Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Overvåking celle til celle overføring av Prion som Protein mengdefunksjoner i Drosophila Melanogaster

doi: 10.3791/56906 Published: March 12, 2018

Summary

Samler bevis støtter ideen om at sykdomsfremkallende protein aggregater knyttet til nevrodegenerative sykdommer spre mellom celler med prion-lignende egenskaper. Her beskriver vi en metode som gjør at visualisering av celle-til-celle spredning av prion som aggregater i modellen organismen, Drosophila melanogaster.

Abstract

Protein samling er en sentral funksjon for de fleste nevrodegenerative sykdommer, inkludert Alzheimers sykdom (AD), Parkinsons sykdom (PD), Huntingtons sykdom (HD) og amyotrofisk lateral sklerose (ALS). Protein aggregater er nært forbundet med neuropathology i disse sykdommer, men den eksakte mekanismen som avvikende protein aggregering forstyrrer vanlig mobilnettet homeostase ikke er kjent. Nye data gir sterk støtte for hypotesen at sykdomsfremkallende mengdefunksjoner i Annonsen, PD, HD, og ALS har mange likheter prioner, som er bare protein smittestoffer ansvarlig for smittsomme kugalskap Anne encephalopathies. Prioner replikere selv av templating konvertering av innfødt-brettet versjoner av samme protein, forårsaker spredning av aggregering fenotypen. Hvordan prioner og prion-lignende proteiner i Annonsen, PD, HD og ALS trekk fra en celle til en annen er et område av intens gransking. Her beskrives Drosophila melanogaster modell som tillater overvåking av prion-lignende, celle-til-celle overføring av mutant huntingtin (Htt) aggregater forbundet med HD. Denne modellen tar nytte av kraftige verktøy for å manipulere transgene uttrykk i mange forskjellige Drosophila vev og benytter en fluorescently merket cytoplasmatiske protein til direkte rapport prion som overføring av mutant Htt aggregater. Viktigere, kan tilnærmingen vi beskriver her brukes til å identifisere romanen gener og veier som megle spredning av protein aggregater mellom ulike cellen typer i vivo. Informasjon fra disse studiene utvide begrenset forståelse av patogene mekanismer som ligger til grunn for nevrodegenerative sykdommer og avsløre nye muligheter for terapeutisk intervensjon.

Introduction

Prion hypotesen uttaler at smittsomme agent ansvarlig for smittsomme kugalskap Anne encephalopathies (f.eksCreutzfeldt - Jakob sykdom hos mennesker, Skrapesyke sauer, kronisk herjer sykdom i hjort og elg og "kugalskap" i storfe ) utelukkende består av protein og blottet for nukleinsyrer1. Prionsykdommer inneholder mobilnettet prion protein (PrPC) en ikke-native, stabil fold (PrPSc) som er svært beta ark-rik og kan selv reprodusere ved konvertering og rekruttere monomerisk PrPC molekyler i stabil amyloid samler. PrPSc aggregater bruke denne selvreproduserende mekanismen for å spre mellom forskjellige cellene i en organisme og mellom individuelle organismer2.

Protein misfolding og aggregering er også en sentral funksjon for de fleste nevrodegenerative sykdommer (Alzheimers sykdom (AD), Parkinsons sykdom (PD), Huntingtons sykdom (HD) og amyotrofisk lateral sklerose (ALS))3. Dannelsen av intra - eller ekstra cellular aggregert protein samlinger i disse sykdommene er nært forbundet med cytotoksisitet4 og fortsetter langs svært reproduserbare og sykdom-spesifikke stier gjennom hjernen over tid5, 6. disse mønstrene spredningen foreslår at sykdomsfremkallende aggregater knyttet disse lidelser har prion-lignende egenskaper. Sterk støtte finnes nå prion som overføring av aggregater forbundet med Annonsen, PD, HD og ALS - de spredte seg fra celle til celle og mal conformational endringen av monomerisk samme protein i tidligere upåvirket celler7, 8.

Fleste studier undersøker prion som spredning av protein aggregater hittil har utført med pattedyr celle kultur modeller, der aggregater overføring i cytoplasma naiv celler fra ekstracellulære plass eller fra en annen celle cytoplasma9,10,11,12,13,14,15, eller injisere samlet inneholder materiale i musen hjerner og overvåking samle utseende utenfor de injeksjon område16,17,18,19,20,21,22, 23. mer nylig transgene dyrene har blitt brukt til å demonstrere at intracellulær aggregater spre seg til andre celler i intakt hjerner24,25,26,27, 28,29,30. Her beskriver vi en metode for direkte visualisering av samlet overføring mellom enkeltceller i Drosophila melanogasterintakt hjerne. Drosophila modeller av HD/polyglutamine (polyQ) sykdommer ble først utviklet nesten to tiår siden31,32 og har gitt mange uvurderlig innsikt i de patogene mekanismene som ligger til grunn for disse lidelser 33. HD er en arvelig nevrodegenerativ lidelse forårsaket av en autosomal dominant mutasjon i genet som koder for protein huntingtin (Htt)34. Denne mutasjonen resulterer i utvidelsen av polyQ strekk nær Htt's N-terminus utover en sykdomsfremkallende terskel for ~ 37 glutamines, forårsaker protein misfold og samlet35,36. Vill-type Htt proteiner som inneholder < 37 glutamines i denne strekningen oppnå sin opprinnelige fold, men kan induserte å samle på direkte fysisk kontakt med en Htt samlet "frø"12,27,37. Vi utnytte denne homotypic, kjerne samling av vill-type Htt som en avlesning for prion-lignende overføring og cytoplasmatiske oppføring av mutant Htt aggregater opprinnelse i andre celler.

Bestemme mekanismer av hvilke prion som aggregater kan reise mellom celler føre til identifisering av romanen terapeutiske mål for uhelbredelig nevrodegenerative sykdommer. Vi tar nytte av rask levetid, brukervennlighet og genetisk tractability av Drosophila melanogaster definere molekylære mekanismer for celle til celle spredning av mutant Htt aggregater. Vår eksperimentelle strategi benytter to binære uttrykk systemer tilgjengelig i Drosophila, den veletablerte Gal4-spesifikke oppstrøms aktivering sekvens (Gal4-UAS) systemet38 og den nylig utviklet QF-QUAS systemet39. Koble disse to uavhengige systemene kan begrense uttrykk for mutant og vill-type Htt effekter av transgener til ulike celle populasjoner i samme fly40. Bruker denne tilnærmingen, undersøke vi prion som spredning av mutant Htt ved å overvåke videreformidling av cytoplasmatiske vill-type Htt fra tilstanden vanligvis diffus, løselig til en samlet stat, en direkte konsekvens av fysisk kontakt med en pre-formet mutant Htt samlet "frø". Konvertering av vill-type Htt av mutant Htt kan bekreftes med biokjemiske eller Biofysiske teknikker som rapporterer protein-protein interaksjoner, for eksempel fluorescens resonans energi overføring (bånd)9,27,41 .

Viktigere, får vi også en rekke genetisk verktøy i Drosophila å identifisere gener og/eller veier som megle prion som spredning av protein aggregat. Vi har nylig brukt denne tilnærmingen for å avsløre en nøkkelrolle for cellen overflaten scavenger receptor, Draper42,43, overføre mutant Htt aggregater fra neuronal axons til nærliggende phagocytic glia i Drosophila sentrale nervesystemet (CNS)27. Dermed kan den genetiske og bildebehandling-tilnærmingen som vi beskriver her avsløre viktig grunnleggende biologisk informasjon om en sykdom relevante fenomen i enkel-å-bruk men kraftig modell organisme, Drosophila.

Protocol

1. Koble Gal4 - og QF-mediert Htt Transgene uttrykk i Drosophila

  1. Samle og/eller generere transgene Drosophila melanogaster linjer med vev-spesifikke Gal4 eller QF "drivers", samt linjer med vill-type eller mutant Htt effekter av transgener nedstrøms av Gal4-UAS38 eller QF-QUAS39. Kontroller at proteiner som er uttrykt fra disse effekter av transgener er smeltet fluorescerende proteiner eller epitope-merket å tillate differensiering av mutant og vill-type Htt transgene produkter i samme fly. Se figur 1.
    Merk: Vi vanligvis bruker ekson 1 fragmenter av de menneskelige Htt gene27. Imidlertid blir transgene fluer i stedet generert for å uttrykke lengre Htt fragmenter eller andre gener hvis ønskelig.
  2. Planlegge genetisk strategien slik at mutant og vill-type Htt effekter av transgener måles i forskjellige, ikke-overlappende celle populasjoner.
    1. Hvis det oppstår noen uttrykk overlapper, vil mutant og vill-type Htt proteiner syntetisert i de samme cellene co samlet og hindre oppdagelsen av prion-lignende hendelser. For å unngå dette, bruker Gal4 og QF bestemte repressors, Gal80 og QS40, henholdsvis (figur 1). Velge developmentally-kontrollerte Gal4 og/eller QF drivere kan hjelpe begrense uttrykk av mutant Htt til post mitotisk celler, elimineres muligheten for at celledeling kan bidra til celle til celle samlet sprer seg.
  3. Bruker standard dyrking forhold, mate de flyr for å generere avkom som uttrykker mutant Htt via QF (eller Gal4) i en "donor" celle befolkningen og vill-type Htt via Gal4 (eller QF) i en "mottaker" celle befolkningen. Se figur 1 for en skjematisk viser en mulig genetisk kombinasjon.
    Merk: QF og Gal4 driverne som ble brukt til å generere dataene som vises i tallene 1-4 og vår forrige publikasjonen27 inkluderer DA1 olfactory reseptor Nevron (ORN) driveren, Or67d-QF, og pan-glial sjåfør, repo-Gal4.
  4. Generere kontroll fluer parallelt som uttrykker vill-type Htt i både QF - og Gal4-merket celle populasjoner.
  5. Samle avkom av ønsket genotype, og alder dyrene etter behov.

Figure 1
Figur 1 . Genetisk tilnærming for kombinert uttrykk for mutant og vill-type Htt effekter av transgener med QF-QUAS og Gal4-UAS binære uttrykk systemene. "Celle A," en mCherry-merket mutant Htt protein inneholder sykdomsfremkallende lengde polyQ strekk (Q91) er uttrykt ved hjelp av en QF driver ligger nedstrøms en vev-spesifikke formidler en (PA"). "Celle B," uttrykkes en YFP-merket vill-type Htt som inneholder vanlige polyQ strekk (Q25) via en Gal4 driver kontrollert av vev-spesifikke arrangøren B (PB"). I tallene 2-4, Or67d-QF ble brukt til å kjøre QUAS-HttQ91-mCherry uttrykk i DA1 ORNs og repo-Gal4 ble brukt til å uttrykke UAS-HttQ25-YFP alle glia27. Viktigere, uttrykkes bare HttQ91-mCherry i QF-uttrykke celler i kraft QUAS sekvensen plassert over av transgene. Tilsvarende uttrykkes bare HttQ25-YFP via Gal4, som spesielt gjenkjenner UAS. Hvis noen overlapping i vev fordelingen av de QF og Gal4 driverne oppdages, kan effekter av transgener koding QS i Gal4-uttrykke celler og Gal80 i QF-uttrykke celler innføres. Tilføye fluorescerende protein koder på vill-type og mutant Htt tillater differensiering av to proteiner under bildebehandling og muligheten til å måle bånd mellom passende donor/acceptor par (f.eksCFP/YFP eller YFP/mCherry). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

2. micro-disseksjon og fiksering voksen Drosophila hjerner

Merk: Denne disseksjon prosedyren er endret fra en tidligere publikasjon44, og kan brukes til å forberede hjernen imaging direkte fluorescens signalet fra Htt-fluorescerende protein fusjoner. Endringer i prosedyren som kan gjøres for immunostaining hjernen er omtalt i neste avsnitt.

  1. Samle følgende materialer og plassere på is: fosfat-bufret saline inneholder 0,03% Triton X-100 (PBS/T); microcentrifuge rør som inneholder 970 µL av 4% paraformaldehyde (PFA) etappe, den stabiliserende løsning utarbeidet av tilføyer 200 µL 20% PFA til 770 µL PBS/T; et klart glass rett som inneholder bra; en engangs overføring Pipetter; to dissecting tang (en nr. 3 og en nr. 5).
  2. Bedøve voksne fluene bruker CO2 og overføre dem til en brønn av glass rett på is.
  3. Bruke en overføring Pipetter, legge til litt (~ 500 µL) av kaldt PBS/T til det også inneholder flyr også til en tom brønn. Unngå introdusere mange bobler som de kan forstyrre dissection.
  4. Plasser glass rett på flate under dissecting mikroskop og justere forstørrelsen til fly kroppen fyller synsfelt og er i fokus.
  5. Plasser et par svanehals lyskilder slik at lyset lyser begge sider av glass parabolen. Forankre en foldet lab vev under glass parabolen forkaste kroppen deler/cuticle under dissection.
  6. Bruker nr. 3 tang i ikke-dominante hånd, overfør en enkelt fly til den godt med PBS/T. nakkens fly ved å gripe tak i buken med ventral side opp..
  7. Holde fly fullt neddykket i PBS/T, fjerne fly hodet med nr. 5 tang i dominerende hånden. Setter inn et tips av denne tang under cuticle liten plass ved snabel på den ene siden av fly hodet. Sikre grep på hodet ved å knipe tang for å gripe tak i øyet fra begge sider.
  8. Fjerne fly hodet fra kroppen ved å trekke to Tang fra hverandre. Kast fly kroppen på en lab vev plassert i nærheten. Opprettholde trykket på dominerende hånd tang slik at fly hodet ikke er tapt.
  9. Posisjon en spissen av Tang nummer 3 i det ikke-dominant hånd i samme lite plass under cuticle på den andre siden av snabel. Når posisjonert, knip tang å gripe øynene på samme sted på begge sider av hodet.
  10. Når grepet på cuticle er sikker, trekk forsiktig Tang fra hverandre på 180°. Denne handlingen vil bryte fra hverandre hodet cuticle uten å skade hjernen. Kast cuticle rester på en lab vev.
    1. Men ideelt, kanskje hodet cuticle fjernes ikke fullstendig i ett trinn. I dette tilfellet fjerne cuticle stykke for stykke til hjernen er fullt eksponert. Ta vare ikke for å skade hjernen ved å unngå direkte kontakt med tang.
  11. Fjern dissekert hjernen fra PBS/T ved griper tak i en tilknyttet luftrøret, eller ved aspirating hjernen i mellomrommet mellom tang tips av kapillær handling.
    Merk: Luftrøret fjerning er valgfritt, som det pleier å ikke skjule antennal lobes på fremre overflaten av hjernen hvor vi vanligvis bilde. Men hvis luftrøret forstyrre bildebehandling, fjerne dem nøye så hjernen ikke er skadet av dette manipulasjon.
  12. Overføre fly hjernen til en av microcentrifuge rør som inneholder etappe, den stabiliserende løsning på is. Kontroller at hjernen løsner fra tang og er neddykket i etappe, den stabiliserende løsningen.
  13. Når alle hjernene har blitt dissekert, gitt dem til en "kort-fix" ved å plassere lukket rør på en nutator for ~ 5 min ved romtemperatur i mørket.
    Merk: Dette kort fiksering trinnet sikrer at hjernen er lettere å håndtere i de etterfølgende trinnene og ikke overholder sidene av microcentrifuge røret.
  14. Fjerne meste av etappe, den stabiliserende løsningen med en P1000 pipette og kaste den.
    1. Unngå aspirating hjernen fra tuben under dette og alle påfølgende wash trinn. Angi P1000 til et lavere volum (f.eks, 650 µL) og fjerne nedbryting i to trinn. I tillegg hold microcentrifuge rør i tråd med en lyskilde (f.eks overhead lys) mens aspirating for bedre å visualisere hjernen.
  15. Legge 1 mL av fersk PBS/T til hjernen. Vask raskt (< 1 min) i mørket, Sug opp nedbryting fra hjernen, og kast.
  16. Gjenta vask med PBS/T i mørket ved romtemperatur etter følgende tidsplan: 2 rask (< 1 min) vasker, 1 X 5 minutter, 3 X 20 min og 1 X 1 h vask. Sikre topper på microcentrifuge rør og plassere rør på en nutator mellom vasker.
    1. Hvis DAPI flekker er ønskelig, etterfulgt Erstatt siste 1t vask med 1 X 30 min incubation med 250 ng/mL DAPI fortynnet i PBS/T, av 2 X rask og 1 X 20 min vasker.
  17. Etter siste vask, fjerner de fleste vaske bufferen nedbryting, ta vare ikke for å forstyrre hjernen, og legge 30 µL av glyserol-baserte antifade reagensen til hjernen. Ruge på 4 ° C i mørket uten minst 1 h og opp til 24 timer.

3. endringer i del 2 på immunostai-voksen hjernen

Merk: Bruk denne protokollen for imaging ikke-fluorescerende proteiner eller fluorescerende protein fusjoner med svak fluorescens.

  1. Øker konsentrasjonen av Triton X-100 i PBS/T av 10-fold (PBS + 0,3% Triton X-100) for hvert trinn. Dette sikrer at det finnes nok vaskemiddel permeabilize celle membraner og tillate antistoffer til intracellulær mellomrom.
  2. Fastsette hjernen i 4% PFA i PBS/T etter 20 min ved romtemperatur.
  3. Etter utfører alle vasker, ruge hjernen nylagde blokkerer buffer (PBS/T + 5% normal geit serum (NGS)) i 30 min ved romtemperatur i mørket.
  4. Fjerne og slette blokkerer bufferen. Legge til 0,5 mL av primære antistoff løsning per tube utarbeidet som en master blanding av fortynne primære antistoffer som passer i frisk blokkerer buffer (se Tabell for materiale for brukte antistoffer og fortynninger). Inkuber hjernen i primære antistoffer på en nutator for minst 24 timer på 4 ° C i mørket.
  5. Fjerne den primære antistoff løsningen fra hjernen bruker en P1000 og reserver i en fersk rør. Legg 1 mL av PBS/T å vaske hjernen.
    Merk: Reservert primære antistoff løsningen kan lagres på 4 ° C i opptil fire uker. Vi har vellykket gjenvunnet primære antistoffer opptil to ganger i etterfølgende eksperimenter.
  6. Vaske hjernen raskt (< 1 min) i PBS/T, Sug opp nedbryting fra hjernen, og kast. Gjenta denne rask vask igjen.
  7. Fortsette vask med 1 mL PBS/T ved romtemperatur etter følgende tidsplan: 1 X 5 minutter, 3 X 20 min og 1 X 1 h vask. Sikre topper på microcentrifuge rør og plassere rør på en nutator under vasker.
  8. Etter siste vask, fjerne fleste PBS/T nedbryting av og legge til 0,5 mL av sekundær antistoff løsning utarbeidet som en master blanding av fortynne antistoffer som passer i frisk blokkerer buffer (se Tabell for materiale for brukte antistoffer og fortynninger). Inkuber hjerner i sekundære antistoffer for 24 h på 4 ° C i mørket.
  9. Gjenta vask i trinn 3.5, 3.6 og 3.7 etter inkubasjon med sekundær antistoffer.
  10. Etter siste vask, fjerne meste av vaskebuffer og sørge for at alle hjerner er plassert på bunnen av røret. Legge til 30 µL antifade reagensen i hjernen. Ruge på 4 ° C i mørket uten bevegelse for 16-24 h.

4. hele hjernen montering

  1. Plass en barometer microscope skyve under en dissecting mikroskop og etikett med identifiserende informasjon.
    Merk: Alternativt hjernen kan monteres direkte på et cover glass til begge sider av hjernen under bildebehandling. En protokoll som beskriver denne montering prosedyren har vært publisert tidligere45.
  2. Fjerne hjernen fra hver microcentrifuge rør med en avstumpet Pipetter tips (tilberedt med et barberblad fjerne bunnen ~ 1 cm utenfor en 1-200 µL spissen) og overføre dem inn i midten av lysbildet. Overfør som liten antifade reagens hjernen som mulig.
  3. Bruk tang til å plassere hjernen i ønsket retning (f.eksdorsal peker mot toppen av lysbildet og fremre overflaten grossist for imaging antennal lobe). Når du orientere hjernen, vurdere lys banen til mikroskopet skal brukes for imaging dem.
  4. Fjern overflødig antifade reagens fra lysbildet med spisse hjørnet av en foldet lab vev uten å forstyrre hjernen. La lysbildet sitte for ~ 5-10 min i mørket tillate hjerne til å overholde lysbildet.
  5. Omgi fly hjernen med fire små biter av knust forsiden glass på hver side av hjernen til et felt som er ~ 19 mm x 19 mm. Plasser en av kantene på en 22 x 22 mm nr 1.5 cover glass like utenfor en av disse små biter av glass , og forsiktig lavere i dekkglassvæske over hjerne til å fullføre bridge-fjellet.
  6. Sakte dispensere frisk antifade reagens for å fylle overflaten under dekkglassvæske, pass på ikke å forstyrre dekkglassvæske eller hjernen. Tørke av eventuelle overskytende antifade bruke spisse hjørnet av en foldet lab vev uten direkte kontakt med dekkglassvæske.
  7. Legg en dråpe klare, hurtigtørkende neglelakk til hver av de fire hjørnene av dekkglassvæske. La tørke ~ 10 min. Deretter forsegle de fire kantene på dekkglassvæske med neglelakk til helt omslutter hjernen.
  8. Bilde hjerner umiddelbart, eller lagre på 4 ° C til du er klar.
    1. Hvis imaging iboende fluorescens fra Htt-fluorescerende protein fusjoner, bilde hjernen innen 24 timer for beste signalet.

5. imaging og kvantifisere Prion som overføring av aggregater

  1. Bilde montert hjernen ved hjelp av en AC confocal mikroskop utstyrt med en 40 X eller 60/63 X oljeobjektiv å samle z-bit bilder gjennom regionen av hjernen hvor de valgte Gal4 og QF driverne uttrykkes (figur 2A, B).
    1. Opphisse fluorescerende protein fusjoner eller immunolabeled proteiner ved hjelp av de aktuelle lasere (f.eks488 nm for GFP/YFP/FITC eller 552 nm for mCherry/Cy3). Angi oppdagelsen at fangst maksimal fluorescerende signalet mens de eliminerer kanal cross-talk med spektral deteksjon system eller band/lang pass utslipp filtre spesifikke for hver fluorophore.
      Merk: Være oppmerksomme når imaging protein aggregat. Det er lett for bildepunkter i midten av hver aggregat for å bli mettet, spesielt i større mengder. Forsøk på å redusere metning i bildet, men være klar over risikoen for å miste signalet fra mindre samlet arter (figur 2B, C, D). For mye metning vil øke bildebakgrunnen, gjør det vanskeligere å identifisere isolert puncta. Test forskjellige imaging for å optimalisere før du tar den endelige bilder i hvert datasett.
  2. Analysere dataene ved kvantifisere personlige puncta enten manuelt ved å flytte gjennom z-enkeltsektorer (f.eks figur 2C og Figur 4A) eller etter gjengivelse AC confocal sektorene i 3 dimensjoner (Figur 3 A, B).
    Merk: Dette kan gjøres i bildet J eller andre bildebehandling.
    1. Hvis aggregatene er godt atskilt og det er minimal bakgrunn fluorescens, bruk image analyseprogramvare å systematisk identifisere kvantifisere og analysere aggregatene som tydelig "objekter" eller "overflater" i en 3D rekonstruksjon av AC confocal stabel ( Figur 3 B).
      Merk: Programvare handlingene beskrevet er spesifikk for instrumentet og programvaren som brukes her (se Tabell for materiale).
      1. Visualisere en AC confocal z-serien i 3D visningsmodus. Bruk veiviseren for "Analyse" for å identifisere enkeltsteder i valgte kanal (f.eks den røde kanalen for HttQ91-mCherry samler i Figur 3). Justere terskelverdi og filtre for nøyaktig representere alle heterogeneously størrelse aggregater som individuelle objekter i bildet.
      2. Aktiver "Splitte objekter" under "Binær behandling pre Filter" å skille tett forbundet aggregater som er aberrantly flettet av programvare algoritmen. Merk at det totale antallet objekter og deres tilknyttede målinger rapporteres under "Mål."
        Merk: Denne metoden for kvantifisere mutant Htt aggregater er ikke mottakelig for immunostai-protokollen fordi midten av amyloid aggregat, er ugjennomtrengelig for antistoffer. Resultatet av aggregater vises på mikroskopet som ring-lignende strukturer, og analyseprogramvare er ikke nøyaktig identifisere og skille disse personlige "flekker".
    2. Kvantifisere vill-type Htt aggregater ved å manuelt flytte gjennom z-stakken og scoring vill-type Htt aggregat, sørge for at ingen oppsamlinger er dobbel-scoret hvis de vises i mer enn én sektor (Figur 4A).
      Merk: Denne manuelle kvantifisering kan brukes når mengdefunksjoner i hver AC confocal bunke er rimelig (f.eks20-50). Det er også nyttig når analyseprogramvare ikke skille personlige puncta fra omkringliggende signal i samme kanal (f.ekssignalet fra diffuse vill-type Htt i nærliggende celler) (figur 2B, C og Figur 4 A). kvantifisering vill-type Htt aggregater kan også være utfordrende fordi mange vanlige strukturer i hjernen vises vises punctate (f.ekscelleprosesser og synapser). Co lokalisering av vill-type og mutant Htt signaler kan brukes som et utvalgskriterium; Det er imidlertid mulig at noen mutant Htt "frø" faller under grensen for påvisning av den AC confocal. Et protein enn Htt som ikke samlet i mottakerens cellene (f.eksGFP) kan brukes til å merke urelaterte vises punctate strukturer i hjernen.
  3. Bruk image analyseprogramvare for å utføre ytterligere karakterisering av personlige aggregater. For eksempel fordelingen størrelse av aggregater (Figur 3C), prosent co lokalisering mellom mutant og vill-type Htt proteiner (Figur 4A), eller direkte måle protein-protein interaksjoner ved hjelp av bånd ( Figur 4 B).
    1. Fordelingen størrelse av personlige puncta ved hjelp av en spot- eller overflate algoritme som nøyaktig identifiserer alle synlige mengdefunksjoner i en bestemt kanal. Bruk image analyseprogramvare for å ta relevant mål av flekker eller flater, for eksempel skaffe 'samlet diameter' (Fig. 3 C), 'volum' eller "intensitet" informasjon fra 'Mål' i veiviseren "Analyse" beskrevet i trinn 5.2.1 Oppgi.
      Merk: I Figur 3Cvi rapportere fordelingen av diameter for alle HttQ91-mCherry puncta i en enkelt DA1 glomerulus.
    2. Bestemme den prosent co lokaliseringen mellom HttQ25-YFP og HttQ91-mCherry-aggregater ved manuell flytting skive av skive gjennom en AC confocal z-stabel (mest nøyaktige metoden). Men ta vare ikke for å telle noen aggregater to ganger. For å unngå dette, bare telle mengdefunksjoner i en bestemt z-del hvis flyet av fokus gjennom midten av samlet (Figur 4A).
    3. Beregne bånd effektivitet for indusert HttQ25-YFP-aggregater med colocalized HttQ91-mCherry signal med metoden acceptor photobleaching.
      1. Først fjerne potensielle kryss-snakk mellom YFP og mCherry kanal ved å etablere oppdagelsen Vinduer for bare mCherry og YFP-bare signaler som produserer ingen signal i den andre kanalen. Bruke disse innstillingene, ta en 'før bilde' personlige HttQ25-YFP puncta og deres tilknyttede HttQ91-mCherry-signal ( Figur 4B).
      2. Deretter photobleach mCherry signalet ved å justere rød laser (f.eks552 nm) til 100% intensitet og skanning til signalet er borte. Gå tilbake til innstillingene som brukes for "før image" og ta en "etter avbildning" av den samme puncta (Figur 4B).
      3. Beregne fluorescens intensitet mål for hver punctum før og etter photobleaching med analyseprogramvare.
      4. Beregne bånd effektivitet ved å trekke YFP donor fluorescens målt i den "før bilde' (YFPførste) fra YFP donor fluorescens i 'etter image' (YFPendelig). Dele denne verdien YFPendelige, og multiplisere med 100.
        Merk: Bånd effektivitet kan beregnes piksel for piksel eller samlet for hver HttQ25-YFP samlet (Figur 4B). Acceptor photobleaching er en spesielt nyttig teknikk for å beregne bånd effektivitet når mCherry signalet forbundet med hver HttQ25-YFP punctum tilstrekkelig høy å produsere synlig YFP dequenching etter mCherry photobleaching.

Representative Results

Metodene som er beskrevet her gi robust data demonstrere prion som overføring av Htt protein aggregater fra én celle befolkningen til en annen i intakt fly CNS. Konvertering av vill-type Htt fra diffuse til vises punctate er observert av direkte fluorescens denne YFP fusion protein i mottakerens glia som følge av HttQ91-mCherry uttrykk i donor ORNs (figur 2Vekselstrøm og Figur 4A, B). Nøyaktig rapportering av prion-lignende overføre hendelser mellom disse to celle populasjoner krever nøye utvalg av transgene fluer og Gal4/QF sjåførene å produsere sterke uttrykk nivåer av mutant og vill-type Htt effekter av transgener uten alle overlappe under utvikling eller i voksen alder. Gjennomtenkt design av fluorescerende protein-Htt fusion effekter av transgener kan i tillegg aktivere kraftig nedstrøms analyser. For eksempel mutant og vill-type Htt aggregater kan være kvantifisert som vises punctate objekter enten manuelt (figur 2C og Figur 4en) eller bruker analyseprogramvare (Figur 3A, B), kan måles og preget som samlet populasjoner (Figur 3C), kan vurderes for co lokalisering mellom mutant og vill-type proteiner (Figur 4A), og kan bli analysert for bånd27 (Figur 4 B). Disse analysene krever blanding av mutant og vill-type Htt til fluorescerende protein koder med tilstrekkelig atskilt fluorescens egenskaper, men med nok spectral overlapping aktivere bånd mellom giver og acceptor par (f.eks, CFP/YFP9 eller YFP/mCherry27).

Figure 2
Figur 2 . AC confocal bilder av prion-lignende konvertering av glial HttQ25-YFP av neuronal HttQ91-mCherry-aggregater. (A)-maksimale intensitet projeksjon av ~ 30 µm av AC confocal skiver viser en antennal lobe fra et mannlig fly uttrykke HttQ91-mCherry (rød) i DA1 ORN axons ved hjelp Or67d-QF og HttQ25-YFP (grønn) i glia bruke repo-Gal4. Omtrentlig grensene antennal lobe og DA1 glomerulus, der DA1 ORN axons avslutte, angis med de prikkete og heltrukne linjene, henholdsvis. (B) maksimum intensitet projeksjon fra ~ 20 µm av AC confocal skiver viser en forstørret visning av regionen DA1 glomerular fra A. (C) A enkelt 0,35 µm AC confocal skive viser en enkelt HttQ25-YFP-puncta og dens tilknyttede HttQ91-mCherry signal ( angitt med pilen i hver kanal). Signalet i den røde kanalen ble forbedret for å visualisere co lokalisering mellom HttQ25-YFP og HttQ91-mCherry-signaler. Alle bilder ble kjøpt med en 40 X 1.4NA oljeobjektiv. Skalere barer = 10 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 . Tre-dimensjonal analyse av HttQ91-mCherry-aggregater i DA1 ORN axons. (A) en 3D fremstilling av HttQ91-mCherry-aggregater uttrykt i det DA1 glomerulus via Or67d-QF bruker samme data som vises i figur 2B. (B) en skjermbilde viser individuelle objekter eller "flekker" identifisert fra rådata i (A) bruke en bildet analyse programvarepakke. Programvaren identifisert 56 gjenstander av varierende størrelse i denne kanalen/bilde. Stedet angitt med pilspissen i (B) ble målt har en diameter på ~ 1,2 µm. piler peker til plasseringer der to objekter er unøyaktig flettet til ett sted av programvaren, sannsynligvis på grunn av nærheten til den individuelle puncta. For å overvinne dette, ulike terskelverdi innstillinger bør testes i programvaren og/eller flettede flekker skal skilles manuelt hvis mulig. Skalere barer = 10 µm. (C) histogrammet viser fordelingen av diameter målt av programvaren for HttQ91-mCherry "flekker" vises i (B). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 . Co lokalisering og bånd analyse av indusert HttQ25-YFP-aggregater. (A) A montasje av 4 individuelle 0,35 µm AC confocal z-skiver fra en mannlig fly hjerne uttrykke HttQ91-mCherry i DA1 ORNs med Or67d-QF og HttQ25-YFP i glia med repo-Gal4. Signalene ble justert slik at selv små HttQ91-mCherry-aggregater er synlige og indusert HttQ25-YFP-aggregater stå fra omliggende diffus signal. Skiver vises skilles hver med ~ 1.0 µm (stykkenummer angitt i nedre høyre hjørne av flettede bilder) slik at flere aggregater kan observeres. Pilene angir HttQ25-YFP puncta som var bestemt på å være i eller nær fokus i bestemt z-sektoren ved å manuelt flytte gjennom z-stakken. Av de sju HttQ25-YFP puncta angitt her, har seks detectably knyttet HttQ91-mCherry-signalet (dvs.86% av HttQ25-YFP-aggregater co lokalisere med HttQ91-mCherry). Merk at mCherry signalet forbundet med HttQ25-YFP puncta er ofte svakere enn fleste av mCherry-positive puncta i DA1 glomerulus. Skala bar = 5 µm. (B) A HttQ25-YFP/HttQ91-mCherry-co-lokalisert punctum før (venstre panel) og etter (høyre panel) mCherry (acceptor) photobleaching. Den påfølgende økningen i YFP (giveren) fluorescens ble brukt til å produsere en piksel for piksel bånd effektivitet (båndeff) bildet med AccPbFRET plug-in for ImageJ46. Dette bestemte samlet har en samlet båndeff av 61%. Skala bar = 1 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Som antall pasienter som lider av nevrodegenerative sykdommer fortsetter å øke, er det et presserende behov for å øke forståelsen av molekylære patogenesen av disse sykdommene slik at bedre behandlinger kan utvikles. Her beskriver vi metodene som tillater for overvåking prion som overføring av patogene protein aggregater mellom ulike celletyper i modellen organismen, Drosophila melanogaster. Vi har nylig brukt denne metodikken å demonstrere prion som overføring av mutant Htt aggregater i vivo og identifisere en phagocytic reseptor som formidler spredningen av disse aggregater fra neurons til glia27. Vår tilnærming utnytter flere fordeler ved Drosophila for å studere genetisk menneskelig sykdom: kort livssyklus og store genetiske verktøysett, som kan akselerere oppdagelsen av grunnleggende biologisk informasjon som er terapeutisk relevant.

Metodene som beskrives her gir to store fordeler over andre eksisterende dyr og celle kultur modeller for prion-lignende overføring: (1) samles utløsende agent (f.eksmutant Htt) er produsert i en celle i en intakt vev, og (2) uttrykk av normalt foldet versjon av samme protein (f.eksvill-type Htt) i en separat celle befolkningen gir en lett tilgjengelig "reporter" prion-lignende hendelser. Uttrykk for mutant og vill-type Htt proteiner i ikke-overlappende celle populasjoner i den samme organismen har vi oppnådd ved hjelp av avanserte genetisk verktøy som er godt etablert i Drosophila40. Fordi mange ulike vev-spesifikke Gal4 og QF drivere er lett tilgjengelig, er undersøke prion-lignende overføring mellom egentlig noen forskjellige celletyper i fly kroppen mulig.

En kritisk komponent av tilnærming er å oppnå segregerte uttrykk for mutant og vill-type Htt proteiner i ulike celle populasjoner i samme dyret. Noen uttrykk overlapping må elimineres slik at vill-type Htt samling i mottakerens celler rapporterer cytoplasmatiske penetrasjon av prion som aggregater opprinnelse i donor cellene9,12,27, 41. Dette kan gjøres ved å innføre mer genetisk verktøy (f.eks, Gal80 og QS repressors40) å lindre problemet. Når ideelle genotype er designet og valgt, må det opprettes en systematisk metode for å kvantifisere puncta. Dette vil i stor grad avhenger av antall celler som er merket, antall aggregater som vises, og signal-til-støy forholdet mellom prøven. Vilkår som co lokalisering og/eller positiv bånd kan brukes for å analysere dataene, som vi har beskrevet her i Figur 4. Imidlertid kan begrense utvalget av vill-type Htt aggregater basert på disse funksjonene føre til undervurdering av prion-lignende overføre hendelser, siden noen mutant Htt samlet frø kan falle under grensen for påvisning av AC confocal mikroskopet.

I vivo tilnærming beskrevet her er ikke eksklusivt for prion-lignende oppførsel av aggregater HD eller andre polyQ lidelser. Transgene fluer kan utvikles for å undersøke prion som spredning av alpha-synuclein i PD, tau i Annonsen, og SOD1 eller TDP-43 i ALS bruker samme eksperimentelle paradigmet. For hver av disse proteinene, bør en samling utsatt mutant uttrykkes i giver celler, og en løselig versjon av samme protein at bare aggregat når nucleated bør uttrykkes i mottakerens celler. Dette eksperimentelle paradigmet kan også være nyttig for å undersøke nye ideen at sykdomsfremkallende proteiner forbundet med ulike sykdommer kan kommunisere via en cross-såing mekanisme47. Til slutt, av utallige genetisk verktøyene i Drosophila kan brukes for å undersøke og identifisere molekylær mechanism(s) underliggende cytoplasma til cytoplasma spredning av patogene protein aggregater forbundet med disse dødelige sykdommer.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Vi takker medlemmer av Kopito, Luo og Pearce laboratorier for mange nyttig diskusjoner under utviklingen av disse metodene. Vi har også takke Brian Temsamrit for kritisk lesning av dette manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av midler fra Universitetet i realfag og ww Smith veldedige stiftelser.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphate buffered saline (PBS), 10X, pH 7.4 ThermoFisher Scientific AM9625 Dilute to 1X
Triton X-100 Sigma-Aldrich T9284-1L
Kimwipes Thomas Scientific 2904F24
20% paraformaldehyde (PFA) Electron Microscopy Sciences 15713-S
Normal Goat Serum (NGS), filtered Lampire Biological Laboratories 7332500 Aliquot and freeze upon receipt
Chicken anti-GFP Aves Labs GFP-1020 Use at 1:500 dilution
Rabbit anti-DsRed Clontech 632496 Use at 1:2000 dilution; can recognize DsRed-based fluorescent proteins (e.g. mCherry, mStrawberry, tdTomato, etc.)
Mouse anti-Bruchpilot Developmental Studies Hybridoma Bank nc82 Use at 1:100 dilution; will label active pre-synaptic structures thoughout the fly brain
FITC anti-chicken ThermoFisher Scientific SA1-7200 Use at 1:250 dilution
Alexa Fluor 568 anti-rabbit Life Technologies A11011 Use at 1:250 dilution
Alexa Fluor 647 anti-mouse antibody Life Technologies A21235 Use at 1:250 dilution
Slowfade Gold Antifade Reagent Life Technologies S36936
Microscope Slides (25 x 75 x 1.0 mm) Fisher Scientific 12-550-143
Cover Glass (22 x 22 mm) Globe Scientific 1404-15
Dumont Biology Grade Forceps, Style 3 Ted Pella 503 use in non-dominant hand
Dumont Biology Grade Forceps, Style 5 Ted Pella 505 use in dominant hand
LAS X image analysis software Leica
Imaris image analysis software Bitplane

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Prusiner, S. B. Biology and genetics of prions causing neurodegeneration. Annu Rev Genet. 47, 601-623 (2013).
  2. Haïk, S., Brandel, J. P. Infectious prion diseases in humans: Cannibalism, iatrogenicity and zoonoses. Infect Genet Evol. 26, 303-312 (2014).
  3. Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. Adapting Proteostasis for Disease Intervention. Science. 319, (5865), 916-919 (2008).
  4. Stroo, E., Koopman, M., Nollen, E. A., Mata-Cabana, A. Cellular Regulation of Amyloid Formation in Aging and Disease. Front Neurosci. 11, 64 (2017).
  5. Brundin, P., Melki, R., Kopito, R. Prion-like transmission of protein aggregates in neurodegenerative diseases. Nat Rev Mol Cell Biol. 11, (4), 301-307 (2010).
  6. Jucker, M., Walker, L. C. Self-propagation of pathogenic protein aggregates in neurodegenerative diseases. Nature. 501, (7465), 45-51 (2013).
  7. Stopschinski, B. E., Diamond, M. I. The prion model for progression and diversity of neurodegenerative diseases. Lancet Neurol. 16, (4), 323-332 (2017).
  8. Walker, L. C., Jucker, M. Neurodegenerative diseases: expanding the prion concept. Annu Rev Neurosci. 38, 87-103 (2015).
  9. Holmes, B. B., et al. Heparan sulfate proteoglycans mediate internalization and propagation of specific proteopathic seeds. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, (33), 3138-3147 (2013).
  10. Munch, C., O'Brien, J., Bertolotti, A. Prion-like propagation of mutant superoxide dismutase-1 misfolding in neuronal cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, (9), 3548-3553 (2011).
  11. Nonaka, T., et al. Prion-like properties of pathological TDP-43 aggregates from diseased brains. Cell Rep. 4, (1), 124-134 (2013).
  12. Ren, P. H., et al. Cytoplasmic penetration and persistent infection of mammalian cells by polyglutamine aggregates. Nat Cell Biol. 11, (2), 219-225 (2009).
  13. Trevino, R. S., et al. Fibrillar structure and charge determine the interaction of polyglutamine protein aggregates with the cell surface. J Biol Chem. 287, (35), 29722-29728 (2012).
  14. Volpicelli-Daley, L. A., et al. Exogenous alpha-synuclein fibrils induce Lewy body pathology leading to synaptic dysfunction and neuron death. Neuron. 72, (1), 57-71 (2011).
  15. Zeineddine, R., et al. SOD1 protein aggregates stimulate macropinocytosis in neurons to facilitate their propagation. Mol Neurodegener. 10, 57 (2015).
  16. Ayers, J. I., Fromholt, S. E., O'Neal, V. M., Diamond, J. H., Borchelt, D. R. Prion-like propagation of mutant SOD1 misfolding and motor neuron disease spread along neuroanatomical pathways. Acta Neuropathol. 131, (1), 103-114 (2016).
  17. Clavaguera, F., et al. Brain homogenates from human tauopathies induce tau inclusions in mouse brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, (23), 9535-9540 (2013).
  18. de Calignon, A., et al. Propagation of tau pathology in a model of early Alzheimer's disease. Neuron. 73, (4), 685-697 (2012).
  19. Eisele, Y. S., et al. Induction of cerebral beta-amyloidosis: intracerebral versus systemic Abeta inoculation. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (31), 12926-12931 (2009).
  20. Luk, K. C., et al. Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice. Science. 338, (6109), 949-953 (2012).
  21. Meyer-Luehmann, M., et al. Exogenous induction of cerebral beta-amyloidogenesis is governed by agent and host. Science. 313, (5794), 1781-1784 (2006).
  22. Mougenot, A. L., et al. Prion-like acceleration of a synucleinopathy in a transgenic mouse model. Neurobiol Aging. 33, (9), 2225-2228 (2012).
  23. Rey, N. L., et al. Widespread transneuronal propagation of alpha-synucleinopathy triggered in olfactory bulb mimics prodromal Parkinson's disease. J Exp Med. 213, (9), 1759-1778 (2016).
  24. Babcock, D. T., Ganetzky, B. Transcellular spreading of huntingtin aggregates in the Drosophila brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, (39), 5427-5433 (2015).
  25. Kim, D. K., et al. Anti-aging treatments slow propagation of synucleinopathy by restoring lysosomal function. Autophagy. 12, (10), 1849-1863 (2016).
  26. Liu, L., et al. Trans-synaptic spread of tau pathology in vivo. PLoS One. 7, (2), 31302 (2012).
  27. Pearce, M. M., Spartz, E. J., Hong, W., Luo, L., Kopito, R. R. Prion-like transmission of neuronal huntingtin aggregates to phagocytic glia in the Drosophila brain. Nat Commun. 6, 6768 (2015).
  28. Pearce, M. M. Prion-like transmission of pathogenic protein aggregates in genetic models of neurodegenerative disease. Curr Opin Genet Dev. 44, 149-155 (2017).
  29. Pecho-Vrieseling, E., et al. Transneuronal propagation of mutant huntingtin contributes to non-cell autonomous pathology in neurons. Nat Neurosci. 17, (8), 1064-1072 (2014).
  30. Wu, J. W., et al. Neuronal activity enhances tau propagation and tau pathology in vivo. Nat Neurosci. 19, (8), 1085-1092 (2016).
  31. Jackson, G. R., et al. Polyglutamine-expanded human huntingtin transgenes induce degeneration of Drosophila photoreceptor neurons. Neuron. 21, (3), 633-642 (1998).
  32. Warrick, J. M., et al. Expanded polyglutamine protein forms nuclear inclusions and causes neural degeneration in Drosophila. Cell. 93, (6), 939-949 (1998).
  33. McGurk, L., Berson, A., Bonini, N. M. Drosophila as an In Vivo Model for Human Neurodegenerative Disease. Genetics. 201, (2), 377-402 (2015).
  34. The Huntington's Disease Collaborative Research Group. A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes. Cell. 72, (6), 971-983 (1993).
  35. Bates, G. P., et al. Huntington disease. Nat Rev Dis Primers. 1, 15005 (2015).
  36. Scherzinger, E., et al. Self-assembly of polyglutamine-containing huntingtin fragments into amyloid-like fibrils: implications for Huntington's disease pathology. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, (8), 4604-4609 (1999).
  37. Chen, S., Berthelier, V., Yang, W., Wetzel, R. Polyglutamine aggregation behavior in vitro supports a recruitment mechanism of cytotoxicity. J Mol Biol. 311, (1), 173-182 (2001).
  38. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, (2), 401-415 (1993).
  39. Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis. Cell. 141, (3), 536-548 (2010).
  40. Riabinina, O., Potter, C. J. The Q-System: A Versatile Expression System for Drosophila. Methods Mol Biol. 1478, 53-78 (2016).
  41. Costanzo, M., et al. Transfer of polyglutamine aggregates in neuronal cells occurs in tunneling nanotubes. J Cell Sci. 126, (16), 3678-3685 (2013).
  42. Freeman, M. R., Delrow, J., Kim, J., Johnson, E., Doe, C. Q. Unwrapping glial biology: Gcm target genes regulating glial development, diversification, and function. Neuron. 38, (4), 567-580 (2003).
  43. MacDonald, J. M., et al. The Drosophila cell corpse engulfment receptor Draper mediates glial clearance of severed axons. Neuron. 50, (6), 869-881 (2006).
  44. Wu, J. S., Luo, L. A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining. Nat Protoc. 1, (4), 2110-2115 (2006).
  45. Tito, A. J., Cheema, S., Jiang, M., Zhang, S. A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains. J Vis Exp. (118), (2016).
  46. Roszik, J., Szöllosi, J., Vereb, G. AccPbFRET: an ImageJ plugin for semi-automatic, fully corrected analysis of acceptor photobleaching FRET images. BMC Bioinformatics. 9, 346 (2008).
  47. Spires-Jones, T. L., Attems, J., Thal, D. R. Interactions of pathological proteins in neurodegenerative diseases. Acta Neuropathol. 134, (2), 187-205 (2017).
Overvåking celle til celle overføring av Prion som Protein mengdefunksjoner i <em>Drosophila Melanogaster</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Donnelly, K. M., Pearce, M. M. P. Monitoring Cell-to-cell Transmission of Prion-like Protein Aggregates in Drosophila Melanogaster. J. Vis. Exp. (133), e56906, doi:10.3791/56906 (2018).More

Donnelly, K. M., Pearce, M. M. P. Monitoring Cell-to-cell Transmission of Prion-like Protein Aggregates in Drosophila Melanogaster. J. Vis. Exp. (133), e56906, doi:10.3791/56906 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter