Summary
We presenteren een protocol om te onderzoeken de Overspraak tussen Caco-2 X-Vleug-bestraalde en perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC). Het protocol start met Caco-2 bestraling en opzet van de co cultuur met PBMC; trans-epitheliale elektrische weerstand is vervolgens regelmatig gedurende 48 h en westelijke vlek uitgevoerd in zowel Caco-2 en PBMC gemeten.
Abstract
De aanneming van het protocol in dit werk richt zich op het ontrafelen van hoe x-stralen erover de werking van de intestinale barrière, gericht op de wisselwerking tussen colorectale tumorcellen en het immuunsysteem. Colorectaal carcinoom is een van de meest voorkomende vorm van kanker, meestal behandeld door chirurgie, chemotherapie en radiotherapie. Voordelen van radiotherapie in de tumor gericht zijn bekend. Zelfs beperkte blootstelling aan gezonde weefsels zijn echter van groot belang, met name over de gevolgen voor de intestinale barrière en het immuunsysteem. De geadopteerde setup kunt bestuderen de interactie tussen twee cel populaties in een voorwaarde meer vergelijkbaar is met de fysiologische, in vergelijking met normale celculturen. Voor dit doel, we toevlucht nemen tot de verschillende technieken en gebruikten we een in vitro co cultuur model, gebaseerd op Caco-2 cellen onderscheiden als een enkelgelaagde en PBMC, delen de zelfde kweekmedium. Dit protocol heeft ontwikkeld om zich te concentreren op zowel macroscopische effecten, dat wil zeggen de levensvatbaarheid van de cellen en Trans-epitheliale elektrische weerstand (TEER), en, via de westelijke vlek, moleculaire veranderingen, dat wil zeggen van de activering van inflammatoire traject in immune cellen en de strakke junction eiwituitdrukking in Caco-2 cellen. Eerste evaluatie gevolgen van straling op de levensvatbaarheid van de cellen van de Caco-2 werd beoordeeld via het 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) en Trypan blauwe testen, terwijl TEER via een ohmmeter op vaste tijdstippen gemeten was speciaal ontworpen voor co cultuur systemen. Op deze manier kunnen de effecten als gevolg van straling, de aanwezigheid van perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC), en uiteindelijk hun synergetische effect, worden aangetoond. Via deze complementaire technieken zien we een radio-inwerking van Caco-2 binnen het bereik van 2-10 Gy van x-stralen en een verhoogde permeabiliteit van de Caco-2 enkelgelaagde wanneer PBMCs werden toegevoegd. In het bijzonder PBMC aanwezigheid bleek geassocieerd te worden met de variatie in de strakke junction steiger eiwitten expressie.
Introduction
De methodologie in dit werk is ontworpen voor het onderzoeken van de wisselwerking tussen colorectal kankercellen en het immuunsysteem, exploitatie van een set-up dichter naar de fysiologische toestand in vergelijking met normale 2-dimensionale celculturen.
Colorectaal carcinoom (CRC) wordt beschouwd als de derde meest voorkomende vorm van kanker, met meer dan een miljoen gevallen wereldwijd (globale kanker observatorium, internationale agentschap voor onderzoek naar kanker, World Health Organization, http://gco.iarc.fr). Beheer van CRC routinematig uitgevoerd door chirurgie, chemotherapie of radiotherapie1. In vergelijking met invasieve technieken zoals chirurgie of chemotherapie, vermijdt radiotherapie grotendeels de typische schadelijk systemische reacties die voortvloeien uit deze klinische benaderingen, dankzij de gelokaliseerde levering van stralingsdosis. Echter kunnen bijwerkingen ontstaan in de omliggende gezonde weefsels, triggering ontsteking met directe schade aan gezonde cellen en schade gemedieerd door niet-doelgerichte effecten2,3,4. Focussen op de negatieve effecten als gevolg van de bestraling tijdens de behandeling van het colorectaal carcinoom, twee aspecten moeten worden onderzocht. Ten eerste, de mechanismen die verantwoordelijk zijn voor intestinale ondoordringbaarheid kunnen worden gewijzigd door straling levering veroorzaakt, op hun beurt de mogelijkheid van bijwerkingen als gevolg van een veranderde insluiting van bacteriële bevolking en de passage van de paracellular van moleculen en opgeloste stoffen. Ten tweede, de aanwezigheid van gut-geassocieerde lymfatische weefsel (GALT) fungeert als een buitenpost van het immuunsysteem, met de functie van de bacteriële groei te beheren en bemiddelen van de algemene immuunrespons5,6,7. Voor het afhandelen van deze functies, wordt intestinale ondoordringbaarheid gehouden als gevolg van de functie van regulates complexen tussen cellen membranen. Om deze redenen werden de geïnduceerde nadelige gevolgen te wijten aan verschillende doses van x-stralen onderzocht in Caco-2 cellen alleen en in co culturen met PBMC.
Hoewel het uitvoeren van studies over celculturen de eerste setline van onderzoek in biomedisch onderzoek is, kan het ontbreken van gedetailleerde kennis van de mechanismen die rijden cel biologie en wederkerige interactie tussen de verschillende soorten cellen worden kritisch wanneer het naderen van de studie van de Fysiologie van de organen, systemen en apparaten die gemakkelijk opnieuw kunnen niet worden gemaakt in het laboratorium. Daarom besloten hebben we tot een co cultuur set-up, waardoor zowel de studie van twee cel populaties samen en de dissectie van de aspecten in verband met intercellulaire en extracellulaire mechanismen.
Co cultuur is een techniek die misbruikt wanneer studeren epitheliale functies en het samenspel tussen de verschillende soorten cellen. In het bijzonder wordt het gebruik van een dergelijke techniek verplicht in ons geval omdat epithelen zijn opgebouwd uit cellen gekenmerkt door polariteit. In het geval van de intestinale barrière, enterocyten Toon een welomschreven polarisatie, met apicale en basolaterale Polen normaal gescheiden als gevolg van de aanwezigheid van strakke junction genererende celadhesie-moleculen. Deze opdeling is nodig voor de weefsel fysiologie, paracellular, mensenhandel en waardoor de passage van bepaalde moleculen alleen vermijden. Deze functie is natuurlijk onmogelijk om opnieuw met een normale cel culturing set-up. Bovendien, de aanneming van de co cultuur set-up reproduceert de aanwezigheid van immune cellen alleen in de basolaterale oppervlakte, terwijl het apicale oppervlak (overeenkomend met intestinale lumen) niet rechtstreeks in contact met andere cellen is.
Onlangs kreeg Caco-2 cellijnen belangrijker als een in vitro model van intestinale barrière. Hoewel afgeleid van menselijke Colón adenocarcinoom, Caco-2 cellen behouden de mogelijkheid van differentiatie en maken een functionele gepolariseerde enkelgelaagde8, waarmee het onderzoek van de celmembraan eigenschappen als volwassen in een co cultuur invoegen.
Caco-2 kweken op een poreuze membraan is een gevestigde in vitro model van intestinale enkelgelaagde, is een verbetering sinds de co cultuur tussen Caco-2 en andere cellen. Deze set-up is vaak tot aangenomen maatregel de Overspraak tussen verschillende typen9 cel en kan worden gebruikt om te ontrafelen Caco-2 verstoord reactie op exogene stimuli bij co cultuur, met betrekking tot Caco-2 alleen gekweekt.
Vele studies hebben aangepakt Caco-2 gedrag wanneer mede gekweekte met zowel niet-pathogene bacteriën en perifere bloed mononucleaire cellen, ophelderen met name de Overspraak met het immuunsysteem10. Pozo-Rubio et al. de expressie van diverse cytokinen in een Caco-2/PBMC co cultuur studeerde 11 met bifidobacteriën stimuleren Caco-2 cellen. Hun werk belicht substantiële wijziging van cytokine expressieprofielen afhankelijk van bacteriële stimulatie uitgevoerd in aanwezigheid/afwezigheid van PBMC. Hun resultaten leiden tot de conclusie dat de aanwezigheid van PBMC Caco-2 naar bifidobacteriën sensibiliseert.
Verschillende reacties van Caco-2 cellen op niet-pathogene en pathogene bacteriën zijn beoordeeld door verschillende onderzoeksteams. Parlesak et al. 12 aangetoond de immunosuppressieve effecten van Caco-2 cellen op Escherichia coli-PBMC gestimuleerd. Bovendien Haller et al. 13 studeerde de reactie van Caco-2 cellen gestimuleerd met beide lipopolysaccharide (LPS) van het enteropathogenic E. coli spp. of niet-enteropathogenic bacteriën i.e.E. coli spp., versterking van Lactobacillus spp., de vermoeden dat de Caco-2 cellen antwoord strikt afhankelijk is van de aanwezigheid van leukocyten in de opstelling mede cultuur.
Door het uitvoeren van de verschillende complementaire laboratorium testen (bijvoorbeeld westelijke vlek, trans-epitheliale elektrische weerstand, MTT, etc.), naast de analyse van verschillende celtypes gegroeid in co-cultuur, belooft de hele methodologie resultaten die kunnen worden beschouwd als meer representatief is voor wat er werkelijk in vivo gebeurt. Bovendien, deze set-up maakt de scheiding van de verschillende mede cultuur compartimenten, zodat niet alleen de studie van de celtypes betrokken, maar ook de intercellulaire signalering moleculen vrijgegeven in het onderste compartiment bovenste vs. of aanwezigheid VS. afwezigheid van co cultuur.
Protocol
Het volgende protocol omvat menselijk bloed terugtrekking uit gezonde vrijwilligers. Donors verstrekt schriftelijke geïnformeerde toestemming voorafgaand aan de inschrijving. Deze procedure is in overeenstemming met de verklaring van Helsinki en bloed opnames werden uitgevoerd door een professionele gezondheidszorg assistent.
1. cel cultuur en co cultuur Set-up
- Een week voor de bestraling, bereid een celsuspensie van Caco-2 met 2,5 × 105 cellen/mL in verse RPMI1640 medium aangevuld met 10% foetale runderserum (FBS), 2 mM L-glutamine, 100 U/mL penicilline en 100 μg/mL streptomycine.
- Zaad 2 mL celsuspensie in steriele 1 µm-porie diameter celkweek wordt ingevoegd voor 6-Wells-platen en zet het invoegen in een 6-well-plate.
Opmerking: Cel cultuur inserts mogelijk moet worden geactiveerd door incubatie met steriele compleet medium vóór het zaaien van de cel. In dit geval moet voedingsbodems worden verwijderd en vervangen door cel schorsing media. - Voeg 3 mL van verse RPMI1640 medium aangevuld met 10% FBS, 2 mM L-glutamine 100 IU/mL penicilline en 100 µg/mL streptomycine in elke onderste compartiment, en cultuur van de cellen bij 37 ° C in een broedstoof met bevochtigde sfeer met 5% CO2.
- Op dezelfde dag van Caco-2 cel bestraling, verzamelen menselijke volbloed in verkrijgbare lithium-heparine gecoat 6 mL buisjes (tube formaat: 13 x 100 mm).
- Vervolgens, perifere bloed mononucleaire cellen (PBMC) isoleren met behulp van de helling van de densiteitgradiënt. Verdund 1:1 met RPMI1640 op het oppervlak van de densiteitgradiënt te scheiden van PBMC, 25 mL van densiteitgradiënt in een tube van 50 mL conische centrifuge en laag een gelijk volume volbloed.
Opmerking: Een normale gezonde donor is meestal ongeveer 4-10 × 106 PBMC/mL. - Centrifugeer de 50 mL tubes bij 400 x g gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Zachtjes verzamelen de PBMC op het raakvlak tussen de densiteitgradiënt en plasma door aspiratie met een pipet van Pasteur en leg ze in een conische tube van 15 mL.
- Wassen de PBMC tweemaal door het toevoegen van 10 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en centrifugeren PBMC bij 250 x g gedurende 10 minuten.
- Cultuur PBMC voor een maximum van 3-5 uur in T25 cm2 kolven in RPMI1640 media, zoals eerder is beschreven bij 37 ° C in een bevochtigde sfeer met 5% CO2voltooien.
Opmerking: PBMC verzamelen op de dag van het experiment en zaad van 2 × 106 cellen/well, geschorst in 3 mL voor volledige RPMI1640 medium, in het onderste compartiment van de co-cultuur. Inzetstukken met Caco-2 cellen worden overgebracht in PBMC-bevattende wells 30 min na de bestraling. PBMC verzameld uit volbloed kan niet worden gehandhaafd in cultuur voor meer dan ongeveer 72 h, zoniet gestimuleerd met bijv. Phytohemagglutinine (PHA), waarna de levensvatbaarheid van de cellen verloren is.
Let op: De kwaliteit en de veiligheid van alle bloed en bloedprodukten moeten worden gewaarborgd tijdens het hele proces.
2. bestraling Set-up
Opmerking: Bestraling van Caco-2 cellen werd uitgevoerd met een lineaire versneller routinematig gebruikt voor de behandeling van verschillende soorten kankers op de afdeling radiotherapie van Istituto di Ricovero e Cura een bitmap Scientifico (IRCCS) S. Maugeri (Pavia, Italië).
- Foton x-stralen energie tot 6 MV piek instellen De lineaire versneller opereert in een pulserende regime (tijd tussen twee opeenvolgende pulsen ongeveer van 4 ms; duur van een enkele puls over 5 µs met een dosis stem maximaal 1 × 10-3 Gy/p).
- Plaats de 6-Wells-platen met inzetstukken met Caco-2 op het traject van x-stralen op een 1.4 cm dikke Plexiglas vel (overeenkomend met een afstand iets groter dan de opbouw van de gebruikte straling) op 100 cm vanaf de bron van straling.
- Plaats een 0.5 cm dik bolus op elk monster voordat de bestraling plaatsvindt ter waarborging van de terugverstrooide straling component en het evenwicht van de geladen deeltjes.
- Bestralen van de cellen (doses in het bereik 2-10 Gy) met een vlakke en symmetrische (± 2%) 20 x 20 cm2 stralingsveld en een dosering van 3 Gy/min.
Opmerking: Controle "sham"-bestraalde cellen onderging dezelfde procedurele voorwaarden van de bestraalde ones, zonder het invoeren van de kamer van de bestraling (ontvangen dosis: 0 Gy).
Let op: ioniserende straling-producerende apparaten moeten alleen worden gebruikt door gespecialiseerd personeel.
3. cel levensvatbaarheid Assay (MTT Assay)
Opmerking: Caco-2 cel metabole activiteit werd beoordeeld door middel van het 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay14.
- Zaad 2 × 105 Caco-2 in een 24-well bord 24 h vóór bestraling 1,25 mL van volledige medium.
- De cellen zoals beschreven in stappen 2.1-2.4 bestralen dan Incubeer de cellen bij 37 ° C in een bevochtigde sfeer met 5% CO2.
- 21 h na bestraling, voeg 100 µL van MTT-oplossing van 5 mg/mL en houden van de cellen bij 37 ° C in een bevochtigde sfeer met 5% CO2 gedurende 3 uur.
- Verwijder het supernatant en wassen van de cellen met 1 mL PBS.
- Formazan kristallen ontbinden door 500 µL van dimethylsulfoxide (DMSO) toe te voegen in elk putje en evalueren van de extinctie met een multi goed afleesapparaat op λ = 570 nm.
- Herhaal stap 3.3-3.4 - 3.5-3.6 op 45 h na bestraling.
Opmerking: De resultaten worden weergegeven als een verstoring van de overeenkomstige sham aandoening, die wordt genormaliseerd tot 100%.
Let op: DMSO is agent van ontvlambare en irriterend voor de huid, de ogen en de ademhalingswegen (GHS07, GHS08). Bij aanraking met de ogen onmiddellijk met overvloedig water wassen en deskundig medisch advies inwinnen. MTT is een irritante agent voor de huid, de ogen en de ademhalingswegen (GHS07, GHS08). Bij aanraking met de ogen onmiddellijk met overvloedig water afspoelen en deskundig medisch advies inwinnen.
4. aantal levensvatbare cellen bepaling (Trypan blauwe kleurstof uitsluiting Assay)
Opmerking: Percentage van levensvatbare cellen werd beoordeeld door Trypan blauwe kleurstof uitsluiting assay.
- Zaad 2 × 105 Caco-2 in 24-well plaat 24 h vóór bestraling 1,25 mL van volledige medium.
- Bestralen van de cellen met doses in het bereik 0 - 10 Gy (Zie stappen 2.1-2.4) vervolgens Incubeer de cellen bij 37 ° C in een bevochtigde sfeer met 5% CO2 voor 24-48 h.
- Nadat de twee gekozen tijd punten, wassen de cellen met PBS, verwijderen, voeg dan 100 µL van trypsine-ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) oplossing. Zet de cellen bij 37 ° C in een bevochtigde sfeer met 5% CO2 gedurende 2 minuten dan volledige medium om arrestatie van de enzymatische reactie toevoegen.
- Verzamelen van de cellen in een 1,5 mL-buis en centrifugeer de buis bij 500 x g gedurende 5 min. negeren het supernatant en resuspendeer de cellen in 50 µL van PBS.
- Meng de celsuspensie met 50 µL van Trypan blauwe kleurstof oplossing en laat het mengsel gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur inwerken.
- Tellen de gekleurd (niet-levensvatbare) en onbevlekt (levensvatbare) cellen met een Bürker kamer.
5. Trans-epitheliale elektrische weerstand (TEER)
- Zaad 5 × 105 Caco-2 cellen een week voorafgaand aan de bestraling in 6-well plaat cultuur samen inserts (polyethyleentereftalaat (PET), 2 x 106 poriën/cm2).
- 1 h voor bestraling, meten de TEER met een voltmeter/ohmmeter.
- Bestralen cellen zoals beschreven in stappen 2.1-2.4.
- Incubeer Caco-2 cellen in aanwezigheid/afwezigheid van co cultuur met PBMC bij 37 ° C in een bevochtigde sfeer met 5% CO2.
- Voor de eerste paar uur na bestraling, meten TEER elk uur, en vervolgens elke 3 h tot 48 uur.
6. de Western Blot analyse van Claudin-1, Occludin, Afadin, ZO-1, ZO-2, NF-kB en XIAP
- Zaad 5 × 105 cellen 1 week vóór de blootstelling van de x-stralen in 6-well plaat co cultuur wordt ingevoegd (PET, 2 x 106 poriën/cm2) en cellen zoals beschreven in stappen 2.1-2.4 bestralen.
- Incubeer Caco-2 cellen in aanwezigheid/afwezigheid van co cultuur met PBMC bij 37 ° C in een bevochtigde sfeer met 5% CO2.
- 48 h na bestraling, bereiden Caco-2 en PBMC cel lysates door het behandelen van cellen met lysis van de cel buffer en slaan van de monsters bij-20 ° C.
Opmerking: het protocol kan hier worden gepauzeerd. - Bedrag van de totale proteïne te kwantificeren door bicinchoninic zuur (BCA) methode.
Opmerking: het protocol kan hier worden gepauzeerd. - Meng gelijke hoeveelheden van totale eiwitten met Laemli monster Buffer toegevoegd met β-mercaptoethanol (eindconcentratie van β-mercaptoethanol is 5%), warmte van de monsters bij 95 ° C gedurende 5 min en draaien ze op 10.000 x g.
- Belasting monsters in een 4-20% voorgegoten gel en voer de elektroforese op 120 V voor 1 h. overdracht eiwitten op een polyvinildiene-fluoride (PVDF) membraan.
- Aspecifieke bandplaatsen blokkeren door het broeden van PVDF membraan bij kamertemperatuur met 5% non-fat droge melk (NFDM) in PBS toegevoegd met 0,2% Tween-20 (PBT). Wassen van het membraan driemaal met 10 mL 0,2% PBT gedurende 5 minuten.
- Incubeer het membraan met zachte agitatie voor 1 uur vóór het 's nachts bij 4 ° C met de volgende primaire antilichamen worden gebracht op kamertemperatuur: anti-claudin-1, anti-ZO-1, anti-ZO-2, anti-afadin, anti-occludin, anti-NF-kB, anti-XIAP en anti-actine. Wassen van het membraan driemaal met 10 mL 0,2% PBT gedurende 5 minuten.
- Incubeer de membranen met secundaire antilichamen Horseradish Peroxidase HRP-geconjugeerde gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met zachte agitatie. Wassen van het membraan driemaal met 10 mL 0,2% PBT gedurende 5 minuten.
- Ontwikkelen bij kamertemperatuur, fotografische films door de membranen met verbeterde chemo-luminescent kit aan het broeden.
- Verwerven van fotografische films met een scanning systeem en kwantificeren van de verkregen bands met geschikte afbeelding analysesoftware.
Opmerking: De beoordeling van Claudin-1, Occludin, Afadin, ZO-1 en ZO-2 is uitgevoerd in Caco-2 cellen. De evaluatie van NF-kB en XIAP wordt uitgevoerd in PBMC.
Let op: β-mercaptoethanol is giftig (GHS05, GHS06, GHS08, GHS09). Niet inademen van dampen, Voorkom lozing in het milieu, en individuele bescherming apparaten en ademhalingsbescherming dragen. Bij inslikken, onmiddellijk medisch advies vragen.
7. statistische analyse
- Om te bepalen of de blootstelling aan straling en de co cultuur een statistisch significante verstoring veroorzaken, een twee-weg variantieanalyse (ANOVA)-test met meerdere vergelijkingen voor herhaalde metingen uitvoeren (met Bonferroni post-hoc tests om te vergelijken repliceren betekent).
- Indien niet anders vermeld, berekenen de statistische significantie (p) door de tweezijdige Student t-test. Elke waarde is het gemiddelde van ≥3 onafhankelijke experimenten ± standaardafwijking van het betekenen (SEM).
Representative Results
Een week voorafgaand aan het experiment, zijn cellen gezaaid op het poreuze membraan van het donormateriaal en toegestaan om te groeien tijdens de volgende dagen. Het niveau van de samenvloeiing kan worden gecontroleerd via een omgekeerde Microscoop of via de meting van het TEER-waarden. Inderdaad, tijdens de groeifase, TEER blijft stijgen totdat alle het poreuze membraan is gecoverd door cellen en ze een gedifferentieerde cel enkelgelaagde vormen. Als cellen sneller/langzamer vermenigvuldigen, kon het experiment begint eerder/later tijdstippen na waarmee seeding wordt uitgevoerd. Bij samenvloeiing, cellen worden ingebracht om de doorstralingsinstallatie, minimaliseren van de bijgebracht milieudruk en (temperatuur of pH), vóór het opstarten de co cultuur met/zonder PBMC, zaadjes in het onderste compartiment (Figuur 1A), of evaluatie van de proliferatie van Caco-2 cellen. Gezien de eerste seeding dichtheid, op dag moeten 0 cellen bereiken van 100% samenvloeiing en maak een gedifferentieerde enkelgelaagde van epitheliale cellen, die kunnen worden waargenomen door het plateau in TEER afgebeeld in Figuur 1B. Zodra de cellen deze hoedanigheid bereiken, wordt de waarde van de TEER gehouden relatief constant de volgende week, zo lang als het oude kweekmedium wordt vervangen met verse medium, ten minste eenmaal per week (Figuur 1B). Zoals blijkt uit Figuur 1C, toont de MTT-test niet elke statistisch significante wijziging in de proliferatieve status van Caco-2 cellen op 24u noch in 48 h, onafhankelijk van de dosis ontvangen (maximaal 10 Gy).
Een ander resultaat werd waargenomen betreffende de op korte termijn sterfte van Caco-2 cellen. Op beide tijdstippen, Trypan blauw kleuring vertonen een verhoging van de dosis-afhankelijke cel sterfte. Deze resultaten tonen een duidelijk effect van de blootstelling aan straling, hoewel de percentages van de dode cellen zeer laag is, lijken met name bij het overwegen dat de hoogste afgeleverde dosis (10 Gy) slechts ongeveer 20% van de dood van de cel (Figuur 1D produceert).
Monsters werden mede gekweekte met of zonder PBMC in het onderste compartiment. Gezien het feit dat PBMC ontving niet elke externe prikkel te verspreiden, een 48u experiment werd beschouwd als ideaal om te voorkomen dat de bias geïntroduceerd door PBMC beginnen te sterven. Daarom was vanaf onmiddellijk voorafgaand aan de bestraling, TEER regelmatig gemeten gedurende 48 uur, om mogelijke tijdelijke effecten veroorzaakt door het protocol van bestraling bij te houden. Zoals blijkt uit Figuur 1 E-F, TEER waarden worden gepresenteerd als relatieve variaties met betrekking tot de vooraf behandelde aandoening (die waren in de orde van 1200-1500 Ω·cm2) beter de perturbation geïnduceerd door de X-ray bestraling van hoogtepunt en / of door de aanwezigheid/afwezigheid van PBMC in de co cultuur. In beide gevallen kan een eerste tijdelijke piek duidelijk worden gezien op het eerste punt van de tijd na de blootstelling aan straling, die kan worden toegeschreven aan de procedure van de bestraling.
Wanneer niet in co-cultuur met PBMC (Figuur 1E), TEER waarden bijna constant omhoog tot 48 h terwijl na 10 Gy van x-stralen zijn, cellen Toon een langdurige daling van TEER beginnen bij 3 h na bestraling. De aanwezigheid van PBMCs wijzigt volledig de temporele dynamiek van TEER (Figuur 1F). Voor alle doses is een vermindering van de TEER duidelijk waarneembare van 3u tot ongeveer 30 h na bestraling, wanneer TEER verschijnt te vestigen op een constante waarde (Figuur 1F).
Tight junction complexen expressie niveaus werden onderzocht in Caco-2 cellen lysates door westelijke vlek assay. CaCO-2 cellen werden blootgesteld aan ioniserende straling verbonden gevaren (met doses van 0, 2 en 10 Gy) en vervolgens uitgegroeid alleen of in co-cultuur met PBMCs in het onderste compartiment voor 48 h (zoals weergegeven in Figuur 2A-F). Zowel Claudin-1 en Occludin (Figuur 2A, 2B) bleken door X-ray en/of co cultuur met PBMC niet aanzienlijk worden gewijzigd. Grote schommelingen werden in plaats daarvan in de steiger eiwitten ZO-1 en ZO-2 Afadin (Figuur 2C, 2D, 2E) waargenomen. In het bijzonder is een vermindering in ZO-2 expressie niveaus waargenomen reeds na 2 Gy bij co cultuur met PBMC alleen bij 10 Gy wanneer Caco-2 groeiden alleen. Afadin zijn expressie in plaats daarvan beïnvloed pas na 10 Gy van x-stralen, met een extra korting wanneer Caco-2 zijn mede gekweekte met PBMCs.
PBMCs mede gekweekt met Caco-2 werden geanalyseerd met betrekking tot de inflammatoire staat, in het bijzonder het nucleaire transcriptiefactor kB (NF-kB) en de X-gebonden remmer van apoptosis eiwitniveaus (XIAP) zijn onderzocht (Figuur 2 G-ik). NF-kB totale bedrag werd niet beïnvloed door de co cultuur met Caco-2 blootgesteld aan verschillende stralingsdoses (Figuur 2G). Integendeel, waren XIAP niveaus 4-fold omhoog-geregeld in zowel de 2 Gy en 10 Gy mede culturen, hoewel de grote variaties eisen een hoger aantal monsters geanalyseerd om te verminderen van dergelijke schommelingen en krijgen een beter statistisch onderscheidingsvermogen.
Zoals blijkt uit Figuur 2F en 2I, sommige niet-specifieke banden mogelijk weergegeven naast de verwachte molecuulgewicht van de proteïne van belang. Tenzij de echte en niet-drugspecifieke bands zijn gemakkelijk te onderscheiden, moeten verschillende antilichaam en/of BSA of NFDM concentraties worden beschouwd.
Figuur 1 . Over het geheel genomen experimentele opzet en macroscopische effecten van blootstelling aan straling en/of PBMC co cultuur. A) Schematische voorstelling van het model co cultuur. B) TEER waarden gemeten dagelijks vanaf het oorspronkelijke zaad van Caco-2 cellen te beoordelen van de juiste status van de groei en differentiatie van de enkelgelaagde. Levensvatbaarheid van de cellen C) en D) sterfte in Caco-2 blootgesteld aan x-stralen (0, 2, 5 en 10 Gy). E) TEER metingen in Caco-2 cellen bestraald met 0, 2 en 10 Gy van x-stralen gekweekt zonder of F) met PBMCs. Elke waarde is het gemiddelde van ≥3 onafhankelijke experimenten ± SEM. * p-val < 0,05; ** p-va l < 0,01; p-val < 0,001. Grafieken van Morini et al.aangepast. 15. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2. Western Blot Caco-2 en PBMC lysates resultatenvan. Niveau van de expressie van de strakke junction eiwitten (Claudin-1 (A), Occludin (B), ZO-1 (C), ZO-2 (D) en Afadin (E)) in Caco-2 na 0, 2 en 10 Gy van x-stralen en aanwezigheid/afwezigheid van PBMC in co-cultuur. Waarden zijn genormaliseerd op actine niveau. Illustratieve films voor elke tight junction eiwit en voorwaarden worden getoond in deelvenster (F). Expressie niveau van NF-recombination (G) en XIAP (H) in PBMCs mede gekweekt met Caco-2 cellen. Representatieve films voor NF-kB, XIAP en actine worden weergegeven in het deelvenster. Elke waarde is het gemiddelde van ≥3 onafhankelijke experimenten ± SEM. grafieken van Morini et al.aangepast. 15. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Discussion
Colorectale kanker, met deze hoge zich voordoet in ontwikkelde landen, is een van de meest voorkomende oorzaken van morbiditeit en mortaliteit in de bevolking. Het wordt gewoonlijk beheerd door chirurgie, chemotherapie en radiotherapie1. In het kader van behandelingen van radiotherapie, moet bijzondere aandacht worden besteed aan de gevolgen van gezond weefsel blootstelling4; Bovendien, systematische studies over de relatie tussen blootstelling aan straling en het immuunsysteem zijn fundamenteel voor de ontwikkeling van benaderingen van radio-immunotherapie3.
De methodologie die wij hierbij heeft zijn afgestemd op het onderzoek van Caco-2 cellen en PBMC overspraak. We gericht op het effect van x-stralen blootstelling van tumorcellen, maar hetzelfde protocol kan worden aangepast aan studies met farmacologische agenten. Dichter bij de fysiologische omstandigheden met betrekking tot standaard cel kweken is, het grote voordeel van deze methode de mogelijkheid van een volledige dissectie van een complex systeem, gegeven de mogelijkheid van het analyseren van verschillende celtypes zowel de vrijlating van signaalmoleculen in de twee compartimenten van de co cultuur zelf. Op deze manier kunnen routinematig toegepaste biologische methoden helpen het begrip van cellulaire samenspel verwante mechanismen.
De eerste karakterisering van X-Vleug-geïnduceerde effecten op Caco-2 cellen was gebaseerd op twee aanvullende metingen, dat wil zeggen de MTT colorimetrische bepaling en de uitsluiting van de blauwe kleurstof Trypan testen. De blijkbaar inconsistente resultaten kunnen worden verklaard door de verschillende focus van deze twee tests. MTT beoordeelt de oxidoreductasen enzymen activiteit, terwijl de Trypan blauwe kleurstof is gebaseerd op een levende-cel uitsluitingsmechanisme kleurstof.
Het onderzoek van Caco-2-PBMC interactie vereist de oprichting van een epitheliale enkelgelaagde kunnen leiden tot een volledige scheiding tussen de twee compartimenten van de co-cultuur. De mogelijkheid van zaaien Caco-2 cellen in de co cultuur invoegen kunt dedoorstraling van alleen deze celpopulatie. Aangezien de co cultuur na bestraling begint, is er geen bias als gevolg van een toevallige blootstelling van PBMC. Deze set-up moet zorgvuldig worden behandeld om te voorkomen beschadiging (of verontreiniging) de cellulaire enkelgelaagde tijdens de bewegingen van het invoegen van een 6-well plaat naar de andere. Wanneer goed uitgevoerd, zijn TEER metingen een eenvoudige en niet-invasieve methode te onderzoeken de enkelgelaagde permeabiliteit. Deze test is strikt betrekking hebben op de set-up van de co-cultuur, en het is niet de enige keuze voor onderzoek van enkelgelaagde permeabiliteit. Hierdoor een goede reproduceerbaarheid van maatregelen zodra het goed is gekalibreerd met verse compleet medium. Gemeenschappelijke tests gericht op de verspreiding van chemische kleurstoffen uit de bovenste "apicale" compartiment aan de onderkant "basolaterale" een (b.v. fluoresceïne isothiocyanaat (FITC)-dextran assay)16. Echter, aangezien PBMC aanwezig zijn in het compartiment van de basolaterale in deze studie, besloten we om te voorkomen dat de invoering van chemische reagentia in de experimenten.
Onder de verschillende technieken die in dit werk aangenomen, is TEER meting het enige waarvoor de co cultuur set-up17,18. De andere gemeenschappelijke laboratoriumtechnieken bieden echter meer informatieve resultaten wanneer toegepast op cellen in co-cultuur, omdat zij toestaan dat het onderzoek van een instelling dichter bij fysiologische omstandigheden en de gegevens een sterkere biologische betekenis hebben. Aan de andere kant, moet opgemerkt worden dat het gebruik van cellen die zijn geteeld op een poreuze ondersteuning tot enkele problemen in de operaties die nodig zijn leiden kan ter voorbereiding van de monsters, zoals de lysis van de cel voor de bereiding van extracten van de cellulaire te worden geanalyseerd door het westelijke bevlekken.
Het systeem aangenomen in deze studie heeft de potentie om verder verbeterd, bijvoorbeeld met de toepassing van stoffen kunnen opnieuw de extracellulaire matrix milieu. Echter, dit zal ook leiden tot een grotere complexiteit van het systeem, en een volledige dissectie van de set-up zullen moeilijker te bereiken.
Setups voor co celkweek vertegenwoordigen zeker een krachtig instrument voor de bevordering van het in vitro onderzoek, en voor het begrip van complexe systemen. Deze techniek heeft de potentie om het vergroten van de kennis over fundamentele mechanismen, verstrekken van nieuwe ingangen aan fundamenteel onderzoekstudies op moleculaire signalering en met mogelijke toepassingen tegen de modulering van de activiteit van het immuunsysteem in het kader van Oncologische klinische patiëntenbeheer.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflict.
Acknowledgments
Italiaans Instituut voor nucleaire fysica (INFN) gedeeltelijk gefinancierd dit werk door middel van het project INFN-MERIDIAAN. De auteurs erkennen Prof. Edoardo Milotti (faculteit Technische Natuurkunde, Universiteit van Triëst, Italië) voor de coördinatie van het project van de INFN-MERIDIAN; Dr. Roberto Chignola (departement van biotechnologie, Universiteit van Verona, Italië) voor het verstrekken van de Caco-2 cellen, de ohmmeter, en voor zijn waardevolle hulp en opleiding. We erkennen ook Agnese Solari voor technische bijstand.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ThinCert 6 Well Cell Culture Inserts for Multiwell Plates |
Greiner Bio-one | 657610 | Equipment |
| Cell Culture Multiwell Plate, 6 Well | Greiner Bio-one | 657160 | Plastic |
| Cell Culture Multiwell Plate, 24 Well | Greiner Bio-one | 662160 | Plastic |
| RPMI 1640 without L-Glutamine | Lonza | 12-167F | Reagents |
| Foetal Bovine Serum | Lonza | DE14-801 | Reagents |
| L-Glutamine 200 mM | Lonza | 17-605C | Reagents |
| Penicillin/Streptomycin 10K/10K | Lonza | 17-602E | Reagents |
| CO2 Incubator | Heal Force | HF240 | Equipment |
| Ficoll Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | Reagents |
| Tube, 50 mL, PP, Conical Bottom | Greiner Bio-one | 227261 | Plastic |
| Tube, 15 mL, PP, Conical Bottom | Greiner Bio-one | 188261 | Plastic |
| Centrifuge | ThermoScientific | CL31R | Equipment |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P3813 | Reagents |
| Cell Culture Flask, 25 cm2, PS | Greiner Bio-one | 690175 | Plastic |
| Clinac 2100 Linear Accelerator | Varian | CLINAC 2100C/D | Equipment |
| 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) | Sigma-Aldrich | M5655 | Reagents |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | Reagents |
| Multiwell Plate Reader | GDV | DV990BV6 | Equipment |
| Trypan Blue Solution 0,4 % | Amresco | K940 | Reagents |
| Trypsin-EDTA Solution | Sigma-Aldrich | T4049 | Reagents |
| 1.5 mL tubes | Eppendorf | 0030125150 | Reagents |
| Millicell-ERS voltmeter/ohmeter | Millipore | MERS 00001 | Equipment |
| Cell Lysis Buffer (10x) | Cell Signalling Technology | #9803 | Reagents |
| Bürker Hemocytometer | Sigma-Aldrich | BR719520 | Equipment |
| BCA Protein Quantification Kit | Abcam | ab102536 | Reagents |
| 2x Laemmli Sample Buffer | BioRad | #1610737 | Reagents |
| 2-Mercaptoethanol | BioRad | #1610710 | Reagents |
| Accublock Digital Dry Bath | Labnet International Inc. | D1100 | Equipment |
| 4–20% Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Protein Gels, 10 well, 30 µL | BioRad | #4568093 | Reagents |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gel | BioRad | #1658004 | Equipment |
| PowerPac HC High-Current Power Supply | BioRad | #1645052 | Equipment |
| Precision Plus Protein WesternC Blotting Standards | BioRad | #1610385 | Reagents |
| 10x Tris/Glycine/SDS Running Buffer | BioRad | #1610732 | Reagents |
| Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs | BioRad | #1704156 | Reagents |
| Trans-Blot Turbo Transfer System | BioRad | #1704150 | Equipment |
| Blotting-Grade Blocker | BioRad | #1706404 | Reagents |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | 93773 | Reagents |
| Claudin-1 (D5H1D) XP Rabbit mAb | Cell Signalling Technology | #13255 | Reagents |
| Bovine Serum Albumine | Sigma-Aldrich | A7906 | Reagents |
| ZO-1 (D7D12) Rabbit mAb | Cell Signalling Technology | #8193 | Reagents |
| ZO-2 Antibody | Cell Signalling Technology | #2847 | Reagents |
| Afadin (D1Y3Z) Rabbit mAb | Cell Signalling Technology | #13531 | Reagents |
| Anti-Occludin Antibody | Millipore | ABT146 | Reagents |
| Anti-NF-kB p65 antibody [E379] | Abcam | ab32536 | Reagents |
| Anti-XIAP antibody | Abcam | ab21278 | Reagents |
| Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep) | GE Healthcare Life Sciences | NA931V | Reagents |
| Amersham ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey) | GE Healthcare Life Sciences | NA934V | Reagents |
| Clarity Western ECL Substrate, 200 mL | BioRad | #1705060 | Reagents |
| Carestream Kodak autoradiography GBX developer/replenisher | Sigma-Aldrich | P7042 | Reagents |
| Carestream Kodak autoradiography GBX fixer/replenisher | Sigma-Aldrich | P7167 | Reagents |
| Carestream Kodak BioMax light film | Sigma-Aldrich | Z370401 | Reagents |
| Gel Doc EZ System | BioRad | #1708270 | Equipment |
References
- Cunningham, D., et al. Colorectal cancer. Lancet. 375 (9719), 1030-1047 (2010).
- Mancuso, M., et al. Oncogenic bystander radiation effects in Patched heterozygous mouse cerebellum. PNAS. 105 (34), 12445-12450 (2008).
- Demaria, S., Formenti, S. C. Can abscopal effects of local radiotherapy be predicted by modeling T cell trafficking. J Immunother Cancer. 4 (1), 29 (2016).
- Trott, K. R., et al. Biological mechanisms of normal tissue damage: Importance for the design of NTCP models. Radiother Oncol. 105 (1), 79-85 (2012).
- Derer, A., Deloch, L., Rubner, Y., Fietkau, R., Frey, B., Gaipl, U. S. Radio-immunotherapy-induced immunogenic cancer cells as basis for induction of systemic anti-tumor immune responses - pre-clinical evidence and ongoing clinical applications. Front Immunol. 6, 505 (2015).
- Frey, B., Gaipl, U. S. Radio-immunotherapy: The focused beam expands. Lancet Oncol. 16 (7), 742-743 (2015).
- Prise, K. M., O'Sullivan, J. M. Radiation-induced bystander signalling in cancer therapy. Nat Rev Cancer. 9 (5), 351-360 (2009).
- Sambuy, Y., De Angelis, I., Ranaldi, G., Scarino, M. L., Stammati, A., Zucco, F. The Caco-2 cell line as a model of the intestinal barrier: Influence of cell and culture-related factors on Caco-2 cell functional characteristics. Cell Biol Toxicol. 21 (1), 1-26 (2005).
- Babini, G., et al. Mechanisms of the induction of apoptosis mediated by radiation-induced cytokine release. Radiat Prot Dosim. 166 (1-4), 165-169 (2015).
- Pellegrina, C. D., et al. Effects of wheat germ agglutinin on human gastrointestinal epithelium: Insights from an experimental model of immune/epithelial cell interaction. Toxicol Appl Pharm. 237 (2), 146-153 (2009).
- Pozo-Rubio, T., et al. Immunostimulatory effect of faecal Bifidobacterium species of breast-fed and formula-fed infants in a peripheral blood mononuclear cell/Caco-2 co-culture system. Brit J Nutr. 106 (8), 1216-1223 (2011).
- Parlesak, A., Haller, D., Brinz, S., Baeuerlein, A., Bode, C. Modulation of cytokine release by differentiated CACO-2 cells in a compartmentalized coculture model with mononuclear leucocytes and nonpathogenic bacteria. Scand J Immunol. 60 (5), 477-485 (2004).
- Haller, D. Non-pathogenic bacteria elicit a differential cytokine response by intestinal epithelial cell/leucocyte co-cultures. Gut. 47 (1), 79-87 (2000).
- Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assay. J Immunol Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
- Morini, J., Babini, G., Barbieri, S., Baiocco, G., Ottolenghi, A. The Interplay between Radioresistant Caco-2 Cells and the Immune System Increases Epithelial Layer Permeability and Alters Signaling Protein Spectrum. Front Immunol. 8, (March) 1-12 (2017).
- Dittmar, S., Harms, H., Runkler, N., Maisner, A., Kim, K. S., Schneider-Schaulies, J. Measles virus-induced block of transendothelial migration of T lymphocytes and infection-mediated virus spread across endothelial cell barriers. J Virol. 82 (22), 11273-11282 (2008).
- Srinivasan, B., Kolli, A. R., Esch, M. B., Abaci, H. E., Shuler, M. L., Hickman, J. J. TEER Measurement Techniques for In Vitro Barrier Model Systems. J Lab Autom. 20 (2), 107-126 (2015).
- Moyes, S. M., Killick, E. M., Morris, J. F., Kadhim, M. A., Hill, M. A., Carr, K. E. Changes produced by external radiation in parameters influencing intestinal permeability and microparticle uptake in vitro. Int J Radiat Biol. 84 (6), 467-486 (2008).
