fluor488 Anti-Mouse Antibody [Donkey] | Jackson ImmunoResearch | 715-545-150 | Use at a concentration of 1 : 400. |
| 4′,6-Diamidine-2′-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma Aldrich | D9542 | Reconstitute the powder in Milli-Q water to 1 mg/mL. Aliquot and store at -20°C, light sensitive. Use at a concentration of 1 : 500. |
| Equipment | |||
| T75 flask [Nunclon Delta Surface] | ThermoFisher Scientific | 156499 | |
| 24-well plate [Nunc] | ThermoFisher Scientific | 142485 | |
| 1.5 mL polypropylene tube | Sigma Aldrich | Z336769 | |
| 15 mL falcon tube | Sarstedt | 62.554.502 | |
| 50 mL falcon tube | Sarstedt | 62.547.254 | |
| CryoPure tube 1.6 mL | Sarstedt | 72.380 | |
| Pippette controller | For pipetting volumes 1-25 mL. | ||
| Sterile serological pipettes: 5, 10 and 25 mL | Sarstedt | 86.1253.001, 86.1254.001, 86.1685.001 | |
| Adjustable volume pipettors: 5, 20, 200, and 1,000 µL | |||
| Sterile pipette tips | For pipetting volumes of 0.5 - 1,000 µL. | ||
| Glass coverslips | NeuVitro | GG-12-1.5-oz | #1.5 thickness, 12mm diameter, 0.5oz, CE certified, fit 24 well plates. |
| Glass dish | Approximately 150mm diameter. | ||
| Glass beaker | Make sure to have an appropriate size beaker for the sonicator bath available. Water from the sonicator bath should not overflow into the glass beaker. | ||
| Parafilm M | VWR | ||
| ThawSTAR Automated Cell Thawing System | BioCision | BCS-601 | |
| Countess II Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Cell counting chambers [50 slides] and trypan blue [0.4%] | ThermoFisher Scientific | C10228 | For use with Countess II Automated Cell Counter. |
| CoolCell Cell LX Controlled-rate Freezing Container | Biocision | BCS-405 | |
| Laminar flow hood | |||
| Humidified 5% CO2 37 °C incubator | |||
| Centrifuge | Suitable for 1,5, 15 and 50 mL tubes. | ||
| Orbital shaker | |||
| Sonicator - Bransonic Model B200 cleaner | Sigma Aldrich | Z305359 | Frequency = 50-60Hz, Amplitude = 30 Watts |
| FACS Aria III cell sorter | BD Pharmingen | ||
| Phase contrast microscope | Olympus | CKX31 | |
| Inverted fluorescence microscope | Leica | DMI6000 B |
References
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