Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Övervakning Cell till cell överföring av Prion-liknande Protein aggregat i Drosophila Melanogaster

doi: 10.3791/56906 Published: March 12, 2018

Summary

Ackumulerande bevis stöder tanken att patogena protein aggregat i samband med neurodegenerativa sjukdomar sprids mellan celler med prion-liknande egenskaper. Här beskriver vi en metod som möjliggör visualisering av cell-till-cell spridning av prion-liknande aggregat i modell organismen, Drosophila melanogaster.

Abstract

Protein är ett centralt inslag i de flesta neurodegenerativa sjukdomar, däribland Alzheimers sjukdom (AD), Parkinsons sjukdom (PD), Huntingtons sjukdom (HD) och amyotrofisk lateralskleros (ALS). Protein aggregat är nära förknippade med neuropatologi i dessa sjukdomar, även om den exakta mekanismen genom vilken avvikande protein aggregering stör normala cellulära homeostas inte är känt. Framväxande data ger starkt stöd för hypotesen att patogena aggregat i AD, PD, HD, och ALS har många likheter med prioner, som är endast protein-smittämnen ansvarar för de transmissibel spongiform encefalopati. Prioner replikerar själv mallhantering omvandlingen av inföding-viks versioner av samma protein, orsakar spridning av aggregation fenotypen. Hur prioner och prion-liknande proteiner i AD, PD, HD och ALS flytta från en cell till en annan är för närvarande ett område med intensiv utredning. Här beskrivs en Drosophila melanogaster -modell som tillåter övervakning av prion-liknande, cell-till-cell överföring av muterade huntingtin (Htt) aggregat är associerad med HD. Denna modell tar fördel av kraftfulla verktyg för att manipulera transgenens uttryck i många olika Drosophila vävnader och utnyttjar en fluorescently-taggade cytoplasmatiska protein direkt rapport prion-liknande överföring av muterade Htt aggregat. Ännu viktigare, kan den metod som vi beskriver här används för att identifiera nya gener och vägar som förmedlar spridning av protein aggregat mellan olika cell typer i vivo. Information som erhålls från dessa studier kommer att expandera den begränsade förståelsen av de patogena mekanismer som ligger bakom neurodegenerativa sjukdomar och avslöja nya möjligheter för terapeutisk intervention.

Introduction

Prion hypotesen anges att smittämnet ansvarar för de transmissibel spongiform encefalopati (t.ex., Creutzfeldt - Jakobs sjukdom hos människor, skrapie hos får, kroniskt avmagrade sjukdom i hjort och älg och ”galna kosjukan” hos nötkreatur ) endast består av protein och saknar nukleinsyror1. I prionsjukdomar, cellulära prionproteinet (PrPC) utgår från en främmande, stabil vik (PrPSc) som är mycket beta ark-rika och kan själv propagera genom att konvertera och rekrytera monomer PrPC molekyler till stabil amyloid aggregat. PrPSc aggregat använder denna självreplikerande mekanism för att sprida sig mellan olika celler i en organism och även mellan enskilda organismer2.

Protein Skellefteåsjukan och aggregering är också ett centralt inslag i de flesta neurodegenerativa sjukdomar (Alzheimers sjukdom (AD), Parkinsons sjukdom (PD), Huntingtons sjukdom (HD) och amyotrofisk lateralskleros (ALS))3. Bildandet av intra - eller extra - celler aggregerade protein församlingar i dessa sjukdomar är nära förknippad med cytotoxicitet4 och fortskrider mycket reproducerbara och sjukdomsspecifika vägar genom hjärnan över tid5, 6. dessa mönster sprids föreslår att patogena aggregat samband med dessa sjukdomar har prion-liknande egenskaper. Nu finns starka stöd för prion-liknande överföring av aggregat associerade med AD, PD, HD och ALS - de sprida sig från cell till cell och mall conformationaländring monomer former av samma protein i tidigare opåverkade celler7, 8.

Majoriteten av studier som undersöker prion-liknande spridningen av protein aggregat hittills har utförts med däggdjursceller kultur modeller, där aggregat transfer i cytoplasman i naiva celler från extracellulära eller från en annan cell cytoplasman9,10,11,12,13,14,15, eller genom att injicera aggregat-innehållande material i mus hjärnor och övervakning aggregera utseende utanför injektion webbplats16,17,18,19,20,21,22, 23. mer nyligen, transgena djur har använts för att demonstrera att intracellulära aggregat sprids till andra celler inom intakt hjärnor24,25,26,27, 28,29,30. Här, beskriver vi en metod för direkt visualisering av aggregerade överföring mellan enskilda celler i intakt hjärnan på Drosophila melanogaster. Drosophila modeller av HD/polyglutamine (polyQ) sjukdomar utvecklades först nästan två decennier sedan31,32 och har gett många ovärderliga insikter i de patogena mekanismerna som ligger bakom dessa sjukdomar 33. HD är en ärftlig neurodegenerativ sjukdom orsakas av en autosomal dominerande mutationen i genen som kodar för proteinet huntingtin (Htt)34. Denna mutation resulterar i expansion av en polyQ sträcka nära Htt's N-terminalen över en patogena tröskel av ~ 37 glutaminer, orsakar proteinet till misfold och samlade35,36. Vildtyp Htt proteiner som innehåller < 37 glutaminer i denna sträcka uppnå sina infödda vika, men kan förmås att aggregera vid direkt fysisk kontakt med en Htt sammanlagda ”frö”12,27,37. Vi utnyttjar denna homotypic, kärnförsedda sammanläggning av vildtyp Htt som en avläsning för prion-liknande överföring och cytoplasmiska tillträdeet av muterade Htt aggregat med ursprung i andra celler.

Att bestämma mekanismerna genom vilka prion-liknande aggregat kan resor mellan celler leda till identifiering av nya terapeutiska mål för obotliga neurodegenerativa sjukdomar. Vi tar fördel av snabba livscykel, användarvänlighet, och genetiska tractability av Drosophila melanogaster att definiera molekylära mekanismer för cell till cell spridning av muterade Htt aggregat. Vår experimentella strategi sysselsätter två system för binärt uttryck i Drosophila, den väletablerade Gal4-specifika uppströms aktiverande sekvens (Gal4-UAS) system38 och den nyligen utvecklade QF-QUAS system39. Dessa två oberoende kopplingssystem kan begränsa uttrycket av muterade och vildtyp Htt transgener till distinkta cellpopulationer inom samma flyga40. Använder denna metod kan undersöka vi prion-liknande fördelning av mutant Htt genom att övervaka omfördelning av cytoplasmisk vildtyp Htt från normalt diffusa, lösligt tillstånd till en aggregerad stat, en direkt följd av fysisk kontakt med en förformad mutant Htt sammanlagda ”frö”. Konvertering av vildtyp Htt av mutant Htt kan bekräftas använder biokemisk eller biofysiska tekniker som rapportera protein-protein interaktioner, såsom fluorescens resonans energi överföring (bandet)9,27,41 .

Ännu viktigare, vi kan också komma åt ett stort antal genetiska verktyg i Drosophila att identifiera gener och/eller vägar som förmedlar prion-liknande spridningen av protein aggregat. Vi har nyligen använt denna metod för att avslöja en nyckelroll för cell surface gatsopare receptorn, Draper42,43i överföra muterat Htt aggregat från nervcellernas axoner till närliggande fagocytos glia i Drosophila centrala nervsystemet (CNS)27. Således kan den genetiska - och imaging-baserade strategi som vi beskriver här avslöja viktig grundläggande biologisk information om en sjukdom-relevanta fenomen i den enkel att använda men kraftfull modellorganism, Drosophila.

Protocol

1. koppling Gal4 - och QF-medierad Htt transgenens uttryck i Drosophila

  1. Samla in och/eller generera transgena Drosophila melanogaster linjer som innehåller vävnad-specifika Gal4 eller QF ”drivrutiner”, liksom linjer som innehåller wild-type eller muterade Htt transgener, nedströms Gal4-UAS38 eller QF-QUAS39. Säkerställa att de proteiner som uttrycks från dessa transgener är smält till fluorescerande proteiner eller epitop-Taggade som möjliggör differentiering av muterade och vildtyp Htt transgenens produkter i samma fluga. Se figur 1.
    Obs: Vi använder vanligtvis exon 1 fragment av den mänskliga Htt gen27. Dock kan transgena flugor istället genereras för att uttrycka längre Htt fragment eller andra gener om så önskas.
  2. Planera den genetiska strategin så att muterade och vildtyp Htt transgener kommer att uttryckas i distinkta, icke-överlappande cellpopulationer.
    1. Mutant och vildtyp Htt proteiner syntetiseras i samma celler kommer Co aggregera och förhindra upptäckt av prion-liknande händelser om överlappning uttryck. För att undvika detta, Använd Gal4 och QF specifika kvinnoförtryckarna, Gal80 och QS40, respektive (figur 1). Att välja utvecklingsmässigt-kontrollerade Gal4 och/eller QF drivrutiner kan hjälp att begränsa uttryck för mutant Htt till efter mitotiska celler, vilket eliminerar möjligheten att celldelning kan bidra till cell-till-cell sammanlagda spridning.
  3. Använda standardvillkor för odling, mate flugor för att generera avkomma som uttrycker mutant Htt via QF (eller Gal4) i en ”givare” cell befolkningen och vildtyps-Htt via Gal4 (eller QF) i en ”mottagare” cell befolkningen. Se figur 1 för en schematisk visar en möjlig genetisk kombination.
    Obs: QF och Gal4 drivrutiner som användes för att generera data visas i figurerna 1-4 och i våra tidigare publikation27 inkludera DA1 luktreceptor neuron (ORN) föraren, Or67d-QF, och pan-gliaceller drivrutin, repo-Gal4.
  4. Generera kontroll flugor parallellt som uttrycker vildtyp Htt i båda QF - och Gal4-märkt cellpopulationer.
  5. Samla in avkomman av önskad genotyp och ålder djur som är lämpligt.

Figure 1
Figur 1 . Genetiska tillvägagångssätt för kopplade uttryck av muterade och vildtyp Htt transgener med QF-QUAS och Gal4-UAS binärt uttryck systemen. I ”cell A”, en mCherry-taggade mutant Htt protein som innehåller en patogen-längd polyQ sträcka (Q91) uttrycks med en QF-drivrutin som ligger nedströms en vävnad-specifika promotorn en (”PA”). I ”cell B”, uttrycks en YFP-taggade vildtyp Htt innehållande en normal polyQ sträcka (Q25) via en Gal4 drivrutin kontrolleras av vävnad-specifika promotorn B (”PB”). I figurerna 2-4, Or67d-QF användes för att köra QUAS-HttQ91-mCherry uttryck i DA1 ORNs och repo-Gal4 användes för att uttrycka UAS-HttQ25-YFP i alla glia27. Ännu viktigare, uttrycks HttQ91-mCherry endast i QF-uttryckande celler enligt sekvensen QUAS placeras uppströms transgenens. Likaså uttrycks HttQ25-YFP endast via Gal4, som uttryckligen erkänner UAS. Om någon överlappning i vävnad fördelningen av QF och Gal4 drivrutinerna upptäcks kan transgener kodning QS i Gal4-uttryckande celler och Gal80 i QF-uttryckande celler införas. Att lägga till fluorescerande protein taggar på vildtyp och mutant Htt möjliggör differentiering av de två proteinerna under imaging och förmågan att mäta bandet mellan lämpliga givare/acceptor par (t.ex., GFP/YFP eller YFP/mCherry). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

2. micro-dissektion och fixering av vuxen Drosophila hjärnor

Obs: Proceduren dissektion har ändrats från en tidigare publikation44, och kan användas för att förbereda hjärnor för imaging direkt fluorescens signal från Htt-fluorescerande protein fusioner. Ändringar i förfarandet som kan göras för immunfärgning hjärnor diskuteras i nästa avsnitt.

  1. Samla in följande material och placera på is: fosfatbuffrad saltlösning som innehåller 0,03% Triton x-100 (PBS/T); mikrocentrifug rör innehållande 970 µL av 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) fixativ lösning som beretts genom att lägga till 200 µL 20% PFA till 770 µL PBS/T; en klart glas maträtt som innehåller väl; en disponibel överföring Pipettera; två dissekera pincett (en nr 3 och nr 5).
  2. Söva vuxna flugor med CO2 och överföra dem till en brunn av glas skålen på is.
  3. Använda en överföring Pipettera, lägga en liten mängd (~ 500 µL) av kall PBS/T till den brunn innehållande flugor samt att en tom brunn. Undvika att införa alltför många bubblor eftersom de kan störa dissektion.
  4. Placera glas skålen på en plan yta nedanför dissekera Mikroskop och justera förstoringen tills flyga kroppen fyller synfältet och är i fokus.
  5. Placera ett par svanhals ljuskällor så att ljuset lyser båda sidor av glas skålen. Förankra en vikta lab vävnaden under glas skålen att kasta kropp delar/nagelband under dissektion.
  6. Med nr 3 tången i den icke-dominanta handen, överföra en enda fluga i den brunn som innehåller PBS/T. immobilisera i farten genom att gripa tag i dess buk med den ventrala sidan uppåt.
  7. Att hålla i farten helt nedsänkt i PBS/T, avlägsna flyga huvudet med nr 5 tången i dominerande handen. Infoga ett tips av denna pincett under nagelbanden i det lilla utrymmet intill snabel på ena sidan av flyga huvudet. Säkra greppet på huvudet genom att nypa tången för att gripa tag i ögat från båda sidor.
  8. Ta bort flyga huvudet från dess kropp genom att dra två tången apart. Kassera flyga kroppen på ett lab vävnad placerad i närheten. Upprätthålla trycket på dominanta-hand tången så att flyga huvudet inte är förlorat.
  9. Position ett tips av nr 3 tången i det icke-dominant hand i samma lilla utrymmet under nagelbandet på andra sidan på proboscis. När placerade, nyp tången för att greppa ögonen på samma plats på båda sidor av huvudet.
  10. När greppet om nagelbanden är säkert, försiktigt dra tången isär på 180°. Denna åtgärd kommer att bryta isär huvudet nagelbanden utan att skada hjärnan. Kassera nagelband rester på en lab-vävnad.
    1. Men perfekt, kan huvudet nagelbanden inte tas bort helt i ett steg. I detta fall bort den nagelband bit-för-bit tills hjärnan är helt exponerad. Ta hand inte kommer för att skada hjärnan genom att undvika direktkontakt med tången.
  11. Ta bort dissekerade hjärnan från PBS/T antingen genom att greppa tag i en bifogad luftstrupen, eller aspirera hjärnan i mellanrummet mellan tången tips av kapillärkraften.
    Obs: Luftstrupen borttagning är valfritt eftersom det tenderar att inte skymma antennal loberna på den främre ytan av hjärnan där vi vanligtvis bild. Dock om luftstrupen stör imaging, ta bort dem försiktigt så att hjärnan inte är skadad genom denna manipulation.
  12. Över flyga hjärnan till en av de mikrocentrifugrör innehållande fixativ lösning på is. Säkerställa att hjärnan lossnar från tången och är nedsänkt i fixativ lösningen.
  13. När alla hjärnor har varit dissekerade, utsätta dem för en ”kort-fix” genom att placera slutna rören på en nutator för ~ 5 min i rumstemperatur i mörkret.
    Obs: Detta kort fixering steg säkerställer att hjärnan är lättare att hantera i efterföljande steg och inte klibbar till sidorna av mikrocentrifug röret.
  14. Ta bort majoriteten av den fästande lösningen med P1000 pipett och kassera den.
    1. Undvik att aspirera hjärnor från röret under detta och eventuella efterföljande tvättningen. Ange P1000 till en lägre volym (t.ex., 650 µL) och ta bort supernatanten i två steg. Dessutom håll mikrocentrifugrör i linje med en ljuskälla (t.ex. overhead lampor) medan aspirera för att visualisera bättre hjärnor.
  15. Tillsätt 1 mL färsk PBS/T till hjärnan. Tvätta snabbt (< 1 min) i mörkret, Aspirera supernatanten från hjärnor och kassera.
  16. Upprepa tvätten med PBS/T i mörker vid rumstemperatur enligt följande schema: 2 quick (< 1 min) tvättar, 1 X 5 min, 3 X 20 min och 1 X 1 h tvätt. Secure toppar på mikrocentrifugrör och placera rören på en nutator mellan tvättar.
    1. Om DAPI färgning önskas, följt Ersätt den slutliga 1 h tvätten med 1 X 30 minuters inkubation med 250 ng/mL DAPI utspätt i PBS/T, av 2 X snabb och 1 X 20 min tvättar.
  17. Efter den sista tvättningen, ta bort de flesta wash buffer supernatanten, noga med att inte störa hjärnor, och Lägg till 30 µL av glycerol-baserade antifade reagens hjärnor. Inkubera vid 4 ° C i mörker utan rörelse för minst 1 h och upp till 24 h.

3. ändringar i avsnitt 2 för immunfärgning vuxen hjärna

Obs: Använd detta protokoll för imaging icke fluorescerande proteiner eller fluorescerande protein fusioner med svag fluorescens.

  1. Öka koncentrationen av Triton x-100 i PBS/T av 10-faldig (PBS + 0,3% Triton x-100) för varje steg. Detta säkerställer att det finns tillräckligt rengöringsmedel permeabilize cellmembran och tillåta antikroppar tillgång till intracellulära utrymmen.
  2. Fixa hjärnor i 4% PFA i PBS/T i 20 min i rumstemperatur.
  3. Efter att ha utfört alla tvättar, inkubera hjärnor på nylagade blockerande buffert (PBS/T + 5% normala get serum (NGS)) i 30 min i rumstemperatur i mörkret.
  4. Avlägsna och kassera det blockerande buffert. Tillsätt 0,5 mL av primär antikropp lösning per rör utarbetats som en master mix av späda primära antikroppar som är lämpligt i färska blockerande buffert (se Tabell av material för vanliga antikroppar och utspädningar). Inkubera hjärnor i primära antikroppar på en nutator i minst 24 timmar vid 4 ° C i mörker.
  5. Ta bort primär antikropp lösningen från hjärnor med hjälp av en P1000 och boka i en frisk slang. Tillsätt 1 mL PBS/T att tvätta hjärnor.
    Obs: Reserverade primär antikropp lösningen kan förvaras vid 4 ° C i upp till fyra veckor. Vi har framgångsrikt återvunnet primära antikroppar upp till två gånger i efterföljande experiment.
  6. Tvätta hjärnan snabbt (< 1 min) i PBS/T, Aspirera supernatanten från hjärnor och kassera. Upprepa detta snabb tvätt en gång till.
  7. Tvättningen med 1 mL PBS/T vid rumstemperatur enligt följande schema: 1 X 5 min, 3 X 20 min och 1 X 1 h tvätt. Secure toppar på mikrocentrifugrör och placera rören på en nutator under tvättar.
  8. Efter den sista tvättningen, ta bort majoriteten av PBS/T supernatanten och tillsätt 0,5 mL sekundär antikropp lösning utarbetats som en master mix av späda antikropparna som är lämpligt i färska blockerande buffert (se Tabell av material för vanliga antikroppar (och utspädningar). Inkubera hjärnor i sekundära antikroppar för 24 h vid 4 ° C i mörker.
  9. Upprepa tvätta steg i steg 3.5, 3.6 och 3.7 efter inkubation med sekundära antikroppar.
  10. Efter den sista tvättningen, ta bort flesta tvättlösning och se till att alla hjärnor är placerade på botten av röret. Lägga till 30 µL antifade reagens hjärnor. Inkubera vid 4 ° C i mörker utan rörelse för 16-24 h.

4. hela hjärnan montering

  1. Placera ett glas objektglas under ett dissekera Mikroskop och en etikett med identifieringsinformation.
    Obs: Alternativt hjärnor kan monteras direkt på en skyddsglaset åtkomst till båda sidor av hjärnan under imaging. Ett protokoll som beskriver proceduren montering har funnits tidigare publicerade45.
  2. Ta bort hjärnan från varje mikrocentrifug rör använder en avtrubbad Pipettera spets (förberedd med ett rakblad för att ta bort botten ~ 1 cm utanför en 1-200 µL spetsen) och överföra dem i mitten av bilden. Överför som lilla antifade reagens med hjärnor som möjligt.
  3. Använd tången för att placera hjärnor i önskad orientering (t.ex., dorsala pekar mot toppen av bild- och främre ytan uppåt för imaging på antennal LOB). När orientera hjärnor, överväga ljusstrålen av mikroskopet ska användas för imaging dem.
  4. Ta bort överflödigt antifade reagens från bilden med det spetsiga hörnet av en vikta lab vävnad utan att störa hjärnor. Låt bilden sitter för ~ 5-10 min i mörkret att tillåta hjärnor att följa bilden.
  5. Omger flyga hjärnor med fyra små bitar av trasiga skyddsglaset placeras på varje sida av hjärnan att bilda en kvadrat som är ~ 19 mm x 19 mm. placera ena sidan av en 22 x 22 mm nr 1,5 skyddsglaset precis utanför ett av dessa små bitar av glas , och försiktigt sänka täckglaset över hjärnor att slutföra bridge-fästet.
  6. Långsamt fördela färska antifade reagens för att fylla ytan under den täckglas, vara noga med att inte störa täckglaset eller hjärnor. Torka bort eventuella överskott antifade med det spetsiga hörnet av en vikta lab vävnad utan att direkt kontakta täckglaset.
  7. Lägg en droppe av klar, snabbtorkande nagellack till var och en av de fyra hörnen av täckglaset. Låt torka i ~ 10 min. Sedan försegla kanter på täckglaset med nagellack att helt omsluta hjärnor.
  8. Bild hjärnor omedelbart eller förvaras vid 4 ° C tills den.
    1. Om imaging inneboende fluorescens från Htt-fluorescerande protein fusioner, image hjärnor inom 24 h för bästa signal.

5. imaging och kvantifiera Prion-liknande överföring av aggregat

  1. Bild monterade hjärnor med confocal Mikroskop utrustat med en 40 X eller 60/63 X olja mål att samla in z-slice bilder genom regionen av hjärnan där de valda Gal4 och QF drivkrafter uttrycks (figur 2A, B).
    1. Excitera den fluorescerande protein fusioner eller immunolabeled proteiner med hjälp av lämpliga lasrar (t.ex., 488 nm för GFP/YFP/FITC eller 552 nm för mCherry/Cy3). Ställa in windows så upptäckt att fånga maximalt fluorescerande signalera samtidigt eliminera kanal överhörning använder antingen en spektral detektionssystem eller band/lång passera utsläpp filter specifikt för varje fluorophore.
      Obs: Var uppmärksam när imaging protein aggregat. Det är lätt för pixlar i mitten av varje aggregat bli mättad, särskilt i större aggregat. Försök att minimera färgmättnaden i bilden, men vara medveten om risken att förlora signal från mindre aggregerade arter (figur 2B, C, D). För mycket mättnad kommer att öka bild bakgrunden, vilket gör det svårare att identifiera isolerade puncta. Testa olika imaging inställningar för att optimera innan du tar de sista bilderna i varje datauppsättning.
  2. Analysera data genom att kvantifiera enskilda puncta antingen manuellt genom att flytta genom individuella z-skivor (t.ex., figur 2C och figur 4A) eller efter rendering confocal skivor i 3 dimensioner (figur 3A, B).
    Obs: Detta kan göras i bilden J eller andra bildbehandlingsprogram.
    1. Om aggregaten är väl separerade och det finns minimal bakgrund fluorescens, använda bild analys programvara för att systematiskt identifiera, kvantifiera och analysera aggregaten som distinkta ”objekt” eller ”ytor” i en 3D rekonstruktion av confocal stack ( Figur 3 ( B).
      Obs: Programvaran åtgärder som beskrivs är specifika för de instrument och programvara som används här (se Tabell för material).
      1. Visualisera en confocal z-serie i 3D-visningsläget. Använd guiden ”analys” för att identifiera enskilda ställen i en vald kanal (t.ex. den röda kanalen för HttQ91-mCherry aggregerar i figur 3). Justera tröskelvärde och filter för att korrekt representera alla heterogeneously medelstora aggregat som enskilda objekt i bilden.
      2. Aktivera ”delade objekt” under ”binära bearbetning före Filter” att separera närstående aggregat som samkörs aberrantly av mjukvaran algoritmen. Observera att det totala antalet objekt och deras associerade mätningar rapporteras under ”mått”.
        Obs: Denna metod för att kvantifiera mutant Htt aggregat är inte mottaglig för immunfärgning protokollet eftersom mitten av amyloid aggregat, är ogenomträngligt för antikroppar. Som ett resultat, aggregaten visas på mikroskopet som ringliknande strukturer och bild analys programvara är att korrekt identifiera och särskilja dessa enskilda ”fläckar”.
    2. Kvantifiera vildtyp Htt aggregat genom att manuellt flytta genom z-stacken och scoring vildtyp Htt aggregat, att se till att inga aggregat är dubbel-gjorde om de visas i mer än en skiva (figur 4A).
      Obs: Detta manuell kvantifiering tillvägagångssätt kan användas när antalet aggregat i varje confocal stack är rimliga (t.ex., 20-50). Det är också bra när bild analys programvara inte kan skilja enskilda puncta från omgivande signal i samma kanal (t.ex., signalen från diffusa vildtyp Htt i celler i närheten) (figur 2B, C och figur 4 A). kvantifiera vildtyp Htt aggregat kan också vara svårt eftersom många normala strukturer i hjärnan visas punktuell (t.ex., cellprocesser och synapser). Samtidig lokalisering av vildtyp och muterade Htt signaler kan användas som urvalskriterium; Det är dock möjligt att vissa muterade Htt ”frön” faller under detektionsgränsen för de confocal. Ett protein än Htt som inte samlade i de mottagande cellerna (t.ex., GFP) kan användas för att märka orelaterade punktuell strukturer i hjärnan.
  3. Använda bild analys programvara för att utföra ytterligare karakterisering av enskilda aggregat. Till exempel bestämma fördelningen av storlek av aggregaten (figur 3C), procent Co lokalisering mellan mutant och vildtyps-Htt proteiner (figur 4A), eller direkt mäta protein-protein interaktioner med hjälp bandet ( Figur 4 ( B).
    1. Bestämma storleksfördelningen av enskilda puncta använder en plats eller ytan upptäckt algoritm som exakt identifierar alla synliga aggregat i en viss kanal. Använda programvaran bild analys för att ta relevanta mått ställen eller ytor, till exempel få 'sammanlagda diameter' (Fig. 3 C), 'volym' eller 'intensitet' information från 'Mått' i guiden ”analys” som beskrivs i steg 5.2.1.
      Obs: I figur 3Credovisar vi distribution av diametrar för alla HttQ91-mCherry puncta identifieras i en enda DA1 glomeruli.
    2. Bestämma den procent Co lokaliseringen mellan HttQ25-YFP och HttQ91-mCherry aggregat genom att manuellt flytta segment-av-slice genom en confocal z-skorsten (mest exakta metoden). Men ta hand inte för att räkna alla aggregat två gånger. För att förhindra detta, räknas endast aggregat i en viss z-sektor om Plant av fokus är genom centrum av sammanlagt (figur 4A).
    3. Beräkna bandet effektivitet för inducerad HttQ25-YFP aggregat med colocalized HttQ91-mCherry signal med metoden acceptor fotoblekning.
      1. Först eliminera potentiella överhörning mellan YFP och mCherry kanaler genom att etablera identifiering windows för mCherry-bara och endast YFP signaler som producerar ingen signal i den andra kanalen. Använda dessa inställningar, ta en ”före bild' av enskilda HttQ25-YFP puncta och deras associerade HttQ91-mCherry signal ( figur 4B).
      2. Sedan photobleach mCherry signal genom att justera röd laser (t.ex., 552 nm) till 100% intensitet och skanna tills signalen är borta. Återgå till inställningarna som används för 'före bild', och ta en 'efter bild' av den samma puncta (figur 4B).
      3. Beräkna fluorescens intensitet mätningar för varje punctum före och efter fotoblekning med bild analys programvara.
      4. Beräkna bandet effektivitet genom att subtrahera YFP givare fluorescens mätt i den 'före bild' (YFPinledande) från YFP givare fluorescens i 'efter bild' (YFPslutlig). Dividera detta värde med YFPslutlig, och multiplicera med 100.
        Obs: FRET effektivitet kan beräknas pixel-till-pixel eller övergripande för varje HttQ25-YFP aggregat (figur 4B). Acceptor fotoblekning är en särskilt användbar teknik för att beräkna bandet effektivitet när mCherry signalen är associerad med varje HttQ25-YFP punctum är tillräckligt höga för att producera detekterbara YFP dequenching efter mCherry fotoblekning.

Representative Results

Metoderna som beskrivs här producera robusta data visar prion-liknande överföring av Htt protein aggregat från en cell befolkningen till en annan i intakt flugan CNS. Konvertering av vildtyp Htt från diffusa till punktuell observeras av direkta fluorescens av detta YFP fusionsprotein i mottagarens glia till följd av HttQ91-mCherry uttryck i givaren ORNs (figur 2A-C och figur 4A, B). Korrekt rapportering av prion-liknande överföring händelser mellan dessa två cellpopulationer kräver noggrant urval av transgena flugor och Gal4/QF förare att producera starka uttryck nivåer av muterade och vildtyp Htt transgener utan någon överlappning under utveckling eller i vuxen ålder. Genomtänkta designen av den fluorescerande protein-Htt fusion transgener kan dessutom aktivera kraftfull nedströms analyser. Till exempel mutant och vildtyps-Htt aggregat kan kvantifieras som punktuell objekt antingen manuellt (figur 2C och figur 4en) eller med bild analys programvara (figur 3A, B), kan mätas och kännetecknas vidare som sammanlagda befolkningen (figur 3C), kan bedömas för samtidig lokalisering mellan mutant och vildtyps-proteiner (figur 4A), och kan analyseras för bandet27 (figur 4 B). Dessa analyser kräver fusion av muterade och vildtyp Htt till fluorescerande protein Taggar med tillräckligt separerade fluorescens egenskaper, men med tillräckligt spektrala överlappning för att bandet mellan givare och acceptor par (t.ex., det gemensamma fiskeripolitiken/YFP9 (eller YFP/mCherry27).

Figure 2
Figur 2 . Confocal bilder av prion-liknande omvandling av gliaceller HttQ25-YFP av neuronala HttQ91-mCherry aggregat. (A) maximalt intensitet projektion av ~ 30 µm confocal skivor visar en antennal LOB från en manlig fluga som uttrycker HttQ91-mCherry (röd) i DA1 ORN axoner med Or67d-QF och HttQ25-YFP (grön) i glia använder repo-Gal4. Ungefärliga gränser för antennal LOB och DA1 glomeruli, där DA1 ORN axoner avsluta, indikeras av de prickade och fasta linjerna, respektive. (B) maximal intensitet projektion från ~ 20 µm confocal skivor visar en förstorad bild av regionen DA1 glomerulär från A. (C) A 0,35 µm confocal cirkelsektor visar en enda HttQ25-YFP puncta och dess associerade HttQ91-mCherry signal ( (indikeras av pilen i varje kanal). Signalen i den röda kanalen var bättre för att visualisera samtidig lokalisering mellan HttQ25-YFP och HttQ91-mCherry signaler. Alla bilder har förvärvats med en 40 X 1.4NA olja målsättningen. Skala barer = 10 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 . Tredimensionell analys av HttQ91-mCherry aggregat i DA1 ORN axoner. (A), en 3D skildring av HttQ91-mCherry aggregat uttryckt i de DA1 glomeruli via Or67d-QF med samma data som visas i figur 2B. (B) en skärmdump visar enskilda objekt eller ”fläckar” identifierade från rådata (A) använda ett avbildningspaket analys programvara. Programvaran identifieras 56 föremål av varierande storlek i denna kanal/bild. Den plats som anges av pilspetsen i (B) mättes för att ha en diameter på ~ 1,2 µm. pilarna pekar på platser där två objekt är felaktigt sammanslagna till en plats av programvaran, sannolikt på grund av närheten av de enskilda puncta. För att övervinna detta, olika tröskelvärde inställningar bör testas i programvaran och/eller sammanslagna ställen bör separeras manuellt om möjligt. Skala barer = 10 µm. (C) Histogram visar fördelningen av diametrar mätt programvaran för den HttQ91-mCherry ”fläckar” i (B). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 . Samtidig lokalisering och bandet analys av inducerad HttQ25-YFP aggregat. (A) A montage av 4 individuella 0,35 µm confocal z-skivor från en manlig flyga hjärnan uttrycker HttQ91-mCherry i DA1 ORNs med Or67d-QF och HttQ25-YFP i glia använder repo-Gal4. Signalerna justerades så att även små HttQ91-mCherry aggregat är synliga och inducerad HttQ25-YFP aggregat utmärker sig från omgivande diffusa signal. De segment som visas är avgränsade med ~ 1,0 µm (skiva nummer anges i nedre högra hörnet av sammanslagna bilder) så att flera aggregat kan observeras. Pilarna anger HttQ25-YFP puncta som var fast beslutna att vara i eller nära fokus i att viss z-sektor genom att manuellt flytta genom z-stacken. Av de sju HttQ25-YFP puncta anges här, har sex nötkreatur associerat HttQ91-mCherry signal (dvs.86% av HttQ25-YFP aggregaten Co lokalisera med HttQ91-mCherry). Observera att mCherry signalen är associerad med HttQ25-YFP puncta ofta är svagare än flesta mCherry-positiv puncta i de DA1 glomeruli. Skalstapeln = 5 µm. (B) A HttQ25-YFP/HttQ91-mCherry-co-lokaliserad punctum före (vänster paneler) och efter (höger paneler) mCherry (acceptor) fotoblekning. Den resulterande ökningen YFP (givare) fluorescens användes för att producera en pixel-till-pixel bandet effektivitet (bandeteff) bild med AccPbFRET plug-in för ImageJ46. Detta särskilt aggregat har en övergripande bandeteff 61%. Skalstapeln = 1 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Discussion

Eftersom antalet patienter med neurodegenerativa sjukdomar fortsätter att öka, finns det ett brådskande behov av att öka förståelsen för molekylär patogenes av dessa sjukdomar så att bättre behandlingar kan utvecklas. Här, beskriver vi metoder som möjliggör övervakning prion-liknande överföring av patogena protein aggregat mellan olika celltyper i modell organismen, Drosophila melanogaster. Vi har nyligen använt denna metod att påvisa prion-liknande överföring av muterade Htt aggregat i vivo och identifiera en fagocytos receptor som medierar spridningen av dessa aggregat från nervceller till glia27. Vår metod utnyttjar flera fördelar att använda Drosophila för att studera genetiska sjukdomar hos människan: dess korta livslängd och stora genetiska verktygsuppsättning, vilket kan påskynda upptäckten av grundläggande biologiska terapeutiskt relevant information.

De metoder som vi beskriver här erbjuder två stora fördelar över andra befintliga djur och cell kultur modeller för prion-liknande överföring: (1) aggregering orsakande agens (t.ex., mutant Htt) produceras i en cell som bosatt i en intakt vävnad, och (2) uttryck för den normal-viks versionen av samma protein (t.ex., vildtyp Htt) i en separat cell befolkning ger en lättillgänglig ”reporter” för prion-liknande händelser. Med hjälp av sofistikerade genetiska verktyg som är väletablerad i Drosophila40har vi uppnått uttryck av mutant och vildtyps-Htt proteiner i icke-överlappande cellpopulationer inom samma organism. Eftersom många olika vävnadsspecifika Gal4 och QF förare är lätt tillgängliga, är att undersöka prion-liknande överföring mellan i huvudsak alla olika celltyper i flyga kroppen genomförbart.

En kritisk komponent i metoden är att uppnå segregerade uttryck av mutant och vildtyps-Htt proteiner i olika cellpopulationer inom samma djur. Överlappning uttryck måste elimineras så att vildtyp Htt aggregation i mottagarens celler rapporterar cytoplasmiska penetration av prion-liknande aggregat med ursprung i givare celler9,12,27, 41. Detta kan åstadkommas genom att införa ytterligare genetiska verktyg (t.ex., Gal80 och QS kvinnoförtryckarna40) att lindra problemet. När idealisk genotypen är utformade och utvalda, måste en systematisk metod för att kvantifiera puncta fastställas. Detta beror till stor del på antalet celler som är märkta, antalet aggregat som visas, och signal-brus-förhållandet av provet. Kriterier såsom samtidig lokalisering eller positiva bandet kan användas för att analysera data, som vi har beskrivit här i figur 4. Dock kan begränsar urval av vildtyp Htt aggregat utifrån dessa funktioner leda till underskattning av prion-liknande överföring händelser, eftersom vissa muterade Htt samlade frön kan falla under detektionsgränsen i mikroskopet confocal.

Den in-vivo -strategi som beskrivs här är inte exklusivt för prion-liknande beteende av aggregat som är associerad med HD eller även andra polyQ sjukdomar. Transgena flugor kan utvecklas för att undersöka prion-liknande fördelning av alfa-synuklein i PD, tau i AD, och SOD1 eller TDP-43 i ALS använder samma experimentella paradigm. För varje av dessa proteiner, bör en sammanläggning-benägen mutant uttryckas i givare celler och en löslig version av samma protein att endast aggregat när nucleated bör uttryckas i mottagarens celler. Detta experimentella paradigm kan också vara användbar för att undersöka framväxande idén att patogena proteiner associerade med olika sjukdomar kan interagera genom en cross-sådd mekanism47. Slutligen kan, de otaliga genetiska verktyg som finns i Drosophila tillämpas för att undersöka och identifiera molekylära mekanismerna underliggande cytoplasman-till-cytoplasman spridning av patogena protein aggregat är associerad med dessa dödliga sjukdomar.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Vi tackar medlemmar av de Kopito, Luo och Pearce laboratorier för många bra diskussioner under utvecklingen av dessa metoder. Vi tackar också Brian Temsamrit för kritisk läsning av detta manuskript. Detta arbete stöds av medel från University of vetenskaperna och de WW Smith Charitable trusterna.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphate buffered saline (PBS), 10X, pH 7.4 ThermoFisher Scientific AM9625 Dilute to 1X
Triton X-100 Sigma-Aldrich T9284-1L
Kimwipes Thomas Scientific 2904F24
20% paraformaldehyde (PFA) Electron Microscopy Sciences 15713-S
Normal Goat Serum (NGS), filtered Lampire Biological Laboratories 7332500 Aliquot and freeze upon receipt
Chicken anti-GFP Aves Labs GFP-1020 Use at 1:500 dilution
Rabbit anti-DsRed Clontech 632496 Use at 1:2000 dilution; can recognize DsRed-based fluorescent proteins (e.g. mCherry, mStrawberry, tdTomato, etc.)
Mouse anti-Bruchpilot Developmental Studies Hybridoma Bank nc82 Use at 1:100 dilution; will label active pre-synaptic structures thoughout the fly brain
FITC anti-chicken ThermoFisher Scientific SA1-7200 Use at 1:250 dilution
Alexa Fluor 568 anti-rabbit Life Technologies A11011 Use at 1:250 dilution
Alexa Fluor 647 anti-mouse antibody Life Technologies A21235 Use at 1:250 dilution
Slowfade Gold Antifade Reagent Life Technologies S36936
Microscope Slides (25 x 75 x 1.0 mm) Fisher Scientific 12-550-143
Cover Glass (22 x 22 mm) Globe Scientific 1404-15
Dumont Biology Grade Forceps, Style 3 Ted Pella 503 use in non-dominant hand
Dumont Biology Grade Forceps, Style 5 Ted Pella 505 use in dominant hand
LAS X image analysis software Leica
Imaris image analysis software Bitplane

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Prusiner, S. B. Biology and genetics of prions causing neurodegeneration. Annu Rev Genet. 47, 601-623 (2013).
  2. Haïk, S., Brandel, J. P. Infectious prion diseases in humans: Cannibalism, iatrogenicity and zoonoses. Infect Genet Evol. 26, 303-312 (2014).
  3. Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. Adapting Proteostasis for Disease Intervention. Science. 319, (5865), 916-919 (2008).
  4. Stroo, E., Koopman, M., Nollen, E. A., Mata-Cabana, A. Cellular Regulation of Amyloid Formation in Aging and Disease. Front Neurosci. 11, 64 (2017).
  5. Brundin, P., Melki, R., Kopito, R. Prion-like transmission of protein aggregates in neurodegenerative diseases. Nat Rev Mol Cell Biol. 11, (4), 301-307 (2010).
  6. Jucker, M., Walker, L. C. Self-propagation of pathogenic protein aggregates in neurodegenerative diseases. Nature. 501, (7465), 45-51 (2013).
  7. Stopschinski, B. E., Diamond, M. I. The prion model for progression and diversity of neurodegenerative diseases. Lancet Neurol. 16, (4), 323-332 (2017).
  8. Walker, L. C., Jucker, M. Neurodegenerative diseases: expanding the prion concept. Annu Rev Neurosci. 38, 87-103 (2015).
  9. Holmes, B. B., et al. Heparan sulfate proteoglycans mediate internalization and propagation of specific proteopathic seeds. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, (33), 3138-3147 (2013).
  10. Munch, C., O'Brien, J., Bertolotti, A. Prion-like propagation of mutant superoxide dismutase-1 misfolding in neuronal cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, (9), 3548-3553 (2011).
  11. Nonaka, T., et al. Prion-like properties of pathological TDP-43 aggregates from diseased brains. Cell Rep. 4, (1), 124-134 (2013).
  12. Ren, P. H., et al. Cytoplasmic penetration and persistent infection of mammalian cells by polyglutamine aggregates. Nat Cell Biol. 11, (2), 219-225 (2009).
  13. Trevino, R. S., et al. Fibrillar structure and charge determine the interaction of polyglutamine protein aggregates with the cell surface. J Biol Chem. 287, (35), 29722-29728 (2012).
  14. Volpicelli-Daley, L. A., et al. Exogenous alpha-synuclein fibrils induce Lewy body pathology leading to synaptic dysfunction and neuron death. Neuron. 72, (1), 57-71 (2011).
  15. Zeineddine, R., et al. SOD1 protein aggregates stimulate macropinocytosis in neurons to facilitate their propagation. Mol Neurodegener. 10, 57 (2015).
  16. Ayers, J. I., Fromholt, S. E., O'Neal, V. M., Diamond, J. H., Borchelt, D. R. Prion-like propagation of mutant SOD1 misfolding and motor neuron disease spread along neuroanatomical pathways. Acta Neuropathol. 131, (1), 103-114 (2016).
  17. Clavaguera, F., et al. Brain homogenates from human tauopathies induce tau inclusions in mouse brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, (23), 9535-9540 (2013).
  18. de Calignon, A., et al. Propagation of tau pathology in a model of early Alzheimer's disease. Neuron. 73, (4), 685-697 (2012).
  19. Eisele, Y. S., et al. Induction of cerebral beta-amyloidosis: intracerebral versus systemic Abeta inoculation. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (31), 12926-12931 (2009).
  20. Luk, K. C., et al. Pathological alpha-synuclein transmission initiates Parkinson-like neurodegeneration in nontransgenic mice. Science. 338, (6109), 949-953 (2012).
  21. Meyer-Luehmann, M., et al. Exogenous induction of cerebral beta-amyloidogenesis is governed by agent and host. Science. 313, (5794), 1781-1784 (2006).
  22. Mougenot, A. L., et al. Prion-like acceleration of a synucleinopathy in a transgenic mouse model. Neurobiol Aging. 33, (9), 2225-2228 (2012).
  23. Rey, N. L., et al. Widespread transneuronal propagation of alpha-synucleinopathy triggered in olfactory bulb mimics prodromal Parkinson's disease. J Exp Med. 213, (9), 1759-1778 (2016).
  24. Babcock, D. T., Ganetzky, B. Transcellular spreading of huntingtin aggregates in the Drosophila brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, (39), 5427-5433 (2015).
  25. Kim, D. K., et al. Anti-aging treatments slow propagation of synucleinopathy by restoring lysosomal function. Autophagy. 12, (10), 1849-1863 (2016).
  26. Liu, L., et al. Trans-synaptic spread of tau pathology in vivo. PLoS One. 7, (2), 31302 (2012).
  27. Pearce, M. M., Spartz, E. J., Hong, W., Luo, L., Kopito, R. R. Prion-like transmission of neuronal huntingtin aggregates to phagocytic glia in the Drosophila brain. Nat Commun. 6, 6768 (2015).
  28. Pearce, M. M. Prion-like transmission of pathogenic protein aggregates in genetic models of neurodegenerative disease. Curr Opin Genet Dev. 44, 149-155 (2017).
  29. Pecho-Vrieseling, E., et al. Transneuronal propagation of mutant huntingtin contributes to non-cell autonomous pathology in neurons. Nat Neurosci. 17, (8), 1064-1072 (2014).
  30. Wu, J. W., et al. Neuronal activity enhances tau propagation and tau pathology in vivo. Nat Neurosci. 19, (8), 1085-1092 (2016).
  31. Jackson, G. R., et al. Polyglutamine-expanded human huntingtin transgenes induce degeneration of Drosophila photoreceptor neurons. Neuron. 21, (3), 633-642 (1998).
  32. Warrick, J. M., et al. Expanded polyglutamine protein forms nuclear inclusions and causes neural degeneration in Drosophila. Cell. 93, (6), 939-949 (1998).
  33. McGurk, L., Berson, A., Bonini, N. M. Drosophila as an In Vivo Model for Human Neurodegenerative Disease. Genetics. 201, (2), 377-402 (2015).
  34. The Huntington's Disease Collaborative Research Group. A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes. Cell. 72, (6), 971-983 (1993).
  35. Bates, G. P., et al. Huntington disease. Nat Rev Dis Primers. 1, 15005 (2015).
  36. Scherzinger, E., et al. Self-assembly of polyglutamine-containing huntingtin fragments into amyloid-like fibrils: implications for Huntington's disease pathology. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, (8), 4604-4609 (1999).
  37. Chen, S., Berthelier, V., Yang, W., Wetzel, R. Polyglutamine aggregation behavior in vitro supports a recruitment mechanism of cytotoxicity. J Mol Biol. 311, (1), 173-182 (2001).
  38. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, (2), 401-415 (1993).
  39. Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis. Cell. 141, (3), 536-548 (2010).
  40. Riabinina, O., Potter, C. J. The Q-System: A Versatile Expression System for Drosophila. Methods Mol Biol. 1478, 53-78 (2016).
  41. Costanzo, M., et al. Transfer of polyglutamine aggregates in neuronal cells occurs in tunneling nanotubes. J Cell Sci. 126, (16), 3678-3685 (2013).
  42. Freeman, M. R., Delrow, J., Kim, J., Johnson, E., Doe, C. Q. Unwrapping glial biology: Gcm target genes regulating glial development, diversification, and function. Neuron. 38, (4), 567-580 (2003).
  43. MacDonald, J. M., et al. The Drosophila cell corpse engulfment receptor Draper mediates glial clearance of severed axons. Neuron. 50, (6), 869-881 (2006).
  44. Wu, J. S., Luo, L. A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining. Nat Protoc. 1, (4), 2110-2115 (2006).
  45. Tito, A. J., Cheema, S., Jiang, M., Zhang, S. A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains. J Vis Exp. (118), (2016).
  46. Roszik, J., Szöllosi, J., Vereb, G. AccPbFRET: an ImageJ plugin for semi-automatic, fully corrected analysis of acceptor photobleaching FRET images. BMC Bioinformatics. 9, 346 (2008).
  47. Spires-Jones, T. L., Attems, J., Thal, D. R. Interactions of pathological proteins in neurodegenerative diseases. Acta Neuropathol. 134, (2), 187-205 (2017).
Övervakning Cell till cell överföring av Prion-liknande Protein aggregat i <em>Drosophila Melanogaster</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Donnelly, K. M., Pearce, M. M. P. Monitoring Cell-to-cell Transmission of Prion-like Protein Aggregates in Drosophila Melanogaster. J. Vis. Exp. (133), e56906, doi:10.3791/56906 (2018).More

Donnelly, K. M., Pearce, M. M. P. Monitoring Cell-to-cell Transmission of Prion-like Protein Aggregates in Drosophila Melanogaster. J. Vis. Exp. (133), e56906, doi:10.3791/56906 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter