Summary
Biz X x-ray ışınlanmış Caco-2 ve periferik kan mononükleer hücreler (PBMC) arasındaki çapraz karışma araştırmak için bir protokol mevcut. Protokol Caco-2 ışınlama ve set-up ortak kültür PBMC ile başlar; daha sonra trans-epitel elektriksel direnç düzenli olarak 48 s ve western blot Caco-2 ve PBMC gerçekleştirilen üzerinden ölçülür.
Abstract
Protokolü kabul edilen bu eser nasıl x-ışınları bağırsak bariyer, işleyişi kolorektal tümör hücreleri ve bağışıklık sistemi arasında Interplay odaklanan huzursuz çözülüyor amaçlamaktadır. Kolorektal Karsinom en sık görülen tip kanser, genellikle cerrahi, kemoterapi ve radyoterapi tarafından kabul arasındadır. Tümör hedefleme içinde radyoterapi avantajları iyi bilinmektedir. Ancak, sağlıklı dokuların bile sınırlı Etkilenmeler özellikle bağırsak bariyer ve bağışıklık sistemi üzerine etkileri ile ilgili olarak büyük bir endişe vardır. Kabul edilen kurulum normal hücre kültürleri için karşılaştırıldığında fizyolojik bir daha benzer bir durumda iki hücre popülasyonlarının arasındaki etkileşimi çalışmaya izin verir. Bu amaçla, biz farklı teknikler için başvurmak ve biz bir monolayer ve PBMC, aynı kültür orta paylaşımı olarak ayrıştırılan Caco-2 hücreleri temel alan bir vitro bir ortak kültür modeli kullanılır. Bu iletişim kuralı için odak makroskopik etkileri, Yani hücre canlılığı ve Trans-epitel elektrik direnci (AYLARININ) ve western blot, moleküler değişiklik, Yani içinde inflamatuar aktivasyonu geliştirilmiştir bağışıklık hücreleri ve Caco-2 hücreleri sıkı kavşak protein ifadede. AYLARININ sabit zaman aralıklarında bir ohmmeter ile ölçüldü iken Caco-2 hücre canlılığı üzerinde radyasyon etkileri ilk değerlendirilmesi 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromür (MTT) ve Trypan mavi deneyleri, değerlendirildi ortak kültür sistemleri için özel olarak tasarlanmış. Bu şekilde, radyasyon, varlığı, periferik kan mononükleer hücreler (PBMC) ve sonunda onların sinerjik etkisi nedeniyle etkileri göstermiş olabilir. PBMCs eklendiğinde bu tamamlayıcı teknikleri sayesinde, biz bir yüksek radyo-direnç Caco-2, 2-10 Gy x-ışınları ve artan bir Caco-2 monolayer geçirgenliği menzili içinde gözlenen. Özellikle, PBMC varlığı sıkı kavşak iskele proteinler ifade varyasyon ile ilişkili bulundu.
Introduction
Bu çalışmada kabul edilen metodoloji kolorektal kanser hücreleri ve bağışıklık sistemi, bir tuzak daha yakın zaman için normal 2-boyutlu hücre kültürleri göre fizyolojik durumuna istismar arasındaki etkileşimi araştırmak için tasarlanmıştır.
Kolorektal Karsinom (CRC) kanseri, olguların dünya çapında bir milyondan fazla (Global kanser Gözlemevi, kanser, Dünya Sağlık Örgütü, http://gco.iarc.fr üzerinde araştırma için Uluslararası Ajansı) üçüncü en sık türü olarak kabul edilir. CRC yönetiminin rutin cerrahi, kemoterapi veya radyoterapi1ile gerçekleştirilir. Cerrahi veya kemoterapi gibi invaziv teknikler karşılaştırıldığında, radyoterapi radyasyon dozu yerelleştirilmiş teslimini sayesinde bu klinik yaklaşımlar türetmek tipik zararlı sistemik reaksiyonlar büyük ölçüde önler. Ancak, yan etkiler iltihap sağlıklı hücrelere doğrudan zarar ve hasar olmayan hedefli etkileri2,3,4tarafından aracılı ile uyarının harekete geçirilmesine karşılık çevredeki sağlıklı dokularda ortaya çıkabilir. Kolorektal kanser tedavisi sırasında ışınlama nedeniyle olumsuz etkileri üzerinde odaklanarak, iki yönü araştırılması gerekiyor. İlk olarak, bağırsak sızdırmazlık sorumlu mekanizmaları radyasyon teslim neden olan, buna karşılık, bakteriyel nüfus değiştirilmiş bir çevreleme ve moleküller ve solutes paracellular geçirilmesi nedeniyle yan etkilerin olasılığını tarafından değiştirilmiş. İkinci olarak, bağışıklık sisteminin ileri karakol Bakteriyel büyüme kontrol ve genel bağışıklık yanıtı5,6,7arabuluculuk fonksiyonu ile lenfatik doku (GALT) gut ilişkili varlığı görür. Bu işlevleri yerine getirmek için hücreleri membranlar arasında bileske kompleksleri işlevi nedeniyle bağırsak sızdırmazlık tutulur. Bu nedenlerden dolayı indüklenen zararlı sonuçları farklı dozlarda röntgen nedeniyle yalnız ve PBMC ile ortak kültürleri Caco-2 hücreleri araştırıldı.
Hücre kültürü üzerinde çalışmalar yürüten soruşturmanın ilk setline Biyomedikal Araştırma olsa da, farklı hücre tipleri arasındaki hücre biyolojisi ve karşılıklı etkileşimler sürüş mekanizmaların ayrıntılı bilgi eksikliği ne zaman kritik hale gelebilir organlar, sistemleri ve laboratuvar olarak kolayca yeniden için aygıtlar Fizyoloji çalışmanın yaklaşıyor. Bu nedenle, ortak kültür set-up benimsemeye birlikte iki hücre popülasyonlarının incelenmesi ve hücreler arası ve ekstraselüler mekanizmaları ile ilgili yönleri diseksiyon izin karar verdik.
Ortak kültür epitel işlevleri ve farklı hücre tipleri arasında Interplay okurken yararlanan bir tekniktir. Özellikle, epiteli hücrelerinin polarite tarafından karakterize oluşur çünkü böyle bir tekniği kullanımı bizim durumumuzda zorunlu hale gelir. Bağırsak bariyer durumunda enterositler apikal ile iyi tanımlanmış bir kutuplaşma göstermek ve demiri Polonyalılar normalde sıkı birleşim oluşturma adezyon molekülleri varlığı nedeniyle ayrılmış. Bu bölmelere trafiği ve kararlı moleküller sadece geçişini sağlayan paracellular kaçınmak doku Fizyoloji için gereklidir. Bu özellik tabii set-up kültür normal bir hücre ile yeniden mümkün değildir. Ayrıca, (intestinal Lümen için karşılık gelen) apikal yüzey değil diğer hücrelere doğrudan temas halinde iken ortak kültür set-up kabulü demiri yüzey bağışıklık hücreleri sadece varlığı üretir.
Son zamanlarda, Caco-2 hücre hatları vitro model bağırsak bariyer olarak daha fazla önem kazanmıştır. Her ne kadar insan kolon adenokarsinom türetilmiş, Caco-2 hücreleri ayırt etme yeteneğini korumak ve soruşturma bir ortak kültür yuvasını yetiştirilen hücre zarı özellikleri sağlayan bir işlev polarize monolayer8, oluşturmak.
Caco-2 gözenekli bir membran üzerinde kültür bir iyi kurulmuş vitro bağırsak monolayer modeldir, bir iyileşme Caco-2 ve diğer hücreler arasındaki ortak kültür oldu. Bu kurulum sık sık kabul edilmiş crosstalk arasında farklı hücre türleri9 ve Caco-2 çözmek için kullanılan ölçü birimi ortak kültür zaman, Caco-2 yalnız kültürlü açısından eksojen bizi canlı tutan tedirgin.
Birçok çalışma Caco-2 ele sahip davranış ne zaman her iki sigara Patojen bakteriler ile birlikte kültürlü ve periferik kan mononükleer hücreler, özellikle bağışıklık sistemi10ile çapraz karışma aydınlatmak için. Pozo-Rubio vd. 11 Caco-2/PBMC ortak kültür çeşitli sitokinlerin ifade Caco-2 hücreleri uyarıcı bifidobakteri ile okudu. İşlerini sitokin ifade profilleri bağlı olarak bakteriyel stimülasyon varlığı/yokluğu PBMC gerçekleştirilen önemli değişiklik vurgulanır. Sonuçları PBMC varlığı Caco-2 bifidobakteri için sensitizes sonuca yol açar.
Caco-2 hücreleri farklı yanıt patojenik olmayan ve Patojen bakteriler için farklı araştırma ekipleri tarafından değerlendirildi var. Parlesak ve ark. 12 Escherichia coliimmünsüpresif Caco-2 hücreleri etkileri gösterdi-PBMC uyarılmış. Ayrıca, Haller ve ark. 13 okudu Caco-2 hücreleri her iki lipopolysaccharide (LPS) ile uyarılan yanıt enteropathogenic E. coli spp. veya enteropathogenic bakteri i.e.E. coli spp., Lactobacillus spp., güçlendirilmesi Caco-2 hücreleri yanıt kesinlikle ortak kültür set-up lökosit varlığını bağlıdır bir varsayım.
Farklı tamamlayıcı laboratuvar deneyleri yaparak (örneğin western blot, trans-epitel elektriksel direnç, MTT, vb), ortak kültüründe yetiştirilen farklı hücre tipleri analiz yanı sıra, Bütün metodoloji vaat ediyor. Ne gerçekten içinde vivoolur daha fazla temsilcisi olarak kabul edilebilir sonuçlar. Ayrıca, bu kurulum sadece da alt bölmeye üst vs veya huzurunda serbest hücreler arası sinyal molekülleri hücre tipleri dahil çalışma izin farklı ortak kültür bölmeleri ayırma sağlar vs ortak kültür yokluğu.
Protocol
Aşağıdaki iletişim kuralı sağlıklı gönüllü çekilme insan kanı içerir. Bağış yazılı Onam kayıt önce sağlanan. Helsinki Bildirisi'ne uygun olarak bu yordamdır ve kan para çekme profesyonel bir sağlık görevlisi tarafından gerçekleştirilmiştir.
1. hücre kültürü ve ortak kültür Set-up
- Bir hafta önce ışınlama 2.5 × 105 hücre/mL % 10 fetal sığır serum (FBS), 2 mM L-glutamin, 100 U/mL penisilin ve 100 μg/mL streptomisin ile takıma taze RPMI1640 ortamda içeren Caco-2 hücre süspansiyon hazırlamak.
- Tohum 2 mL steril 1 µm gözenek çapı hücre kültürü hücre süspansiyon 6-şey plakalar için ekler ve ekleme 6-şey plaka koymak.
Not: Hücre kültürü ekler hücre tohum önce steril tam orta ile kuluçka tarafından etkinleştirilmesi gerekir. Bu durumda, kültür medya atılır ve hücre süspansiyon medya ile değiştirilmesi gerekir. - %10 FBS, 2 mM L-glutamin, 100 IU/mL penisilin ve 100 µg/mL streptomisin her alt bölmeye ile takıma taze RPMI1640 orta 3 mL ekleyin ve bir kuluçka 37 ° C'de hücreler içeren % 5 CO2oksijen atmosferi ile kültür.
- Caco-2 hücre ışınlama aynı gün, piyasada bulunan lityum heparin kaplı 6 mL tüpler içinde insan tam kan toplamak (tüp boyutu: 13 x 100 mm).
- Daha sonra periferik kan mononükleer hücreler (PBMC) Ficoll degrade kullanarak yalıtmak. PBMC ayrı, bir 50 mL konik santrifüj tüpü ve katman eşit bir tam kan hacmi 25 mL Ficoll koymak için 1:1 Ficoll yüzeyinin üzerine RPMI1640 ile seyreltilmiş.
Not: Normal sağlıklı donör genellikle yaklaşık 4-10 × 106 PBMC/mL vardır. - 400 x g için oda sıcaklığında 30 dk de 50 mL tüpler santrifüj kapasitesi.
- Yavaşça PBMC arayüz aspirasyon Pasteur pipet ile tarafından Ficoll ve plazma arasında toplamak ve bir 15 mL konik tüp içinde koydu.
- PBMC 10 mL fosfat tamponlu tuz (PBS) ekleme ve 250 x g 10 min için de PBMC centrifuging tarafından iki kez yıkayın.
- Cm2 şişeler içinde oksijen bir atmosferde % 5 CO2içeren 37 ° C'de daha önce açıklandığı gibi RPMI1640 medya tamamlandı kültür PBMC en fazla 3-5 h T25 içinde.
Not: PBMC deneme günü toplamak ve 2 × 106 hücreler/tam RPMI1640 orta, ortak kültür alt bölmesinde 3 mL içinde iyi, tohum. Ekler Caco-2 hücreleri ile PBMC içeren wells 30 dk sonra onların ışınlama aktarılır. Tam kan toplanan PBMC cant kültür fazla yaklaşık 72 h için tutulan olmasa bile e.gile uyarılmış. phytohaemagglutinin (PHA), sonra hücrelerin canlılık kaybolur.
Dikkat: Kalite ve güvenlik tüm kan ve kan ürünleri tüm süreç garanti gerekir.
2. ışınlama Set-up
Not: Caco-2 hücreleri ışınlama Istituto di Ricovero e Cura Carattere bilimsel Enstitüsü (IRCCS) S. Maugeri (Pavia, İtalya) radyoterapi bölümü rutin olarak değişik kanserlerin tedavisinde kullanılan bir lineer hızlandırıcı ile gerçekleştirildi.
- Foton x-ışınları enerji 6 MV zirveye ayarlayın. Lineer hızlandırıcı bir nabız gibi atan rejim çalışır (zamana iki ardışık darbeleri yaklaşık 4 ms arasında; süresi 5 µs bir dozla ilgili tek bir darbe oranı en fazla 1 × 10-3 Gy/p).
- X-ışınları yörünge (kullanılan radyasyon birikmesi biraz daha fazla bir mesafe için karşılık gelen) bir sayfada 1.4 cm kalınlığında pleksiglas radyasyon kaynağından 100 cm üzerinde Caco-2 ile ekler içeren 6-şey tabak koyun.
- Backscattered radyasyon bileşeni ve yüklü parçacıklar denge güvence altına almak için Işınlama oluşmadan önce 0,5 cm kalınlığında bolus her örnek üzerinde yerleştirin.
- Hücreleri ışınlatayım (doses içinde belgili tanımlık sıra, 2-10 Gy) bir düz ve simetrik (± % 2) 20 x 20 cm2 radyasyon alan ve doz hızı 3 Gy/dak.
Not: "Sham" kontrol-ışınlanmış hücre uygulanan Işınlama odasına girmeden olmadan radyasyonlu olanların aynı yordam koşulları (alınan doz: 0 Gy).
Dikkat: İyonlaştırıcı radyasyon üreten cihazlar yalnýzca uzman personel tarafından kullanılması gerekir.
3. hücre canlılığı tahlil (ÇMT tahlil)
Not: Caco-2 hücre metabolik aktivite ile 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromür (MTT) tahlil14değerlendirildi.
- Tohum 2 × 105 Caco-2 bir 24-şey tabak 24 saat içinde tam orta 1,25 ml Işınlama önce.
- 2.1-2.4 adımlarda açıklandığı gibi hücreleri ışınlatayım sonra hücreleri oksijen bir atmosferde % 5 CO2içeren 37 ° C'de kuluçkaya.
- Işınlama sonra 21 h 100 µL 5 mg/mL MTT çözüm ekleyin ve hücreleri içeren % 5 CO2 3 h için bir oksijen atmosferde 37 ° C'de kalmasını sağlayın.
- Süpernatant atın ve 1 mL PBS hücrelerle yıkayın.
- Her kuyuda 500 µL Dimetil sülfoksit (DMSO) ekleyerek formazan kristalleri dağıtılması ve λ, çok iyi plaka okuyucu ile Absorbans değerlendirmek 570 = nm.
- 3.3-3.4 - 3.5-3.6 45 h, ışınlama sonra adımları yineleyin.
Not: %100 için normalleştirilmiş karşılık gelen sahte durum pertürbasyon olarak sonuçları gösterilir.
Dikkat: DMSO yanıcı ve rahatsız edici cilt, göz ve solunum sistemi (GHS07, GHS08) aracısıdır. Gözlerle temas halinde hemen bol su ile yıkayın ve tıbbi yardım isteyin. MTT cilt, gözleri ve solunum sistemi (GHS07, GHS08) için rahatsız edici bir ajandır. Gözlerle temas halinde hemen bol su ile durulayın ve tıbbi yardım isteyin.
4. hücrelerin belirlenmesi (Trypan mavi boya dışlama tahlil) yüzdesi
Not: Hücrelerin yüzdesi Trypan mavi boya dışlama tahlil tarafından değerlendirildi.
- Tohum 2 × 105 Caco-2 24-şey plaka 24 Saat tam orta 1,25 ml Işınlama önce.
- 0 ve dozlarda hücrelerle ışınlatayım - 10 Gy sonra hücreleri oksijen bir atmosferde içeren % 5 CO2 için 24-48 h 37 ° C'de kuluçkaya (2.1-2.4 adımlara bakın).
- İki seçilen zaman puan, yıkadıktan sonra PBS hücrelerle, onu atmak, sonra 100 µL tripsin-ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) çözüm ekleyin. 37 ° C'de hücreler içeren % 5 CO2 2 min için bir oksijen atmosfere koymak sonra enzimatik reaksiyon tutuklamak için tam orta ekleyin.
- 1.5 mL tüp hücrelerde toplamak ve tüp 500 x g 5 dk. atmak için de süpernatant santrifüj kapasitesi ve PBS 50 µL hücrelerde yeniden askıya alma.
- Hücre süspansiyon Trypan mavi boya çözüm 50 µL ile karıştırın ve karışımı oda sıcaklığında 3 min için kuluçkaya.
- Lekeli saymak (uygun olmayan) ve () hücrelerin Bürker odası günahı.
5. Trans-epitel elektrik direnci (AYLARININ)
- Tohum 5 × 105 Caco-2 hücreleri bir hafta önce 6-şey plaka ışınlama ekler (polietilen tereftalat (PET), 2 x 106 gözenekleri/cm2) ortak kültür.
- Işınlama önce 1 h AYLARININ bir voltmetre/ohmmeter ile ölçmek.
- Hücreleri 2.1-2.4 adımlarda açıklandığı gibi ışınlatayım.
- Caco-2 hücreleri oksijen bir atmosferde % 5 CO2içeren 37 ° C'de PBMC ile ortak kültür varlığı/yokluğunda kuluçkaya.
- AYLARININ ilk birkaç saat sonrası ışınlama için ölçmek her saat ve daha sonra her 3 h kadar 48 s.
6. Western Blot analizi / Claudin-1, Occludin, Afadin, ZO-1, ZO-2, NF-kB ve XIAP
- Tohum 5 × 105 hücreleri 1 hafta önce röntgen çekim 6-şey plaka ortak kültür (PET, 2 x 106 gözenekleri/cm2) ekler ve 2.1-2.4 adımlarda açıklandığı gibi hücreleri ışınlatayım.
- Caco-2 hücreleri oksijen bir atmosferde % 5 CO2içeren 37 ° C'de PBMC ile ortak kültür varlığı/yokluğunda kuluçkaya.
- 48 h ışınlama sonra hazırlamak Caco-2 ve PBMC hücre lysates hücre lizis hücrelerle tedavi tarafından tampon ve örnekleri-20 ° C'de depolayın
Not: protokol burada duraklatılmış. - Bicinchoninic asit (BCA) yöntemi ile toplam protein miktarı ölçmek.
Not: protokol burada duraklatılmış. - Laemli örnek arabellek β-mercaptoethanol ile eklenen toplam proteinler eşit miktarda karıştırın (β-mercaptoethanol son konsantrasyonu olduğunu % 5), örnekleri 5 min için 95 ° c ısı ve onları de 10.000 x g spin.
- 4-%20 yük örnekleri jel prekast ve Elektroforez 120 V 1 h. Transfer Protein polyvinildiene florid (PVDF) membran üzerinde gerçekleştirmek.
- PVDF membran ile %5 yağsız kuru süt (NFDM) ile % 0,2 eklendi PBS içinde oda sıcaklığında kuluçka tarafından non-spesifik bağlayıcı siteleri blok ara-20 (PBT). Membran üç kez 10 mL % 0,2 ile yıkayın PBT 5 min için.
- Membran gecede aşağıdaki birincil antikorlar ile 4 ° C'de konuyor önce oda sıcaklığında 1 h için nazik ajitasyon ile kuluçkaya: anti-claudin-1, anti-ZO-1, anti-ZO-2, anti-afadin, anti occludin, anti-NF-kB, anti-XIAP ve anti-aktin. Membran üç kez 10 mL % 0,2 ile yıkayın PBT 5 min için.
- Membranlar ile Horseradish peroksidaz HRP Birleşik ikincil antikorlar nazik ajitasyon ile oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya. Membran üç kez 10 mL % 0,2 ile yıkayın PBT 5 min için.
- Oda sıcaklığında fotoğraf filmleri membranlar ile gelişmiş kemoterapi-ışıklı teçhizat kuluçka tarafından geliştirmek.
- Fotoğraf filmleri bir tarama sistemi ile elde etmek ve elde edilen gruplar uygun görüntü analiz yazılımı ile ölçmek.
Not: Claudin-1, Occludin, Afadin, ZO-1 ve ZO-2 değerlendirilmesi Caco-2 hücreleri içinde gerçekleştirilir. NF-kB ve XIAP değerlendirilmesi PBMC içinde gerçekleştirilir.
Uyarı: toksik β-mercaptoethanol (GHS05, GHS06, GHS08, GHS09). Değil buharlar nefes, yayın ortamına önlemek ve bireysel koruma cihazları ve solunum koruma giymek. Yutulması halinde hemen tıbbi yardım isteyin.
7. istatistiksel analiz
- Radyasyona maruz kalma ve ortak kültür istatistiksel olarak anlamlı bir pertürbasyon neden olup olmadığını belirlemek için iki yönlü Varyans analizi (ANOVA) testi ile birden fazla karşılaştırmalar için tekrarlanan ölçüler (karşılaştırmak için Bonferroni post-hoc testleri ile gerçekleştirmek çoğaltma) anlamına gelir.
- Aksi belirtilmedikçe, istatistiksel anlamlılık (p) iki kuyruklu Öğrenci t-testi ile hesaplayın. ≥3 bağımsız deneyler ± standart hata, yani (SEM) ortalaması her değerdir.
Representative Results
Bir hafta önce deneme, hücreleri ekleme geçirgen membran ekili ve aşağıdaki günlerde büyümeye izin. Kesiştiği yerde seviyesi de ters bir mikroskop kullanarak kontrol edilebilir veya AYLARININ değerleri ölçümü ile. Gerçekten de, büyüme aşamasında AYLARININ geçirgen membran hücreleri tarafından karşılanmıştır ve onlar farklılaşmış hücre monolayer formu kadar artırma tutar. Hücreleri daha hızlı/yavaş çoğalırlar, deneme numaralı seribaşı sonra erken/geç zaman noktalarda başlayabilirsin. İzdiham zaman, adlı hücre sonra olan/olmayan PBMC (şekil 1A), alt bölmede tohumlari, ortak kültür başlamadan önce öğretilir çevresel stres (sıcaklık veya pH), minimize ışınlama tesisi için getirilen veya Caco-2 hücrelerin çoğalması değerlendiriliyor. İlk tohumlama yoğunluğu göz önüne alındığında, gün 0 hücreleri % 100 izdiham ulaşmak ve farklılaştırılmış monolayer şekil 1'Bgösterilen AYLARININ Plato tarafından gözlenen epitel hücrelerinin oluşturmanız gerekir. Hücreleri böyle durum ulaştığınızda, eski kültür orta taze orta ile en az bir kez bir hafta (şekil 1B) değiştirilir sürece AYLARININ değeri aşağıdaki haftadır nispeten sabit tutulur. Şekil 1' deCgösterildiği gibi ÇMT tahlil ne 24 h, ne de, 48 h, bağımsız olarak (en fazla 10 Gy) alınan doz Caco-2 hücreleri proliferatif durumunun istatistiksel olarak anlamlı bir değişiklik göstermez.
Farklı bir sonuç Caco-2 hücreleri kısa vadeli mortalite ile ilgili gözlendi. Her iki zaman noktalarda, hücre ölüm bir doz bağımlı artış göstermek Trypan mavi boyama. Ölü hücreleri oranlarda özellikle dikkate yüksek teslim edilen doz (10 Gy) sadece kabaca % 20 (şekil 1D) hücre ölümü üretir çok düşük olması gibi görünse de bu sonuçlar radyasyona maruz kalma, net etkisini göstermek.
Veya PBMC alt bölmeye olmadan ortak kültürlü edildi. PBMC herhangi bir dış uyaran çoğalırlar almadı gerçeği göz önüne alındığında, 48 h deneme ölmek başlayan PBMC tarafından tanıtılan önyargı önlemek için ideal kabul edildi. Bu nedenle, gelen ışınlama hemen önce AYLARININ düzenli olarak 48 saat için olası geçici etkileri radyoterapi protokolünün neden izlemek için ölçüldü. X-ışını ışınlama tarafından indüklenen pertürbasyon göreli varyasyonları ile ilgili (1200-1500 Ω·cm2Order of olan) önceden tedavi durumu daha iyi vurgulamak olarak şekil 1 E-Fiçinde gösterildiği gibi AYLARININ değerleri sunulan ve / veya varlığı/yokluğunda PBMC ortak kültür tarafından. Her iki durumda da, ilk geçici tepe açıkça ilk kez noktada ışınlama yordamına atfedilen radyasyona maruz kaldıktan sonra görülebilir.
PBMC (şekil 1E) ile ortak kültür, AYLARININ değerleri x-ışınları 10 Gy sonra ise, 48 h neredeyse sürekli yukarı değil olduğunda, hücreleri AYLARININ uzun süreli bir düşüş göstermek 3 h sonrası radyoterapi başlangıç. PBMCs varlığını tamamen AYLARININ zamansal dinamiği (şekil 1F) değiştirir. AYLARININ sabit bir değerle (şekil 1F) yerleşmek için göründüğünde tüm doz için AYLARININ bir azalma gözlemlenebilir 3 h'e kadar yaklaşık 30 h sonrası radyoterapi, açıkça demektir.
Sıkı bağlantı kompleksleri ifade düzeyleri Caco-2 hücreleri lysates Batı leke tahlil ile araştırıldı. Caco-2 hücreleri İyonlaştırıcı radyasyonla (0, 2 ve 10 Gy doz) maruz ve daha sonra ( Şekil 2A-Fiçinde gösterildiği gibi) tek başına veya PBMCs içinde 48 h alt bölme ile ortak kültür büyüdü. Claudin-1 ve Occludin (Şekil 2A, 2B) önemli ölçüde x-ışını ve/veya PBMC ile ortak kültür tarafından değiştirilmesi değil bulunamadı. Büyük dalgalanmalar yerine iskele proteinler ZO-1, ZO-2 ve Afadin (Şekil 2C, 2D, 2E) tespit edildi. Özellikle, Caco-2 büyüyen zaman yalnız zaten sonra 10 Gy iken, sadece PBMC ile ortak kültüründe 2 Gy ZO-2 ifade düzeyleri bir azalma görülmektedir. Afadin ifade düzeyleri yerine sadece 10 Gy x-ışınları, sonra Caco-2 PBMCs ile birlikte kültürlü olduğunda ek bir azaltma ile etkilenir.
Caco-2 ile birlikte kültürlü PBMCs inflamatuar durumu ile ilgili analiz, özellikle nükleer transkripsiyon faktörü kB (NF-kB) ve X'e inhibitörü olan Apoptozis protein (XIAP) düzeyleri araştırdı (Şekil 2 G-Ben). NF-kB toplam tutarı Caco-2 farklı radyasyon doz (Şekil 2G) maruz ile ortak kültür tarafından etkilenen değil. Aksine, ne kadar büyük değişimleri böyle dalgalanmalar azaltmak ve bir daha iyi istatistik güç kazanmak için analiz örnekleri daha yüksek bir dizi talep XIAP düzeyleri 4'e katlanmış up-2 Gy ve 10 Gy co kültürlerde, düzenlenmiş edildi.
Şekil 2F ve 2I' de gösterildiği gibi bazı özel olmayan Grup beklenen faiz protein molekül ağırlığı yanında görünebilir. Gerçek ve belirsiz bantları kolayca ayırt olmadığınız sürece, farklı antikor ve/veya BSA veya NFDM konsantrasyonları düşünülmelidir.
Resim 1 . Genel olarak deneysel kurulum ve makroskopik etkileri radyasyona maruz kalma ve/veya PBMC ortak kültür. A) ortak kültür modeli şematik gösterimi. B) AYLARININ değerler günlük Caco-2 hücreleri monolayer uygun büyüme ve farklılaşma durumunu değerlendirmek için ilk tohum ölçülür. C) hücre canlılığı ve D) mortalite Caco-2 (0, 2, 5 ve 10 Gy) röntgen maruz. Caco-2 hücreleri ölçümlerde E) AYLARININ ışınlanmış 0, 2 ve 10 Gy of olmadan kültürlü x-ışınları veya F) ile PBMCs. ≥3 bağımsız deneyler ± SEM ortalaması her değerdir * p-val < 0,05; ** p-va l < 0,01; p-val < 0,001. Grafikleri Morini ve arkuyarlanmıştır. 15. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2. Western Blot sonuçlarını Caco-2 ve PBMC lysates. Sıkı bağlantı proteinleri (Claudin-1 (A), (B) Occludin, ZO-1 (C), ZO-2 (B) ve Afadin (E)) Caco-2 0, 2 ve 10 Gy, x-ışınları sonra ve varlığı/yokluğunda PBMC ortak kültür düzeyini ifade. Değerleri aktin düzeyde normalleştirilmiş. Her sıkı kavşak protein ve koşullar için açıklayıcı filmleri (F) panelinde gösterilir. NF-κB (G) ve XIAP (H) Caco-2 hücreleri ile birlikte kültürlü PBMCs ifade düzey. NF-kB, XIAP, aktin için temsilcisi Filmler panelinde gösterilir. Her değer ≥3 bağımsız deneyler ± SEM Morini ve arkadapte grafikler ortalamasıdır. 15. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Discussion
Kolorektal kanser, gelişmiş ülkelerde yüksek onun oluşumu ile morbidite ve mortalite artışına en sık nedenlerinden biridir. Genellikle cerrahi, kemoterapi ve radyoterapi1tarafından yönetilir. Radyoterapi tedavileri çerçevesinde sağlıklı doku pozlama4etkileri özel önem verilmesi gerekir; Ayrıca, radyasyona maruz kalma ve bağışıklık sistemi arasındaki ilişki üzerine sistematik çalışmalar radyo-immünoterapi3yaklaşımlar geliştirmek için temel vardır.
Bu çalışmada evlat edindik metodoloji Caco-2 hücreleri ve PBMC crosstalk araştırmaya göre uyarlanmış. X-ışınları pozlama tümör hücrelerinin etkisi odaklı, ancak aynı iletişim kuralını farmakolojik ajanlar ile çalışmaları için adapte edilebilir. Standart hücre kültürü çalışmalarının göre fizyolojik şartlarda daha yakın olmak, bu yöntemin güçlü avantajı farklı hücre tipleri ve serbest bırakılması analiz imkanı verilen karmaşık bir sistemin tam bir diseksiyon imkanı vardır sinyal molekülleri iki bölmeleri ortak kültürünün içine. Bu şekilde, rutin olarak uygulanan yöntemleri Biyoloji ilgili mekanizmaları Interplay cep anlayış yardımcı olabilir.
Caco-2 hücreleri üzerinde etkileri X x-ray indüklenen ilk karakterizasyonu iki tamamlayıcı ölçümler dayanıyordu, Yani MTT Renkölçer tahlil ve Trypan mavi boya dışlama test. Görünüşe göre tutarsız sonuçlar bu iki deneyleri farklı odak tarafından açıklanabilir. MTT oxidoreductase enzimler etkinlik, mavi boya bir yaşam-hücre dışlama boya mekanizma dayanmaktadır Trypan süre değerlendiriyor.
Caco-2-PBMC Interplay incelenmesi bir epitel monolayer ortak kültür iki bölmeleri arasında tam bir ayrılık günSalazar oluşturulmasını gerektirir. Yalnızca bu hücre popülasyon ışınlama Caco-2 hücreleri ortak kültür eklemek içinde tohum imkanı sağlar. Ortak kültür ışınlama sonra başlatılmasından bu yana, hiçbir önyargı PBMC herhangi bir kaza sonucu maruz vardır. Bu kurulum hasarı (veya kirlenme) önlemek için dikkatli bir şekilde ele alınması için hücresel monolayer ekleme hareketleri sırasında diğer bir 6-şey plaka ihtiyacı var. Dikkatle gerçekleştirilen AYLARININ ölçümleri monolayer geçirgenliği araştırmak için basit ve non-invaziv bir yöntem vardır. Bu tahlil kesinlikle ortak kültür set-up ilgilidir ve bu monolayer geçirgenliği incelenmesi için tek seçenek değil. Bir kez de ile taze tam orta kalibre edilmiş iyi bir tekrarlanabilirlik önlemler bırakmak. Ortak deneyleri odaklanmak için alt "demiri" bir üst "apikal" yuvası üzerinden kimyasal boyalar Difüzyon üzerinde (örneğin floresein isothiocyanate (FITC)-dextran tahlil)16. PBMC demiri yerde bu çalışmanın mevcut olduğundan, ancak, biz deneylerde kimyasal reaktifler giriş önlemek karar verdi.
Bu çalışmada kabul farklı teknikler arasında AYLARININ ölçüm ortak kültür set-up17,18gerektirir tek kişi o. Ancak, diğer ortak laboratuvar teknikleri ortak kültür, hücrelerde bir kurulum yakın fizyolojik şartlarda incelenmesi sağlarlar ve verileri daha güçlü bir biyolojik önemi olan uygulandığında daha bilgilendirici sonuçlar sağlar. Öte yandan, üzerinde gözenekli bir destek yetiştirilen hücrelerin kullanımı örnekleri, Batı kurutma yoluyla çözümlenmesi hücresel özleri hazırlanması için hücre lizis gibi hazırlamak için gereken işlem bazı zorluklar neden olabilir dikkat edilmelidir.
Bu çalışmada kabul sistemi daha da geliştirilmiş, örneğin maddeler hücre dışı matriks ortamın yeniden uygulanması ile olma potansiyeli var. Ancak, bu da sistemin artan bir karmaşıklık neden olur ve set-up tam bir diseksiyon ulaşılması daha zor olacak.
Kurulumları için hücre ortak kültürü kesinlikle güçlü bir araç ve karmaşık sistemleri anlayış vitro araştırma ilerlemesi için temsil eder. Bu teknik bilgi moleküler sinyal ve modülasyon aktivitesinin olası uygulamaları çerçevesinde bağışıklık sisteminin temel araştırma çalışmaları için yeni girişi sağlayan temel mekanizmaları üzerinde artırmak için potansiyeli Onkoloji klinik hasta yönetimi.
Disclosures
Yazarlar hiçbir çıkar çatışması beyan ederim.
Acknowledgments
İtalyanca Enstitüsü nükleer fizik (INFN) bu çalışma INFN-MERIDIAN proje sayesinde kısmen finanse edilmektedir. Yazarlar Prof. Edoardo Milotti (Fizik Bölümü, Trieste Üniversitesi, İtalya) INFN-MERIDIAN Proje koordinasyon için kabul; Dr. Roberto Chignola (Biyoteknoloji Bölümü, University of Verona, İtalya) Caco-2 hücreleri, ohmmeter sağlamak için ve onun değerli yardım ve eğitim için. Ayrıca teknik yardım için Agnese Solari kabul.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ThinCert 6 Well Cell Culture Inserts for Multiwell Plates |
Greiner Bio-one | 657610 | Equipment |
| Cell Culture Multiwell Plate, 6 Well | Greiner Bio-one | 657160 | Plastic |
| Cell Culture Multiwell Plate, 24 Well | Greiner Bio-one | 662160 | Plastic |
| RPMI 1640 without L-Glutamine | Lonza | 12-167F | Reagents |
| Foetal Bovine Serum | Lonza | DE14-801 | Reagents |
| L-Glutamine 200 mM | Lonza | 17-605C | Reagents |
| Penicillin/Streptomycin 10K/10K | Lonza | 17-602E | Reagents |
| CO2 Incubator | Heal Force | HF240 | Equipment |
| Ficoll Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | Reagents |
| Tube, 50 mL, PP, Conical Bottom | Greiner Bio-one | 227261 | Plastic |
| Tube, 15 mL, PP, Conical Bottom | Greiner Bio-one | 188261 | Plastic |
| Centrifuge | ThermoScientific | CL31R | Equipment |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P3813 | Reagents |
| Cell Culture Flask, 25 cm2, PS | Greiner Bio-one | 690175 | Plastic |
| Clinac 2100 Linear Accelerator | Varian | CLINAC 2100C/D | Equipment |
| 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) | Sigma-Aldrich | M5655 | Reagents |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | Reagents |
| Multiwell Plate Reader | GDV | DV990BV6 | Equipment |
| Trypan Blue Solution 0,4 % | Amresco | K940 | Reagents |
| Trypsin-EDTA Solution | Sigma-Aldrich | T4049 | Reagents |
| 1.5 mL tubes | Eppendorf | 0030125150 | Reagents |
| Millicell-ERS voltmeter/ohmeter | Millipore | MERS 00001 | Equipment |
| Cell Lysis Buffer (10x) | Cell Signalling Technology | #9803 | Reagents |
| Bürker Hemocytometer | Sigma-Aldrich | BR719520 | Equipment |
| BCA Protein Quantification Kit | Abcam | ab102536 | Reagents |
| 2x Laemmli Sample Buffer | BioRad | #1610737 | Reagents |
| 2-Mercaptoethanol | BioRad | #1610710 | Reagents |
| Accublock Digital Dry Bath | Labnet International Inc. | D1100 | Equipment |
| 4–20% Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Protein Gels, 10 well, 30 µL | BioRad | #4568093 | Reagents |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gel | BioRad | #1658004 | Equipment |
| PowerPac HC High-Current Power Supply | BioRad | #1645052 | Equipment |
| Precision Plus Protein WesternC Blotting Standards | BioRad | #1610385 | Reagents |
| 10x Tris/Glycine/SDS Running Buffer | BioRad | #1610732 | Reagents |
| Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs | BioRad | #1704156 | Reagents |
| Trans-Blot Turbo Transfer System | BioRad | #1704150 | Equipment |
| Blotting-Grade Blocker | BioRad | #1706404 | Reagents |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | 93773 | Reagents |
| Claudin-1 (D5H1D) XP Rabbit mAb | Cell Signalling Technology | #13255 | Reagents |
| Bovine Serum Albumine | Sigma-Aldrich | A7906 | Reagents |
| ZO-1 (D7D12) Rabbit mAb | Cell Signalling Technology | #8193 | Reagents |
| ZO-2 Antibody | Cell Signalling Technology | #2847 | Reagents |
| Afadin (D1Y3Z) Rabbit mAb | Cell Signalling Technology | #13531 | Reagents |
| Anti-Occludin Antibody | Millipore | ABT146 | Reagents |
| Anti-NF-kB p65 antibody [E379] | Abcam | ab32536 | Reagents |
| Anti-XIAP antibody | Abcam | ab21278 | Reagents |
| Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep) | GE Healthcare Life Sciences | NA931V | Reagents |
| Amersham ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey) | GE Healthcare Life Sciences | NA934V | Reagents |
| Clarity Western ECL Substrate, 200 mL | BioRad | #1705060 | Reagents |
| Carestream Kodak autoradiography GBX developer/replenisher | Sigma-Aldrich | P7042 | Reagents |
| Carestream Kodak autoradiography GBX fixer/replenisher | Sigma-Aldrich | P7167 | Reagents |
| Carestream Kodak BioMax light film | Sigma-Aldrich | Z370401 | Reagents |
| Gel Doc EZ System | BioRad | #1708270 | Equipment |
References
- Cunningham, D., et al. Colorectal cancer. Lancet. 375 (9719), 1030-1047 (2010).
- Mancuso, M., et al. Oncogenic bystander radiation effects in Patched heterozygous mouse cerebellum. PNAS. 105 (34), 12445-12450 (2008).
- Demaria, S., Formenti, S. C. Can abscopal effects of local radiotherapy be predicted by modeling T cell trafficking. J Immunother Cancer. 4 (1), 29 (2016).
- Trott, K. R., et al. Biological mechanisms of normal tissue damage: Importance for the design of NTCP models. Radiother Oncol. 105 (1), 79-85 (2012).
- Derer, A., Deloch, L., Rubner, Y., Fietkau, R., Frey, B., Gaipl, U. S. Radio-immunotherapy-induced immunogenic cancer cells as basis for induction of systemic anti-tumor immune responses - pre-clinical evidence and ongoing clinical applications. Front Immunol. 6, 505 (2015).
- Frey, B., Gaipl, U. S. Radio-immunotherapy: The focused beam expands. Lancet Oncol. 16 (7), 742-743 (2015).
- Prise, K. M., O'Sullivan, J. M. Radiation-induced bystander signalling in cancer therapy. Nat Rev Cancer. 9 (5), 351-360 (2009).
- Sambuy, Y., De Angelis, I., Ranaldi, G., Scarino, M. L., Stammati, A., Zucco, F. The Caco-2 cell line as a model of the intestinal barrier: Influence of cell and culture-related factors on Caco-2 cell functional characteristics. Cell Biol Toxicol. 21 (1), 1-26 (2005).
- Babini, G., et al. Mechanisms of the induction of apoptosis mediated by radiation-induced cytokine release. Radiat Prot Dosim. 166 (1-4), 165-169 (2015).
- Pellegrina, C. D., et al. Effects of wheat germ agglutinin on human gastrointestinal epithelium: Insights from an experimental model of immune/epithelial cell interaction. Toxicol Appl Pharm. 237 (2), 146-153 (2009).
- Pozo-Rubio, T., et al. Immunostimulatory effect of faecal Bifidobacterium species of breast-fed and formula-fed infants in a peripheral blood mononuclear cell/Caco-2 co-culture system. Brit J Nutr. 106 (8), 1216-1223 (2011).
- Parlesak, A., Haller, D., Brinz, S., Baeuerlein, A., Bode, C. Modulation of cytokine release by differentiated CACO-2 cells in a compartmentalized coculture model with mononuclear leucocytes and nonpathogenic bacteria. Scand J Immunol. 60 (5), 477-485 (2004).
- Haller, D. Non-pathogenic bacteria elicit a differential cytokine response by intestinal epithelial cell/leucocyte co-cultures. Gut. 47 (1), 79-87 (2000).
- Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assay. J Immunol Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
- Morini, J., Babini, G., Barbieri, S., Baiocco, G., Ottolenghi, A. The Interplay between Radioresistant Caco-2 Cells and the Immune System Increases Epithelial Layer Permeability and Alters Signaling Protein Spectrum. Front Immunol. 8, (March) 1-12 (2017).
- Dittmar, S., Harms, H., Runkler, N., Maisner, A., Kim, K. S., Schneider-Schaulies, J. Measles virus-induced block of transendothelial migration of T lymphocytes and infection-mediated virus spread across endothelial cell barriers. J Virol. 82 (22), 11273-11282 (2008).
- Srinivasan, B., Kolli, A. R., Esch, M. B., Abaci, H. E., Shuler, M. L., Hickman, J. J. TEER Measurement Techniques for In Vitro Barrier Model Systems. J Lab Autom. 20 (2), 107-126 (2015).
- Moyes, S. M., Killick, E. M., Morris, J. F., Kadhim, M. A., Hill, M. A., Carr, K. E. Changes produced by external radiation in parameters influencing intestinal permeability and microparticle uptake in vitro. Int J Radiat Biol. 84 (6), 467-486 (2008).
