Summary
병원 성 단백질 집계 프리온 같은 속성에 포함 된 셀 사이 확산 하는 신경 퇴행 성 질환과 관련 된 아이디어를 지원 증거를 축적 합니다. 여기, 프리온 같은 집계 모델 유기 체 초파리 melanogaster의 셀 확산의 시각화를 가능 하 게 하는 방법을 설명 합니다.
Abstract
단백질 집계 Alzheimer의 질병 (광고), 파 킨 슨 병 (PD), 헌팅턴의 질병 (HD), 그리고 루 경화 증 (ALS)를 포함 하 여 대부분의 신경 퇴행 성 질병의 중앙 특징 이다. 정도 벗어난 단백질 집계 방해 정상적인 세포 항상성 정확한 메커니즘은 알려져 있지 있지만 단백질 집계는이 질병에 neuropathology와 밀접 하 게 관련. 데이터를 신흥 AD, PD, hd, 그 병원 성 집계 가설에 대 한 강력한 지원을 제공 하 고 ALS prions, 단백질만 전염 성 요원 전달할 수 면 encephalopathies에 대 한 책임에 많은 유사점을가지고. 자기 prions 집계 형의 확산을 일으키는 동일한 단백질의 기본적으로 접혀 버전의 변환 템플릿으로 복제. 어떻게 prions 그리고 광고, 프리온 같은 단백질 한 셀에서 다른 PD, HD, 및 ALS 이동 현재 강렬한 수 사의 영역입니다. 여기, HD와 관련 된 돌연변이 huntingtin (Htt)의 프리온 처럼, 셀 전송의 모니터링을 허용 하는 초파리 melanogaster 모델을 설명 합니다. 이 모델 transgene 식 많은 다른 초파리 조직에 조작 하기 위한 강력한 도구를 활용 하 고 돌연변이 체 Htt의 직접 보고서 프리온 같은 전송에 놓여있는지 태그 세포질 단백질을 이용 한다. 중요 한 것은, 우리가 여기에 대해 설명 하는 접근 소설 유전자와 단백질의 다양 한 셀 형식 비보사이의 확산을 중재 하는 경로 식별 하기 위해 사용할 수 있습니다. 이러한 연구에서 얻은 정보는 신경 퇴행 성 질병 기초 및 치료 적 개입을 위한 새로운 기회를 공개 하는 병원 성 메커니즘의 제한 된 이해를 확장 됩니다.
Introduction
프리온 가설 상태에 전염성이 에이전트 전송 가능 해 encephalopathies (예를 들면, 인간에서 크로이츠펠트-야콥 병, 양, 사슴, 엘크, 만성 낭비 질병 및 "광우병" 가축에서 scrapie에 대 한 책임 )의 단백질 및 핵 산1없는 전적으로 구성 되어 있습니다. 프리온 질병, 세포 프리온 단백질 (PrPC) 가정 아닌, 안정적인 접이식 PrP (Sc) 높은 베타 시트-부자 이며 자체 변환 및 안정 된 아 밀 로이드로 단위체 PrPC 분자에 의해 전파 수 있습니다. 집계합니다. PrPSc 집계는 유기 체에 다른 세포 사이 및 개별 유기 체2사이 확산이 자기 복제 메커니즘을 사용 합니다.
단백질 misfolding 및 집계 또한 대부분 신경 퇴행 성 질환 (Alzheimer의 질병 (광고), 파 킨 슨 병 (PD), 헌팅턴의 질병 (HD), 그리고 루 경화 증 (ALS))의 중앙 특징 이다3. 이러한 질병에 내부 또는 여분 cellular 집계 단백질 어셈블리의 형성은 시간5, 에 밀접 하 게 관련 된 세포 독성4 와 두뇌를 통해 높은 재현성 및 질병 특정 경로 따라 진행 6. 이러한 패턴의 확산이이 질환과 관련 된 병원 성 집계 프리온 같은 속성을가지고 제안. 강력한 지원, 광고와 관련 된 집계의 프리온 같은 전송에 대 한 존재 PD, HD, 및 ALS-그들은 셀 템플릿 이전 영향을 받지 않는 셀7, 동일한 단백질의 단위체 형태의 구조적 변화에서 확산 8.
날짜의 단백질 프리온 처럼 확산 조사 연구의 대다수 포유류 세포 문화 모델, 어디 집계 전송을 사용 순진한 세포의 세포질에 다른 세포 또는 세포 외 공간에서 수행 되었습니다. 세포질9,10,11,12,13,,1415, 또는 마우스 두뇌에 집계 포함 된 재료를 주입 하 고 모니터링 하 여 집계는 사출 사이트16,17,18,19,20,,2122, 이외의 모양 23. 최근 유전자 변형 동물 세포내 집계 그대로 두뇌24,25,,2627, 내의 다른 셀에 확산을 보여 주기 위해 사용 되었습니다 28,,2930. 여기, 우리는 초파리 melanogaster의 그대로 뇌에 있는 개별 셀 사이의 집계 전송의 직접 시각화 하는 방법을 설명합니다. 초파리 모델 HD/polyglutamine (polyQ) 질병의 거의 2 년 전 처음 개발31,32 이 무질서의 기반이 되는 병원 성 메커니즘에 대 한 많은 귀중 한 통찰력 제공 33. HD는 단백질 huntingtin (Htt)34코드 하는 유전자는 상 염색체 지배적인 돌연변이 의해 발생 하는 상속 된 신경 장애. 이 돌연변이의 병원 문 턱을 넘어 Htt의 N-말단 근처 polyQ 스트레치의 확장 결과 ~ 37 glutamines, misfold 및 집계35,36단백질을 일으키는. 야생-타입 Htt 단백질 포함 된 <이 뻗 기에 37 glutamines 그들의 네이티브 배를 달성 하지만에 유도 될 수 있다는 Htt 집계 "씨앗"12,,2737와 직접적인 물리적 접촉 시 집계. 우리는이 homotypic, 프리온 같은 전송에 대 한 판독으로 야생-타입 Htt의 nucleated 집계 및 다른 세포에서 발생 하는 돌연변이 체 Htt 집계의 세포질 항목을 악용 합니다.
프리온 같은 집계 하 여 결정 하는 메커니즘 셀 사이의 여행 불 치 신경 퇴행 성 질환에 대 한 새로운 치료 대상의 식별 될 수 있습니다. 우리는 빠른 라이프 사이클을 이용, 사용의 용이성, 그리고 초파리 melanogaster 돌연변이 체 Htt의 셀을 확산에 대 한 분자 메커니즘 정의를 유전적 추적성을 걸릴. 우리의 실험 전략 초파리, 잘 설립 Gal4 특정 상류 활성화 순서 (Gal4 UAS) 시스템38 및 QF QUAS 최근 개발 시스템39에서 사용할 수 있는 두 개의 이진 식 시스템을 사용합니다. 이 두 개의 독립적인 시스템을 커플링 같은 비행40내 뚜렷한 세포 인구를 제한 하는 돌연변이 야생-타입 Htt transgenes의 표현 수 있습니다. 이 방법을 사용 하 여, 프리온 같은 집계 된 상태로, 미리 형성 된 돌연변이 체 Htt와 육체적 인 접촉의 직접적인 결과 일반적으로 확산, 수용 성 상태에서 세포질 야생-타입 Htt의 재분배를 모니터링 하 여 돌연변이 Htt의 확산 검토 집계 "씨입니다." Htt의 돌연변이 의해 야생-타입 Htt의 변환 생물을 사용 하 여 확인 될 수 있다 또는 단백질 단백질 상호 작용, 형광 공명 에너지 등을 보고 생물 기술 전송 (무서 워)9,,2741 .
중요 한 것은, 우리 또한 많은 유전자 초파리 유전자 및 단백질의 프리온 같은 확산을 중재 하는 경로 식별 하기 위해 도구를 액세스할 수 있습니다. 우리는 최근 세포 표면 폐품 수용 체, 드레이퍼42,43, 신경 축 삭에서 초파리 중앙에 가까운 phagocytic 명과 돌연변이 체 Htt 집계를 전송에 대 한 중요 한 역할을 공개 하기 위해이 접근을 사용 신경 시스템 (CNS)27 따라서, 우리가 여기에 설명 하는 유전 및 이미징 기반 접근 강력한 모델 생물, 초파리하지만 사용 하기 간단한에서에서 질병 관련 현상에 대 한 중요 한 기본적인 생물 학적 정보를 밝힐 수 있다.
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Protocol
1. 초파리 에 Gal4 QF 중재 Htt Transgene 식 커플링
- 수집 또는 생성 하는 유전자 변형 초파리 melanogaster 조직 관련 Gal4 또는 QF "드라이버"를 포함 하는 라인으로 줄 야생-타입 또는 돌연변이 체 Htt transgenes 하류 Gal4 UAS38 또는39QF-QUAS. 단백질이이 transgenes에서 표현 되는 형광 단백질을 융합 또는 동일한 비행에 돌연변이 야생-타입 Htt transgene 제품의 차별화에 대 한 있도록 피토 프 태그 인지 확인 합니다. 그림 1을 참조 하십시오.
참고: 우리는 일반적으로 인간의 Htt 유전자27의 exon 1 조각을 사용합니다. 그러나, 유전자 변형 파리 대신 원하는 경우 더 이상 Htt 조각 또는 다른 유전자를 표현 하기 위해 생성할 수 있습니다. - 돌연변이 야생-타입 Htt transgenes 별개, 겹치지 않는 세포 인구에 표현 될 것 이다 그런 유전 전략을 계획 합니다.
- 어떤 식의 중복 발생, 돌연변이 및 야생-타입 Htt 단백질 같은 세포에서 합성 공동 집계 하 고 프리온 같은 이벤트의 탐지를 방지. 이 문제를 방지 하려면 Gal4 및 QF 특정 repressors, Gal80 및 품질 평가 점수40, 각각 (그림 1). 발달 제어 Gal4 / QF 드라이버 선택 제한 돌연변이 Htt의 표현 가능성을 제거 하는 포스트 mitotic 세포는 세포 분열 하는 데 도움이 수에 기여할 수 셀 집계 확산.
- 표준 자란 상태를 사용 하 여, 돌연변이 "기증자" QF (또는 Gal4) 통해 Htt 셀 인구와 야생-타입 Gal4 (QF) "받는 사람"에 통해 Htt 세포 인구를 표현 하는 자손을 생성 하기 위해 파리 친구. 회로도 가능한 유전자 조합을 보여주는 그림 1 을 참조 하십시오.
참고: 우리의 이전 게시27 에서 그림 1-4 에 표시 된 데이터를 생성 하는 데 사용 했다 QF Gal4 드라이버 DA1 후 각 수용 체 신경 (온) 드라이버, Or67d-QF, 팬 glial 드라이버, repo Gal4 포함. - QF Gal4 표시 두 세포 인구에서 야생-타입 Htt를 표현 하는 병렬에서 제어 파리를 생성 합니다.
- 원하는 유전자 형의 자손을 수집 하 고 적절 한 동물 나이.
그림 1 . 돌연변이 야생-타입 Htt transgenes QF-QUAS 및 Gal4 UAS 이진 식 시스템을 사용 하 여 결합 된 표현에 대 한 유전 접근. "셀 A,"는 mCherry 태그 돌연변이 체 Htt 단백질 포함 된 병원 성 길이 polyQ 스트레치 (Q91) 표현 있는 QF 드라이버를 사용 하 여 조직의 특정 발기인은 ("PA")의 하류. "셀 B," YFP 태그 야생-타입 Htt 정상적인 polyQ 스트레치 (Q25)를 포함 하는 조직-특정 발기인 B ("P"B")에 의해 제어 Gal4 드라이버를 통해 표현 된다. 그림 2-4, Or67d-QF DA1 ORNs QUAS-HttQ91-mCherry 식 구동 하는 데 사용 했다 그리고 repo Gal4 모든 명과27UAS-HttQ25-YFP 표현 하는 데 사용 되었다. 중요 한 것은, HttQ91-mCherry 배치는 transgene의 업스트림 QUAS 시퀀스 덕 QF 표현 셀에만 표시 됩니다. 마찬가지로, HttQ25-YFP만 구체적으로 인식 하는 UAS Gal4 통해 표현 된다. QF Gal4 드라이버의 조직 분포에 어떤 중복 감지 되 면 transgenes 인코딩 QS Gal4 표현 셀에 및 Gal80 QF 표현 세포에 도입 수 있습니다. 이미징 및 적절 한 기증자 또는 수락자 쌍 (예를 들어, c f P/YFP 또는 YFP/mCherry) 사이 무서 워를 측정 하는 능력 중 두 가지 단백질의 차별화 야생 형 및 돌연변이 체 Htt에 형광 단백질 태그를 추가 할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
2. 마이크로 해 부와 성인 초파리 두뇌의 고정
참고:이 해 부 절차 이전 게시44에서 수정 되었습니다 및 두뇌 Htt 형광 성 단백질 융해에서 이미징 직접 형광 신호에 대 한 준비를 사용할 수 있습니다. 수정 할 수 있는 immunostaining에 대 한 두뇌 절차는 다음 섹션에서 설명 되어 있습니다.
- 다음과 같은 자료를 수집 하 고 얼음에: 0.03%를 포함 하는 인산 염 버퍼 염 분 Triton X-100 (PBS/T); microcentrifuge 튜브 200 µ L 20%를 추가 하 여 준비 하는 4 %paraformaldehyde (PFA) 통 솔루션의 포함 970 µ L 770 µ L PFA PBS/T; 투명 유리 접시 포함 하는 잘; 일회용 전송 피펫으로; 두 해 집게 (한 3 및 1 5)
- CO2 를 사용 하 여 성인 파리 anesthetize 하 고 얼음에 유리 접시의 한 잘에 그들을 전송.
- 작은 금액을 추가 사용 하 여 전송 피펫으로 (~ 500 µ L) 차가운 PBS/T 필요는 잘 포함 하는 빈 잘으로도 파리의. 그들은 해 부를 방해할 수 있습니다 너무 많은 거품을 소개 하지 마십시오.
- 해 현미경 아래 평평한 표면에 유리 접시를 놓고 비행 몸 보기의 필드를 채웁니다 때까지 초점이 배율을 조정 합니다.
- 빛은 유리 접시의 양쪽 모두를 조명 그렇게 목이 광원의 쌍을 배치 합니다. 해 부 시 신체 부품/표 피를 삭제할 유리 접시 아래 접힌된 연구소 조직 앵커.
- 3 집게 비 지배적인 손을 사용 하 여, 잡아서 비행 그것의 복 부의 복 부 면이 위로 향하도록 잡고 잘 포함 PBS/t. 고정으로 하나의 비행 전송.
- PBS/T에 완전히 빠져들 비행 유지, 지배적인 손에 5 집게와 비행 머리를 제거 합니다. 비행 머리의 1 개의 측에 코에 인접 한 작은 공간에 표 피 아래이 집게의 한 끝을 삽입 합니다. 눈 양쪽에서 잡고 잡아 집게를 곤란 하 게 하 여 머리에 그립을 확보.
- 두 집게 떨어져 당겨 그 몸에서 비행 머리를 제거 합니다. 근처 위치 연구소 조직에 비행 체의 처분. 비행 거리 머리 손실 되지 않습니다 있도록 지배적인 손을 집게에 압력을 유지 합니다.
- 비 지배에서 제 3 집게의 위치 한 팁 코의 반대편에 표 피 아래 같은 작은 공간에 손을. 일단 위치, 머리의 양쪽에 같은 위치에 눈을 그립에 집게를 꼬집어.
- 일단 표 피에 그립 안전, 부드럽게 당겨는 집게 떨어져 180 °. 이 작업 중단 됩니다 떨어져 머리 표 피는 뇌 손상 없이. 연구소 조직에 표 피 찌 꺼 기를 삭제 합니다.
- 하지만, 머리 표 피 수 있습니다 완전히 제거 되지 한 번에. 뇌가 완전히 노출 될 때까지 경우에, 표 피 조각으로 제거 합니다. 알아서 하지는 집게와 직접 접촉을 방지 하 여 두뇌를 손상.
- 연결 된 기도의 잡아 연락 하거나 모 세관 작용에 의해 집게 끝 사이 공간으로 뇌를 발음 해 부 두뇌 PBS/T에서 제거 합니다.
참고: 우리가 일반적으로 이미지 하는 뇌의 앞쪽 표면에 더듬이 돌출부를 가리지 않도록 경향이 기관 제거 선택 사항입니다. 그러나, 경우 이미징 기도 방해, 제거 신중 하 게 그래서이 조작에 의해 뇌 손상 되지 않은. - 얼음 통 솔루션을 포함 하는 microcentrifuge 튜브 중 하나로 비행 두뇌를 전송 합니다. 두뇌는 집게에서 분리, 통 솔루션에 빠져들 확인 하십시오.
- 모든 두뇌의 해 부 되어, 일단 그들을 주제 "짧은 수정"에 대 한 nutator에 닫힌된 튜브를 배치 하 여 ~ 어둠 속에서 실 온에서 5 분.
참고:이 짧은 고정 단계 하면 두뇌 후속 단계에서 처리를 쉽게 하 고 microcentrifuge 튜브의 양쪽에 고착 하지 않는다. - P1000 피 펫 통 솔루션의 대부분을 제거 하 고 그것을 폐기.
- 이 모든 후속 세척 단계 동안 관에서 두뇌를 발음 하지 마십시오. (예를 들어, 650 µ L) 낮은 볼륨에서 P1000 설정 고 두 단계에는 상쾌한을 제거 합니다. 또한, 더 나은 두뇌를 시각화 하기 위해 발음 하면서 광원 (예: 오버 헤드 조명)에 따라 microcentrifuge 튜브를 누르십시오.
- 두뇌에 신선한 PBS/T의 1 mL를 추가 합니다. 신속 하 게 세척 (< 1 분), 어둠 속에서 두뇌에서 상쾌한 발음 및 삭제.
- 다음 일정에 따라 실 온에서 어둠 속에서 PBS/t 세척을 반복: 2 빠른 (< 1 분) 세척, 1 X 5 분, 3 X 20 분, 및 1 X 1 h 세척. Microcentrifuge 튜브에 상판을 보호 하 고 세척 사이 nutator에 튜브를 놓습니다.
- DAPI 얼룩을 원하는 경우 대체 250 ng/mL DAPI 가진 1 X 30 분 외피와 최종 1 시간 세척/T의 PBS에 희석 뒤 2 배 빠른 및 1 X 20 분 세척.
- 마지막 세척 후, 머리를 방해 하지 않도록 주의 복용 워시 버퍼 상쾌한의 대부분을 제거 하 고 두뇌를 30 µ L 글리세롤 기반 antifade 시 약의 추가. 적어도 1 시간 및 24 h까지 운동 없이 어둠 속에서 4 ° C에서 품 어.
3. 제 2 Immunostaining 성인 두뇌에 대 한 수정
참고: 사용 하 여이 프로토콜 비 형광 단백질을 이미징 또는 형광 성 단백질 융해에 대 한 약한 형광으로.
- 트라이 톤 X-100 PBS/T에 의해에서 농도 10 배 증가 (PBS + 0.3% 트라이 톤 X-100) 모든 단계에 대 한. 이렇게 하면은 충분 한 세제 permeabilize 세포 막 항 체 세포내 공간에 액세스를 허용 하는.
- 4%에서 머리를 수정 PFA PBS/T 실 온에서 20 분 동안에.
- 세척의 모든 작업을 수행한 후 어둠 속에서 실 온에서 30 분 동안 갓 블로킹 버퍼 (PBS/T + 5% 정상 염소 혈 청 (NGS))에 머리를 품 어.
- 제거 하 고 차단 버퍼를 삭제 합니다. 0.5 mL 신선한 블로킹 버퍼에서 적절 한 1 차 항 체를 diluting 하 여 마스터 혼합으로 준비 하는 관 당 1 차적인 항 체 솔루션의 추가 (일반적으로 사용 되는 항 체 및 희석 재료의 표 참조). 어둠 속에서 4 ° C에서 24 시간 이상에 대 한 nutator에 1 차 항 체에 두뇌를 품 어.
- 두뇌는 P1000 사용 하 여에서 1 차적인 항 체 솔루션을 제거 하 고 신선한 튜브에 예약. 두뇌 씻어 PBS/T의 1 mL를 추가 합니다.
참고: 예약 된 기본 항 체 솔루션 저장할 수 있습니다 4 ° C에서 최대 4 주 동안. 우리는 성공적으로 재활용 1 차 항 체를 두 번 후속 실험에서. - 두뇌를 신속 하 게 세척 (< 1 분) PBS/T에 두뇌에서 상쾌한 발음 및 삭제. 이 빠른 세척을 한 번 더 반복 합니다.
- 다음 일정에 따라 실 온에서 1 mL PBS/T와 함께 세척을 계속: 1 X 5 분, 3 X 20 분, 및 1 X 1 h 세척. Microcentrifuge 튜브에 상판을 보호 하 고 세척 동안는 nutator에 튜브를 놓습니다.
- 마지막 세척 후 PBS/T 상쾌한의 대부분을 제거 하 고 신선한 블로킹 버퍼에 적절 한 항 체를 diluting 하 여 마스터 혼합으로 준비 하는 이차 항 체 솔루션의 0.5 mL을 추가 (일반적으로 사용 되는 항 체에 대 한 재료의 표 참조 그리고 희석)입니다. 어둠 속에서 4 ° C에서 24 h에 대 한 2 차 항 체에 두뇌를 품 어.
- 2 차 항 체를 가진 외피 후 3.5, 3.6, 3.7 단계에서 세척 단계를 반복 합니다.
- 최종 세척 후 워시 버퍼의 대부분을 제거 하 고 모든 두뇌는 튜브의 하단에 있는지 확인 합니다. 두뇌를 30 µ L antifade 시 약을 추가 합니다. 16-24 h에 대 한 운동 없이 어둠 속에서 4 ° C에서 품 어.
4. 뇌 장착
- 유리 현미경 슬라이드 해 현미경 및 식별 정보 레이블을 배치 합니다.
참고: 또는, 두뇌 장착할 수 있습니다 이미징 동안 두뇌의 양쪽 모두에 액세스 하는 커버 유리에 직접. 이 설치 절차를 설명 하는 프로토콜45이전에 게시 되었습니다. - 무딘된 피펫으로 팁을 사용 하 여 각 microcentrifuge 튜브에서 두뇌를 제거 (바닥을 제거 하는 면도날을 사용 하 여 준비 ~ 1 200 µ L 팁에서 1cm) 슬라이드의 중간에 그들을 전송. 최대한 머리와 작은 antifade 시 약으로 전송.
- 집게를 사용 하 여 원하는 방향 (예를 들어, 슬라이드 앞쪽 표면 더듬이 엽 이미징에 대 한 위로 향하도록 상단 쪽으로 향하고 등)에 머리를. 머리 방향을 때 그들을 상상 하는 데 사용할 현미경의 빛 경로 고려 하십시오.
- 두뇌를 방해 하지 않고 접힌된 연구소 조직의 뾰족한 모서리를 사용 하 여 슬라이드에서 초과 antifade 시 약을 제거 합니다. 앉아 슬라이드 하자 ~ 슬라이드에 머리 수 있도록 어둠 속에서 5-10 분.
- 깨진된 커버 유리는 광장을 형성 하는 머리의 각 측에 4 개의 작은 조각으로 비행 두뇌를 둘러싸고 ~ 19 m m x 19 mm. 유리의이 작은 조각 중 하나 밖에 22 x 22 mm No. 1.5 커버 글라스의 한 모서리에 배치 부드럽게 다리-산을 완료 하는 머리 위로 coverslip 내립니다.
- 천천히 분배 되는 coverslip 또는 두뇌를 방해 하지 않도록 주의 하는 coverslip 아래 표면 채우기 위해 신선한 antifade 시 약. 어떤 과잉 antifade는 coverslip 직접 하지 않고 접힌된 연구소 조직의 뾰족한 모서리를 사용 하 여 닦아.
- coverslip의 네 모서리의 각을 명확 하 고, 빠른 건조 매니큐어의 한 방울을 추가 합니다. 에 대 한 건조 허용 ~ 10 분. 그런 다음, 완전히 머리를 묶는 데 매니큐어와 coverslip의 4 개의 가장자리 물개.
- 두뇌를 즉시, 이미지 또는 준비 될 때까지 4 ° C에서 저장.
- Htt 형광 성 단백질 융해에서 본질적인 형광 이미징 하는 경우 최상의 신호에 대 한 24 시간 이내 두뇌 이미지.
5. 이미징 및 측정의 프리온 같은 전송
- Confocal 현미경 선택한 Gal4 QF 드라이버는 표현 하는 두뇌의 영역을 통해 z 슬라이스 이미지를 수집 하는 40 X 또는 오일 목표 X 60/63를 갖춘 (그림 2A, B)를 사용 하 여 탑재 된 두뇌 이미지.
- 형광 성 단백질 융해 또는 immunolabeled 단백질 적절 한 레이저를 사용 하 여 자극 (예를 들어, 488 nm mCherry/Cy3에 GFP/YFP/FITC 또는 552 nm에). 최대 형광을 캡처 설정된 검색 창을 채널 잡담 중 스펙트럼 탐지 시스템을 사용 하 여 제거 하는 동안 신호 또는 밴드/긴 각 fluorophore에 대 한 특정 방출 필터를 통과.
참고: 있을 때 단백질 집계 이미징 세심 한. 각 집계를 포화 되 고, 특히 큰 집계에에서의 중심에 픽셀 쉽습니다. 이미지에 채도 최소화 하지만 작은 집계 종 (그림 2B, C, D)에서 신호를 잃기의 위험을 인식 하려고 합니다. 너무 많은 채도 이미지 배경, 더 어려운 고립 된 puncta를 식별 하 고 증가할 것 이다. 각 데이터 세트에 최종 이미지를 복용 하기 전에 최적화 하려면 다른 이미징 설정을 테스트 합니다.
- 형광 성 단백질 융해 또는 immunolabeled 단백질 적절 한 레이저를 사용 하 여 자극 (예를 들어, 488 nm mCherry/Cy3에 GFP/YFP/FITC 또는 552 nm에). 최대 형광을 캡처 설정된 검색 창을 채널 잡담 중 스펙트럼 탐지 시스템을 사용 하 여 제거 하는 동안 신호 또는 밴드/긴 각 fluorophore에 대 한 특정 방출 필터를 통과.
- 수동으로 개별 z-조각 (예를 들어, 그림 2C 및 그림 4A) 또는 3 차원 (그림 3 에 confocal 슬라이스 렌더링 후 이동 하 여 개별 puncta를 측정 하 여 데이터를 분석 A, B)입니다.
참고:이 이미지 J 또는 다른 이미지 처리 소프트웨어에서 할 수 있습니다.- 집계 됩니다 잘 분리 하는 경우는 최소한의 배경 형광 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 체계적으로 식별, 계량, 및 다른 "개체" 또는 "표면" confocal 스택 (3D 재구성에 집계 분석 그림 3 B)입니다.
참고: 설명 하는 소프트웨어 작업은 악기와 여기에 사용 되는 소프트웨어 ( 재료의 표참조).- 3D 보기 모드에서 confocal z 시리즈를 시각화 합니다. "분석" 마법사를 사용 하 여 선택한 채널 (예: HttQ91 mCherry에 대 한 빨강 채널 그림3에서 집계)에서 개별 관광 명소를 식별. 임계 처리 및 정확 하 게 나타내는 모든 heterogeneously 크기의 집계는 이미지에서 개별 개체 필터를 조정 합니다.
- "이진 처리 사전 필터" aberrantly 소프트웨어 알고리즘에 의해 병합 됩니다 밀접 하 게 관련 된 집계를 별도의 "개체를 분할"을 사용 합니다. 개체와 관련 된 그들의 측정의 총 수는 "측정"에서 보고 note
참고:이 방법은 돌연변이 체 Htt 집계 측정에 대 한 아니다 immunostaining 프로토콜 의무가, 녹말 체의 중심은 항 체를 꿰 뚫을 수 있기 때문에. 그 결과, 집계 현미경에 고리 모양의 구조로 나타나고 이미지 분석 소프트웨어는 정확 하 게 식별 하 고 이러한 개별 "반점"를 구별할 수 없습니다.
- 야생-타입 Htt 집계 수동으로 z 스택을 통해 이동 하 고 득점 야생-타입 Htt 집계, 아니 집계는 더블-득점 이상에 나타나는 경우 확인 하 여 계량 슬라이스(그림 4).
참고:이 수동 정량화 방법은 각 confocal 스택의 집계 수는 적당 한 (예를 들어, 20-50) 때 사용할 수 있습니다. 이미지 분석 소프트웨어 (예를 들어, 가까운 세포에서 확산 야생-타입 Htt에서 신호) 같은 채널에서 주변 신호에서 개별 puncta를 구별할 수 없을 때 그것은 또한 도움이 된다 (그림 2B, C , 그림 4 A). 야생-타입 Htt 집계 측정도 도전적 일 수 있다 두뇌에 많은 정상적인 구조 punctate (예를 들어, 셀 프로세스와 시 냅 스) 표시 때문에. 야생-타입 및 돌연변이 체 Htt 신호 공동 지역화; 선택 기준으로 사용할 수 있습니다. 그러나, 그것은 일부 돌연변이 체 Htt "씨앗" 탐지는 confocal의 제한 아래가. 받는 사람 셀 (예를 들어, GFP)에 집계 되지 않는 Htt 이외의 단백질 없는 두뇌 punctate 구조를 사용할 수 있습니다.
- 집계 됩니다 잘 분리 하는 경우는 최소한의 배경 형광 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 체계적으로 식별, 계량, 및 다른 "개체" 또는 "표면" confocal 스택 (3D 재구성에 집계 분석 그림 3 B)입니다.
- 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 추가 개별 집계의 특성화를 수행. 예를 들어 집계 (그림 3C), 돌연변이 야생-타입 Htt 단백질그림 4(A), 사이 백분율 공동 지역화의 크기 분포를 결정 하거나 직접 무서 워 (단백질 단백질 상호 작용을 측정 그림 4 B)입니다.
- 특정 채널에서 모든 표시 집계를 정확 하 게 식별 하는 자리 또는 표면 탐지 알고리즘을 사용 하 여 개별 puncta의 크기 분포를 결정 합니다. 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 관광 명소 또는 표면 관련 측정, 예를 들어 '집계 직경' (그림 3 C), '볼륨', 얻거나 5.2.1 단계에서 설명 하는 소프트웨어 "분석" 마법사에서 '측정'에서 '강도' 정보.
참고: 그림 3C, 우리는 단일 DA1 glomerulus에서 식별 된 모든 HttQ91-mCherry puncta에 대 한 직경 분포를 보고 합니다. - 수동으로 조각으로 슬라이스 confocal z 스택 (가장 정확한 방법)를 통해 이동 하 여 HttQ25 YFP 및 HttQ91 mCherry 집계 사이 백분율 공동 지역화를 결정 합니다. 그러나, 주의 하지 두 번 모든 집계를 계산 하십시오. 이 방지 하려면 초점의 비행기는 집계(그림 4)의 센터를 통해 사용 하는 경우만 특정 z 슬라이스에서 집계를 계산 합니다.
- 수락자 photobleaching 메서드를 사용 하 여 colocalized HttQ91-mCherry 신호 유도 HttQ25 YFP 집계에 대 한 무서 워 효율을 계산 합니다.
- 첫째, 다른 채널에 신호를 생성 하는 mCherry 전용 및 YFP 전용 신호 감지 windows를 설정 하 여 YFP 및 mCherry 채널 사이 잠재적인 크로스 토크 제거 합니다. 이러한 설정을 사용 하 여가지고 '이미지'의 개별 HttQ25 YFP puncta 및 그들의 관련된 HttQ91 mCherry 신호 ( 그림 4B) 전에.
- 다음, photobleach는 mCherry 빨간 레이저를 조정 하 여 신호 (예를 들어, 552 nm) 100% 강도를 스캔 신호 사라질 때까지. '이미지' 전에 동일한 puncta (그림 4B)의 '후 이미지'에 사용 된 설정으로 돌아갑니다.
- 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 photobleaching 전후 각 푼 크 툼에 대 한 형광 강도 측정을 계산 합니다.
- 무서 워 효율성 YFP 기증자 형광 측정을 빼서 계산는 '이미지' 전에 (YFP초기) '이후 이미지'에 YFP 기증자 형광에서 (YFP최종). YFP마지막에 의해이 값을 분할 하 고 100을 곱하십시오.
참고: 픽셀-픽셀 또는 각 HttQ25 YFP 집계 (그림 4B)에 대 한 전반적인 무서 워 효율성을 계산할 수 있습니다. 수락자 photobleaching 무서 워 효율성을 계산 하는 각 HttQ25 YFP 푼 크 툼 연관 mCherry 신호 감지 YFP dequenching mCherry photobleaching 후 생산을 충분히 높을 때 특히 유용한 기술입니다.
- 특정 채널에서 모든 표시 집계를 정확 하 게 식별 하는 자리 또는 표면 탐지 알고리즘을 사용 하 여 개별 puncta의 크기 분포를 결정 합니다. 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여 관광 명소 또는 표면 관련 측정, 예를 들어 '집계 직경' (그림 3 C), '볼륨', 얻거나 5.2.1 단계에서 설명 하는 소프트웨어 "분석" 마법사에서 '측정'에서 '강도' 정보.
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Representative Results
여기에 설명 된 방법을 그대로 비행 CNS에서에서 다른 한 세포 인구에서 Htt의 단백질 프리온 같은 전송 시연 하는 강력한 데이터 생성. 야생-타입 Htt의에서 변환 확산 punctate 기증자 ORNs (그림 2A C 및 그림 4A, B)에서 HttQ91 mCherry 식의 결과로 받는 사람 명과에서이 YFP 융해 단백질의 직접 형광에 의해 관찰 됩니다. 이 두 세포 인구 사이 프리온 같은 전송 이벤트의 정확한 보고 유전자 변형 파리와 중 어떤 오버랩 없이 돌연변이 야생-타입 Htt transgenes의 강한 식 수준의 생산 Gal4/QF 드라이버의 신중한 선택 필요 개발 또는 성인에서. 또한, 형광 단백질-Htt 퓨전 transgenes의 사려깊은 디자인 강력한 다운스트림 분석을 사용할 수 있습니다. 예를 들어 돌연변이 및 야생-타입 Htt 집계 될 수 정량 punctate 개체로 하거나 수동으로 (그림 2C 및 그림 4) 또는 이미지 분석 소프트웨어 (그림 3A, B)를 사용 하 여 측정 될 수 있다 고 돌연변이 야생-타입 단백질그림 4(A), 사이 공동 지역화에 대 한 평가 될 수 있다 집계 인구그림 3(C)으로 추가 특징, 그리고 무서 워27 (그림 4에 대 한 분석 될 수 있다 B). 이러한 분석 필요 (예를 들어, c f P/YFP9 기증자 및 수락자 쌍 사이 무서 워 수 있도록 형광 단백질 태그 충분히 분리 된 형광 속성, 하지만 충분 한 스펙트럼 오버랩에 돌연변이 야생-타입 Htt의 융합 또는 YFP/mCherry27).
그림 2 . 신경 HttQ91 mCherry 집계에 의해 glial HttQ25 YFP의 프리온 같은 변환의 공초점 이미지. (A) 최대의 강도 투영 ~ (빨간색) DA1 ORN axons repo Gal4를 사용 하 여 명과 Or67d-QF와 HttQ25-YFP (녹색)를 사용 하 여 표현 하는 HttQ91 mCherry 남성 비행에서 한 더듬이 엽 보여주는 confocal 조각의 30 µ m. 더듬이 엽 DA1 glomerulus, DA1 온 축 삭 종료의 대략적인 경계는 점선 및 고체 라인으로 각각 표시 됩니다. (B) 최대 강도 프로젝션 ~ 슬라이스에서 A. (C) A 단일 0.35 µ m confocal 단일 HttQ25 YFP puncta 및 그것의 관련된 HttQ91 mCherry 신호 (DA1 사 영역의 확대 보기를 표시 하는 confocal 조각의 20 µ m 각 채널에 화살표로 표시). 빨강 채널에서 신호 HttQ25 YFP 및 HttQ91 mCherry 신호 사이 공동 지역화를 시각화 하기 위해 향상 되었습니다. 모든 이미지는 40 X 1.4NA 오일 목표를 사용 하 여 인수 했다. 스케일 바 = 10 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 . HttQ91-mCherry 집계 DA1 온 축 삭에서의 3 차원 분석. (A)는 3D 묘사의 HttQ91-mCherry Or67d-QF 같은 그림 2B에 표시 된 데이터를 사용 하 여 통해 DA1 glomerulus 표현. (B) A 스크린샷 개별 개체 또는 이미지 분석 소프트웨어 패키지를 사용 하 여 (A)에 원시 데이터에서 확인 된 "반점"를 보여주는. 소프트웨어는이 채널/이미지에 다양 한 크기의 56 개체를 식별합니다. (B) 화살촉으로 표시 하는 자리를의 직경을 측정 했다 ~ 1.2 µ m. 화살표 어디 두 개체는 정확 하 게 병합 하지 한 자리에 개별 puncta의 가까운 근접으로 인해 소프트웨어에 의해 위치를 가리킵니다. 이것을 극복 하기 위해 다른 임계 처리 설정 소프트웨어에서 테스트 해야/또는 병합 된 관광 명소 가능 하면 수동으로 분리 해야 합니다. 스케일 바 = 10 µ m.의 직경 분포를 보여 주는 (C) 히스토그램 측정 소프트웨어에 의해 HttQ91 mCherry (B)에 표시 된 "반점"에 대 한. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 . 공동 현지화 및 무서 워 분석 유도 HttQ25 YFP 집계. (A) A 4 개별 0.35 µ m confocal z-조각 표현 repo Gal4를 사용 하 여 명과 Or67d-QF와 HttQ25 YFP를 사용 하 여 DA1 ORNs에 HttQ91-mCherry 남성 비행 두뇌에서의 몽타주. 신호는 작은 HttQ91 mCherry 집계 되 고 유도 HttQ25 YFP 집계 확산 신호를 주변에서 밖으로 서 있도록 조정 되었다. 분할 영역 표시는 각각 구분 하 여 ~ 1.0 µ m (슬라이스 번호 병합 된 이미지의 오른쪽 하단 모서리에 표시)는 여러 집계를 관찰할 수 있다. 화살표는 수동으로 z 스택을 통해 이동 하 여 또는 그 특정 z 슬라이스에 초점 근처에 있을 하기로 결정 했다 HttQ25 YFP puncta를 나타냅니다. 여기에 표시 된 7 개의 HttQ25 YFP puncta의 6 탐지 HttQ91 mCherry 신호 연결 (즉, HttQ25 YFP 집계의 86% 공동 지역화와 HttQ91-mCherry). MCherry 신호 HttQ25 YFP puncta와 관련 된 참고는 종종 DA1 glomerulus에 mCherry-긍정적인 puncta의 대부분 보다는 더 약하다. 눈금 막대 = 5 µ m. (B) A HttQ25 YFP/HttQ91-mCherry-co-지역화 푼 크 툼 (왼쪽된 패널) 전에 전후 (오른쪽 패널) mCherry (수락자) photobleaching. YFP (기증자) 형광 결과 증가 ImageJ46에 대 한 AccPbFRET 플러그인을 사용 하 여 픽셀에 의해 무서 워 효율 (무서 워eff) 이미지를 생산 하기 위해 사용 되었다. 이 특정 집계의 61%는 전반적인 무서 워eff 는 있다. 눈금 막대 = 1 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
신경 퇴행 성 질환으로 고통 받는 환자 수가 증가 하 고, 더 나은 치료법을 개발 될 수 있도록 이러한 질병의 분자 pathogenesis의 이해를 증가 하는 긴급 한 필요가 있다. 여기, 우리 모델 유기 체 초파리 melanogaster의 다른 세포 유형 사이 병원 성 단백질의 프리온 같은 전송 모니터링을 허용 하는 방법을 설명 합니다. 최근 돌연변이 체 Htt 집계에서 vivo에서 의 프리온 같은 전송 설명 하 고 명과27뉴런에서 이러한 집계의 확산을 중재 phagocytic 수용 체를 식별 하이 방법을 사용 했습니다. 우리의 접근 방식을 악용 초파리 를 사용 하 여 유전자 인간 질병 연구의 몇 가지 장점: 그것의 짧은 라이프 사이클 및 치료와 관련 된 기본적인 생물 학적 정보의 발견을 가속화할 수 있는 광대 한 유전 도구.
우리는 여기에 설명 하는 방법을 기존의 다른 동물에 비해 두 가지 주요 이점을 제공 및 세포 프리온 같은 전송에 대 한 문화 모델: 그대로 조직, 그리고 (2)에 있는 세포에서 생산 되는 (1) 집계 원인이 되는 에이전트 (예를 들면, 돌연변이 체 Htt) 일반적으로 접혀 버전을 별도 셀에에서 동일한 단백질 (예를 들어, 야생-타입 Htt)의 식을 프리온 같은 이벤트에 대 한 쉽게 액세스할 수 있는 "기자를"를 제공합니다. 우리는 초파리40확고는 정교한 유전자 도구를 사용 하 여 돌연변이 같은 유기 체 내에서 세포 인구 겹치지 야생-타입 Htt 단백질의 표현을 달성 했다. 많은 다른 조직 관련 Gal4 및 QF 드라이버를 쉽게 사용할 수 있기 때문에 비행 체에 본질적으로 어떤 뚜렷한 세포 유형 사이 프리온 같은 이전을 검토 하는 것은 가능 합니다.
접근의 중요 한 구성 요소는 돌연변이 같은 동물 내에서 다른 세포 인구에 있는 야생-타입 Htt 단백질의 차별된 표정을 달성 이다. 모든 식 중복 받는 사람 세포에서 야생-타입 Htt 집계 정확 하 게 보고 기증자 세포9,12,,27에서 발생 하는 프리온 같은 집계의 세포질 침투 되도록 제거 될 필요가 41. 이 추가적인 유전 도구 (예를 들어, Gal80와 QS repressors40)이이 문제를 완화 하 여 수행할 수 있습니다. 이상적인 유전자 설계 및 선정, 일단 puncta를 측정 하는 체계적인 방법을 설정 해야 합니다. 이 크게 표시 되는 셀의 수, 집계, 수 및 샘플의 신호 대 잡음 비율에 따라 달라 집니다. 우리는 여기에서 설명한 그림 4공동 지역화 긍정적인 무서 워 등 기준 데이터를 분석 하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나, 야생-타입 Htt의 선택 제한 집계가이 기능에 따라 발생할 수 있습니다 과소 프리온 같은 전송 이벤트의 몇몇 돌연변이 체 Htt 집계 씨 confocal 현미경의 검출 한도 이하로 떨어질 수 있기 때문.
여기에 설명 된 vivo에서 접근 HD 또는 심지어 다른 polyQ 장애 관련 된 집계의 프리온 처럼 행동에 대 한 배타적입니다. 유전자 변형 파리 프리온 처럼 알파 synuclein PD, 광고, 타우에에서의 확산을 검사 개발 될 수 있다 및 SOD1 또는 동일한 실험 패러다임을 사용 하 여 ALS에 TDP-43. 이 단백질의 각 집계 경향이 돌연변이 기증자 세포, 그리고 유일한 집계 nucleated 때 받는 사람 세포에서 표현 되어야 합니다 같은 단백질의 용 해 버전에서 표현 되어야 합니다. 이 실험적인 패러다임 또한 다른 질병와 관련 된 병원 성 단백질 크로스 시드 메커니즘47을 통해 상호 작용 수 있습니다 신흥 아이디어 조사를 위해 유용할 수 있습니다. 마지막으로, 조사 하 고 식별 분자 따라 세포질-세포질 확산이 치명적인 질병와 관련 된 병원 성 단백질의 기본 장치를 마더보드에 초파리 에서 사용할 수 있는 무수 한 유전 도구를 적용할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리는 이러한 방법을 개발 하는 동안 많은 도움이 토론을 위한 Kopito, 루 오, 그리고 피어스 연구소의 회원을 감사합니다. 우리는 또한이 원고에의 중요 한 독서에 대 한 브라이언 Temsamrit을 감사합니다. 이 작품은 대학 과학 및 트 면 스미스 자선 신탁에서에서 자금에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate buffered saline (PBS), 10X, pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | AM9625 | Dilute to 1X |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-1L | |
| Kimwipes | Thomas Scientific | 2904F24 | |
| 20% paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15713-S | |
| Normal Goat Serum (NGS), filtered | Lampire Biological Laboratories | 7332500 | Aliquot and freeze upon receipt |
| Chicken anti-GFP | Aves Labs | GFP-1020 | Use at 1:500 dilution |
| Rabbit anti-DsRed | Clontech | 632496 | Use at 1:2000 dilution; can recognize DsRed-based fluorescent proteins (e.g. mCherry, mStrawberry, tdTomato, etc.) |
| Mouse anti-Bruchpilot | Developmental Studies Hybridoma Bank | nc82 | Use at 1:100 dilution; will label active pre-synaptic structures thoughout the fly brain |
| FITC anti-chicken | ThermoFisher Scientific | SA1-7200 | Use at 1:250 dilution |
| Alexa Fluor 568 anti-rabbit | Life Technologies | A11011 | Use at 1:250 dilution |
| Alexa Fluor 647 anti-mouse antibody | Life Technologies | A21235 | Use at 1:250 dilution |
| Slowfade Gold Antifade Reagent | Life Technologies | S36936 | |
| Microscope Slides (25 x 75 x 1.0 mm) | Fisher Scientific | 12-550-143 | |
| Cover Glass (22 x 22 mm) | Globe Scientific | 1404-15 | |
| Dumont Biology Grade Forceps, Style 3 | Ted Pella | 503 | use in non-dominant hand |
| Dumont Biology Grade Forceps, Style 5 | Ted Pella | 505 | use in dominant hand |
| LAS X image analysis software | Leica | ||
| Imaris image analysis software | Bitplane |
References
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