Summary
Doğrudan nöronal yeniden programlama başlangıç somatik hücre çağı korumak neurons oluşturur. Burada, indüklenen nöronlar dermal fibroblastlar yetişkin insan bağış elde oluşturmak için tek bir vektör tabanlı yöntemi açıklanmaktadır.
Abstract
İndüklenen nöronlar (Ins), ürün somatik hücre doğrudan nöronlar için dönüştürülmüş hasta kaynaklı nöronlar kolayca erişilebilir dokudan elde etmek için bir yoldur. Bu yönlendirme yolu olgun nöronlar birkaç birkaç hafta içinde elde edilebilir. Burada, dermal fibroblastlar biyopsi örnekleri yetişkin insan bağış elde bileşenleri almak için basit ve hızlı tek adımlı Protokolü açıklar. Biz dermal fibroblastlar, hisse senedi hücre kültürünü oluşturmak için dondurucu yordamı bakım da dahil olmak üzere işleminin her adımı açıklamak hücreleri yeniden programlama için hem de kültür koşulları dönüştürme işlemi sırasında tohum. Ayrıca, cam coverslips hazırlanması Elektrofizyolojik kayıtlar, uzun vadeli kaplama koşulları ve floresan aktif hücre (FACS) sıralama açıklamaktadır. Biz de örnekler beklenen sonuçları göstermektedir. Burada açıklanan protokol gerçekleştirmek kolay ve uygulanabilir insan fibroblast insan deri biyopsi hastaların çeşitli farklı tanı ve yaş ile üzerinden elde edilebilir. Bu iletişim kuralı Biyomedikal uygulamaları, hastalık modelleme, uyuşturucu tarama ve hedef doğrulama dahil olmak üzere geniş bir dizi için kullanılan bileşenler yeterli miktarda oluşturur.
Introduction
Nörolojik bozukluklar için etkili tedaviler gelişimi sınırlı erişim ile yaşayan insan beyin hücrelerin mekanik çalışmaları ve işlevsel testleri gerçekleştirmek için engel. Yaklaşık on yıl önce bu durum İndüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSCs) teknolojisi1,2gelişimi ile kökten değişti. Bu, birlikte daha iyi normal insan gelişimi sırasında meydana gelen sinir farklılaşma mekanizmaları anlamak ile tanımlanmış ve farklı nöronal alt türlerinden gelen hasta ve hastalık belirli malzeme üretimi için izin verdi. Bu malzeme ile Şimdi hücre içi mekanizmalar nörolojik hastalıklar ve farklı bileşikler potansiyel o patolojik özellikler3hafifletmek için temel eğitim mümkündür.
İPSCs nörolojik alana devrimci olmuştur, önemli bir dezavantajı bu hücrelerin yaşlanma imzalarını gençleşmek nöron ile ilişkili güvenlik açığı korumaz şekilde programlama işlemi sırasında silinir iken 4,5,6yaşlanma. Bu özellik üretilen nöron hücre içi patojenik cascade, özellikle yaşlılık önemli bir risk faktörü olduğu hastalıklar söz konusu olduğunda, bir çok yönünü recapitulating için kritik olmuyor olabilir.
Sinirsel yeniden programlama bir teknoloji nerede somatik hücre doğrudan dönüştürülür içine doğrudan bir sahne orta pluripotent gitmeden içinde. Bu için hasta ve hastalık belirli olabilir insan nöronlar vitro olarak hızlı oluşturulmasını sağlar. Doğrudan yeniden programlama, bir olağanüstü donör hücre başlangıç yaşı korunur ve, oksidatif stres4,7' nin üretim süreçleri gibi yaşlanma onun güvenlik arttı özelliğidir. Alzheimer ve Parkinson hastalığı, gibi Biyomedikal uygulamalar modelleme, ilaç deneyleri ve toksikoloji çalışmalar eleme hastalığı da dahil olmak üzere geniş bir yelpazesi için uygun sonucu olarak, nörolojik hastalıkları olan hastalar INS'den yaşlanma ile ilişkili .
İNs hastalardan yaygın olarak kullanılan nörodejeneratif hastalıklar ile engelledi ana bilmeniz gereken onlar yeniden programlamak kolay değildir ve bu fibroblastlar bir genişlemesi ile daha da zor hale gelir. Sonuç olarak, bu tür uygulamalar için gerekli miktarda hücrelerdeki nesil sadece son8kadar elde edilmiştir değil. Biz şimdi fibroblastlar bağış her yaştan çok verimli bir şekilde yeniden programlamak için basit bir yöntem geliştirdik. Bu yöntem tek bir vektör kullanarak önleyici protein RE1 susturmak transkripsiyon faktörü (REST) bir nakavt ile zorla ifade Ascl1 ve Brn2 nöronal transkripsiyon faktörlerin birleştirir. Burada, Cilt fibroblastlar yaşlı bağışçılardan biyopsi gelen dönüştürülür iNs nesil önde gelen farklı adımları açıklar.
Protocol
Yetişkin dermal fibroblastlar ve Parkinson hastalığı araştırma ve Huntington hastalığı klinikler John van Geest Merkezi beyin tamir (Cambridge, Birleşik Krallık) için elde edilen ve yerel etik onayı (REC 09/H0311/88) altında. Cilt biyopsisi örnekleme yordamı hakkında ayrıntılar için bkz: başvuru8.
1. yeniden programlama için hazırlanması cilt fibroblastlar
- Sistem veya 37 ° C su banyosu çözdürme otomatik bir hücre kullanarak, yetişkin insan dermal fibroblastlar (aHDFs) çözülme ve 200.000 T75 şişeye (olan bir otomatik hücre sayaç sayısı) fibroblast orta 10 mL başına plakası (bkz. Tablo 1) 37 ° c % 5 CO2.
- Tam bir orta değişim fibroblast orta ile ertesi gün gerçekleştirmek.
- Fibroblast orta her 3-4 hücreleri % 95 confluency ulaşana kadar gün değiştirin.
Not: Bir Konfluent şişesi yaklaşık 1.000.000 hücreler içerir. AHDFs bir hücre kültürünü (Bölüm 2) hisse senedi veya doğrudan yeniden kaplama hazır (Bölüm 3) yeniden programlama için inşa etmek için donmuş olabilir.
2. cilt fibroblastlar dondurulması
- Buz ile bir kutu veya buzdolabı 4 ° C'de kontrollü oranlı dondurma konteyner yerleştirin
- 3-5 dk 37 ° C'de % 0.05 tripsin (T75 şişe başına 1,5 mL) hücrelerle ayırmak.
- Fibroblast orta (tripsin (T75 şişe başına her temizlemedeki 3 mL) etkisiz hale getirmek ve iki kez dışarı şişeye hücrelerde temizlenerek 15 mL tüp içinde müstakil hücreleri toplamak için fetal sığır serum (FBS) içeren) ekleyin.
- Otomatik hücre sayaç hücreleri saymak; (önerilen) donma şişe başına yaklaşık 500.000 aHDFs.
- Spin aşağı hücreleri 400 x g 5 min için de.
- Hücre Pelet dondurucu orta 1 mL resuspend (bkz. Tablo 1) ve transfer kriyojenik tüp içine. Tüpler doğrudan kontrol oranı dondurma konteyner yerleştirin.
- -80 ° C'de cihaz gecede buz gibi kontrollü oranı saklayın. Ertesi gün, tüpler-140 ° C dondurucu aktarın ve ihtiyaç kadar depolayın.
3. (gün 1) yeniden programlama için kaplama
Not: Bu bir jelatin kaplama için kısa vadeli deneyleri (30 gün); kullanma için tavsiye edilir Alternatif olarak, uzun vadeli deneyler için bu bir Poli-L-Ornitin, fibronektin ve laminin (PFL) kaplama başlatmak için tavsiye edilir.
- yeniden programlama için aHDFs kaplama önce 60 dk % 0,1 jelatin (250 µL/de) 24-şey plakalı ceket ve 37 ° C'de kuluçkaya
- AHDFs fibroblast medyada Aspire edin. Bir kez DPBS ile yıkayın. 3-5 dk 37 ° C'de % 0.05 tripsin (T75 şişe başına 1,5 mL) hücrelerle ayırmak.
- Tripsin (T75 şişe başına her temizlemedeki 3 mL) etkisiz hale getirmek ve iki kez dışarı şişeye hücrelerde temizlenerek 15 mL tüp içinde müstakil hücreleri toplamak için fibroblast orta ekleyin.
- Spin aşağı vasıl 400 x g 5 dk. atma süpernatant için hücreleri ve hücre Pelet 1 mL fibroblast orta resuspend.
- (Hücre canlılığı trypan mavi ile % 90 üzerinde boyama kaliteli dönüşüm onay) sağlamak için bir otomatik hücre sayaç kullanarak hücreleri saymak.
- Tam bir 24-şey plaka için orta 100.000 hücre/mL süspansiyon (veya 55.000 hücreler/kuyuda gerekli kuyu sayısı ile çarpımına fibroblast orta 550 µL) elde etmek için fibroblast Orta 13.2 mL 1,320,000 hücrelerinin bir süspansiyon hazırlamak.
- Jelatin plaka Aspire edin ve iki kez DPBS ile yıkayın. Her şey için hücre süspansiyon 500 µL ekleyin ve gecede %5 CO237 ° C'de kuluçkaya.
4. viral iletim (0 gün)
Not: Kategori 2 ekipman ve virüsü nötralize etmek için bir ajan kullanımı lentiviral parçacıkları ile çalışma gerektirir. Çift Kişilik Çift eldiven giyiyor da önemle önerilir.
- 13.2 mL fibroblast orta 37 ° C'ye kadar sıcak
- Ascl1 ve geri kalan oda sıcaklığında hedefleme Brn2 iki kısa saç tokası RNA'ların (shRNA) ile transkripsiyon faktörleri içeren bir lentiviral vektör yaz.
Not:8başvurmak için bakın; yapı bir plazmid depoda mevcut olduğunu. Lentiviruses üretmek için yordamı hakkında ayrıntılı bilgi için lütfen9referans bakın. - Lentivirus enfeksiyonu (MOI) çokluğu, aHDFs bulaştırmak için gerekli hacmi olmadan herhangi bir iletim arttırıcılar orta 20 ekleyin.
- 24-şey plaka ortamda lentiviral vektör (500 µL/de) içeren fibroblast orta ile değiştirin ve gecede %5 CO237 ° C'de kuluçkaya.
- Ertesi gün, lentiviral vektör olmadan fibroblast taze orta Wells orta yerine.
Not: Orta 7 gün boyunca bulaşıcı olarak kabul edilir ve bu nedenle, yeterli koruma ve işleme yordamlarını viral iletim takip ilk haftasında kullanılmalıdır.
5. bakım dönüştürme hücre
Not: dönüşüm başladıktan sonra hücre kaldırma için duyarlı; plaka uç ve önlemek için medya kaldırma hücreleri ayırma 1.000 µL pipet kullanın için dikkat ediniz.
- Gün 3, fibroblast orta kaldırın ve erken nöronal dönüşüm orta 500 µL ekleyin (bkz. Tablo 1).
- Haftada 2-3 kez, 225 µL kuyudan eski orta ve eklemek-içinde 250 µL taze erken nöronal dönüşüm orta al.
- Gün 18, tüm Orta her kuyudan kaldırmak ve geç nöronal dönüşüm orta 500 µL ile değiştirin (bkz. Tablo 1).
- Geç nöronal dönüşüm orta ile orta yarısı 2-3 günde 25 gün veya deneme bitiş noktası (şekil 1A) kadar değiştirmek için devam edin.
Not: hücreler her iyi deney için kaplama değil, boş wells orta açık buharlaşma önlemek ve kuyular arasında varyasyon en aza indirmek için PBS veya su ile doldurun.
| Hisse senedi toplama | Çalışma konsantrasyonu | |
| Fibroblast orta | ||
| Bazal orta | N/A | N/A |
| Penisilin/streptomisin | 10.000 U/mL | 100 mg/mL |
| FBS | N/A | % 10 |
| Dondurucu orta | ||
| Fibroblast orta | N/A | % 45 |
| FBS | N/A | % 45 |
| DMSO | N/A | % 10 |
| Erken nöronal dönüşüm orta (ENM) | ||
| Sinirsel farklılaşma orta | N/A | N/A |
| Penisilin/streptomisin | 10.000 U/mL | 100 mg/mL |
| CHIR99021 | 10 mM | 2 ΜM |
| SB-431542 | 20 mM | 10 ΜM |
| Kafa | 100 µg/mL | 0,5 µg/mL |
| LDN-1931189 | 10 mM | 0,5 ΜM |
| VPA | 1 M | 1 mM |
| LM-22A4 | 20 mM | 2 ΜM |
| GDNF | 20 µg/mL | 2 ng/mL |
| NT3 | 10 µg/mL | 10 ng/µL |
| DB-kampı | 50 mM | 0,5 mM |
| Geç nöronal dönüşüm orta (LUH) | ||
| Sinirsel farklılaşma orta | N/A | N/A |
| Penisilin/streptomisin | 10.000 U/mL | 100 mg/mL |
| LM-22A4 | 20 mM | 2 ΜM |
| GDNF | 20 µg/mL | 2 ng/mL |
| NT3 | 10 µg/mL | 10 ng/µL |
| DB-kampı | 50 mM | 0,5 mM |
| FACS arabellek | ||
| HBSS 1 x [- kalsiyum, magnezyum, - fenol red] | N/A | N/A |
| BSA | N/A | % 1 |
| DNAase | N/A | % 0.05 |
Tablo 1: kullanılan farklı medya bileşimi. Fibroblast orta de dahil olmak üzere, orta, erken nöronal dönüşüm orta, geç nöronal dönüşüm orta ve FACS arabellek buz gibi bu protokol için gerekli tüm medya için kompozisyon tam açıklaması.
6. cam Coverslips Elektrofizyolojik kayıtlar için
Not: Bu bir laboratuar önlüğü, gözlük takmak, eldiven çift ve tüm duman başlıklı çalışmaları tamamlamak için tavsiye edilir. Bu 10' dan adapte iletişim kuralıdır.
- Cam coverslips alt çakışma olmadan bir cam tabak koyun.
- Genel laboratuvar deterjan tüm riski taşma olmadan coverslips (yaklaşık 30 mL) sallayarak sırasında daldırın temizlik ekleyin. Yavaş hızda bir orbital Çalkalayıcı 2s için üzerine yerleştirin.
- Altı kez (30 dk her) autoclaved deiyonize su ile yıkayın.
- % 95 etanol 2s için ekleyin.
- Etanol kaldırmak ve coverslips kuru kadar bekleyin.
- Bir kez kuru, coverslips bir cam kabı aktarmak ve coverslips batık kadar % 70 nitrik asit ekleyin.
- 60 dk sonicator banyo cam kabı yerleştirin.
- Nitrik asit kaldırmak ve üç kez autoclaved deiyonize su ile yıkayın.
Dikkat: Bu şiddetli bir tepki neden olabilir gibi her zaman asit su, asla başka bir yol ekleyin. - Kadar su kabı mümkün olduğunca kaldırın ve coverslips batık kadar konsantre hidroklorik asit (HCI) ekleyin; kabı ve parafin film ile kapak girdap.
- 60 dk için solüsyon içeren temizleyicide (50-60 Hz, 30 W).
- Kadar HCI coverslips mümkün ve yer olarak uygun bir atık depo gözüne kaldırın. İki kez autoclaved deiyonize suyla durulayın.
- Coverslips başlık dışarı almak ve tüm HCI kaldırılıncaya kadar 20 kez (veya daha fazla) autoclaved deiyonize suyla durulayın.
- Bir kez kuru, coverslips steril 24-şey kalıplara yerleştirin.
- Ultraviyole (UV) altında tabak koyun gecede ışık. Ertesi gün coverslips kullanmaya hazırsınız.
Not: cam coverslips kullanılıyorsa, PFL kaplama kullanmak için önerilir. Sadece bir coverslip (steril forseps kullanarak) bir 24-şey plaka her kuyunun içine yerleştirin ve iletişim kuralı aşağıdaki gibi izleyin.
7. PFL kaplama için uzun süreli kültür
- Poli-L-Ornitin (500 µL/de) 24-şey plakalı ceket ve 37 ° c % 5 CO2gece bırakın.
- Poli-L-Ornitin Aspire edin ve form damla üstüne kuru olana kadar bekleyin.
- İyi ve coverslip tüm yüzey kapsayacak şekilde yayılmış bir damla (yaklaşık 60 µL) her Center'da laminin olun. 2 saat 45 dk 37 ° c % 5 CO2için bırakın.
- Üç kez DPBS ile yıkayın.
- Fibronektin (500 µL/de) ekleyin ve 37 ° c % 5 CO2gece bırakın.
- Bir kez DPBS ile hücreleri eklemeden önce yıkayın.
Not: 30 günden itibaren beklenen ilerici hücre ölümü olmasına rağmen PFL kaplama bileşenleri (100 gün ve üzeri), uzun dönem kültürleri için kullanılabilir.
8. FACS
Not: hücreleri yeniden FACS sonra plaka için sıralama hazırlamak PFL kaplı plaka 48 saat önceden. Hücreler nöral hücre adezyon molekülü (NCAM) antikor 20 günden itibaren iletim ardından kullanarak sıralayabilirsiniz.
- 1000 µL pipet ile medyayı çıkarın (hücreleri ayırma önlemek için yıkama yok).
- Ajan (250 µL/de) dissociating ekleyin, 10-20 dk için hücreleri Asansör ve kayan nokta kadar tek hücreler olarak bırakın.
- Bu süre zarfında FACS arabellek hazırlayın.
- Yavaşça 1.000 µL pipet ile triturate. Bazı kümeleri kalırsa, biraz daha kuluçkaya.
- Bir tek hücre süspansiyon alındıktan sonra kuyudan çıkarın ve 1,5 mL tüp içine yerleştirin.
- Evet iki kez dışarı ile yıkayın geç nöronal dönüşüm orta ve yer aynı 1,5 mL tüp içine.
- Spin aşağı vasıl 400 x g 5 min için ve süpernatant atın.
- Hücre Pelet FACS arabellek 200 µL içinde resuspend.
- Spin aşağı vasıl 400 x g 5 min için hücreleri ve süpernatant atın.
- 8.8 ve 8,9 adımları iki kez tekrarlayın.
- Hücre Pelet 50 µL FACS arabelleği at 1:50 15 dakika bir konsantrasyon buz üzerinde insan CD56 (NCAM) antikor içeren resuspend. Işıktan korumak.
- Spin aşağı hücreleri 400 x g 5 min için de.
- 200 µL FACS arabelleği yıkamak ve spin 400 x g 5 min için de hücreleri aşağı resuspend.
- 8.13 arasındaki adımları yineleyin.
- FACS arabellek propidium iyodür (PI; 10 µg/mL) içeren 200 µL içinde resuspend. NCAM pozitif (Ins) ve PI negatif (canlı) hücreleri FACS NCAM antikor veya PI ile lekeli değil kontrol örnekleri Floresans yoğunluk düzeyini dayalı geçişi kullanarak sıralayın.
- Geç nöronal dönüşüm orta içeren bir tüp NCAM pozitif hücrelerinin toplamak.
- Geç nöronal dönüşüm orta kaplı PFL tabak içinde bir otomatik hücre sayaç ve yeniden plakası hücreleri bir yüksek yoğunluklu (50.000 hücreleri/cm2) kullanarak hücreleri saymak.
- Orta yarısı deney bitiş noktası (şekil 1A) kadar 2-3 kez bir hafta geç nöronal dönüşüm orta ile değiştirmek için devam edin.
Representative Results
Hücre morfolojisi açık bir değişiklik günden itibaren 5 (şekil 1B) görünür olmalıdır. Bazı hücre ölümü viral iletim sonra beklenen değil açıktan açığa rağmen bir şey. Her şey bir 24-şey plaka üzerinden toplam hücre verim 20,000-40,000 hücre gün 25, bunların yaklaşık yarısı sinir hücreleri haline beklenmelidir. Verim ve saflık hücre çizginin yanı sıra hastalık durumu ve virüs toplu işlemleri ile değişebilir unutmamak gerekir.
Hücreleri MAP2 ve TAU (şekil 1 c) de dahil olmak üzere çoğu standart nöronal işaretleri olgun nöronal Morfoloji sergilenmesi ek olarak günde 25 ifade edecek. Saf bir nüfus içinde marker NCAM dayalı FACS yaparak elde etmek mümkündür (bkz: başvuran8,11). Hücreler bundan sonra da yeniden kaplama PFL üçlü kaplama üzerine (referans10bakın) veya doğrudan biyomoleküler analizleri için dondurulmuş.
Hücreleri sıralanır değil Eğer MAP2 ya da TAU ile ayirt etiketleme olmalı başarıyla dönüştürülen hücrelerini tanımlamak için gerçekleştirilen ve faiz protein ile birlikte etiketli.
Şekil 1: zaman içinde dönüşüm evrimi. (A)zaman çizelgesi deney ve yetişkin insan dermal fibroblastlar yeniden programlamak için kullanılan bir lentivirus paketlenmiş yapı Haritası. Her siyah oku orta bir değişiklik gösterir. (B) temsilcisi faz kontrast görüntüler günden güne (her panelin sağ üst köşesinde belirtildiği gibi) 22 0 arasında dönüştürme işlemi sırasında hücre morfolojisi değişimler gösteren. Görüntüleri faz kontrast 10 X amacı istimal mikroskop alındı. (C) bir TAU ve MAP2 çift gün 35 sonrası iletim boyama ayirt görüntü. Hücreleri % 4 paraformaldehyde sabit ve permeabilized ile % 0,1 Triton DPBS 10 dk. hücrelerin içinde 30 dk içinde DPBS %5 serum çözümde için bloke edildi. Antikorlar çözüm engelleme seyreltilmiş ve gecede 4 ° C'de uygulanan İkincil antikorlar Fluorophore Birleşik çözüm engelleme seyreltilmiş ve 2 h. hücreleri DAPI ile 15 dakika DPBS ile 3 yıkar ve ardından counterstained için uygulanan vardı. Görüntüleri 20 X amacı istimal bir ters Floresans mikroskobu alındı. Ölçek çubukları 100 µm (B, C) =. Kısaltmalar: ENM: erken nöronal orta; LUH: geç nöronal orta. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Discussion
Bu tek-adım/bir vektör yöntemi yeniden programlama iNs insan yetişkin fibroblastlar elde etmek için etkili bir yöntem sağlar. İnsan yetişkin fibroblastlar önceden verimliliği yaklaşık 5-%1012,13raporlama sınırlı çalışmaları ile fetal fibroblastlar gizli normalde çok daha zordur. Ancak, bu yeni iletişim kuralı ile yaklaşık %508(MAP2 + hücreler olarak ölçülür) nöronal bir verim elde etmek mümkündür. Ayrıca, bizim iletişim kuralı birden çok kez dönüşüm verimliliği kaybetmeden pasajlı bu dermal fibroblastlar kullanılabilir. Şimdiye kadar 14 kez dönüşüm verimliliği herhangi bir azalma tespit olmadan pasajlı hücreleri kullandık. Ayrıca, Kendi ellerimizle fibroblastlar yaş 52 ve 87 arasında bağışçılardan verimliliği yeniden programlama içinde hiçbir fark yoktur. Yaş ve diğer hücre hatları ile bu yapıyı test hastalık hakkında daha fazla bilgi için bkz: başvuru8. Diğer çalışmalarda da 0 ile 89 yaşında4arasında bağış ile bir lentiviral tabanlı ve küçük molekül gelişmiş protokolünü kullanarak dönüşüm verimliliği arasında fark yoktur bildirdi. Ayrıca, miRNA tabanlı nöronal yeniden programlama ile tutarlı uygulanabilirliği ile bağış 0 ile 86 yaş7arasında her yaştan fibroblastlar bildirilmiştir. Bu yönlendirme yolu olgun nöronlar yaklaşık 12-15 hafta vitro veya nakli vivo içinde8takip yaklaşık 8 hafta içinde elde edilebilir. Bu avantajlı çünkü hastalığı ve hasta için erişim sağlar kolayca erişilebilir dokusundan belirli insan iNs. Bu iletişim kuralı verimli olmasına rağmen bir % 100 nöronal verim oluşturmaz ve bu nedenle FACS örneğin kullanarak bir arıtma adım gereklidir.
En kritik bu iletişim kuralına viral iletim (iletişim kuralı Bölüm 4) adımdır. Virüs titresi kesin, aHDFs dönüşüm için doğru bir dizi kaplama ek olarak çok önemlidir. Bu iletişim kuralı ile kullanmak için önerilen titresi 4 x 108 4 x 109arasındadır. Bir şey 1 x 108 aşağıda titresi kullanarak virüs geniş hacimli hücrelere toksik ekleme gibi tavsiye edilir değil. Ayrıca, onlar fibroblastlar iNs gizli başladığınızda daha kırılgan ve kaldırma duyarlı olacak. Hücreleri çok fazla rahatsız etmemek için medya değiştirirken nazik olmak esastır. Bu 1.000 µL pipet yavaşça sıvıyla kaldırarak yapılabilir. Son olarak, ne zaman (iletişim kuralı Bölüm 3) yeniden programlama için kaplama bir deney başlamadan önce sağlıklı fibroblast nüfus sağlamak önemlidir; Bu bir hücre canlılığı trypan mavi boyama ile % 90 üzerinde gösterilir. AHDFs her zaman % 95'i confluency ulaşmadan önce passaged.
Viral iletim önce göze çarpan hücre ölümü ise, dönüştürme başlamayan: çift kontrol hücre canlılığı üzerinde % 90 olduğunu ve kaplama plaka ile herhangi bir sorun vardı. Bu viral iletim takip hücre ölümü küçük bir miktar var bekleniyor, ancak, bu önemli olmamalı. Bu durumda, doğru 50.000 aHDFs/kuyu tohum onaylamak ve virüs titresi kontrol edin. Dönüştürme sırasında kuyular arasında göze çarpan tutarsızlık varsa önce her şey medya eşit miktarda içerir ve aleni buharlaşma kenarlarında gerçekleşmiyor (gerekli ilave medya kenar wells eklenebilir eğer) kontrol edin. Alternatif olarak, adım 4.4 denetleyin ve uygun homojen bir süspansiyon için karıştırma ne zaman transducing emin olun. Lentivirus Orta olarak ilk, bu kuyu eklemeden önce eklemek çok önemlidir. Doğrudan lentivirus kuyu ekleyerek iyi-iyi değişkenlik artıracak ve aynı zamanda hücrelere zehirli olması muhtemeldir. Son olarak, her zaman orta 37 ° C-hücrelere eklemeden önce ısındı kontrol edin.
Bu iletişim kuralı iNs ve nöronal saflık artırmak için sıralama FACS uzun vadeli kültür için kaplama koşulları için isteğe bağlı bölümleri içerir. İşlevsel bileşenlerin karakterizasyonu araştırmak isteyen deneyler için Elektrofizyoloji cam coverslips hazırlanması için bir iletişim kuralı da dahil edilmiştir. Dönüştürme iletişim kuralı burada 24-şey plaka ile kullanmak için ayarlanır; Bu değiştirilebilir bir 6 - 12, 48-, için istenirse 96-şey plaka veya şişeler. Bu durumda, tüm birimlere plaka veya kullanılan flask yüzey alanı ayarlayın lütfen.
Bu iletişim kuralı birlikte Ascl1 ve Brn2 ifade zorla bir pan-nöronal fenotip iNs oluşturmak için tüm paket içinde bir tek vektör8 ile dinlenme köşenize kullanır. Bu yöntemle gliyal herhangi bir alt türlerinden nesil ancak, tespit değil. Bu yöntem bu nedenle alt türü belirli sinir hücreleri elde etmek için programlama diğer faktörler ile kullanmak için değiştirilmesi gerekir. Doğrudan yeniden programlama daha önce motor nöronlar, duyusal sinir hücreleri, photoreceptors, striatal orta dikenli nöronlar ve dopaminerjik nöron10,14oluşturmak için olasılık göstermiştir. Bu nörolojik hastalıklar hangi belirli nöronal alt türü tercihen etkilenen, örnek Parkinson hastalığı ve dopaminerjik nöron için soruşturma yararlı olacaktır.
Çok yakın zamana kadar doğrudan sinirsel programlama teknoloji iNs üretimi için standart ve verimli bir şekilde izin vermedi — bir seviyeye toksikoloji ve ilaç deneyleri büyük ölçüde eleme için gereklidir. Bu yeni yöntem çok verimli ve öyle ki şimdi bu kısıtlamalar ortadan kaldırır ve insan sinir sistemi değil sadece, aynı zamanda hasta belirli olabilir bir sistemi çalışmaları, geniş bir dizi için açılır bu çoğu zaman, pasajlı fibroblastlar kullanılabilir. Bu yaklaşım ve sadeliği içinde teknoloji benzer çalışmalar kurum içi gerçekleştirmek isteyen herhangi bir grup için erişilebilir oluşturur ve kolayca uyuşturucu tarama ve toksikoloji deneyleri, gibi büyük ölçekli Biyomedikal uygulamalar için sadece ama aynı zamanda desteklemek için kullanılabilir veri hayvan modelleri ve insan post mortem doku örnekleri elde.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Marie Persson Vejgården teknik yardım için teşekkür ederiz. Bu sonuçlar için önde gelen araştırma New York kök hücre Vakfı, Avrupa Araştırma Konseyi Avrupa Birliği'nin yedinci çerçeve programı altında fon aldı: FP/2007-2013 nöro kök hücre tamir (no. 602278) ve ERC hibe sözleşmesi yok. 30971, İsveçli Araştırma Konseyi (hibe sözleşmesi 521-2012-5624, 2016-00873 ve 70862601 / Bagadilico), İsveçli Parkinson Vakfı (Parkinsonfonden) ve Lund Üniversitesi Multipark (çok disiplinli araştırma, stratejik araştırma alanı Parkinson hastalığı). Janelle Drouin-Ouellet, arayan sağlık Kanada Enstitüleri araştırma (CIHR) Bursu (#358492) tarafından desteklenmektedir ve Roger Barker desteklenmektedir University of Cambridge/Addenbrooke'nın hastaneye bir NIHR Biyomedikal Araştırma Merkezi hibe. Malin Parmar bir New York kök hücre Vakfı Robertson dedektif olduğunu. Shelby Shrigley Marie Skłodowska-Curie yenilikçi eğitim ağı ve hibe sözleşmesi No 676408 altında Avrupa Birliği ufuk 2020 program (H2020-MSCA-ITN-2015) tarafından finanse edilmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell Lines | |||
| Adult human dermal fibroblasts | [C2 passage #7] Donor was a 67 year old female. Cells obtained from the Parkinson’s Disease Research and Huntington’s disease clinics at the John van Geest Centre for Brain Repair (Cambridge, UK). | ||
| Reagents for Fibroblast Culture, Transduction and Conversion | |||
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) [-CaCl2, -MgCl2] | Gibco | 14190094 | |
| Trypsin-EDTA [0.5%] | Gibco | 15400-054 | Dilute to 0.05% in DPBS. |
| Virkon (agent used to neutralize virus) | Viroderm | 7511 | Dilute to 1% solution with warm water. |
| Milli-Q Water | Millipore | ||
| Basal medium - Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) + GlutaMax | Gibco | 61965059 | |
| Penicillin/Streptomycin [10,000 U/mL] | Gibco | 15140-122 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| CryoMACS® dimethyl sulfoxide (DMSO) 10 | Miltenyi | 170-076-303 | |
| Neural differentiation medium - NDiff 227 | Takara-Clontech | Y40002 | |
| LM-22A4 | Tocris | 4607 | Dilute 10 mg in 1450 µL DMSO. Stock concentration: 20 mM. |
| Glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) [recombinant human] | R&D systems | 212-GD-010 | Dilute 10 ug in 500 µL 0,1% BSA in DPBS. Stock concentration: 20 µg/mL. |
| NT3 [recombinant human] | R&D systems | 267-N3-025 | Dilute 25 µg in 2,5 mL 0,1% BSA in DPBS. Stock concentration: 10 µg/mL. |
| db-cAMP | Sigma Aldrich | D0627 | Dilute 1 g in 40,7 mL Milli-Q water. Filter and make 500 µL aliquots or stock tubes of 10 mL. Stock concentration: 50 mM. |
| CHIR99021 | Axon | 1386 | Dilute 2 µg in 429,8 µL DMSO. Stock concentration: 10 mM. |
| SB-431542 | Axon | 1661 | Dilute 5 mg in 595 µL DMSO. Stock concentration: 20 mM. |
| Noggin [recombinant human] | Miltenyi | 130-103-456 | Dilute 100 µg in 100 µL of Milli-Q water + 900 µL 0,1% BSA in DPBS. Stock concentration: 100 µg/mL. |
| LDN-193189 | Axon | 1509 | Dilute 2 mg in 360 µL DMSO. Stock concentration: 10 mM. |
| Valproic acid sodium salt (VPA) | Merck Millipore | 676380 | Dilute 5 g in Milli-Q water to acheive a stock concentration of 1 M. CAUTION: Avoid ingestion, contact with skin, and breathing dust formation. |
| Reagents for Coatings | |||
| Gelatin | Sigma Aldrich | G2500 | Dilute to 0.1% in Milli-Q water. |
| Poly-L-ornithine | Sigma Aldrich | P3655 | Dissolve in Milli-Q water. Use at 15µg/mL. |
| Fibronectin | ThermoFisher Scientific | 33010-018 | 2 mL of Milli-Q water + 70 µL 0,25 M NaOH. Use at 5 µg/mL. |
| Laminin | ThermoFisher Scientific | 23017-015 | Store at -80°C. Thaw on ice, keep cool and aliquot 30 µL. Use at 5 µg/mL. |
| Reagents for Fluorescence Activated Cell Sorting | |||
| Cell dissociation agent - Accutase (Stem Pro) | ThermoFisher Scientific | A1110501 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) 1X [-calcium, -magnesium, - phenol red] | ThermoFisher Scientific | 14175-046 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153 | Use at 1% concentration for Anti-Human CD56 (NCAM). |
| DNAase | Sigma Aldrich | DN-25 | Use at 0.05% concentration. |
| Anti-Human CD56 (NCAM) Antibody [Mouse] | BD Pharmingen | 555518 | Use at 1 : 50. |
| Propidium iodide | Sigma Aldrich | P4170 | Dilute to 1mg/mL in PBS and keep sterile. Use at 1:1000 to achieve a concentration of 10µg/mL. |
| Reagents for Glass Coverslips | |||
| Autoclaved deionized water | |||
| Alconox detergent | Sigma Aldrich | Z273228 | |
| Ethanol 95% | |||
| Nitric Acid | Sigma Aldrich | 438073-M | CAUTION: Concentrated nitric acid is highly corrosive, and its vapours are potentially harmful. |
| Concentrated hydrochloric acid (HCI) | CAUTION: Concentrated hydrochloric acid is highly corrosive, and its vapours are potentially harmful. | ||
| Reagents for Immunocytochemistry | |||
| Paraformaldehyde (PFA) | Merck Millipore | 1040051000 | Use at a concentration of 4%. CAUTION: PFA is a potent fixative. Avoid ingestion and contact with skin |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | 10254640 | Use at a concentration of 0.1%. |
| Serum [Donkey] | Merck Millipore | S30-100ML | |
| Anti-MAP2 Antibody [Chicken] | Abcam | ab5392 | Use at a concentration of 1 : 5,000. |
| Tau HT7 Monoclonal Antibody [Mouse] | ThermoFisher Scientific | MN1000 | Use at a concentration of 1 : 500. |
| Cy3 Anti-Chicken Antibody [Donkey] | Jackson ImmunoResearch | 703-165-155 | Use at a concentration of 1 : 400. |
| Alexa Fluor488 Anti-Mouse Antibody [Donkey] | Jackson ImmunoResearch | 715-545-150 | Use at a concentration of 1 : 400. |
| 4′,6-Diamidine-2′-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | Sigma Aldrich | D9542 | Reconstitute the powder in Milli-Q water to 1 mg/mL. Aliquot and store at -20°C, light sensitive. Use at a concentration of 1 : 500. |
| Equipment | |||
| T75 flask [Nunclon Delta Surface] | ThermoFisher Scientific | 156499 | |
| 24-well plate [Nunc] | ThermoFisher Scientific | 142485 | |
| 1.5 mL polypropylene tube | Sigma Aldrich | Z336769 | |
| 15 mL falcon tube | Sarstedt | 62.554.502 | |
| 50 mL falcon tube | Sarstedt | 62.547.254 | |
| CryoPure tube 1.6 mL | Sarstedt | 72.380 | |
| Pippette controller | For pipetting volumes 1-25 mL. | ||
| Sterile serological pipettes: 5, 10 and 25 mL | Sarstedt | 86.1253.001, 86.1254.001, 86.1685.001 | |
| Adjustable volume pipettors: 5, 20, 200, and 1,000 µL | |||
| Sterile pipette tips | For pipetting volumes of 0.5 - 1,000 µL. | ||
| Glass coverslips | NeuVitro | GG-12-1.5-oz | #1.5 thickness, 12mm diameter, 0.5oz, CE certified, fit 24 well plates. |
| Glass dish | Approximately 150mm diameter. | ||
| Glass beaker | Make sure to have an appropriate size beaker for the sonicator bath available. Water from the sonicator bath should not overflow into the glass beaker. | ||
| Parafilm M | VWR | ||
| ThawSTAR Automated Cell Thawing System | BioCision | BCS-601 | |
| Countess II Automated Cell Counter | ThermoFisher Scientific | AMQAX1000 | |
| Cell counting chambers [50 slides] and trypan blue [0.4%] | ThermoFisher Scientific | C10228 | For use with Countess II Automated Cell Counter. |
| CoolCell Cell LX Controlled-rate Freezing Container | Biocision | BCS-405 | |
| Laminar flow hood | |||
| Humidified 5% CO2 37 °C incubator | |||
| Centrifuge | Suitable for 1,5, 15 and 50 mL tubes. | ||
| Orbital shaker | |||
| Sonicator - Bransonic Model B200 cleaner | Sigma Aldrich | Z305359 | Frequency = 50-60Hz, Amplitude = 30 Watts |
| FACS Aria III cell sorter | BD Pharmingen | ||
| Phase contrast microscope | Olympus | CKX31 | |
| Inverted fluorescence microscope | Leica | DMI6000 B |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
- Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nat Rev Mol Cell Biol. 17, 170-182 (2016).
- Mertens, J., et al. Directly Reprogrammed Human Neurons Retain Aging-Associated Transcriptomic Signatures and Reveal Age-Related Nucleocytoplasmic Defects. Cell Stem Cell. 17, 705-718 (2015).
- Hashizume, O., et al. Epigenetic regulation of the nuclear-coded GCAT and SHMT2 genes confers human age-associated mitochondrial respiration defects. Sci Rep. 5, 10434 (2015).
- Lapasset, L., et al. Rejuvenating senescent and centenarian human cells by reprogramming through the pluripotent state. Genes Dev. 25, 2248-2253 (2011).
- Huh, C. J., et al. Maintenance of age in human neurons generated by microRNA-based neuronal conversion of fibroblasts. Elife. 5, (2016).
- Drouin-Ouellet, J., et al. REST suppression mediates neural conversion of adult human fibroblasts via microRNA-dependent and -independent pathways. EMBO Mol Med. , (2017).
- Tiscornia, G., Singer, O., Verma, I. M. Production and purification of lentiviral vectors. Nat Protoc. 1, 241-245 (2006).
- Richner, M., Victor, M. B., Liu, Y., Abernathy, D., Yoo, A. S. MicroRNA-based conversion of human fibroblasts into striatal medium spiny neurons. Nat Protoc. 10, 1543-1555 (2015).
- Lau, S., Rylander Ottosson, D., Jakobsson, J., Parmar, M. Direct neural conversion from human fibroblasts using self-regulating and nonintegrating viral vectors. Cell Rep. 9, 1673-1680 (2014).
- Pfisterer, U., Wood, J., Nihlberg, K., Hallgren, O., Bjermer, L., Westergren -Thorsson, G., Lindvall, O., Parmar, M. Efficient induction of functional neurons from adult human fibroblasts. Cell Cycle. 10, 3311-3316 (2011).
- Caiazzo, M., Dell'Anno, M. T., Dvoretskova, E., Lazarevic, D., Taverna, S., Leo, D., Sotnikova, T. D., Menegon, A., Roncaglia, P., Colciago, G., Russo, G., Carninci, P., Pezzoli, G., Gainetdinov, R. R., Gustincich, S., Dityatev, A., Broccoli, V. Direct generation of functional dopaminergic neurons from mouse and human fibroblasts. Nature. 476, 224-227 (2011).
- Masserdotti, G., Gascón, S., Götz, M. Direct neuronal reprogramming: learning from and for development. Development. 143, 2494-2510 (2016).
- Pereira, M., Pfisterer, U., Rylander, D., Torper, O., Lau, S., Lundblad, M., Grealish, S., Parmar, M. Highly efficient generation of induced neurons from human fibroblasts that transplantation into the adult rat brain. Sci Rep. 4, 6330 (2014).
