Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

رصد خلية إلى انتقال بروتين بريون مثل المجاميع في Melanogaster المورفولوجية

Published: March 12, 2018 doi: 10.3791/56906
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological Sciences, University of the Sciences

Summary

تتراكم الأدلة تؤيد فكرة أن المجاميع البروتين المسببة للأمراض المرتبطة بأمراض الأعصاب تنتشر بين الخلايا التي تحتوي على خصائص مثل بريون. هنا، يمكننا وصف أسلوب يتيح للتصور من خلية إلى خلية انتشار بريون مثل المجاميع في نموذج الكائن الحي، melanogaster المورفولوجية.

Abstract

تجميع البروتين سمة أساسية لمعظم أمراض الأعصاب، بما في ذلك مرض الزهايمر (AD) ومرض باركنسون (PD)، ومرض هنتنغتون (HD)، والتصلب العضلي الجانبي (المرض). البروتين المجاميع ترتبط ارتباطاً وثيقا بأمراض الأعصاب في هذه الأمراض، وعلى الرغم من أن الآلية الدقيقة الذي يعطل تجميع البروتين الشاذة التوازن الخلوية العادية غير معروف. تظهر البيانات تقديم دعم قوي للفرضية القائلة بأن المجاميع المسببة للأمراض في الإعلان، PD، هد، والمرض لديها الكثير من أوجه التشابه إلى البريونات، وعوامل معدية البروتين فقط مسؤولة عن الاعتلال الاسفنجي. الذاتي تكرار البريونات بقولبة تحويل الإصدارات مطوية أصلاً من البروتين نفسه، مما تسبب في انتشار النمط الظاهري التجميع. كيف البريونات وبروتينات بريون الشبيهة في الإعلان، تحرك PD، عالية الدقة، والمرض من خلية واحدة إلى آخر في الوقت الراهن مجالاً لتحقيقات مكثفة. ويرد هنا، نموذج melanogaster المورفولوجية التي تسمح برصد انتقال بريون--مثل، خلية إلى خلية هونتينجتين المسخ (Htt) المجاميع المرتبطة بهد. هذا النموذج يأخذ استفادة أدوات قوية لمعالجة التعبير التحوير في العديد من الأنسجة المورفولوجية المختلفة ويستخدم بروتين هيولى معلم فلوريسسينتلي مباشرة التقرير بريون مثل نقل متحولة Htt المجاميع. الأهم من ذلك، يمكن استخدام النهج الذي يصف لنا هنا لتحديد الجينات الجديدة والمسارات التي تتوسط نشر المجاميع البروتين بين أنواع الخلايا المتنوعة في فيفو. المعلومات المكتسبة من هذه الدراسات سيتم توسيع الفهم المحدود للآليات المسببة للمرض التي تكمن وراء أمراض الأعصاب، وتكشف عن فرص جديدة للتدخل العلاجي.

Introduction

بريون فرضية تنص على أن الوكيل المعدية مسؤولة عن الاعتلال الاسفنجي (مثلاً، كروتزفيلد-جاكوب لدى البشر، والرعاش في الخراف ومرض الهزال المزمن في الأيائل والغزلان "مرض جنون البقر" في الماشية ) تتألف فقط من البروتين وخالية من الأحماض النووية1. في أمراض بريون، يفترض بروتين بريون الخلوية (PrPج) حظيرة غير أصلية، ومستقرة (PrPSc) هو درجة عالية من بيتا الغنية بورقة، ويمكن نشر الذاتي بتحويل وتوظيف أحادي الحزب الثوريج الجزيئات في اميلويد مستقرة المجاميع. PrPاتفاقية استكهولم تجميعات استخدام هذه الآلية ذاتية لتنتشر بين خلايا مختلفة في الكائن حي، وحتى بين الكائنات الفردية2.

بروتين ميسفولدينج والتجميع أيضا سمة أساسية لمعظم أمراض الأعصاب (مرض الزهايمر (AD) ومرض باركنسون (PD)، ومرض هنتنغتون (HD)، والتصلب العضلي الجانبي (المرض))3. تشكيل جمعيات البروتين مجمعة داخل أو خارج الخلايا في هذه الأمراض يرتبط ارتباطاً وثيقا سيتوتوكسيسيتي4 ، وتقدم على طول مسارات استنساخه للغاية وخاصة بالمرض عن طريق الدماغ على مر الزمن5، 6-أنماط انتشار هذه توحي بأن المجاميع المسببة للأمراض المرتبطة بهذه الاضطرابات خصائص مثل بريون. الآن يوجد دعم قوية لانتقال بريون مثل المجاميع المرتبطة بالإعلان، PD، عالية الدقة، والمرض--أنها تنتشر من خلية إلى خلية وقالب تغيير أحادي أشكال البروتين نفسه في خلايا تتأثر سابقا7، كونفورماشونال 8.

وقد أجريت معظم الدراسات التحقيق في انتشار بريون مثل المجاميع البروتين إلى تاريخ استخدام نماذج الثقافة خلية الثدييات، حيث نقل المجاميع في السيتوبلازم للخلايا ساذجة من الفضاء خارج الخلية أو من خلية أخرى السيتوبلازم9،10،11،،من1213،،من1415، أو عن طريق حقن المواد المحتوية على التجميع في أدمغة الفأر والرصد تجميع مظهر خارج حقن الموقع16،17،،من1819،20،21،22، 23. في الآونة الأخيرة، وقد استخدمت الحيوانات المحورة وراثيا لإثبات أن تنتشر مجاميع داخل الخلايا إلى خلايا أخرى ضمن العقول سليمة24،25،،من2627، 28،،من2930. هنا، نحن تصف طريقة للتصور مباشرة لنقل الكلي بين خلايا فردية في الدماغ سليمة من melanogaster المورفولوجية. أولاً وضعت نماذج المورفولوجية للأمراض عالية الدقة/بوليجلوتاميني (polyQ) منذ ما يقرب من عقدين من الزمان32 من31،، وقد قدم العديد من الأفكار لا تقدر بثمن في الآليات المسببة للمرض التي تكمن وراء هذه الاضطرابات 33-عالية الدقة هو اضطراب الأعصاب موروثة الناجمة عن طفرة مهيمنة جسمية في الجينات التي رموز ل البروتين هونتينجتين (Htt)34. نتائج هذه الطفرة في التوسع في امتداد polyQ قرب ن-تيرمينوس ل Htt تتجاوز عتبة المسببة للأمراض من ~ جلوتامينيس 37، يسبب البروتين ميسفولد و إجمالي35،36. البرية من نوع Htt البروتينات التي تحتوي على < جلوتامينيس 37 في هذا الامتداد تحقيق على إضعاف الأصلي، ولكن يمكن أن يتسبب للتجميع عند الاتصال الجسدي المباشر مع Htt تجميعية "البذور"12،،من2737. يمكننا استغلال هذه هوموتيبيك، تجميع Htt البرية من نوع الأنوية كقراءات لنقل مثل بريون ودخول هيولى متحولة Htt المجاميع الصادرة في الخلايا الأخرى.

تحديد الآليات بالمجاميع التي تشبه بريون السفر بين الخلايا يمكن أن يؤدي إلى تحديد أهداف علاجية جديدة للأمراض المستعصية الأعصاب. ونحن اتخاذ استفادة دورة حياة سريعة، وسهولة الاستخدام، والمقاييس الوراثية من melanogaster المورفولوجية لتحديد الآليات الجزيئية لخلية إلى انتشار متحولة Htt المجاميع. لدينا استراتيجية تجريبية توظف التعبير ثنائي نظامين متاحة المورفولوجيةوالراسخة الخاصة Gal4 المنبع تفعيل تسلسل (Gal4-UAS) نظام38 ووضعت مؤخرا QF-QUAS نظام39. اقتران هذين النظامين مستقلة يسمح تقييد التعبير عن المتسلسلات Htt متحولة والبرية من نوع للسكان خلية متميزة داخل يطير نفسه40. باستخدام هذا النهج، علينا أن ندرس بريون مثل نشر متحولة Htt برصد إعادة توزيع هيولى Htt البرية من نوع من حالته عادة منتشر، والقابلة للذوبان إلى حالة مجمعة، كنتيجة مباشرة للاتصال الجسدي مع متحولة سابق تشكيل Htt تجميع "البذور". يمكن تأكيد تحويل Htt البرية من نوع من المسخ Htt باستخدام الكيمياء الحيوية أو نقل التقنيات الفيزيائية الحيوية التي تقرير تفاعلات البروتين البروتين، مثل الطاقة صدى الأسفار (الحنق)9،،من2741 .

الأهم من ذلك، يمكننا أيضا الوصول إلى عدد كبير من الأدوات الجينية في المورفولوجية لتحديد الجينات و/أو المسارات التي تتوسط بريون مثل انتشار المجاميع البروتين. وقد استخدمنا مؤخرا هذا النهج لكشف النقاب عن دور رئيسي لمستقبلات الكاسح سطح الخلية، دريبر42،43، في نقل متحولة Htt المجاميع من محاور عصبية العصبية لإطلاق متجولة القريبة في المورفولوجية المركزية الجهاز العصبي (CNS)27. وهكذا، يمكن أن تكشف عن النهج الوراثية التصوير القائم والذي يصف لنا هنا المعلومات البيولوجية الأساسية الهامة حول ظاهرة ذات صلة بمرض في البسيطة الاستخدام لكنها قوية طراز الكائن الحي، و المورفولوجية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-اقتران التحوير Htt Gal4 وربع النهائي-بوساطة التعبير في المورفولوجية

  1. جمع و/أو توليد المعدلة وراثيا melanogaster المورفولوجية الأسطر التي تحتوي على الأنسجة الخاصة Gal4 أو ربع النهائي "برامج التشغيل"، فضلا عن الأسطر التي تحتوي على البرية من نوع أو متحولة Htt المتسلسلات المصب Gal4 UAS38 أو QF-QUAS39. التأكد من وجود البروتينات التي يتم التعبير عنها من هذه المتسلسلات تنصهر بالبروتينات الفلورية أو حانمه معلم للسماح للتفريق بين المنتجات التحوير Htt متحولة والبرية من نوع في الطاير نفس. انظر الشكل 1.
    ملاحظة: نحن نستخدم عادة شظايا إكسون 1 Htt الجينات البشرية27. ومع ذلك، بدلاً من ذلك يمكن أن تتولد الذباب وراثيا للتعبير عن أطول Htt الشظايا أو جينات أخرى إذا رغبت في ذلك.
  2. خطة استراتيجية الوراثية مثل هذا سوف يكون أعرب عن المتسلسلات Htt متحولة والبرية من نوع في السكان خلية متميزة، وغير متداخلة.
    1. في حالة حدوث أي تداخل التعبير، سوف يشترك تجميع متحولة والبرية من نوع من البروتينات Htt توليفها في نفس الخلايا ومنع الكشف عن الأحداث مثل بريون. لتجنب هذا الأمر، استخدم ريبريسورس محددة Gal4 وربع النهائي، Gal80 و QS40، على التوالي (الشكل 1). اختيار السائقين Gal4 و/أو ربع النهائي تسيطر تنمويا يمكن أن تساعد على تقييد التعبير متحولة Htt إلى الخلايا بعد الانقسامية، والقضاء على إمكانية أن انقسام الخلية قد تسهم خلية إلى نشر تجميع.
  3. استخدام الظروف القياسية تثقيف، رفيقه الذباب لتوليد ذرية التي تعبر عن متحولة السكان خلية Htt عبر ربع النهائي (أو Gal4) في "مانحة" والبرية من نوع Htt أو عن طريق Gal4 (قطر) في "مستلم" الخلية. انظر الشكل 1 لتخطيطي عرض تركيبة وراثية المحتملة.
    ملاحظة: تشمل السائقين QF و Gal4 التي كانت تستخدم لتوليد البيانات المعروضة في الأرقام 1-4 وفي أعمالنا السابقة نشر27 السائق العصبية (اورن) مستقبلات الشم DA1، Or67d-ربع النهائي، وسائق عموم الدبقية، Gal4 الريبو.
  4. توليد الذباب التحكم بالتوازي التي تعبر عن Htt البرية من نوع في كلا السكان خلية QF والمسمى Gal4.
  5. جمع ذرية من النمط الوراثي المطلوب، وعمر الحيوانات حسب الاقتضاء.

Figure 1
الشكل 1 . النهج الوراثية إلى جانب التعبير عن المتسلسلات Htt متحولة والبرية من نوع استخدام نظم التعبير ثنائي QF-QUAS و Gal4 UAS. "الخلية A،" معلم مشري متحولة Htt بروتين تحتوي على امتداد طول المسببة للأمراض polyQ (Q91) أعرب فيه عن استخدام برنامج تشغيل QF يقع المصب من مروج الأنسجة على حدة ("PA"). في "خلية ب،" يعبر عن Htt البرية من نوع المعلمة يفب المحتوية على امتداد polyQ عادي (Q25) عن طريق برنامج تشغيل Gal4 التي تسيطر عليها المروج الأنسجة الخاصة ب ("فب"). في الأرقام 2-4، واستخدمت Or67d-ربع النهائي لمحرك التعبير QUAS-HttQ91-متشيري في أورنس DA1 والريبو-Gal4 كانت تستخدم للتعبير عن UAS-HttQ25-يفب في كل إطلاق27. الأهم من ذلك، HttQ91-مشري فقط المعرب عنها في الخلايا QF-الإعراب عن حكم التسلسل QUAS وضعت المنبع للتحوير. وبالمثل، فقط أعربت عن HttQ25-يفب عبر Gal4، الذي يسلم على وجه التحديد UAS. إذا تم الكشف عن أي تداخل في توزيع الأنسجة السائقين QF و Gal4، ويمكن إدخال المتسلسلات ترميز QS في التعبير عن Gal4 الخلايا و Gal80 في خلايا معربا عن ربع النهائي. إلحاق علامات البروتين الفلورية إلى البرية من نوع والمسخ Htt يسمح بتمييز البروتينات اثنين أثناء التصوير، والقدرة على قياس الحنق بين أزواج المناسبة المانحة/يقبلون (مثلاً، الحراجية المعتمدة/يفب أو يفب/مشري). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

2-مايكرو-تشريح والتثبيت من العقول الكبار المورفولوجية

ملاحظة: هذا الإجراء التشريح قد تم تعديلها من منشور سابق44، ويمكن استخدامها لإعداد العقول للتصوير إشارة fluorescence مباشرة من اندماج بروتين فلوري Htt. وتناقش التعديلات على الإجراءات التي يمكن إجراؤها إيمونوستينينج العقول في المقطع التالي.

  1. جمع المواد التالية ووضع على الجليد: المالحة مخزنة الفوسفات الذي يحتوي على 0.03% Triton X-100 (برنامج تلفزيوني/T)؛ ميكروسينتريفوجي أنابيب تحتوي على ميليلتر 970 حل مثبت بارافورمالدهيد 4% (PFA) أعد بإضافة 200 ميليلتر 20% منهاج عمل بيجين إلى 770 ميليلتر برنامج تلفزيوني/تي؛ طبق زجاج واضحة تتضمن كذلك؛ بيبيت نقل المتاح؛ ملقط تشريح اثنين (واحد رقم 3 وواحد رقم 5).
  2. تخدير الذباب الكبار استخدام CO2 ونقلها إلى بئر واحدة للطبق الزجاج بالجليد.
  3. استخدام بيبيت نقل، إضافة كمية صغيرة (~ 500 ميليلتر) لبرنامج تلفزيوني/تي الباردة لتتضمن أيضا الذباب، وكذلك فيما يتعلق ببئر فارغة. تجنب إدخال فقاعات كثيرة جداً كما أنها يمكن أن تتداخل مع التشريح.
  4. ضع الصحن الزجاج على سطح مستو تحت مجهر تشريح وضبط التكبير حتى الجسم يطير تملأ مجال الرؤية وهو في التركيز.
  5. وضع زوج من مصادر الضوء gooseneck حيث الضوء هو إلقاء الضوء على جانبي الطبق الزجاج. مرساة أنسجة مختبر مطوية تحت الطبق الزجاج لتجاهل أجزاء الجسم/بشرة خلال التشريح.
  6. استخدام الملقط رقم 3 في اليد غير المهيمنة، نقل ذبابة واحدة إلى "شل" برنامج تلفزيوني/ت. كذلك تحتوي على الطاير بالاستيلاء على عقد من البطن، مع الجانب البطني مواجهة.
  7. حفظ الطاير مغمورة تماما في برنامج تلفزيوني/T، إزالة الرأس يطير مع الملقط رقم 5 في اليد المهيمنة. إدراج تلميح واحد من هذا الملقط تحت بشرة في مساحة صغيرة المتاخمة ململه على جانب واحد من الرأس يطير. تأمين قبضة على رأسه معسر الملقط الاستيلاء على عقد العين من كلا الجانبين.
  8. إزالة الرأس يطير من الهيئة عن طريق سحب الملقط اثنين عن بعضها البعض. التخلص من الجسم يطير في مختبر أنسجة المتمركزة في مكان قريب. الحفاظ على الضغط على الملقط اليد المهيمنة حتى لا تفقد رأسه يطير.
  9. من ناحية موقف طرف واحد من الملقط رقم 3 غير المهيمنة في نفس مساحة صغيرة تحت بشرة على الجانب الآخر من ململه. بمجرد وضعه، قرصه الملقط قبضة العينين في نفس المكان على كلا الجانبين من الرأس.
  10. بمجرد تأمين الخناق على بشرة، اجذب الملقط بعيداً في 180°. وسوف التفكك هذا الإجراء بشرة الرأس دون إلحاق الضرر بالدماغ. تجاهل بقايا بشرة في مختبر أنسجة.
    1. على الرغم من مثالية، بشرة الرأس قد لا يكون تماما إزالة في خطوة واحدة. وفي هذه الحالة، إزالة بشرة القطعة بالقطعة حتى يتعرض الدماغ تماما. الحرص على عدم تلف الدماغ بتجنب الاتصال المباشر مع الملقط.
  11. إزالة الدماغ تشريح من برنامج تلفزيوني/T أما بالاستيلاء على أهولد من القصبة المرفق، أو يسفط الدماغ في الفضاء بين نصائح الملقط بعمل شعري.
    ملاحظة: إزالة القصبة الهوائية اختياري، كما أنه يميل إلى عدم حجب الفصوص باللوامس على السطح الأمامي للمخ حيث أننا عادة الصورة. ومع ذلك، إذا القصبة الهوائية تتداخل مع التصوير، إزالتها بعناية حتى لا تلف الدماغ بهذا التلاعب.
  12. نقل المخ يطير إلى واحدة من الأنابيب ميكروسينتريفوجي التي تحتوي على الحل مثبت على الجليد. ضمان أن الدماغ يفصل من الملقط وهي مغمورة في الحل مثبت.
  13. مرة واحدة وقد تم تشريح جميع العقول، إخضاعها ل "قصيرة-إصلاح" بوضع أنابيب مغلقة على نوتاتور ل ~ 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
    ملاحظة: هذه الخطوة التثبيت القصير يضمن أن العقول هي أسهل للتعامل معها في الخطوات اللاحقة، ولا تلتزم بالجانبين من أنبوب ميكروسينتريفوجي.
  14. إزالة غالبية الحل مثبت مع ماصة P1000 وتخلص منه.
    1. تجنب يسفط العقول من الأنبوب خلال هذا وأي خطوة الغسيل اللاحقة. تعيين P1000 لانخفاض حجم (مثلاً، ميليلتر 650) وإزالة المادة طافية في خطوتين. وبالإضافة إلى ذلك، عقد أنابيب ميكروسينتريفوجي وفقا لمصدر ضوء (مثل أضواء علوية) بينما يسفط لتصور أفضل العقول.
  15. أضف 1 مل من برنامج تلفزيوني جديد/تي للعقول. تغسل بسرعة (< 1 دقيقة) في الظلام، ونضح المادة طافية من العقول، وتجاهل.
  16. تكرار الغسيل مع برنامج تلفزيوني/تي في الظلام في درجة حرارة الغرفة ووفقا للجدول الزمني التالي: 2 يغسل السريع (< 1 دقيقة) 1 × 5 دقائق، 3 × 20 دقيقة ويغسل ح 1 X 1. تأمين قمم في أنابيب ميكروسينتريفوجي ووضع الأنابيب في نوتاتور ما بين يغسل.
    1. إذا كان المطلوب هو تلطيخ DAPI، استبدال الغسيل النهائي ح 1 مع حضانة 1 × 30 دقيقة مع 250 نانوغرام/مليلتر DAPI المخفف في برنامج تلفزيوني/T، تليها 2 X سريعة و 1 × 20 دقيقة يغسل.
  17. بعد الغسيل الأخير، إزالة معظم المادة طافية المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي، مع الحرص على عدم الإخلال العقول، وإضافة 30 ميليلتر من كاشف أنتيفادي والغليسيرول المستندة إلى العقول. تبني في 4 درجات مئوية في الظلام دون حركة على الأقل 1 ح وتصل إلى 24 ساعة.

3-إدخال تعديلات على الفرع 2 للعقول الكبار إيمونوستينينج

ملاحظة: استخدام هذا البروتوكول للتصوير البروتينات غير الفلورية أو لاندماج بروتين فلوري مع الأسفار ضعيفة.

  1. زيادة تركيز X-100 تريتون في برنامج تلفزيوني/T بمقدار 10 إضعاف (برنامج تلفزيوني + 0.3% Triton X-100) لكل خطوة. يضمن هذا يكفي المنظفات بيرميبيليزي أغشية الخلية والسماح لأجسام مضادة للوصول ممنوع داخل الخلايا.
  2. إصلاح العقول في 4% منهاج العمل في برنامج تلفزيوني/تي لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  3. بعد تنفيذ كل من يغسل، احتضان العقول في المخزن حظر-طازج (برنامج تلفزيوني/T + 5% مصل الماعز العادي (خ ع)) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
  4. إزالة وتجاهل المخزن المؤقت حظر. إضافة 0.5 مل من محلول جسم الابتدائي كل أنبوب أعدتها تمييع الأجسام الأولية حسب الاقتضاء في المخزن المؤقت حظر الطازجة كمزيج رئيسي (انظر الجدول للمواد للأجسام المضادة شيوعاً وتخفيف). احتضان العقول في الأجسام الأولية في نوتاتور لمالا يقل عن 24 ساعة عند 4 درجة مئوية في الظلام.
  5. إزالة الحل جسم الأولية من العقول استخدام P1000 ومحمية في أنبوب جديد. أضف 1 مل من برنامج تلفزيوني/تي لغسل الأدمغة.
    ملاحظة: يمكن تخزين حل جسم الأساسية المحجوزة عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أربعة أسابيع. أننا قد بنجاح إعادة تدوير الأجسام الأولية تصل إلى مرتين في التجارب اللاحقة.
  6. غسل الأدمغة بسرعة (< 1 دقيقة) في برنامج تلفزيوني/T، نضح المادة طافية من العقول، وتجاهل. كرر هذا الغسيل السريع مرة أخرى.
  7. يستمر الغسيل مع مل 1 برنامج تلفزيوني/تي في درجة حرارة الغرفة ووفقا للجدول الزمني التالي: دقيقة 1 × 5 و 3 × 20 دقيقة يغسل ح 1 X 1. تأمين قمم في أنابيب ميكروسينتريفوجي ووضع الأنابيب في نوتاتور خلال يغسل.
  8. بعد الغسيل الأخير، إزالة معظم المادة طافية برنامج تلفزيوني/T وإضافة 0.5 مل من محلول الجسم المضاد الثانوي أعدتها تمييع الأجسام المضادة حسب الاقتضاء في المخزن المؤقت حظر الطازجة كمزيج رئيسي (انظر الجدول للمواد للأجسام المضادة شائعة الاستخدام وتخفيف). احتضان العقول في الأجسام المضادة الثانوية عن 24 ساعة عند 4 درجة مئوية في الظلام.
  9. كرر الخطوات من المياه والصرف الصحي في الخطوات 3.5 و 3.6 و 3.7 بعد الحضانة مع الأجسام المضادة الثانوية.
  10. بعد الغسيل النهائي، إزالة غالبية المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي والتأكد من أن جميع العقول وتقع في الجزء السفلي من الأنبوب. إضافة 30 ميليلتر أنتيفادي كاشف للعقول. تبني في 4 درجات مئوية في الظلام دون حركة ح 16-24.

4-الجامعة الدماغ المتزايدة

  1. ضع شريحة مجهر زجاج تحت مجهر تشريح والتسمية مع معلومات تعريف.
    ملاحظة: بدلاً من ذلك، الأدمغة يمكن تركيبة مباشرة على تغطية زجاج الوصول إلى كلا الجانبين من المخ أثناء التصوير. بروتوكول وصف هذا الإجراء المتصاعدة قد نشرت سابقا45.
  2. إزالة العقول من كل أنبوبة ميكروسينتريفوجي استخدام تلميح بيبيت يتثلم (أعدت باستخدام شفرة حلاقة لإزالة الجزء السفلي ~ 1 سم قبالة تلميح ميليلتر 1-200) وتحويلها إلى منتصف الشريحة. نقل ككاشف أنتيفادي قليلاً مع أدمغة قدر الإمكان.
  3. استخدام الملقط لموقف العقول في الاتجاه المطلوب (مثلاً، لافتاً نحو الجزء العلوي من الشريحة والسطح الأمامي مواجهة للتصوير الفص باللوامس الظهرية). عند توجيه العقول، النظر في مسار الضوء من المجهر لاستخدامها للتصوير لهم.
  4. إزالة كاشف أنتيفادي الزائدة من الشريحة استخدام الركن أشار من الأنسجة مختبر مطوية دون الإخلال العقول. السماح للجلوس للشريحة ~ 5-10 دقيقة في الظلام للسماح للعقل المدبر الانضمام إلى الشريحة.
  5. تحيط العقول يطير مع أربع قطع صغيرة من الزجاج المكسور غطاء يوضع على كل جانب من العقل المدبر لتشكيل ساحة ~ 19 مم × 19 مم-ضع حافة واحدة من الزجاج غطاء 22 مم × 22 مم 1.5 رقم خارج واحدة من هذه القطع الصغيرة من الزجاج ، ولطف أقل ساترة عبر العقل المدبر لإكمال الجسر-جبل.
  6. الاستغناء عن كاشف أنتيفادي جديدة لملء السطح تحت ساترة، مع الحرص على عدم الإخلال ساترة أو العقول ببطء. تمحو أي أنتيفادي الزائد استخدام الركن أشار من الأنسجة مختبر مطوية دون الاتصال مباشرة ساترة.
  7. إضافة قطره طلاء الأظافر واضحة، والتجفيف السريع لكل من الزوايا الأربع ساترة. السماح لتجف ل ~ 10 دقيقة. ثم ختم حواف أربعة ساترة مع طلاء الأظافر لإحاطة العقول تماما.
  8. صورة العقول فورا، أو مخزن في 4 درجات مئوية حتى جاهزة.
    1. إذا كان التصوير fluorescence الجوهرية من اندماج بروتين فلوري Htt، صورة العقول داخل ح 24 لأفضل إشارة.

5-التصوير والتحديد الكمي لانتقال بريون مثل المجاميع

  1. الصورة أدمغة المحملة باستخدام مجهر [كنفوكل] مجهزة X 40 أو 60/63 × الهدف النفط لجمع الصور z-شريحة عن طريق منطقة الدماغ حيث يتم التعبير عن السائقين Gal4 وربع النهائي المحدد (الشكل 2أ، ب).
    1. تثير الأنشطار الفلورسنت البروتين أو البروتينات إيمونولابيليد باستخدام الليزر المناسب (مثلاً، 488 نانومتر للتجارة والنقل/يفب/فيتك أو 552 شمال البحر الأبيض المتوسط مشري/Cy3). تعيين windows الكشف عن ذلك التقاط إشارة أثناء إزالة القناة عبر الحديث باستخدام أما نظام كشف طيفي فلوري كحد أقصى أو الفرقة/طويلة تمرير عوامل الانبعاثات المحددة لكل فلوروفوري.
      ملاحظة: أن ننتبه عند التصوير المجاميع البروتين. فمن السهل كسل في وسط كل تجميع تصبح مشبعة، وبخاصة في المجاميع الكبيرة. محاولة للتقليل إلى أدنى حد التشبع في الصورة، ولكن انتبه من خطر فقدان إشارة من أصغر مجمعة الأنواع (الشكل 2ب، ج، د). وستزيد الكثير تشبع خلفية الصورة، مما يجعل من الصعب أكثر تحديد بونكتا معزولة. اختبار إعدادات التصوير مختلفة لتحسين قبل أخذ الصور النهائية في كل مجموعة بيانات.
  2. تحليل البيانات بقياس بونكتا الفردية أما يدوياً بواسطة الانتقال عن طريق z-شرائح فردية (مثل، الشكل 2ج و الشكل 4أ) أو بعد تقديم الشرائح [كنفوكل] في 3 الأبعاد (الشكل 3 أ، ب.)
    ملاحظة: يمكن أن يتم ذلك في "ي الصورة" أو غيرها من برامج معالجة الصور.
    1. إذا كانت المجاميع فصل جيدا وهناك fluorescence خلفية الحد الأدنى، استخدام برمجيات تحليل الصورة بشكل منهجي تحديد وقياس، وتحليل المجاميع متميزة "كائنات" أو "الأسطح" في إعادة بناء ثلاثي الأبعاد (المكدس [كنفوكل] الشكل 3 ب).
      ملاحظة: برامج الإجراءات الموصوفة الخاصة بالصك والبرمجيات المستخدمة هنا (انظر الجدول للمواد).
      1. تصور سلسلة z [كنفوكل] في وضع العرض ثلاثي الأبعاد. استخدام معالج "التحليل" لتحديد المواقع الفردية في قناة محددة (مثل قناة الأحمر HttQ91-مشري المجاميع في الشكل 3). ضبط مستوى العتبة ومرشحات لتمثيل دقيق لجميع المجاميع الحجم تقوم ككائنات فردية في الصورة.
      2. تمكين "تقسيم الكائنات" تحت "ثنائي معالجة قبل تصفية" لفصل المجاميع المرتبطة بشكل وثيق أن يتم دمج أبيرانتلي من قبل خوارزمية البرنامج. علما أن العدد الإجمالي للكائنات والقياسات المرتبطة بها في بند "القياسات."
        ملاحظة: هذا الأسلوب للتحديد الكمي للمسخ Htt المجاميع أنه غير قابلة للامتثال للبروتوكول immunostaining مركز الخلطات اميلويد، ولا يمكن اختراقها للأجسام المضادة. نتيجة لذلك المجاميع تظهر في المجهر كالهياكل الشبيهة بخاتم، وبرمجيات تحليل الصورة غير قادر على تحديد بدقة وتميز هذه الفردية "البقع".
    2. تحديد المجاميع Htt البرية من نوع يدوياً الانتقال خلال z-المكدس وسجل البرية من نوع Htt المجاميع، التأكد من المجاميع لا مزدوج-وسجل في حالة ظهورها في أكثر من شريحة (الشكل 4أ).
      ملاحظة: يمكن استخدام هذا النهج الكمي اليدوي عندما يكون عدد المجاميع في كل مكدس [كنفوكل] معقول (مثلاً، 20-50). كما أنها مفيدة عندما لا يميز برنامج تحليل الصور بونكتا الفردية من إشارة المحيطة بها في نفس القناة (مثلاً، إشارة من Htt البرية من نوع منتشر في الخلايا المجاورة) (الشكل 2ب، ج و الشكل 4 A)-التحديد الكمي للمجاميع Htt البرية من نوع يمكن أيضا أن يكون تحديا نظراً لظهور العديد من الهياكل العادية في الدماغ الشروريه (مثلاً، عمليات الخلية والاشتباكات العصبية). يمكن استخدام التعريب المشارك من إشارات Htt البرية من نوع ومتحولة كمعيار لتحديد؛ ومع ذلك، من الممكن أن تقع بعض Htt متحولة "بذور" الحد الأدنى للكشف عن [كنفوكل]. يمكن استخدام بروتين خلاف Htt لا تجميع في الخلايا المتلقية (مثلالتجارة والنقل) تسمية لا علاقة لها هياكل الشروريه في الدماغ.
  3. استخدام برمجيات تحليل الصورة لأداء مزيد من توصيف المجاميع الفردية. على سبيل المثال، تحديد حجم توزيع المجاميع (الشكل 3ج)، نسبة التعريب المشارك بين المسخ والبرية من نوع Htt البروتينات (الشكل 4أ)، أو قياس تفاعلات البروتين البروتين باستخدام (الحنق مباشرة الشكل 4 ب).
    1. تحديد توزيع حجم بونكتا الفردية باستخدام خوارزمية كشف الموضعي أو السطحي الذي يحدد بدقة جميع المجاميع مرئية في قناة معينة. استخدام برمجيات تحليل الصورة لأخذ القياسات ذات الصلة للبقع أو الأسطح أو على سبيل المثال الحصول على 'إجمالي القطر' (الشكل 3 ج)، 'حجم' المعلومات 'الكثافة' من 'القياسات' في معالج "تحليل" البرامج الموضحة في الخطوة 5.2.1.
      ملاحظة: في الشكل 3جيم، نحن تقرير توزيع أقطار لجميع بونكتا HttQ91-مشري المحددة في الكبيبة DA1 واحد.
    2. تحديد نسبة توطين المشارك بين HttQ25-يفب ومجاميع HttQ91-مشري بتحريك شريحة بشريحة من خلال [كنفوكل] z-كومة (الطريقة الأكثر دقة) يدوياً. ومع ذلك، تأخذ الرعاية لا لحساب المجاميع أي مرتين. لمنع هذا، الاعتماد فقط المجاميع في شريحة معينة z إذا كانت الطائرة من التركيز من خلال المركز للتجميع (الشكل 4أ).
    3. حساب كفاءة الحنق للمحرض HttQ25-يفب المجاميع مع كولوكاليزيد HttQ91-مشري الإشارات باستخدام الأسلوب فوتوبليتشينج يقبلون.
      1. أولاً، إزالة المحتملة عبر الحديث بين القنوات يفب ومشري بإنشاء windows الكشف عن الإشارات مشري فقط ويفب فقط التي تنتج أي إشارة في قناة أخرى. باستخدام هذه الإعدادات، تأخذ 'قبل الصورة' بونكتا HttQ25-يفب الفردية وإشارة HttQ91-مشري المرتبطة بها ( الشكل 4ب).
      2. ثم، فوتوبلياتش متشيري إشارة بضبط الليزر الأحمر (مثلاً، 552 nm) إلى كثافة 100% والفحص حتى الإشارة من ذهب. العودة إلى الإعدادات المستخدمة للحصول 'قبل الصورة'، وتأخذ صورة 'بعد' من بونكتا نفسه (الشكل 4ب).
      3. حساب قياسات كثافة الأسفار لكل بونكتوم قبل وبعد فوتوبليتشينج باستخدام برمجيات تحليل الصورة.
      4. حساب كفاءة الحنق بطرح يفب المانحة fluorescence تقاس 'قبل الصورة' (يفبالأولية) من الأسفار المانحة يفب في 'الصورة بعد' (يفبالنهائي). قسمة هذه القيمة يفبالنهائي، وضرب بواسطة 100.
        ملاحظة: يمكن حساب كفاءة الحنق بكسل بكسل أو الشاملة لكل مجموع HttQ25-يفب (الشكل 4ب). فوتوبليتشينج يقبلون تقنية مفيدة بشكل خاص لحساب الكفاءة الحنق عند إشارة مشري المرتبطة بكل بونكتوم HttQ25-يفب عالية بما فيه الكفاية لإنتاج ديكوينتشينج يفب يمكن اكتشافها بعد فوتوبليتشينج مشري.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الأساليب الموصوفة هنا إنتاج بيانات قوية تثبت بريون مثل نقل المجاميع البروتين Htt من السكان خلية واحدة إلى آخر في الطاير سليمة الجهاز العصبي المركزي. ولوحظ تحويل Htt البرية من نوع من التشتيت إلى الشروريه بالأسفار مباشرة من هذا البروتين الانصهار يفب في إطلاق المستفيدة نتيجة التعبير مشري HttQ91 في أورنس المانحة (الشكل 2أ-ج و الشكل 4أ، ب). الإبلاغ الدقيق بريون مثل نقل الأحداث بين هؤلاء السكان الخلية اثنين يتطلب الاختيار الدقيق للذباب وراثيا والسائقين Gal4/مؤسسة قطر لإنتاج مستويات التعبير القوى من المتسلسلات Htt متحولة والبرية من نوع دون أي تداخل خلال التنمية أو في مرحلة البلوغ. وبالإضافة إلى ذلك، يمكنك تمكين تصميم مدروس المتسلسلات الانصهار Htt بروتين فلوري تحليلات قوية للمتلقين للمعلومات. على سبيل المثال، يمكن أن تكون متحولة والبرية من نوع Htt المجاميع كمياً ككائنات نقطية أما يدوياً (الشكل 2ج و الشكل 4) أو يمكن قياسها باستخدام برمجيات تحليل الصورة (الشكل 3أ، ب)، و تتميز كذلك كإجمالي السكان (الشكل 3ج)، يمكن تقييم للتعريب المشارك بين المسخ والبروتينات البرية من نوع (الشكل 4أ)، ويمكن تحليلها لبكي27 (الرقم 4 ب). تتطلب هذه التحليلات الانصهار Htt متحولة والبرية من نوع إلى علامات البروتين الفلورسنت مع خصائص fluorescence المنفصلين عن ذويهم بما فيه الكفاية، ولكن مع ما يكفي من التداخل الطيفي لتمكين الحنق بين أزواج من المانحين ويقبلون (مثلاً، يفب الحراجية المعتمدة/9 أو مشري يفب/27).

Figure 2
الشكل 2 . صور [كنفوكل] بريون مثل تحويل يفب HttQ25 الدبقية بالخلايا العصبية HttQ91-مشري المجاميع. (أ) الحد الأقصى كثافة الإسقاط من ~ 30 [م] [كنفوكل] شرائح عرض الفص باللوامس واحد من ذبابة ذكور التعبير عن HttQ91-مشري (أحمر) في محاور عصبية اورن DA1 استخدام Or67d QF و HttQ25-يفب (الأخضر) في إطلاق استخدام الريبو-Gal4. يتم الإشارة إلى حدود تقريبية الفص باللوامس والكبيبه DA1، حيث ينهي اورن DA1 محاور عصبية، بخطوط منقطة والصلبة، على التوالي. (ب) أقصى كثافة الإسقاط من ~ 20 ميكرومتر [كنفوكل] شرائح عرض طريقة عرض مكبرة لمنطقة الكبيبي DA1 من (أ) (ج) بمفرده 0.35 ميكرومتر [كنفوكل] شريحة عرض بونكتا HttQ25-يفب واحدة ولها (إشارة HttQ91-مشري المرتبطة بها يشار إليه بالسهم في كل قناة). وتعززت الإشارات في القناة الحمراء لتصور التعريب المشارك بين HttQ25-يفب وإشارات HttQ91-مشري. جميع الصور تم الحصول عليها باستخدام هدفا نفط 40 × 1.4NA. تغيير حجم أشرطة = 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 . تحليل ثلاثي الأبعاد للمجاميع HttQ91-مشري في محاور عصبية اورن DA1- (أ) 3D تصوير للمجاميع HttQ91-مشري المعرب عنها في الكبيبة DA1 عن طريق استخدام نفس البيانات المبينة في الشكل 2بOr67d-ربع النهائي. (ب) لقطة شاشة عرض كائنات فردية أو "البقع" المحددة من البيانات الخام في (أ) باستخدام حزمة برامج تحليل صورة. وحدد البرنامج 56 كائنات ذات أحجام مختلفة في هذه القناة/الصورة. تم قياس الفور أشارت إلى جانب رأس السهم في (ب) أن يكون قطرها ~ 1.2 ميكرومتر. سهام أشر إلى المواقع حيث دمج كائنين غير دقيق في بقعة واحدة من البرمجيات، واحتمالا بسبب القرب من بونكتا الفردية. للتغلب على هذا، ينبغي اختبار إعدادات مستوى العتبة مختلفة في البرنامج و/أو بقع المدمجة ينبغي أن تفصل يدوياً إذا كان ذلك ممكناً. تغيير حجم أشرطة = 10 ميكرون. الرسم البياني (ج) تبين توزيع أقطار بالبرنامج لقياس HttQ91-مشري "البقع" المبينة في (ب). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4 . المشارك من الترجمة والتحليل الحنق من فعل المجاميع يفب HttQ25- (أ) بالمونتاج من 4 0.35 ميكرومتر [كنفوكل] z-شرائح فردية من المخ يطير ذكور التعبير عن متشيري HttQ91 في أورنس DA1 استخدام Or67d QF و HttQ25-يفب في إطلاق استخدام الريبو-Gal4. تم تعديل الإشارات مرئية حتى الصغيرة HttQ91-مشري المجاميع والمستحث HttQ25-يفب المجاميع التي تبرز من المحيطة بإشارة منتشر. شرائح عرض كل مفصولة ب ~ 1.0 ميكرومتر (شريحة الرقم المشار إليه في الزاوية السفلية اليسرى من الصور المدمجة) حيث أنه يمكن ملاحظة المجاميع متعددة. تشير الأسهم إلى بونكتا HttQ25-يفب التي كانت مصممة على أن تكون في أو بالقرب من التركيز في تلك الشريحة-z خاص بتحريك يدوياً من خلال z-المكدس. من بونكتا HttQ25-يفب سبعة المبين هنا، ستة المرتبطة ديتيكتابلي إشارة HttQ91-مشري (أي86 في المائة المجاميع HttQ25-يفب شارك تعريب مع HttQ91-مشري). علما أن إشارة مشري المرتبطة بونكتا HttQ25-يفب في كثير من الأحيان أضعف من أغلبية بونكتا مشري-الإيجابية في الكبيبة DA1. شريط المقياس = 5 ميكرومتر. (ب) A HttQ25 يفب/HttQ91-مشري-co-المترجمة punctum قبل (لوحات اليسار) وبعد فوتوبليتشينج مشري (acceptor) (حق أفرقة). الزيادة الناتجة في الأسفار يفب (المانحين) استخدمت لإنتاج صورة كفاءة (الحنقeff) الحنق بكسل بكسل باستخدام أككببفريت المكونات في إيماجيج46. هذا التجميع خاصة بالحنق العامالمؤسسة من 61 في المائة. مقياس بار = 1 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

كما أن عدد المرضى الذين يعانون من أمراض الأعصاب تواصل الازدياد، هناك حاجة ملحة زيادة فهم الآلية المرضية الجزيئية لهذه الأمراض بحيث يمكن تطوير علاجات أفضل. هنا، نحن تصف الأساليب التي تسمح لرصد انتقال بريون مثل المجاميع البروتين المسببة للمرض بين أنواع الخلايا المختلفة في نموذج الكائن الحي، melanogaster المورفولوجية. وقد استخدمنا هذه المنهجية لإثبات انتقال بريون تشبه المسخ Htt المجاميع في فيفو وتحديد مستقبل متجولة الذي يتوسط انتشار هذه المجاميع من الخلايا العصبية لإطلاق27مؤخرا. نهجنا يستغل العديد من المزايا لاستخدام المورفولوجية لدراسة الأمراض الوراثية البشرية: لها دورة حياة قصيرة ومجموعة أدوات الوراثية الهائلة، والتي يمكن أن تعجل باكتشاف المعلومات البيولوجية الأساسية ذات الصلة علاجية.

أساليب يصف لنا هنا نقدم اثنين من المزايا الرئيسية على الحيوانات الأخرى الموجودة وخلية نماذج الثقافة لانتقال بريون مثل: (1) تجميع المسبّب (مثلاً، متحولة Htt) ينتج في خلية يقيمون في أنسجة سليمة، و (2) يوفر التعبير عن إصدار مطوية عادة من البروتين نفسه (مثلاً، البرية من نوع Htt) في عدد سكان خلية منفصلة يسهل "مراسل" للأحداث مثل بريون. وقد حققنا التعبير متحولة والبرية من نوع Htt البروتينات في الخلية غير متداخلة السكان داخل الكائن الحي نفسه باستخدام أدوات متطورة الوراثية التي راسخة في المورفولوجية40. نظراً لأن العديد من مختلف الأنسجة Gal4 وربع النهائي برامج تشغيل خاصة متوفرة بسهولة، دراسة بريون مثل نقل بين أساسا أي أنواع متميزة من الخلية في جسم يطير ممكناً.

هو تحقيق عنصر حاسم للنهج التعبير المنفصل للمسخ والبرية من نوع Htt البروتينات في خلية مختلفة السكان داخل الحيوان نفسه. أي تداخل التعبير يحتاج إلى القضاء حيث أن دقة التقارير البرية من نوع Htt التجميع في الخلايا المتلقية اختراق هيولى المجاميع مثل بريون منشؤها المانحة الخلايا9،12،، من27 41. يمكن أن يتحقق هذا عن طريق إدخال أدوات وراثية إضافية (مثلاً، ريبريسورس Gal80 و QS40) للتخفيف من حدة هذه المشكلة. حالما يتم تصميم النمط الوراثي المثالي والمحددة، يجب وضع أسلوب منهجي لتحديد كمية بونكتا. وهذا سوف يعتمد إلى حد كبير على عدد الخلايا المسماة، وعدد المجاميع التي تظهر، والإشارات إلى الضجيج نسبة العينة. يمكن استخدام معايير مثل التعريب المشترك و/أو الحنق إيجابية لتحليل البيانات، كما وصفناها هنا في الشكل 4. ومع ذلك، تقييد اختيار Htt البرية من نوع مجاميع استناداً إلى هذه الميزات قد يؤدي إلى استهانة بريون مثل نقل الأحداث، حيث قد تقع بعض البذور التجميعية Htt متحولة الحد الأدنى للكشف عن المجهر [كنفوكل].

في فيفو النهج الموصوفة هنا ليست حصرية للسلوك مثل بريون المجاميع المرتبطة بهد أو حتى اضطرابات أخرى polyQ. يمكن وضع الذباب وراثيا لدراسة انتشار بريون مثل ألفا-سينوكلين في PD، وتاو في الإعلان، و SOD1 أو 43، ماساتشوستس في المرض باستخدام نفس نموذج تجريبي. لكل من هذه البروتينات، ينبغي التعبير عن المسخ معرضة لتجميع في خلايا المانحين، وإصدار قابل لذوبان من البروتين نفسه أنه ينبغي التعبير عن المجاميع فقط عندما المنبسطة في الخلايا المتلقية. كما يمكن أن يكون هذا النموذج التجريبي مفيدة للتحقيق في هذه الفكرة الناشئة أن البروتينات المسببة للأمراض المرتبطة بأمراض مختلفة قد تتفاعل من خلال إليه بذر عبر47. وأخيراً، يمكن تطبيق الأدوات الجينية العديدة المتاحة في المورفولوجية للتحقيق وتحديد الآليات الجزيئية الكامنة وراء انتشار السيتوبلازم إلى السيتوبلازم المجاميع البروتين المسببة للأمراض المرتبطة بهذه الأمراض القاتلة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

ونشكر أعضاء مختبرات كوبيتو ولو بيرس للعديد من المناقشات مفيدة أثناء تطوير هذه الأساليب. ونشكر أيضا تيمسامريت ريان لقراءة نقدية لهذه المخطوطة. الأموال من جامعة العلوم وصناديق خيرية سميث قد أيد هذا العمل.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphate buffered saline (PBS), 10X, pH 7.4 ThermoFisher Scientific AM9625 Dilute to 1X
Triton X-100 Sigma-Aldrich T9284-1L
Kimwipes Thomas Scientific 2904F24
20% paraformaldehyde (PFA) Electron Microscopy Sciences 15713-S
Normal Goat Serum (NGS), filtered Lampire Biological Laboratories 7332500 Aliquot and freeze upon receipt
Chicken anti-GFP Aves Labs GFP-1020 Use at 1:500 dilution
Rabbit anti-DsRed Clontech 632496 Use at 1:2000 dilution; can recognize DsRed-based fluorescent proteins (e.g. mCherry, mStrawberry, tdTomato, etc.)
Mouse anti-Bruchpilot Developmental Studies Hybridoma Bank nc82 Use at 1:100 dilution; will label active pre-synaptic structures thoughout the fly brain
FITC anti-chicken ThermoFisher Scientific SA1-7200 Use at 1:250 dilution
Alexa Fluor 568 anti-rabbit Life Technologies A11011 Use at 1:250 dilution
Alexa Fluor 647 anti-mouse antibody Life Technologies A21235 Use at 1:250 dilution
Slowfade Gold Antifade Reagent Life Technologies S36936
Microscope Slides (25 x 75 x 1.0 mm) Fisher Scientific 12-550-143
Cover Glass (22 x 22 mm) Globe Scientific 1404-15
Dumont Biology Grade Forceps, Style 3 Ted Pella 503 use in non-dominant hand
Dumont Biology Grade Forceps, Style 5 Ted Pella 505 use in dominant hand
LAS X image analysis software Leica
Imaris image analysis software Bitplane

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Prusiner, S. B. Biology and genetics of prions causing neurodegeneration. Annu Rev Genet. 47, 601-623 (2013).
  2. Haïk, S., Brandel, J. P. Infectious prion diseases in humans: Cannibalism, iatrogenicity and zoonoses. Infect Genet Evol. 26, 303-312 (2014).
  3. Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. Adapting Proteostasis for Disease Intervention. Science. 319 (5865), 916-919 (2008).
  4. Stroo, E., Koopman, M., Nollen, E. A., Mata-Cabana, A. Cellular Regulation of Amyloid Formation in Aging and Disease. Front Neurosci. 11, 64 (2017).
  5. Brundin, P., Melki, R., Kopito, R. Prion-like transmission of protein aggregates in neurodegenerative diseases. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (4), 301-307 (2010).
  6. Jucker, M., Walker, L. C. Self-propagation of pathogenic protein aggregates in neurodegenerative diseases. Nature. 501 (7465), 45-51 (2013).
  7. Stopschinski, B. E., Diamond, M. I. The prion model for progression and diversity of neurodegenerative diseases. Lancet Neurol. 16 (4), 323-332 (2017).
  8. Walker, L. C., Jucker, M. Neurodegenerative diseases: expanding the prion concept. Annu Rev Neurosci. 38, 87-103 (2015).
  9. Holmes, B. B., et al. Heparan sulfate proteoglycans mediate internalization and propagation of specific proteopathic seeds. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (33), 3138-3147 (2013).
  10. Munch, C., O'Brien, J., Bertolotti, A. Prion-like propagation of mutant superoxide dismutase-1 misfolding in neuronal cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (9), 3548-3553 (2011).
  11. Nonaka, T., et al. Prion-like properties of pathological TDP-43 aggregates from diseased brains. Cell Rep. 4 (1), 124-134 (2013).
  12. Ren, P. H., et al. Cytoplasmic penetration and persistent infection of mammalian cells by polyglutamine aggregates. Nat Cell Biol. 11 (2), 219-225 (2009).
  13. Trevino, R. S., et al. Fibrillar structure and charge determine the interaction of polyglutamine protein aggregates with the cell surface. J Biol Chem. 287 (35), 29722-29728 (2012).
  14. Volpicelli-Daley, L. A., et al. Exogenous alpha-synuclein fibrils induce Lewy body pathology leading to synaptic dysfunction and neuron death. Neuron. 72 (1), 57-71 (2011).
  15. Zeineddine, R., et al. SOD1 protein aggregates stimulate macropinocytosis in neurons to facilitate their propagation. Mol Neurodegener. 10, 57 (2015).
  16. Ayers, J. I., Fromholt, S. E., O'Neal, V. M., Diamond, J. H., Borchelt, D. R. Prion-like propagation of mutant SOD1 misfolding and motor neuron disease spread along neuroanatomical pathways. Acta Neuropathol. 131 (1), 103-114 (2016).
  17. Clavaguera, F., et al. Brain homogenates from human tauopathies induce tau inclusions in mouse brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (23), 9535-9540 (2013).
  18. de Calignon, A., et al. Propagation of tau pathology in a model of early Alzheimer's disease. Neuron. 73 (4), 685-697 (2012).
  19. Eisele, Y. S., et al. Induction of cerebral beta-amyloidosis: intracerebral versus systemic Abeta inoculation. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (31), 12926-12931 (2009).
  20. Luk, K. C., et al. Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice. Science. 338 (6109), 949-953 (2012).
  21. Meyer-Luehmann, M., et al. Exogenous induction of cerebral beta-amyloidogenesis is governed by agent and host. Science. 313 (5794), 1781-1784 (2006).
  22. Mougenot, A. L., et al. Prion-like acceleration of a synucleinopathy in a transgenic mouse model. Neurobiol Aging. 33 (9), 2225-2228 (2012).
  23. Rey, N. L., et al. Widespread transneuronal propagation of alpha-synucleinopathy triggered in olfactory bulb mimics prodromal Parkinson's disease. J Exp Med. 213 (9), 1759-1778 (2016).
  24. Babcock, D. T., Ganetzky, B. Transcellular spreading of huntingtin aggregates in the Drosophila brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (39), 5427-5433 (2015).
  25. Kim, D. K., et al. Anti-aging treatments slow propagation of synucleinopathy by restoring lysosomal function. Autophagy. 12 (10), 1849-1863 (2016).
  26. Liu, L., et al. Trans-synaptic spread of tau pathology in vivo. PLoS One. 7 (2), 31302 (2012).
  27. Pearce, M. M., Spartz, E. J., Hong, W., Luo, L., Kopito, R. R. Prion-like transmission of neuronal huntingtin aggregates to phagocytic glia in the Drosophila brain. Nat Commun. 6, 6768 (2015).
  28. Pearce, M. M. Prion-like transmission of pathogenic protein aggregates in genetic models of neurodegenerative disease. Curr Opin Genet Dev. 44, 149-155 (2017).
  29. Pecho-Vrieseling, E., et al. Transneuronal propagation of mutant huntingtin contributes to non-cell autonomous pathology in neurons. Nat Neurosci. 17 (8), 1064-1072 (2014).
  30. Wu, J. W., et al. Neuronal activity enhances tau propagation and tau pathology in vivo. Nat Neurosci. 19 (8), 1085-1092 (2016).
  31. Jackson, G. R., et al. Polyglutamine-expanded human huntingtin transgenes induce degeneration of Drosophila photoreceptor neurons. Neuron. 21 (3), 633-642 (1998).
  32. Warrick, J. M., et al. Expanded polyglutamine protein forms nuclear inclusions and causes neural degeneration in Drosophila. Cell. 93 (6), 939-949 (1998).
  33. McGurk, L., Berson, A., Bonini, N. M. Drosophila as an In Vivo Model for Human Neurodegenerative Disease. Genetics. 201 (2), 377-402 (2015).
  34. The Huntington's Disease Collaborative Research Group. A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes. Cell. 72 (6), 971-983 (1993).
  35. Bates, G. P., et al. Huntington disease. Nat Rev Dis Primers. 1, 15005 (2015).
  36. Scherzinger, E., et al. Self-assembly of polyglutamine-containing huntingtin fragments into amyloid-like fibrils: implications for Huntington's disease pathology. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (8), 4604-4609 (1999).
  37. Chen, S., Berthelier, V., Yang, W., Wetzel, R. Polyglutamine aggregation behavior in vitro supports a recruitment mechanism of cytotoxicity. J Mol Biol. 311 (1), 173-182 (2001).
  38. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  39. Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis. Cell. 141 (3), 536-548 (2010).
  40. Riabinina, O., Potter, C. J. The Q-System: A Versatile Expression System for Drosophila. Methods Mol Biol. 1478, 53-78 (2016).
  41. Costanzo, M., et al. Transfer of polyglutamine aggregates in neuronal cells occurs in tunneling nanotubes. J Cell Sci. 126 (16), 3678-3685 (2013).
  42. Freeman, M. R., Delrow, J., Kim, J., Johnson, E., Doe, C. Q. Unwrapping glial biology: Gcm target genes regulating glial development, diversification, and function. Neuron. 38 (4), 567-580 (2003).
  43. MacDonald, J. M., et al. The Drosophila cell corpse engulfment receptor Draper mediates glial clearance of severed axons. Neuron. 50 (6), 869-881 (2006).
  44. Wu, J. S., Luo, L. A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining. Nat Protoc. 1 (4), 2110-2115 (2006).
  45. Tito, A. J., Cheema, S., Jiang, M., Zhang, S. A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains. J Vis Exp. (118), (2016).
  46. Roszik, J., Szöllosi, J., Vereb, G. AccPbFRET: an ImageJ plugin for semi-automatic, fully corrected analysis of acceptor photobleaching FRET images. BMC Bioinformatics. 9, 346 (2008).
  47. Spires-Jones, T. L., Attems, J., Thal, D. R. Interactions of pathological proteins in neurodegenerative diseases. Acta Neuropathol. 134 (2), 187-205 (2017).

Tags

علم الأعصاب، مسألة 133، أمراض الأعصاب، مجموع البروتين، misfolding البروتين، انتقال بريون--مثل، انتشار التجميعية، المورفولوجية، العصبية، وإطلاق، والدماغ
رصد خلية إلى انتقال بروتين بريون مثل المجاميع في <em>Melanogaster المورفولوجية</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Donnelly, K. M., Pearce, M. M. P.… More

Donnelly, K. M., Pearce, M. M. P. Monitoring Cell-to-cell Transmission of Prion-like Protein Aggregates in Drosophila Melanogaster. J. Vis. Exp. (133), e56906, doi:10.3791/56906 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter