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Neuroscience

Drosophila Melanogaster में Prion-जैसे प्रोटीन समुच्चय के सेल-टू-सेल ट्रांसमिशन का निरीक्षण

Published: March 12, 2018 doi: 10.3791/56906
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological Sciences, University of the Sciences

Summary

सबूत जमते इस विचार का समर्थन करता है कि रोगजनक प्रोटीन समुच्चय neurodegenerative रोगों के साथ जुड़े prion की तरह गुणों के साथ कोशिकाओं के बीच फैल । यहां, हम एक विधि का वर्णन करते है जो मॉडल जीव, Drosophila melanogasterमें सेल-टू-सेल प्रसार के दृश्य को prion-जैसे समुच्चय में सक्षम बनाती है ।

Abstract

प्रोटीन एकत्रीकरण सबसे neurodegenerative रोगों की एक केंद्रीय सुविधा है, जिसमें अल्जाइमर रोग (AD), पार्किंसंस रोग (पीडी), Huntington के रोग (एचडी), और पेशीशोषी पार्श्व स्केलेरोसिस (ALS) शामिल हैं । प्रोटीन समुच्चय बारीकी से इन रोगों में neuropathology के साथ जुड़े हुए हैं, हालांकि सटीक तंत्र है जिसके द्वारा ंयायपालिका प्रोटीन एकत्रीकरण बाधित सामान्य सेलुलर homeostasis ज्ञात नहीं है. उभरते हुए डेटा इस परिकल्पना के लिए प्रबल समर्थन प्रदान करते हैं कि AD, पीडी, HD और ALS में रोगजनक समुच्चय prions के लिए कई समानताएं हैं, जो संक्रामक spongiform encephalopathies के लिए जिंमेदार प्रोटीन-केवल संक्रामक एजेंट हैं । एक ही प्रोटीन के मूल रूप से मुड़े संस्करण के रूपांतरण templating द्वारा Prions आत्म दोहराने, एकत्रीकरण phenotype के कारण फैल गया । कैसे prions और prion-विज्ञापन, पीडी, एच. डी., और ALS में प्रोटीन की तरह एक सेल से दूसरे में ले जाता है वर्तमान में गहन जांच का एक क्षेत्र है । यहां, एक Drosophila melanogaster मॉडल है कि prion की तरह की निगरानी परमिट, सेल-के लिए सेल के बारे में संचरण के उत्परिवर्ती huntingtin (Htt) के साथ जुड़े समुच्चय का वर्णन किया गया है । इस मॉडल के कई विभिंन Drosophila ऊतकों में transgene अभिव्यक्ति जोड़ तोड़ के लिए शक्तिशाली उपकरण का लाभ लेता है और एक फ्लोरोसेंट-टैग cytoplasmic प्रोटीन का इस्तेमाल सीधे उत्परिवर्ती Htt समुच्चय की तरह prion हस्तांतरण की रिपोर्ट । महत्वपूर्ण बात, हम यहां वर्णन दृष्टिकोण उपंयास जीन और रास्ते की पहचान है कि vivo मेंविविध कोशिका प्रकार के बीच प्रोटीन समुच्चय के प्रसार मध्यस्थता इस्तेमाल किया जा सकता है । इन अध्ययनों से प्राप्त जानकारी रोगजनक तंत्र की सीमित समझ है कि आबाद neurodegenerative रोगों का विस्तार होगा और चिकित्सीय हस्तक्षेप के लिए नए अवसरों का पता चलता है ।

Introduction

prion परिकल्पना में कहा गया है कि संक्रामक एजेंट संक्रामक spongiform encephalopathies के लिए जिंमेदार (जैसे, Creutzfeldt-Jakob रोग मनुष्यों में, भेड़ में scrapie, हिरण और एल्क में जीर्ण बर्बाद कर रोग, और "पागल गाय रोग" मवेशियों में ) पूरी तरह से प्रोटीन और न्यूक्लिक एसिड से रहित1से बना है । prion रोगों में, सेलुलर prion प्रोटीन (पीआरपीसी) एक गैर देशी, स्थिर गुना (पीआरपीअनुसूचित जाति) है कि अत्यधिक बीटा शीट-अमीर और स्वयं को परिवर्तित करने और स्थिर amyloid में monomeric पीआरपीसी अणुओं की भर्ती द्वारा प्रचार कर सकते है ग्रहण समुच्चय. पीआरपीअनुसूचित जाति समुच्चय इस आत्म नकल तंत्र का उपयोग करने के लिए एक जीव में विभिंन कोशिकाओं के बीच और भी व्यक्तिगत जीवों2के बीच फैल गया ।

प्रोटीन का खुलासा और एकत्रीकरण भी सबसे neurodegenerative रोगों (अल्जाइमर रोग (विज्ञापन), पार्किंसंस रोग (पीडी), Huntington के रोग (एचडी), और पेशीशोषी पार्श्व स्केलेरोसिस (ALS))3की एक केंद्रीय सुविधा है । इन रोगों में इंट्रा या अतिरिक्त सेलुलर एकत्रित प्रोटीन सभाओं के गठन बारीकी से cytotoxicity4 के साथ जुड़ा हुआ है और समय5के साथ मस्तिष्क के माध्यम से अत्यधिक reproducible और रोग विशेष रास्तों के साथ प्रगति की है, 6. प्रसार के इन नमूनों का सुझाव है कि इन विकारों के साथ जुड़े रोगजनक समुच्चय prion गुणों की तरह है । मजबूत समर्थन अब विज्ञापन, पीडी, एच. डी., और ALS के साथ जुड़े समुच्चय के prion की तरह संचरण के लिए मौजूद है-वे सेल से सेल और टेम्पलेट पहले से अप्रभावित कोशिकाओं में एक ही प्रोटीन के monomeric रूपों के गठन के परिवर्तन का प्रसार7, 8.

prion की जांच की अध्ययन के बहुमत की तारीख करने के लिए प्रोटीन समुच्चय के प्रसार की तरह स्तनधारी सेल संस्कृति मॉडल है, जहां समुच्चय extracellular अंतरिक्ष से भोली कोशिकाओं के कोशिका द्रव्य में हस्तांतरण या किसी अंय सेल से का उपयोग किया गया है कोशिका द्रव्य 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, या माउस दिमाग और निगरानी में कुल युक्त सामग्री इंजेक्शन द्वारा इंजेक्शन स्थल के बाहर कुल उपस्थिति16,17,18,19,20,21,22, 23. हाल ही में, ट्रांसजेनिक जानवरों को प्रदर्शित किया गया है कि intracellular समुच्चय बरकरार दिमाग के भीतर अंय कोशिकाओं में फैले24,25,26,27, 28,29,30. यहां, हम Drosophila melanogasterके बरकरार मस्तिष्क में व्यक्तिगत कोशिकाओं के बीच समग्र हस्तांतरण के प्रत्यक्ष दृश्य के लिए एक विधि का वर्णन । HD/polyglutamine (polyQ) रोगों के Drosophila मॉडल पहले करीब दो दशक पहले विकसित किए गए थे31,32 और रोगजनक तंत्र है कि इन विकारों आबाद में कई अमूल्य अंतर्दृष्टि प्रदान की है 33. HD एक विरासत neurodegenerative जीन में एक autosomal प्रमुख उत्परिवर्तन की वजह से विकार है कि प्रोटीन huntingtin (Htt) के लिए कोड34। Htt के एन के पास एक polyQ खिंचाव के विस्तार में यह उत्परिवर्तन परिणाम ~ 37 glutamines की एक रोगजनक सीमा से परे टर्मिनस, जिससे प्रोटीन के कारण और कुल35,36गुना । जंगली-प्रकार Htt इस खंड में < 37 glutamines युक्त प्रोटीन उनके देशी गुना प्राप्त है, लेकिन एक Htt कुल "बीज" के साथ प्रत्यक्ष शारीरिक संपर्क पर कुल के लिए प्रेरित किया जा सकता है12,27,37। हम इस homotypic, जंगली प्रकार Htt के nucleated एकत्रीकरण का दोहन prion के लिए एक readout के रूप में हस्तांतरण और उत्परिवर्ती cytoplasmic समुच्चय की Htt प्रविष्टि के रूप में अंय कोशिकाओं में उद्भव ।

तंत्र का निर्धारण जिसके द्वारा prion-की तरह समुच्चय कोशिकाओं के बीच यात्रा असाध्य neurodegenerative रोगों के लिए उपंयास चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । हम तेजी से जीवन चक्र का लाभ ले, उपयोग में आसानी, और Drosophila melanogaster के आनुवंशिक पथ के लिए सेल के लिए आणविक तंत्र को परिभाषित करने वाली सेल के उत्परिवर्ती Htt समुच्चय के प्रसार । हमारी प्रायोगिक रणनीति Drosophila, अच्छी तरह से स्थापित Gal4-विशिष्ट ऊपर सक्रिय अनुक्रम (Gal4-यूएएस) प्रणाली38 और हाल ही में विकसित QF-QUAS प्रणाली39में उपलब्ध दो द्विआधारी अभिव्यक्ति प्रणालियों को रोजगार । इन दो स्वतंत्र प्रणालियों युग्मन उत्परिवर्ती और वंय प्रकार Htt transgenes की अभिव्यक्ति प्रतिबंधित एक ही मक्खी के भीतर विशिष्ट कोशिका आबादी के लिए40की अनुमति देता है । इस दृष्टिकोण का उपयोग करना, हम prion की जांच की तरह उत्परिवर्ती Htt के वितरण की निगरानी द्वारा अपने सामांय रूप से फैलाना, घुलनशील राज्य से cytoplasmic जंगली प्रकार के Htt के पुनर्वितरण, एक पूर्व के साथ शारीरिक संपर्क का प्रत्यक्ष परिणाम, उत्परिवर्ती Htt का गठन कुल "बीज." जंगली प्रकार Htt के उत्परिवर्ती Htt द्वारा रूपांतरण जैव रासायनिक या भौतिक तकनीक का उपयोग कर पुष्टि की जा सकती है कि रिपोर्ट प्रोटीन-प्रोटीन बातचीत, जैसे प्रतिदीप्ति अनुनाद ऊर्जा स्थानांतरण (झल्लाहट)9,27,41 .

महत्वपूर्ण बात, हम भी एक बड़ी संख्या में आनुवंशिक उपकरण का उपयोग कर सकते है Drosophila में जीन और/या रास्ते की पहचान करने के लिए कि मध्यस्थता prion-जैसे प्रोटीन समुच्चय के प्रसार । हम हाल ही में सेल भूतल मेहतर रिसेप्टर, ड्रेपर42,43के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका अनावरण करने के लिए इस दृष्टिकोण का इस्तेमाल किया है, के लिए ंयूरॉन axons से पास phagocytic glia में Drosophila केंद्रीय में उत्परिवर्ती Htt समुच्चय स्थानांतरित तंत्रिका तंत्र (सीएनएस)27. इस प्रकार, आनुवंशिक और इमेजिंग आधारित दृष्टिकोण है कि हम यहां का वर्णन एक रोग के बारे में महत्वपूर्ण बुनियादी जैविक जानकारी प्रकट कर सकते है सरल में प्रासंगिक घटना का उपयोग करें, लेकिन शक्तिशाली मॉडल जीव, Drosophila।

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Protocol

1. युग्मन Gal4-और QF-मध्यस्थता Htt Transgene अभिव्यक्ति में Drosophila

  1. इकट्ठा और/या ट्रांसजेनिक Drosophila melanogaster लाइनों ऊतक युक्त विशिष्ट Gal4 या QF "ड्राइवरों," के रूप में अच्छी तरह से जंगली प्रकार या उत्परिवर्ती Htt transgenes के बहाव Gal4-यूएएस38 या QF-QUAS39युक्त लाइनों उत्पंन । सुनिश्चित करें कि प्रोटीन है कि इन transgenes से व्यक्त कर रहे है फ्लोरोसेंट प्रोटीन या epitope के लिए जुड़े हुए है-एक ही मक्खी में उत्परिवर्ती और जंगली प्रकार Htt transgene उत्पादों के विभेद के लिए अनुमति टैग । चित्र 1देखें ।
    नोट: हम आम तौर पर मानव Htt जीन27के एक्सॉन 1 टुकड़े का उपयोग करें । हालांकि, ट्रांसजेनिक मक्खियों के बजाय अब Htt टुकड़े या अंय जीनों एक्सप्रेस अगर वांछित उत्पंन किया जा सकता है ।
  2. योजना आनुवंशिक रणनीति ऐसी है कि उत्परिवर्ती और वंय प्रकार Htt transgenes अलग, गैर अतिव्यापी सेल आबादी में व्यक्त किया जाएगा ।
    1. यदि किसी भी अभिव्यक्ति ओवरलैप होता है, उत्परिवर्ती और जंगली प्रकार Htt प्रोटीन एक ही कोशिकाओं में संश्लेषित सह-समग्र और prion की तरह की घटनाओं का पता लगाने को रोकने जाएगा । इससे बचने के लिए, Gal4 और QF विशिष्ट दमन, Gal80 और QS40, क्रमशः (चित्रा 1) का उपयोग करें । विकास-नियंत्रित Gal4 और/या QF ड्राइवरों का चयन करने के लिए उत्परिवर्ती Htt की अभिव्यक्ति के बाद mitotic कोशिकाओं को प्रतिबंधित करने में मदद कर सकते हैं, संभावना है कि सेल प्रभाग सेल के लिए सेल समग्र प्रसार में योगदान कर सकता है को नष्ट करने ।
  3. मानक संवर्धन शर्तों का उपयोग करना, दोस्त मक्खियों के लिए संतति पैदा कि एक्सप्रेस उत्परिवर्ती Htt के माध्यम से QF (या Gal4) एक "दाता" सेल जनसंख्या और जंगली में Htt के माध्यम से प्रकार Gal4 (या QF) के माध्यम से एक "प्राप्तकर्ता" सेल जनसंख्या में । एक संभव आनुवंशिक संयोजन दिखा एक योजनाबद्ध के लिए चित्रा 1 देखें ।
    नोट: QF और Gal4 ड्राइवर्स जो आंकड़े 1 -4 और हमारे पिछलेप्रकाशन 27 में दिखाए गए डेटा को जनरेट करने के लिए उपयोग किए गए थे, में शामिल है DA1 घ्राण रिसेप्टर ंयूरॉन (ORN) ड्राइवर, Or67d-QF, और पैन-glial ड्राइवर, रेपो-Gal4 ।
  4. उत्पंन नियंत्रण समानांतर में मक्खियों कि एक्सप्रेस जंगली दोनों QF में प्रकार Htt-और Gal4-लेबल सेल आबादी ।
  5. वांछित जीनोटाइप की संतति इकट्ठा, और उपयुक्त के रूप में जानवरों की उम्र ।

Figure 1
चित्र 1 . QF-QUAS और Gal4-यूएएस बाइनरी एक्सप्रेशन सिस्टम का उपयोग कर transgenes के उत्परिवर्ती और वंय-प्रकार Htt के युग्मित अभिव्यक्ति के लिए आनुवंशिक दृष्टिकोण । "में सेल ए," एक mCherry-टैग उत्परिवर्ती Htt प्रोटीन एक रोगजनक लंबाई polyQ खिंचाव (Q91) युक्त एक QF एक ऊतक के बहाव में स्थित चालक का उपयोग कर व्यक्त किया जाता है विशिष्ट प्रमोटर एक ("पीएक") । "सेल बी," में एक YFP-जंगली प्रकार Htt एक सामांय polyQ खिंचाव (Q25) युक्त टैग एक Gal4 ऊतक-विशिष्ट प्रमोटर बी द्वारा नियंत्रित चालक ("पीबी") के माध्यम से व्यक्त की है । आंकड़े 2-4में, Or67d-QF mCherry DA1 में QUAS-HttQ91-ORNs अभिव्यक्ति ड्राइव करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, और रेपो-Gal4 सभी यूएएस27में HttQ25-YFP-glia व्यक्त करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । महत्वपूर्ण बात, HttQ91-mCherry केवल QUAS अनुक्रम transgene के ऊपर रखा के आधार पर QF-व्यक्त कोशिकाओं में व्यक्त की है । इसी प्रकार, HttQ25-YFP केवल Gal4 के माध्यम से व्यक्त किया जाता है, जो विशेष रूप से यूएएस को पहचानता है । यदि QF और Gal4 ड्राइवरों के ऊतक वितरण में किसी भी ओवरलैप का पता चला है, Gal4-एक्सप्रेस कोशिकाओं में transgenes एंकोडिंग QS और Gal80-एक्सप्रेस कोशिकाओं में शुरू किया जा सकता है । जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती Htt पर फ्लोरोसेंट प्रोटीन टैग संलग्न इमेजिंग के दौरान दो प्रोटीन के भेदभाव के लिए अनुमति देता है और उचित दाता के बीच झल्लाहट उपाय करने की क्षमता/स्वीकार जोड़े (जैसे, YFP या YFP/mCherry) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

2. वयस्क Drosophila दिमाग का सूक्ष्म-विच्छेदन और निर्धारण

नोट: यह विच्छेदन प्रक्रिया एक पिछले प्रकाशन से संशोधित किया गया है44, और Htt-फ्लोरोसेंट प्रोटीन फ्यूजन से इमेजिंग प्रत्यक्ष प्रतिदीप्ति संकेत के लिए दिमाग तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । प्रक्रिया है कि दिमाग immunostaining के लिए किया जा सकता है में संशोधन अगले भाग में चर्चा कर रहे हैं ।

  1. निंनलिखित सामग्री और बर्फ पर जगह ले लीजिए: फास्फेट बफर खारा 0.03% ट्राइटन X-100 (पंजाब/ microcentrifuge ट्यूबों जिसमें 970 µ l का 4% paraformaldehyde (पीएफए) निर्धारण समाधान 200 µ को जोड़कर तैयार किया गया l 20% पीएफए को 770 µ l पंजाबियों/ एक स्पष्ट गिलास अच्छी तरह से युक्त पकवान; एक डिस्पोजेबल हस्तांतरण प्लास्टिक; दोन विदारक संदंश (एक नं. ३ व एक नं. ५).
  2. Anesthetize वयस्क सह2 का उपयोग कर मक्खियों और उंहें बर्फ पर कांच पकवान का एक अच्छी तरह से स्थानांतरण ।
  3. एक स्थानांतरण प्लास्टिक का उपयोग करना, अच्छी तरह से मक्खियों से युक्त करने के लिए एक छोटी राशि (~ 500 µ एल) ठंडे पंजाबियों/ वे विच्छेदन के साथ हस्तक्षेप कर सकते है के रूप में भी कई बुलबुले शुरू से बचें ।
  4. एक विदारक माइक्रोस्कोप के नीचे एक सपाट सतह पर कांच पकवान प्लेस और आवर्धन समायोजित जब तक मक्खी शरीर को देखने के क्षेत्र भरता है और ध्यान में है ।
  5. gooseneck प्रकाश स्रोतों की एक जोड़ी स्थिति इतनी है कि प्रकाश कांच पकवान के दोनों ओर रोशन है । लंगर एक ग्लास डिश के तहत तह प्रयोगशाला ऊतक शरीर के अंगों को त्यागने के लिए/छल्ली विच्छेदन के दौरान ।
  6. गैर में नंबर 3 संदंश का प्रयोग, प्रमुख हाथ, अच्छी तरह से युक्त पंजाबियों में एक मक्खी हस्तांतरण/ventral पक्ष के साथ ऊपर का सामना करना पड़ के साथ अपने पेट की पकड़ हथियाने से मक्खी मैटीरियल ।
  7. मक्खी को पूरी तरह से पंजाब में जलमग्न रखते हुए/टी, प्रमुख हाथ में 5 संदंश के साथ मक्खी सिर हटा दें । छल्ली के तहत इस संदंश की एक टिप डालें, जो फ्लाई सिर के एक तरफ सूंड से सटे छोटे से अंतरिक्ष में है । दोनों तरफ से आंख की पकड़ हड़पने के लिए संदंश को चुटकी देकर सिर पर पकड़ सुरक्षित कर ली ।
  8. दो संदंश को अलग खींच कर उसके शरीर से उड़ते सिर को निकाल लें । पास में तैनात एक प्रयोगशाला ऊतक पर मक्खी शरीर के निपटान । प्रमुख हाथ संदंश पर दबाव बनाए रखें ताकि मक्खी सिर नहीं खोया है ।
  9. छल्ली के तहत एक ही छोटी सी जगह में गैर प्रमुख हाथ में no .3 संदंश के एक टिप स्थान सूंड के दूसरी तरफ । एक बार तैनात संदंश ने सिर के दोनों ओर एक ही स्थान पर आंखों को ग्रिप करने के लिए चुटकी ली ।
  10. एक बार छल्ली पर पकड़ सुरक्षित है, धीरे से 180 डिग्री के अलावा संदंश खींचो । यह क्रिया मस्तिष्क को नुकसान पहुंचाए बिना सिर छल्ली के अलावा टूट जाएगी । एक प्रयोगशाला ऊतक पर छल्ली अवशेषों को त्यागें ।
    1. हालांकि आदर्श, सिर छल्ली एक कदम में पूरी तरह से नहीं हटाया जा सकता है । इस मामले में, मस्तिष्क पूरी तरह से उजागर होता है जब तक टुकड़ा-दर-टुकड़ा छल्ली निकालें । संदंश के साथ सीधे संपर्क से बचने के द्वारा मस्तिष्क को नुकसान नहीं करने के लिए ध्यान रखना ।
  11. या तो एक संलग्न श्वासनली के ahold हथियाने के द्वारा, या केशिका कार्रवाई द्वारा संदंश सुझावों के बीच अंतरिक्ष में मस्तिष्क aspirating द्वारा या तो पंजाबियों से विच्छेदित मस्तिष्क निकालें ।
    नोट: श्वासनली हटाने वैकल्पिक है, क्योंकि यह मस्तिष्क के पूर्वकाल सतह पर antennal पालियों अस्पष्ट नहीं है जहां हम आम तौर पर छवि आदत है । हालांकि, अगर श्वासनली इमेजिंग के साथ हस्तक्षेप, उंहें ध्यान से निकालें ताकि मस्तिष्क इस हेरफेर से क्षतिग्रस्त नहीं है ।
  12. बर्फ पर निर्धारण समाधान युक्त microcentrifuge ट्यूबों में से एक में मक्खी मस्तिष्क हस्तांतरण । सुनिश्चित करें कि मस्तिष्क संदंश से अलग करता है और निर्धारण समाधान में जलमग्न हो जाता है ।
  13. एक बार दिमाग के सभी विच्छेदित किया गया है, उंहें एक nutator पर बंद ट्यूबों रखकर ~ 5 मिनट अंधेरे में कमरे के तापमान पर एक "कम तय" के अधीन ।
    नोट: इस छोटे से निर्धारण कदम है कि दिमाग के बाद के चरणों में संभाल करने के लिए आसान कर रहे है और microcentrifuge ट्यूब के पक्ष का पालन नहीं सुनिश्चित करता है ।
  14. एक P1000 पिपेट के साथ निर्धारण समाधान के बहुमत निकालें और इसे त्यागें ।
    1. इस दौरान ट्यूब से aspirating दिमाग से बचें और किसी भी बाद में वॉश स्टेप करें । P1000 को निचले वॉल्यूम (उदा., 650 µ l) पर सेट करें और supernatant को दो चरणों में निकालें । इसके अलावा, एक प्रकाश स्रोत (जैसे उपरि रोशनी) के साथ लाइन में microcentrifuge ट्यूबों पकड़ो, जबकि aspirating के लिए बेहतर दिमाग कल्पना ।
  15. दिमाग के लिए ताजा पंजाब के 1 मिलीलीटर/ अंधेरे में जल्दी से धो लें (< 1 min), दिमाग से supernatant को महाप्राण, और छोड़ें ।
  16. निंनलिखित अनुसूची के अनुसार कमरे के तापमान पर अंधेरे में पंजाब/टी के साथ धुलाई दोहराएं: 2 त्वरित (< 1 min) बहाकर, 1 x 5 मिनट, 3 x 20 मिनट, और 1 x 1 h वाश । microcentrifuge ट्यूबों पर सुरक्षित सबसे ऊपर है और एक nutator पर बहाकर बीच में ट्यूबों जगह है ।
    1. यदि DAPI धुंधलाना वांछित है, 1 एक्स के साथ अंतिम 1 h धो बदलें 250 एनजी/एमएल DAPI में पतला/टी, 2 एक्स जल्दी और 1 x 20 मिनट बहाकर द्वारा पीछा किया ।
  17. अंतिम धोने के बाद, वॉश बफर supernatant के बहुमत को दूर करने के लिए, दिमाग को परेशान करने के लिए नहीं ध्यान में रखते हुए, और दिमाग के लिए ग्लिसरॉल आधारित antifade रिएजेंट के 30 µ एल जोड़ें । आंदोलन के बिना अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस से कम 1 ज और अप करने के लिए 24 ज में मशीन

3. Immunostaining वयस्क दिमाग के लिए खंड 2 में संशोधन

नोट: इमेजिंग गैर फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए या कमजोर प्रतिदीप्ति के साथ फ्लोरोसेंट प्रोटीन संलयन के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग करें ।

  1. हर कदम के लिए ट्राइटन x-100 के पंजाबियों/टी में 10 गुना (पंजाबियों + 0.3% ट्राइटन x-100) की एकाग्रता बढ़ाएं । यह सुनिश्चित करता है कि पर्याप्त डिटर्जेंट permeabilize कोशिका झिल्ली के लिए मौजूद है और एंटीबॉडी intracellular रिक्त स्थान का उपयोग करने की अनुमति ।
  2. कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए पंजाब में 4% पीएफए में दिमाग को ठीक/
  3. धोने के सभी प्रदर्शन करने के बाद, अंधेरे में कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए हौसले से तैयार अवरुद्ध बफर (पंजाब/टी + 5% सामान्य बकरी सीरम (NGS)) में दिमाग की मशीन ।
  4. निकालें और ब्लॉकिंग बफ़र छोड़ें । ताजा अवरुद्ध बफर में उपयुक्त के रूप में कमजोर प्राथमिक एंटीबॉडी द्वारा एक मास्टर मिश्रण के रूप में तैयार प्रति ट्यूब प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के 0.5 मिलीलीटर जोड़ें (आमतौर पर इस्तेमाल किया एंटीबॉडी और कमजोर पड़ने के लिए सामग्री की तालिका देखें) । अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस से कम 24 घंटे के लिए एक nutator पर प्राथमिक एंटीबॉडी में दिमाग की मशीन ।
  5. एक ताजा ट्यूब में एक P1000 और रिजर्व का उपयोग कर दिमाग से प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान निकालें । दिमाग को धोने के लिए पंजाब के 1 मिलीलीटर/
    नोट: आरक्षित प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान चार सप्ताह तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है । हम सफलतापूर्वक बाद में प्रयोगों में दो बार करने के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी पुनर्नवीनीकरण है ।
  6. supernatant को दिमाग से महाप्राण करने के बाद दिमाग को जल्दी से धो लें (< 1 min) । इस क्विक वॉश को एक बार और दोहराएं ।
  7. 1 एमएल पंजाबियों के साथ धुलाई जारी रखें/निंनलिखित अनुसूची के अनुसार कमरे के तापमान पर टी: 1 x 5 मिनट, 3 x 20 मिनट, और 1 x 1 एच धो लो । microcentrifuge ट्यूबों पर सुरक्षित सबसे ऊपर है और एक nutator पर बहाकर दौरान ट्यूबों जगह है ।
  8. पिछले धोने के बाद, पंजाब के बहुमत/टी supernatant और माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान की 0.5 मिलीलीटर जोड़ें ताजा अवरुद्ध बफर में उपयुक्त के रूप में एंटीबॉडी कमजोर द्वारा एक मास्टर मिश्रण के रूप में तैयार (आमतौर पर इस्तेमाल किया एंटीबॉडी के लिए सामग्री की तालिका देखें और कमजोर पड़ने) । अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी में गर्मी दिमाग ।
  9. दोहराएं चरण में चरण 3.5, 3.6, और 3.7 माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ मशीन के बाद धो चरणों ।
  10. अंतिम धोने के बाद, धोने बफर के बहुमत को हटा दें और सुनिश्चित करें कि सभी दिमाग ट्यूब के तल पर स्थित हैं । दिमाग में 30 µ l antifade रिएजेंट जोड़ें । 16-24 ज के लिए आंदोलन के बिना अंधेरे में 4 ° c पर मशीन ।

4. पूरे मस्तिष्क बढ़ते

  1. जानकारी की पहचान के साथ एक विदारक माइक्रोस्कोप और लेबल के तहत एक ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड रखें ।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, दिमाग एक आवरण कांच पर सीधे रखा जा सकता है इमेजिंग के दौरान मस्तिष्क के दोनों पक्षों का उपयोग । एक प्रोटोकॉल इस बढ़ते प्रक्रिया का वर्णन पहले45प्रकाशित किया गया है ।
  2. एक microcentrifuge एक कुंद प्लास्टिक टिप का उपयोग कर ट्यूब से दिमाग निकालें (एक उस्तरा ब्लेड का उपयोग कर एक 1-200 µ एल टिप से नीचे ~ 1 सेमी हटाने के लिए तैयार) और उंहें स्लाइड के बीच में स्थानांतरण । संभव के रूप में दिमाग के साथ छोटे antifade एजेंट के रूप में स्थानांतरण ।
  3. संदंश का उपयोग करने के लिए इच्छित अभिविन्यास में दिमाग की स्थिति (उदा, पृष्ठ स्लाइड के शीर्ष की ओर इशारा करते हुए और पूर्वकाल सतह इमेजिंग antennal पालि के लिए सामना करना पड़ रहा). जब दिमाग ओरिएंट, माइक्रोस्कोप के प्रकाश पथ पर विचार करने के लिए उंहें इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया जाएगा ।
  4. स्लाइड से अतिरिक्त antifade रिएजेंट निकालें दिमाग परेशान बिना एक तह प्रयोगशाला ऊतक के नुकीले कोने का उपयोग कर । स्लाइड चलो अंधेरे में ~ 5-10 मिनट के लिए बैठने के लिए दिमाग स्लाइड का पालन करने की अनुमति ।
  5. टूटे हुए कवर कांच के चार छोटे टुकड़ों के साथ मक्खी दिमाग को चारों ओर एक वर्ग है कि ~ 19 मिमी x 19 मिमी है फार्म के लिए दिमाग के प्रत्येक पक्ष पर रखा है । एक के किनारे एक 22 मिमी x 22 मिमी नहीं 1.5 कवर ग्लास बस कांच के इन छोटे टुकड़ों में से एक के बाहर , और धीरे से दिमाग पर coverslip कम करने के लिए पुल-माउंट पूरा करें ।
  6. धीरे coverslip या दिमाग को परेशान करने के लिए नहीं सावधान किया जा रहा है, coverslip के नीचे सतह को भरने के लिए ताजा antifade एजेंट बांटना । सीधे coverslip से संपर्क के बिना एक तह प्रयोगशाला ऊतक के नुकीले कोने का उपयोग कर किसी भी अतिरिक्त antifade से पोंछें ।
  7. coverslip के चार कोनों में से प्रत्येक के लिए स्पष्ट, जल्दी सुखाने नेल पॉलिश की एक बूंद जोड़ें । ~ 10 मिनट के लिए शुष्क करने की अनुमति दें । फिर, नेल पॉलिश के साथ coverslip के चार किनारों को पूरी तरह से बंद करने के लिए दिमाग को सील करें ।
  8. छवि दिमाग तुरंत, या 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान तैयार जब तक ।
    1. यदि इमेजिंग आंतरिक Htt से प्रतिदीप्ति-फ्लोरोसेंट प्रोटीन फ्यूजन, छवि 24 के भीतर दिमाग सबसे अच्छा संकेत के लिए एच ।

5. इमेजिंग और बढ़ाता Prion-समुच्चय के संचरण की तरह

  1. छवि घुड़सवार दिमाग एक 40X या 60/63X तेल उद्देश्य से सुसज्जित एक फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग मस्तिष्क के क्षेत्र जहां चयनित Gal4 और QF ड्राइवरों (चित्रा 2ए, बी) व्यक्त कर रहे है के माध्यम से z-स्लाइस छवियों को इकट्ठा करने के लिए ।
    1. फ्लोरोसेंट प्रोटीन फ्यूजन या उपयुक्त पराबैंगनीकिरण का उपयोग immunolabeled प्रोटीन उत्तेजित (उदा., 488 एनएम के लिए GFP/YFP/FITC या 552 एनएम के लिए mCherry/Cy3) । एक fluorophore के लिए विशिष्ट या तो एक वर्णक्रमीय जांच प्रणाली या बैंड/लंबे पास उत्सर्जन फिल्टर का उपयोग कर चैनल क्रॉस-टॉक को नष्ट करते हुए अधिकतम फ्लोरोसेंट संकेत कब्जा है कि पता लगाने खिड़कियों सेट करें ।
      नोट: इमेजिंग प्रोटीन समुच्चय जब चौकस रहो । यह एक समग्र के केंद्र में पिक्सल के लिए आसान है, विशेष रूप से बड़ा समुच्चय में संतृप्त हो जाते हैं । छवि में संतृप्ति को कम करने का प्रयास है, लेकिन छोटे एकत्रित प्रजातियों (चित्रा 2बी, सी, डी) से संकेत खोने के जोखिम के बारे में पता है । बहुत अधिक संतृप्ति छवि पृष्ठभूमि में वृद्धि होगी, इसे और अधिक मुश्किल अलग puncta की पहचान करने के लिए बना रही है । प्रत्येक डेटा सेट में अंतिम छवियां लेने से पहले ऑप्टिमाइज़ करने के लिए विभिंन इमेजिंग सेटिंग्स का परीक्षण करें ।
  2. व्यक्तिगत z-स्लाइस (उदा., चित्रा 2सी और चित्रा 4ए) या 3 आयामों में फोकल स्लाइस प्रतिपादन करने के बाद (चित्रा 3 के माध्यम से चलती द्वारा व्यक्तिगत रूप से या तो puncta द्वारा डेटा का विश्लेषण A, B) ।
    नोट: यह छवि जंमू या अंय छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर में किया जा सकता है ।
    1. यदि समुच्चय अच्छी तरह से अलग कर रहे है और वहां ंयूनतम पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति है, का उपयोग करें छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर व्यवस्थित की पहचान करने के लिए, यों तो, और अलग "वस्तुओं" या "के रूप में समुच्चय विश्लेषण के एक 3d पुनर्निर्माण में सतहों" फोकल स्टैक ( चित्र 3 ख) ।
      नोट: वर्णित सॉफ्टवेयर कार्रवाई साधन और सॉफ्टवेयर यहां इस्तेमाल के लिए विशिष्ट है ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
      1. 3d दृश्य मोड में एक फोकल जेड श्रृंखला कल्पना । चयनित चैनल में व्यक्तिगत स्थानों की पहचान करने के लिए "विश्लेषण" विज़ार्ड का उपयोग करें (उदा. चित्रा 3में HttQ91-mCherry समुच्चय के लिए लाल चैनल). छवि में व्यक्तिगत वस्तुओं के रूप में सभी विषम आकार के समुच्चय को सही प्रतिनिधित्व करने के लिए थ्रेसहोल्ड और फिल्टर समायोजित करें ।
      2. "विभाजित ऑब्जेक्ट्स" के अंतर्गत "बाइनरी प्रोसेसिंग प्री-फ़िल्टर" सक्षम करने के लिए निकटता से जुड़े समुच्चय है कि aberrantly सॉफ्टवेयर एल्गोरिथ्म द्वारा विलय कर रहे है अलग । नोट करें कि ऑब्जेक्ट्स की कुल संख्या और उनके संबंधित माप "माप." के अंतर्गत रिपोर्ट की गई है
        नोट: उत्परिवर्ती Htt समुच्चय को बढ़ाता है के लिए इस विधि immunostaining प्रोटोकॉल के लिए उत्तरदाई नहीं है क्योंकि amyloid समुच्चय के केंद्र, एंटीबॉडी को अभेद्य है । नतीजतन, समुच्चय के रूप में खुर्दबीन पर दिखाई अंगूठी की तरह संरचनाओं, और छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर को सही ढंग से पहचान करने में असमर्थ है और इन व्यक्तिगत "स्पॉट" भेद ।
    2. मैन्युअल रूप से z-स्टैक के माध्यम से चलती है और जंगली प्रकार Htt समुच्चय स्कोरिंग जंगली प्रकार Htt समुच्चय, यकीन है कि कोई समुच्चय डबल कर रहे हैं, तो वे एक से अधिक स्लाइस में दिखाई देते हैं (चित्रा 4ए).
      नोट: जब प्रत्येक फोकल स्टैक में समुच्चय की संख्या उचित है (उदा, 20-50), तो यह मैंयुअल ठहराव दृष्टिकोण का उपयोग किया जा सकता है । यह भी उपयोगी है जब छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर एक ही चैनल में सिग्नल आसपास से व्यक्तिगत puncta भेद नहीं कर सकता है (उदा., आसपास के कक्षों में फैलाना वंय-प्रकार Htt से संकेत) (चित्रा 2बी, सी और चित्रा 4 A). जंगली-प्रकार Htt समुच्चय भी चुनौतीपूर्ण हो सकता है क्योंकि मस्तिष्क में कई सामान्य संरचनाओं कबरा दिखाई देते हैं (जैसे, सेल प्रक्रियाओं और synapses). जंगली-प्रकार और उत्परिवर्ती Htt संकेतों के सह स्थानीयकरण एक चयन मापदंड के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है; हालांकि, यह संभव है कि कुछ उत्परिवर्ती Htt "बीज" फोकल का पता लगाने की सीमा से नीचे गिर जाते हैं । Htt के अलावा एक प्रोटीन है कि प्राप्तकर्ता कोशिकाओं में समग्र नहीं करता है (जैसे, GFP) मस्तिष्क में असंबंधित कबरा संरचनाओं लेबल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  3. व्यक्तिगत समुच्चय के आगे लक्षण वर्णन करने के लिए छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें । उदाहरण के लिए, समुच्चय के आकार वितरण का निर्धारण (चित्रा 3ग), प्रतिशत उत्परिवर्ती और जंगली प्रकार Htt प्रोटीन के बीच सह स्थानीयकरण (चित्रा 4ए), या सीधे उपाय प्रोटीन प्रोटीन बातचीत का उपयोग कर झल्लाहट ( चित्र 4 ख) ।
    1. किसी स्थान या सरफ़ेस डिटेक्शन एल्गोरिथ्म का उपयोग करके व्यक्तिगत puncta का आकार वितरण निर्धारित करें जो किसी विशेष चैनल में सभी दृश्यमान एग्रीगेट की सटीक रूप से पहचान करता है । स्पॉट या सतहों के प्रासंगिक माप लेने के लिए छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें, उदाहरण के लिए ' एकीकृत व्यास ' (अंजीर. 3 सी), ' मात्रा ', या ' तीव्रता ' से जानकारी प्राप्त करने के लिए ' माप ' सॉफ्टवेयर में "विश्लेषण" जादूगर चरण 5.2.1 में वर्णित.
      नोट: चित्रा 3मेंसी, हम सभी HttQ91-mCherry puncta एक एकल DA1 glomerulus में पहचान के लिए व्यास के वितरण की रिपोर्ट ।
    2. HttQ25-YFP और HttQ91-mCherry समुच्चय के बीच प्रतिशत सह स्थानीयकरण को मैन्युअल रूप से एक फोकल z-स्टैक (सबसे सटीक विधि) के माध्यम से स्लाइस-बाय-स्लाइस ले जाकर निर्धारित करें. हालांकि, ध्यान रखना किसी भी समुच्चय दो बार गिनती नहीं है । इसे रोकने के लिए, केवल एक विशेष z में समुच्चय गिनती-टुकड़ा अगर ध्यान का विमान कुल के केंद्र के माध्यम से है (चित्रा 4ए) ।
    3. स्वीकार्य mCherry विधि का उपयोग colocalized HttQ91-photobleaching संकेत के साथ प्रेरित HttQ25-YFP समुच्चय के लिए झल्लाहट दक्षता की गणना.
      1. सबसे पहले, YFP और mCherry चैनल के बीच संभावित क्रॉस-टॉक का पता लगाने के लिए mCherry-केवल और केवल YFP केवल संकेत है कि अंय चैनल में कोई संकेत उत्पादन की स्थापना के द्वारा समाप्त । इन सेटिंग्स का उपयोग कर, व्यक्तिगत HttQ25-YFP puncta और उनके संबद्ध HttQ91-mCherry संकेत ( चित्रा 4बी) की एक ' से पहले छवि ' ले ।
      2. फिर, लाल लेजर (उदा., 552 एनएम) का समायोजन करके mCherry सिग्नल को photobleach 100% तीव्रता और स्कैन जब तक सिग्नल चला गया है । ' छवि से पहले ' के लिए उपयोग की गई सेटिंग पर लौटें और समान puncta (चित्र 4B) की एक ' छवि के बाद ' लें ।
      3. छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग photobleaching से पहले और बाद में प्रत्येक punctum के लिए प्रतिदीप्ति तीव्रता माप की गणना.
      4. YFP दाता प्रतिदीप्ति ' से पहले छवि में मापा द्वारा झल्लाहट दक्षता की गणना ' (YFPप्रारंभिक) में YFP दाता प्रतिदीप्ति से ' के बाद छवि ' (YFPअंतिम) । इस मान को YFPअंतिमके आधार पर विभाजित करें, और 100 गुणा बढ़ाएं ।
        नोट: झल्लाहट क्षमता पिक्सेल द्वारा पिक्सेल या प्रत्येक HttQ25-YFP सकल (चित्रा 4बी) के लिए समग्र गणना की जा सकती है । स्वीकारकर्ता photobleaching जब प्रत्येक HttQ25 YFP punctum के साथ जुड़े mCherry संकेत पर्याप्त रूप से YFP mCherry के बाद detectable photobleaching शमन का उत्पादन करने के लिए उच्च है झल्लाहट क्षमता की गणना के लिए एक विशेष रूप से उपयोगी तकनीक है ।

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Representative Results

यहां वर्णित तरीके मजबूत एक कोशिका आबादी से Htt प्रोटीन समुच्चय के prion की तरह हस्तांतरण के प्रदर्शन के लिए बरकरार मक्खी सीएनएस में सुदृढ़ डेटा का उत्पादन । कबरा के लिए फैलाना से जंगली प्रकार Htt का रूपांतरण प्राप्तकर्ता glia में इस YFP फ्यूजन प्रोटीन के प्रत्यक्ष प्रतिदीप्ति द्वारा दाता HttQ91 में mCherry-ORNs अभिव्यक्ति का एक परिणाम के रूप में मनाया जाता है (चित्रा 2ए सी और चित्रा 4ए, बी). prion की सटीक रिपोर्टिंग की तरह इन दो सेल आबादी के बीच स्थानांतरण की घटनाओं ट्रांसजेनिक मक्खियों और Gal4/QF ड्राइवरों की सावधान चयन की आवश्यकता के लिए किसी भी ओवरलैप के बिना के उत्परिवर्ती और जंगली-प्रकार Htt transgenes के मजबूत अभिव्यक्ति स्तर का उत्पादन विकास या वयस्कता में । इसके अलावा, फ्लोरोसेंट प्रोटीन के विचारशील डिजाइन-Htt फ्यूजन transgenes शक्तिशाली बहाव विश्लेषण सक्षम कर सकते हैं । उदाहरण के लिए, उत्परिवर्ती और वंय-प्रकार Htt समुच्चय कबरा वस्तुओं के रूप में quantified जा सकता है या तो मैंयुअल रूप से (चित्रा 2सी और चित्रा 4एक) या छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर (चित्रा 3ए, बी) का उपयोग कर, मापा जा सकता है और कुल आबादी के रूप में आगे की विशेषता (चित्रा 3सी), उत्परिवर्ती और जंगली प्रकार के प्रोटीन के बीच सह स्थानीयकरण के लिए मूल्यांकन किया जा सकता है (चित्रा 4ए), और27 झल्लाहट के लिए विश्लेषण किया जा सकता है (चित्रा 4 ख). इन विश्लेषणों के उत्परिवर्ती और जंगली-पर्याप्त रूप से अलग प्रतिदीप्ति गुणों के साथ फ्लोरोसेंट प्रोटीन टैग करने के लिए प्रकार Htt के फ्यूजन की आवश्यकता है, लेकिन पर्याप्त वर्णक्रमीय के साथ दाता और स्वीकार करने के जोड़े के बीच झल्लाहट सक्षम करने के लिए ओवरलैप (उदा,/YFP9 या YFP/mCherry27).

Figure 2
चित्र 2 . glial HttQ25 के prion-तरह के रूपांतरण की फोकल छवियां-YFP द्वारा न्यूरॉन HttQ91-mCherry समुच्चय. (क) एक पुरुष मक्खी से एक antennal पालि में दिखाने वाले फोकल स्लाइस के ~ 30 µm का अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण HttQ91-mCherry (red) में DA1 ORN axons का उपयोग Or67d-QF और HttQ25-YFP (हरा) में रेपो-glia का उपयोग कर । antennal पालि और DA1 glomerulus की अनुमानित सीमाएं, जहां DA1 ORN axons समाप्त होती हैं, क्रमशः डॉटेड और ठोस रेखाओं द्वारा दर्शाई जाती हैं । (ख) से अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण फोकल स्लाइस के ~ 20 µm से DA1 glomerular क्षेत्र के एक बढ़ाया दृश्य दिखा रहा है. (C) एक एकल 0.35 µm फोकल स्लाइस दिखा एक एकल HttQ25-YFP puncta और उसके संबद्ध HttQ91-mCherry संकेत ( प्रत्येक चैनल में तीर से संकेत दिया) । लाल चैनल में संकेत HttQ25-YFP और HttQ91-mCherry संकेतों के बीच सह स्थानीयकरण की कल्पना करने के लिए बढ़ाया गया था । सभी छवियां एक 40X 1.4 न तेल उद्देश्य का उपयोग कर प्राप्त कर रहे थे । स्केल बार्स = 10 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3 . DA1 ORN axons में HttQ91-mCherry समुच्चय का त्रि-आयामी विश्लेषण । (क) चित्रा २बीमें दर्शाए गए समान डाटा का उपयोग करते हुए Or67d-QF के माध्यम से DA1 glomerulus में व्यक्त HttQ91-mCherry समुच्चय का 3डी चित्रण किया गया है. (ख) एक छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर पैकेज का उपयोग कर (एक) में कच्चे डेटा से पहचाना व्यक्तिगत वस्तुओं या "स्पॉट" दिखा स्क्रीनशॉट । सॉफ्टवेयर इस चैनल में अलग आकार के 56 वस्तुओं की पहचान की छवि/। इस स्थान (ख) में arrowhead द्वारा संकेत दिया गया था की एक व्यास है मापा गया ~ 1.2 µm. तीरों स्थानों जहां दो वस्तुओं गलत तरीके से एक स्थान में सॉफ्टवेयर द्वारा विलय कर रहे हैं, व्यक्तिगत puncta के करीब निकटता के कारण की संभावना को इंगित । इस पर काबू पाने के लिए, अलग थ्रेसहोल्ड सेटिंग्स सॉफ्टवेयर में परीक्षण किया जाना चाहिए और/या विलय स्पॉट मैंयुअल रूप से यदि संभव हो पृथक किया जाना चाहिए । स्केल पट्टियां = 10 µm. (C) हिस्टोग्राम दिखा रहा है HttQ91-mCherry "स्पॉट" (B) में दिखाए गए के लिए सॉफ़्टवेयर द्वारा मापा गया व्यास का वितरण । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 . उत्प्रेरण HttQ25-YFP समुच्चय का सह-स्थानीयकरण और झल्लाहट विश्लेषण. (क) एक पुरुष मक्खी मस्तिष्क से ४ व्यक्ति 0.35 µm फोकल जेड-स्लाइस की एक असेंबलिंग HttQ91-mCherry में DA1 ORNs का उपयोग Or67d-QF और HttQ25-YFP में रेपो-glia का प्रयोग कर Gal4. संकेतों को इतना समायोजित किया गया कि यहां तक कि छोटे HttQ91-mCherry समुच्चय दिखाई दे रहे हैं और प्रेरित HttQ25-YFP समुच्चय आसपास के फैलाना संकेत से बाहर खड़े हैं । दिखाए गए स्लाइसें एक से अलग हैं ~ 1.0 µm (विलय किए गए चित्रों के निचले दाएँ कोने में दर्शाई गई स्लाइस संख्या) ताकि एकाधिक समुच्चय को देखा जा सके. तीर HttQ25-YFP puncta कि विशेष रूप से जेड-स्टैक के माध्यम से मैन्युअल रूप से चलती द्वारा उस विशिष्ट z-स्लाइस में फोकस करने के लिए निर्धारित किए गए थे इंगित करते हैं । के सात HttQ25-YFP puncta ने यहाँ इंगित किया है, छः ने HttQ91-mCherry संकेत (अर्थात, ८६% HttQ25-YFP समुच्चय सह-information with HttQ91-mCherry) का पता लगा लिया है । ध्यान रहे कि HttQ25-YFP puncta से जुड़े mCherry संकेत अक्सर mCherry puncta में DA1-पॉजिटिव glomerulus के बहुमत से कमजोर हो जाते हैं । स्केल बार = 5 µm. (B) A HttQ25-YFP/HttQ91-mCherry-सह-स्थानीयकृत punctum से पहले (बाएं पैनल) और उसके बाद (सही पैनल) mCherry (स्वीकारकर्ता) photobleaching । YFP में जिसके परिणामस्वरूप वृद्धि (दाता) प्रतिदीप्ति के लिए एक पिक्सेल द्वारा पिक्सेल झल्लाहट क्षमता (झल्लाहटeff) AccPbFRET प्लग का उपयोग कर छवि में ImageJ46के लिए उत्पादन किया गया । यह विशेष रूप से कुल 61% की एक समग्र झल्लाहटeff है । स्केल बार = 1 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

जैसे-जैसे neurodegenerative रोगों से पीड़ित रोगियों की संख्या में वृद्धि जारी रहती है, वैसे-वैसे इन रोगों की आणविक रोगजनन की समझ को बढ़ाने की तत्काल आवश्यकता है ताकि बेहतर उपचारों का विकास किया जा सके. यहाँ, हम मॉडल जीव, Drosophila melanogasterमें विभिन्न कोशिका प्रकार के बीच रोगजनक प्रोटीन समुच्चय के prion की तरह संचरण की निगरानी के लिए अनुमति देते हैं कि तरीकों का वर्णन. हम हाल ही में इस पद्धति का इस्तेमाल किया है prion प्रदर्शन करने के लिए vivo में उत्परिवर्ती Htt समुच्चय की तरह संचरण और एक phagocytic रिसेप्टर कि न्यूरॉन्स से इन समुच्चय के प्रसार मध्यस्थता की पहचान करने के लिए glia27. हमारे दृष्टिकोण आनुवंशिक मानव रोग का अध्ययन करने के लिए Drosophila का उपयोग कर के कई लाभ का दोहन: अपने छोटे जीवन चक्र और विशाल आनुवंशिक toolset, जो चिकित्सकीय प्रासंगिक है कि बुनियादी जैविक जानकारी की खोज में तेजी लाने कर सकते हैं ।

तरीकों हम यहां का वर्णन अंय मौजूदा पशु और सेल prion के लिए संस्कृति के मॉडल संचरण की तरह पर दो प्रमुख लाभ प्रदान करते हैं: (1) एकत्र करना प्रेरणा का एजेंट (उदा, उत्परिवर्ती Htt) एक बरकरार ऊतक में रहने वाले एक सेल में उत्पादित है, और (2) सामांय रूप से एक ही प्रोटीन के जोड़ संस्करण की अभिव्यक्ति (जैसे, जंगली-एक अलग सेल जनसंख्या में प्रकार Htt) prion के लिए एक आसानी से सुलभ रिपोर्टर "प्रदान करता है जैसे घटनाओं । हम एक ही जीव के भीतर गैर अतिव्यापी कोशिका आबादी में Htt प्रोटीन के उत्परिवर्ती और जंगली प्रकार की अभिव्यक्ति हासिल की है परिष्कृत आनुवंशिक उपकरण है कि अच्छी तरह से कर रहे है का उपयोग करके Drosophila40में स्थापित । क्योंकि कई अलग ऊतक विशिष्ट Gal4 और QF ड्राइवरों आसानी से उपलब्ध हैं, के बीच अनिवार्य रूप से स्थानांतरण की जांच prion-मक्खी शरीर में किसी भी विशिष्ट कोशिका प्रकार के बीच संभव है ।

दृष्टिकोण का एक महत्वपूर्ण घटक के उत्परिवर्ती और वंय-प्रकार Htt प्रोटीन के विभिंन कोशिका आबादी में एक ही जानवर के भीतर अलग अभिव्यक्ति प्राप्त है । किसी भी व्यंजक ओवरलैप को समाप्त किया जा करने की आवश्यकता है ताकि प्राप्तकर्ता कक्षों में वाइल्ड-टाइप Htt एग्रीगेट सही प्रकार से prion-जैसे समुच्चय की cytoplasmic पहुंच दाता कक्ष9,12,27में उत्पंन हो, 41. इस मुद्दे को कम करने के लिए अतिरिक्त आनुवंशिक उपकरण (जैसे, Gal80 और QS दमन40) शुरू करने से पूरा किया जा सकता है । एक बार आदर्श जीनोटाइप डिजाइन और चयनित है, puncta को बढ़ाता है के लिए एक व्यवस्थित विधि स्थापित किया जाना चाहिए । यह मुख्यतः उन कक्षों की संख्या पर निर्भर करेगा जो लेबल किए गए हैं, समुच्चय की संख्या, और नमूने के सिग्नल-से-शोर अनुपात । जैसे कि हम यहाँ चित्रा 4में वर्णन किया गया डेटा का विश्लेषण करने के लिए सह-स्थानीयकरण और/या सकारात्मक झल्लाहट के रूप में मापदंड का उपयोग किया जा सकता है । हालांकि, इन सुविधाओं के आधार पर जंगली प्रकार के Htt समुच्चय का चयन सीमित prion की तरह हस्तांतरण की घटनाओं को कम करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, के बाद से कुछ उत्परिवर्ती Htt सकल बीज फोकल माइक्रोस्कोप का पता लगाने की सीमा से नीचे गिर सकता है ।

यहां वर्णित vivo में दृष्टिकोण HD या यहां तक कि अंय polyQ विकारों के साथ जुड़े समुच्चय के prion तरह व्यवहार के लिए अनंय नहीं है । ट्रांसजेनिक मक्खियों की जांच करने के लिए विकसित किया जा सकता है prion-अल्फा के प्रसार की तरह-synuclein में पीडी, ताऊ, विज्ञापन में, और SOD1 या तेदेपा-43 ALS में एक ही प्रायोगिक प्रतिमान का उपयोग कर । इन प्रोटीन से प्रत्येक के लिए, एक एकत्रीकरण प्रवण उत्परिवर्ती दाता कोशिकाओं में व्यक्त किया जाना चाहिए, और एक ही प्रोटीन के एक घुलनशील संस्करण है कि केवल समुच्चय जब nucleated प्राप्तकर्ता कोशिकाओं में व्यक्त किया जाना चाहिए । इस प्रयोगात्मक प्रतिमान भी उभरते विचार है कि रोगजनक प्रोटीन विभिंन रोगों के साथ जुड़े एक पार के माध्यम से बातचीत कर सकते है की जांच के लिए उपयोगी हो सकता है, तंत्र47। अंत में, असंख्य आनुवंशिक उपकरण Drosophila में उपलब्ध जांच और आणविक तंत्र (ओं) की पहचान करने के लिए लागू किया जा सकता है कोशिका द्रव्य-to-कोशिका द्रव्य प्रसार रोगजनक प्रोटीन समुच्चय इन घातक रोगों के साथ जुड़े ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम इन तरीकों के विकास के दौरान कई उपयोगी विचार विमर्श के लिए Kopito, लुओ, और Pearce लैब्स के सदस्यों को धंयवाद । हम भी इस पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए ब्रायन Temsamrit धंयवाद । यह काम विज्ञान विश्वविद्यालय और W.W. स्मिथ चैरिटेबल ट्रस्ट से धन द्वारा समर्थित किया गया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphate buffered saline (PBS), 10X, pH 7.4 ThermoFisher Scientific AM9625 Dilute to 1X
Triton X-100 Sigma-Aldrich T9284-1L
Kimwipes Thomas Scientific 2904F24
20% paraformaldehyde (PFA) Electron Microscopy Sciences 15713-S
Normal Goat Serum (NGS), filtered Lampire Biological Laboratories 7332500 Aliquot and freeze upon receipt
Chicken anti-GFP Aves Labs GFP-1020 Use at 1:500 dilution
Rabbit anti-DsRed Clontech 632496 Use at 1:2000 dilution; can recognize DsRed-based fluorescent proteins (e.g. mCherry, mStrawberry, tdTomato, etc.)
Mouse anti-Bruchpilot Developmental Studies Hybridoma Bank nc82 Use at 1:100 dilution; will label active pre-synaptic structures thoughout the fly brain
FITC anti-chicken ThermoFisher Scientific SA1-7200 Use at 1:250 dilution
Alexa Fluor 568 anti-rabbit Life Technologies A11011 Use at 1:250 dilution
Alexa Fluor 647 anti-mouse antibody Life Technologies A21235 Use at 1:250 dilution
Slowfade Gold Antifade Reagent Life Technologies S36936
Microscope Slides (25 x 75 x 1.0 mm) Fisher Scientific 12-550-143
Cover Glass (22 x 22 mm) Globe Scientific 1404-15
Dumont Biology Grade Forceps, Style 3 Ted Pella 503 use in non-dominant hand
Dumont Biology Grade Forceps, Style 5 Ted Pella 505 use in dominant hand
LAS X image analysis software Leica
Imaris image analysis software Bitplane

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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तंत्रिका विज्ञान अंक 133 Neurodegenerative रोग प्रोटीन सकल प्रोटीन का खुलासा prion की तरह संचरण समग्र प्रसार Drosophila ंयूरॉन glia मस्तिष्क
<em>Drosophila Melanogaster</em> में Prion-जैसे प्रोटीन समुच्चय के सेल-टू-सेल ट्रांसमिशन का निरीक्षण
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Donnelly, K. M., Pearce, M. M. P.… More

Donnelly, K. M., Pearce, M. M. P. Monitoring Cell-to-cell Transmission of Prion-like Protein Aggregates in Drosophila Melanogaster. J. Vis. Exp. (133), e56906, doi:10.3791/56906 (2018).

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