Summary
우리는 X 레이 방사선 Caco-2와 주변 혈액 단 세포 (PBMC) 사이 누화를 조사 하는 프로토콜을 제시. 프로토콜은 Caco-2 조사와 PBMC; 공동 문화권의 시작 그 후, 트랜스 상피 전기 저항 48 h 및 서양 오 점 Caco-2에 PBMC 수행을 통해 정기적으로 측정 됩니다.
Abstract
프로토콜 채택에이 작품을 어떻게 엑스레이 교란 장 장벽의 기능 대 장 종양 세포와 면역계 사이의 상호 작용에 초점을 맞추고 탈피 목표로. 대 장 암 암, 수술, 화학요법, 그리고 방사선 치료에 의해 일반적으로 처리의 가장 일반적인 유형 중 하나입니다. 타겟팅 종양에 방사선 치료의 장점은 잘 알려져 있습니다. 그러나, 건강 한 조직의 제한 노출 장의 장벽 및 면역 체계에 미치는 영향에 대해 특히 큰 관심사입니다. 일반 세포 배양에 비해 더 생리 적인 것과 유사한 조건에서 두 셀 인구 사이 상호 작용을 공부 하 채택된 설치 수 있습니다. 이 위해 우리가 다른 기술에 리조트와 우리는 생체 외에서 공동 문화 모델 사용, 단층과 같은 문화 매체를 공유 PBMC 분화 Caco-2 셀에 따라. 이 프로토콜에 염증 통로의 활성화 그리고, 서쪽 오 점, 분자 변경, 즉 거시적인 효과, 즉 세포 생존 능력 및 트랜스 상피 전기 저항 (TEER)에 초점을 개발 되었습니다. 면역 세포와 Caco-2 셀에 꽉 접합 단백질 표정. Caco-2 세포 생존 능력에 방사선 효과의 초기 평가 동안 TEER는 ohmmeter를 통해 고정된 시간 간격 측정 되었다 Trypan 블루 분석 실험, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium 브 로마 이드 (MTT)를 통해 평가 되었다 특히 공동 문화 시스템을 위해 설계 되었습니다. 이 방법에서는, 방사선, 존재의 주변 혈액 단 세포 (PBMC), 그리고 결국 그들의 시너지 효과 인해 효과 설명할 수 있습니다. 이러한 상호 보완적인 기술을 통해 PBMCs 추가 된 때 높은 라디오-저항 Caco-2의 2-10 Gy의 x-레이 및 증가 Caco-2 단층 침투성의 범위 내에서 관찰 합니다. 특히, PBMC 존재 관련 꽉 접합 비 계 단백질 식에서 변형 된 것으로 밝혀졌다.
Introduction
이 작품에서 채택 하는 방법론은 대 장 암 세포와 면역 체계를 이용 하는 일반 2 차원 세포 배양에 비해 생리 적 조건에 가깝게 설정 간의 상호 작용을 조사 하도록 설계 되었습니다.
대 장 암 (CRC) 세 번째 가장 빈번한 유형의 (글로벌 암 전망대, 암, 세계 보건 기구, http://gco.iarc.fr에 대 한 연구를 위한 국제 기관)의 경우 전세계 1 백만 이상으로 암으로 간주 됩니다. CRC의 관리는 수술, 화학요법 또는 방사선 치료1통해 정기적으로 수행 됩니다. 수술 또는 화학요법 같은 침략 적 기법에 비해, 방사선 치료는 크게 일반적인 해로운 조직의 반응 방사선 복용량의 지역화 된 배달 덕분에 이러한 임상 접근에서 파생 방지 합니다. 그러나, 부작용은 건강 한 세포에 직접적인 피해와 피해 대상 비 효과2,,34중재 염증 트리거링 주변의 건강 한 조직에 발생할 수 있습니다. 대 장 암 치료 중 방사선 조사로 인해 불리 한 효과에 초점을 맞추고, 두 가지 측면 조사 될 필요가 있다. 첫째, 장 불 침투성의 책임 메커니즘 방사선 전달 일으키는, 차례 차례로, 세균성 인구 변경된 포함 및 paracellular 통로 분자와 용액의 부작용의 가능성에 의해 변경 될 수 있습니다. 둘째, 창 자 연관 된 림프 조직 (GALT)의 존재 세균성 성장을 통제 하 고 일반적인 면역 반응5,,67중재의 기능을 가진 면역 시스템의 전초 역할을 합니다. 이러한 기능을 수행 하기 위해 장 불 침투성 세포의 세포 막 사이 접합 단지의 기능 때문에 유지 됩니다. 이러한 이유로, 엑스레이의 다른 복용량 인해 유발된 해로운 결과 혼자 및 공동 문화 PBMC Caco-2 셀에 조사 되었다.
생물 의학 연구에 조사의 첫번째 setline는 세포 배양에 대 한 연구를 실시, 운전 하는 다른 세포 유형 사이 세포 생물학과 상호 상호 작용 하는 메커니즘의 상세한 지식이 부족 될 수 있습니다 중요 한 때 기관, 시스템, 그리고 실험실에서 쉽게 다시 만들 수 없는 기구의 생리학의 학문에 접근. 따라서, 우리 두 셀 인구 함께의 연구와 세포와 extracellular 메커니즘에 관련 된 측면의 해 부를 수 있도록 공동 문화 체제를 채택 하기로.
공동 문화 상피 기능과 다른 세포 유형 사이 상호 작용을 공부 하는 때 악용 하는 기법 이다. 특히, 이러한 기술의 사용 epithelia 셀 특징 극성으로 구성 되어 있기 때문에 우리의 경우, 필수 됩니다. 장 배리어의 경우 enterocytes 표시 꼭대기와 잘 정의 된 분극 하 고 basolateral 극 일반적으로 꽉 교차점을 만드는 접착 분자의 존재로 인해 분리 합니다. 이 구획은 paracellular 인신 매매와 결정된 분자만 통과 허용 피하 조직 생리학에 대 한 필요 합니다. 이 기능은 물론 설정 배양 정상 세포와 함께 재현 가능한 되지 않습니다. 또한, 공동 문화 체제의 채택 꼭대기 표면 (창 자 루멘에 해당)은 다른 세포와 직접 접촉 하는 동안만 basolateral 표면에에서 면역 세포의 존재를 재현 합니다.
최근, Caco-2 셀 라인 장 방 벽의 생체 외에서 모델로 더 많은 중요성을 얻었다. 인간 결 장 선 암에서 파생, Caco-2 세포 분화 능력을 유지 하 고 기능 편광된 단층8, 공동 문화 삽입에서 성장 될 때 세포 막 속성의 조사 수 있는 만듭니다.
Caco-2 다공성 막에 경작 장 단층의 잘 설립 된 생체 외에서 모델 이후 개선 Caco-2와 다른 세포 사이 공동 문화 되었습니다. 이 설치는 빈번 하 게 채택 되었다 측정 다른 사이 누화 종류9 셀 Caco-2를 해명 하는 데 사용 수 불안정 Caco-2 혼자 경작에 관하여 공동 문화에서 외 인 자극에 응답.
많은 연구 Caco-2 해결 동작 때 모두 비 병원 성 박테리아와 공동 경작 하 고 주변 혈액 단 세포, 특히 면역 시스템10와 혼선을 명료 하 게. 포-루비 오 외. 11 공부 Caco-2/PBMC 공동 문화에 여러 가지 cytokines의 표정을 Caco-2 세포를 자극 하는 bifidobacteria. 그들의 작품에 cytokine 식 프로필 PBMC의 존재/부재에서 세균성 자극에 따라 상당한 수정 강조 표시 됩니다. 그들의 결과 PBMC 존재 bifidobacteria에 Caco-2 sensitizes 결론으로 이어질.
비 병원 성 및 병원 성 박테리아 Caco-2 셀의 다른 응답 다른 연구 팀에 의해 평가 되어 있다. Parlesak 외. 12 대장균에 Caco-2 셀의 면역 억제 효과 입증-PBMC를 자극. 또한, 할 러 외. 13 enteropathogenic 대장균 종 또는 비 enteropathogenic 박테리아 i.e.E. 대장균 종, Caco-2 셀 두 lipopolysaccharide (LPS)와 자극된의 응답 공부 균 종, 강화는 Caco-2 세포의 응답 공동 문화 설정에 백혈구의 존재에 엄격 하 게 따라 하는 추측.
다른 상호 보완적인 실험실 분석을 수행 하 여 (예: 서쪽 오 점, 트랜스 상피 전기 저항, MTT, 등), 공동 문화에서 성장 하는 다른 세포 유형의 분석 뿐만 아니라 전체 방법론 약속 더 많은 대표에 비보를 정말 어떻게 간주 될 수 있는 결과. 또한,이 설정 관련된 셀 형식의 연구 뿐만 아니라 위 대 더 낮은 구획에 또는 존재 에서에서 발표 하는 세포 신호 분자를 수 있도록 다른 공동 문화 구획의 분리 수 있습니다. 대 공동 문화의 부재.
Protocol
다음 프로토콜 건강 한 지원자에서 인간의 피 철수를 포함 한다. 기증자 등록 사전 서 면된 동의 제공합니다. 이 절차는 헬싱키 선언에 따라 그리고 혈액 인출 전문 의료 조 수에 의해 수행 되었다.
1. 세포 문화 및 공동 문화 설정
- 1 주일 전에 방사선, 2.5 × 105 셀/mL와 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 2 mM L-글루타민, 100 U/mL 페니실린, 100 μ g/mL 스 보충 하는 신선한 RPMI1640 매체에 포함 된 Caco-2 셀 서 스 펜 션 준비.
- 종자의 살 균 1 µ m 기 공 직경 세포 배양에서 세포 현 탁 액 2 mL 6 잘 플레이트에 대 한 삽입 하 고 삽입 6 잘 플레이트에 넣어.
참고: 셀 문화 삽입 셀 뿌리기 전에 메 마른 완전 한 매체를 가진 외피에 의해 활성화 해야 합니다. 이 경우에, 문화 미디어 삭제 하 고 셀 서 스 펜 션 미디어로 대체 되어야 한다. - 10 %FBS, 2 mM L-글루타민, 100 IU/mL 페니실린, 및 각 바닥 구획, 100 µ g/mL 스 보충 하는 신선한 RPMI1640 매체의 3 mL를 추가 하 고 습도 분위기 5% CO2를 포함 하는 인큐베이터에서 37 ° C에서 세포 문화.
- Caco-2 셀 방사선의 같은 날, 상용 리튬-헤 파 린 코팅 6 mL 튜브에 인간의 전체 혈액 수집 (튜브 크기: 13 x 100 m m).
- 그 후, Ficoll 기울기를 사용 하 여 주변 혈액 단 세포 (PBMC)를 격리 합니다. PBMC를 분리, 50 mL 원뿔 원심 분리기 튜브 및 레이어 전체 혈액의 동일 볼륨 Ficoll 25 mL를 넣어 Ficoll 표면에 RPMI1640와 함께 1:1 희석.
참고: 정상적인 건강 한 기증자는 일반적으로 약 4-10 × 106 PBMC/mL 있다. - 실 온에서 30 분 400 x g에서 50 mL 튜브 원심
- 부드럽게 파스퇴르 피 펫과 포부에 의해 Ficoll와 플라즈마 사이의 인터페이스에서 PBMC를 수집 하 고 15 mL 원뿔 튜브에 넣어.
- 두 번 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)의 10 mL를 추가 하 여 10 분 동안 250 x g에서 PBMC centrifuging에서 PBMC를 씻어.
- 문화 PBMC T25 h 조 3-5의 최대 c m2 플라스 크에서 완료 하기 전에, 5% CO2를 포함 하는 습도 분위기에서 37 ° C에서 설명한 대로 RPMI1640 미디어.
참고: 실험 당일 PBMC를 수집 하 고 2 × 106 셀/글쎄, 공동 문화의 아래쪽 구획에서 완전 한 RPMI1640 매체의 3 mL에 씨앗. Caco-2 셀 삽입 PBMC 포함 된 웰 스 30 분 그들의 방사선 조사 후 전송 됩니다. PBMC 전체 혈액에서 수집 수 없습니다 수 이상 약 72 h에 대 한 문화에서 유지 아니라면 예를 들어와 자극. phytohaemagglutinin (PHA), 세포의 생존 후 손실 됩니다.
주의: 모든 혈액과 혈액 제품의 안전과 품질 전체 과정을 통해 보장 되어야 한다.
2. 방사선 설정
참고: Caco-2 세포의 방사선은 정기적으로 다양 한 유형의 암 치료에 사용 되는 선형 가속기 Istituto 디 Ricovero e Cura Carattere Scientifico (IRCCS) 미 됩니다 (파 비아, 이탈리아)의 방사선 치료 부서에서 수행 되었다.
- 6 MV 피크를 광자 엑스레이 에너지를 설정 합니다. 선형 가속기 pulsing 정권에서 작동 한다 (대략 4 ms의 2 연속 펄스 사이의 시간; 5 µs 복용량에 대 한 단일 펄스의 지속 시간 최대 1 × 10-3 Gy/p 비율).
- Caco-2 장에 1.4 cm 두께 유리 야 (사용 된 방사선의 보다 약간 더 큰 거리에 해당) 방사선의 소스에서 100 cm에서 엑스레이의 궤도에 삽입을 포함 하는 6-잘 접시를 놓습니다.
- 방사선 backscattered 방사선 구성 요소 및 입자 평형 발생 하기 전에 각 샘플에 0.5 cm 두께 bolus를 놓습니다.
- 셀을 비추는 (2-10 Gy 사이의 복용량) 아파트와 대칭 (± 2%) 20 x 20 cm2 방사선 분야 그리고 분당 3 Gy의 복용량 비율.
참고: "가짜" 제어-비친된 셀 받았다 방사선 룸을 입력 하지 않고 비친된 그들의 동일한 절차 조건 (받은 복용량: 0 Gy).
주의: 이온화 방사선 생산 장치 전문된 인력에 의해서만 사용 되어야 한다.
3. 세포 생존 능력 분석 실험 (MTT 분석 결과)
참고: Caco-2 세포 대사 활동143-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium 브 로마 이드 (MTT) 분석 결과 통해 평가 했다.
- 시드 2 × 105 Caco-2 24-잘 접시 24 h에에서 완전 한 매체의 1.25 mL에 조사 하기 전에.
- 2.1-2.4 단계에서 설명한 대로 셀을 비추는 다음 5% CO2를 포함 하는 습도 분위기에서 37 ° C에서 세포를 품 어.
- 방사선 조사, 후 21 h 5 mg/mL MTT 솔루션의 100 µ L을 추가 하 고 포함 된 5% CO2 3 h 습도 분위기에서 37 ° C에서 셀을 계속.
- 삭제는 상쾌한 고 1 mL의 PBS로 세포를 씻어.
- 각 잘에서 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)의 500 µ L을 추가 하 여 formazan 결정을 녹이 고 λ에서 다 잘 플레이트 리더 흡 광도 평가 = 570 nm.
- 방사선 조사 후 단계 3.3-3.4-3.5-3.6에서 45 h를 반복 합니다.
참고: 결과 100%로 표준화 해당 가짜 상태에서 섭 동으로 표시 됩니다.
주의: DMSO는 피부, 눈 및 호흡 체계 (GHS07, GHS08)에 대 한 가연성 및 자극 에이전트입니다. 눈 접촉, 풍부한 물으로 즉시 세척 하 고 의료 조언을 추구 합니다. MTT는 피부, 눈 및 호흡 체계 (GHS07, GHS08)에 대 한 자극 에이전트. 눈 접촉, 물로 하 고 의료 조언을 추구 합니다.
4. 가능한 셀 결정 (Trypan Blue 염료 배제 분석 결과)의 비율
참고: 실행 가능한 세포의 백분율 Trypan Blue 염료 배제 분석 결과 의해 평가 되었다.
- 시드 2 × 105 Caco-2 24-잘 접시 24 h에에서 완전 한 매체의 1.25 mL에 조사 하기 전에.
- 셀 범위 0에에서 복용량을 비추는-10 Gy (2.1-2.4 단계 참조) 다음 24-48 h에 대 한 5% CO2 를 포함 하는 습도 분위기에서 37 ° C에서 세포를 품 어.
- 2 선택한 시간 포인트, PBS로 세포 세척, 후, 삭제 다음 트립 신-ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 솔루션의 100 µ L를 추가 합니다. 2 분 동안 5% CO2 를 포함 하는 습도 분위기에서 37 ° C에서 세포를 넣어 다음 완전 한 매체 효소 반응 체포를 추가 합니다.
- 1.5 mL 튜브에 세포를 수집 하 고 원심 5 분 삭제에 대 한 500 x g에 튜브는 상쾌한 다시 PBS의 50 µ L에서 세포를 일시 중지.
- Trypan Blue 염료 솔루션의 50 µ L로 세포 현 탁 액을 혼합 하 고 실 온에서 3 분을 위한 혼합물을 품 어.
- 스테인드 계산 (비 가능한) 및 (가능한) 셀 Bürker 챔버와 흠 없는.
5. 트랜스 상피 전기 저항 (TEER)
- 씨앗 5 × 105 Caco-2 셀 6 잘 플레이트에 조사 이전 1 주일 공동 삽입 (폴 리 에틸렌 테 레프 탈 산 (애완 동물), 2 x 106 모/cm2) 문화.
- 1 시간 전에 방사선, 전압계/ohmmeter와 TEER를 측정 합니다.
- 2.1-2.4 단계에서 설명한 대로 셀을 비추는.
- Caco-2 셀 5% CO2를 포함 하는 습도 분위기에서 37 ° C에서 PBMC 공동 문화의 존재/부재에 품 어.
- 처음 몇 시간 후 방사선에 대 한 측정 TEER 매 시간, 그리고 이후에 모든 3 h 48 h까지.
6. 서쪽 오 점 분석 Claudin-1, Occludin, Afadin, 조 1, ZO-2, NF-kB, 및 XIAP
- 씨앗 5 × 105 셀 6 잘 플레이트 공동 문화에 엑스레이 노출 하기 전에 1 주 (애완 동물, 2 x 106 모/cm2)를 삽입 하 고 2.1-2.4 단계에서 설명한 대로 셀을 비추는.
- Caco-2 셀 5% CO2를 포함 하는 습도 분위기에서 37 ° C에서 PBMC 공동 문화의 존재/부재에 품 어.
- Caco-2를 준비 하는 방사선 조사, 후 48 h 및 PBMC 세포 lysates 셀 세포와 세포를 치료 하 여 버퍼-20 ° c.에 샘플 저장
참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기. - Bicinchoninic 산 (BCA) 메서드에서 총 단백질 양을 계량.
참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기. - Laemli 샘플 버퍼 β-mercaptoethanol 추가 총 단백질의 동등한 양으로 혼합 (β-mercaptoethanol의 최종 농도 5%), 5 분 동안 95 ° C에서 샘플을 열 고 10000 x g에서 그들을 회전.
- 부하 샘플 4-20%에서 젤 캐스트 및 polyvinildiene 불 소 (PVDF) 막에 1 h. 전송 단백질에 대 한 120 V에서 전기 영동을 수행.
- 잠복기 5% 비 지방 건조 우유 (NFDM) 0.2% 추가 PBS에 실 온에서 PVDF 막 여 비 특정 바인딩 사이트 차단 트윈-20 (PBT). 막 세 번 0.2%의 10 mL로 씻어 PBT 5 분.
- 다음 주 항 체와 4 ° C에서 하룻밤 배치 되 고 전에 실 온에서 1 h에 대 한 부드러운 동요와 막 품 어: 안티-claudin-1, 안티-ZO-1, 안티-ZO-2, 안티-afadin, 안티 occludin, 안티-NF-kB, 안티-XIAP와 안티 말라. 막 세 번 0.2%의 10 mL로 씻어 PBT 5 분.
- 부드러운 동요와 함께 실 온에서 1 h에 대 한 2 차 항 체 양 고추냉이 과산화 효소 HRP 활용으로 막 품 어. 막 세 번 0.2%의 10 mL로 씻어 PBT 5 분.
- 실내 온도에, 향상 된 화학 발광 키트와 함께 막을 배양 하 여 사진 필름을 개발 합니다.
- 사진 필름 스캐닝 시스템으로 취득 하 고 적당 한 이미지 분석 소프트웨어와 함께 얻은 밴드 계량.
참고: Claudin 1, Occludin, Afadin, ZO-1, 그리고 조 2의 평가 Caco-2 셀에서 수행 됩니다. NF-kB와 XIAP의 평가 PBMC에서 수행 됩니다.
주의: β-mercaptoethanol은 독성 (GHS05, GHS06, GHS08, GHS09). 하지 증기를 호흡, 환경에 릴리스를 방지 하 고 개인 보호 장치 및 호흡기 보호를 착용. 삼 키는 경우 즉시 의료 조언을 부탁 드립니다.
7. 통계 분석
- 방사선 노출 및 공동 문화는 통계적으로 중요 한 섭 동 유발 여부를 확인 하려면 테스트를 수행 양방향 분산 분석 (ANOVA) 여러 비교 반복 측정 (비교 Bonferroni 게시물 임시 테스트와 함께 복제) 의미합니다.
- 명시 하지 않으면, 양측 스튜던트 t-검정에 의해 통계적 유의 성 (p)를 계산 합니다. 각 값은 ≥3 독립적인 실험 ± 표준 오차의 의미 (SEM)의 평균입니다.
Representative Results
실험 전에 1 주 셀 삽입의 다공성 막에 뿌 렸 고 있으며 다음과 같은 일 동안 성장할 수 있습니다. 합류의 레벨도는 거꾸로 한 현미경을 사용 하 여 확인할 수 있습니다 또는 TEER 값의 측정을 통해. 실제로, 성장 단계 TEER 모든 다공성 막 세포에 의해 덮여 있다 그리고 그들은 차별화 된 셀 단층을 형성 될 때까지 늘리면 유지 합니다. 세포 증식 빠른/느린, 실험 후 시드 되 고 이전/나중 지점에서 시작할 수 있습니다. 때에 합류, 세포는 다음 가져 방사선 조사 시설, imparted 환경 스트레스 (온도, pH)와 함께/없이 아래 칸 (그림 1A)에 시드 PBMC 공동 문화를 시작 하기 전에 최소화 또는 Caco-2 세포의 확산을 평가. 초기 시드 밀도 주어진 하루에 0 셀 한다 도달 100% 합류 하 고 고원 TEER 그림 1B에 의해 관찰 될 수 있는 상피 세포의 차별화 된 단층을 만듭니다. 셀 같은 상태에 도달, TEER 값으로 오래 된 문화 매체는 대체 신선한 매체와 적어도 일주일에 한 번 (그림 1B) 상대적으로 다음 주 일정 유지 됩니다. 그림 1C같이 24 시간에도 접수 (최대 10 Gy) 복용량 별도로 48 h에 MTT 분석 결과 어떤 통계적 Caco-2 세포의 증식 상태 변경을 표시 되지 않습니다.
다른 결과 Caco-2 셀의 단기 사망률에 관한 관찰 되었다. 두 시간 지점에서 셀 사망률에는 복용량-의존 증가 표시 Trypan 푸른 얼룩. 이 결과 죽은 세포의 백분율 높은 배달된 복용량 (10 Gy) 생산 세포 죽음 (그림 1D)의 20% 대략만 고려 하는 경우에 특히 매우 낮은 것으로 나타날 있지만 방사선 노출의 명확한 효과 보여 줍니다.
샘플 또는 더 낮은 구획에서 PBMC 없이 공동 경작 했다. PBMC에 어떤 외부 자극에는 영향을 받지 못한 사실을 감안할 때, 48 h 실험 PBMC 죽을 시작으로 도입 하는 바이어스를 피하기 위해 이상적인 여겨졌다. 따라서,에서 방사선, 직전 TEER 정기적으로 측정 했다 48 h에 대 한 조사 프로토콜에 의해 발생 가능한 일시적인 효과를 추적. 그림 1 E F같이 TEER 값 제시는 더 나은 (1200-1500 Ω·cm2순서의 있던) 미리 치료 조건에 관하여 상대 변형을 강조 x 선 방사선에 의해 유도 된 섭 동 및 존재/부재 PBMC의 공동 문화에 의해 또는. 두 경우 모두에서 초기 과도 피크 볼 수 있습니다 명확 하 게 첫 번째 시간이 시점에서 방사선 노출, 방사선 프로시저에 표시 될 수 있습니다.
하지에서 PBMC (그림 1E)와 함께 공동 문화, TEER 값은 48 h 동안,까지 거의 일정 한 엑스레이의 10 Gy 후, 셀 표시 TEER 장기간된 감소 3 h 방사선 조사 후에 시작. PBMCs의 존재는 완전히 TEER 임시 역학 (그림 1F)를 수정합니다. 모든 복용에 대 한 감소는 TEER 때 명확 하 게 약 30 h 방사선 조사 후, 최대 3 h에서 관찰 TEER 정착 상수 값 (그림 1F)에 나타납니다.
단단한 접속점 단지 식 수준 서쪽 오 점 분석 결과 통해 Caco-2 세포 lysates에서 조사 되었다. Caco-2 셀 (0, 2, 및 10 Gy의 복용량)과 이온화 방사선에 노출 되었고 이후에 성장 혼자 또는 공동 문화 48 h에 대 한 맨 아래 칸에 PBMCs ( 그림 2A-F에서 같이). Claudin-1와 Occludin (그림 22B) x 선 및/또는 공동 문화 PBMC 크게 변경 하지 것을 발견 했다. 큰 변동이 대신 ZO-1 조 2, Afadin (그림 2C, 2D, 2E) 비 계 단백질에서 관찰 되었다. 특히, ZO-2 식 수준에 있는 감소는 Caco-2 혼자 성장 하는 때 동안 10 Gy에서 PBMC와 공동 문화에 때 2 Gy 후 이미 관찰 됩니다. Afadin 식 수준 대신 영향을 받습니다 10 Gy 엑스레이의 직후 Caco-2는 PBMCs와 공동 경작 하는 때 추가 감소.
PBMCs 공동 Caco-2 교양 염증 상태에 관한 분석 했다, 특히 핵 전사 인자 kB (NF-kB)와 apoptosis 단백질 (XIAP) 레벨의 X 연결 된 억제 물 조사 되었습니다 (그림 2 G-난). NF-kB 총 금액은 영향을 받지는 공동 문화 Caco-2 다른 방사선 복용량 (그림 2G)에 노출. 그와 반대로, XIAP 레벨 4-fold 최대 2 Gy에 10 Gy 공동 문화, 규제 하지만 했다 큰 변화가 요구 같은 변동을 얻을 더 나은 통계적 인 힘 분석 샘플의 더 높은 번호.
같이 그림 2F 와 2I, 일부 일반적인 악대는 관심사의 단백질의 예상된 분자량 옆 나타날 수 있습니다. 사실과 일반적인 밴드 쉽게 구별할 수 있습니다, 하지 않는 한 다른 항 체 또는 BSA 또는 NFDM 농도 고려 되어야 한다.
그림 1 . 전반적으로 실험적인 체제 및 방사선 노출 PBMC 공동 문화의 거시적인 효과. 공동 문화 모델의 A) 회로도 묘사. B) TEER 값은 단층의 적절 한 성장과 분화 상태를 평가 하기 위해 Caco-2 셀의 초기 씨앗에서 매일 측정. C) 세포 생존 능력 및 D) Caco-2 엑스레이 (0, 2, 5, 및 10 Gy)에 노출에 사망. Gy의 엑스레이 없이 교양 또는 F E) TEER 측정 Caco-2 셀에 0, 2, 및 10 반구) PBMCs와 함께. 각 값은 ≥3 독립적인 실험 ± SEM.의 평균 * p 발 < 0.05; * * p-버지니아 l < 0.01; p-발 < 0.001입니다. 그래프 Morini 알 외에서에서 적응입니다. 15. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2. 서쪽 오 점 결과 Caco-2와 PBMC lysates의. 꽉 접합 단백질 (Claudin-1 (A), Occludin (B), ZO-1 (C), ZO-2 (D), 및 Afadin (E)) 0, 2, 및 10 Gy의 엑스레이 후 Caco-2 및 공동 문화에서 PBMC의 존재/부재의 식 수준입니다. 값은 말라 수준에서 정규화 됩니다. 각 단단한 연결 단백질 및 조건에 대 한 설명을 영화 패널 (F)에 표시 됩니다. NF-κB (G) 및 XIAP (H) PBMCs 공동 Caco-2 세포와 배양의 식 수준입니다. NF-kB, XIAP, 그리고 걸에 대 한 대표적인 영화 패널에 표시 됩니다. 각 값은 ≥3 독립적인 실험 ± SEM. 그래프 Morini 알 외에서에서 적응의 의미입니다. 15. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
선진국에서 그것의 높은 발생으로 대 장 암 사망률 및 인구에서 사망률의 가장 빈번한 원인 중 하나입니다. 그것은 일반적으로 수술, 화학요법, 그리고 방사선 치료1에 의해 관리 됩니다. 방사선 치료의 프레임 워크에서 특정 주의 건강 한 조직을 노출4;의 효과를 부여 해야 합니다. 또한, 방사선 노출 및 면역 체계의 관계에 대 한 체계적인 연구는 라디오 immunotherapy3의 접근을 개발 하기 위한 기본.
우리는이 작품에서 채택 하는 방법론 Caco-2 셀 및 PBMC 크로스 토크의 조사를 맞게 되었습니다. 우리는 종양 세포의 엑스레이 노출의 효과에 집중 하지만 동일한 프로토콜 약리 작용 연구에 적용할 수 있습니다. 표준 세포 배양 관련 생리 적 조건에 가까이 되 고, 강한이 방법의 장점은 다른 세포 유형 및 자료의 분석의 가능성을 주어진 복잡 한 시스템의 완전 한 해 부의 가능성 공동 문화 자체의 두 구획으로 신호 분자. 이 방법에서는, 정기적으로 적용 된 생물 학적 방법 상호 관련된 메커니즘 휴대의 이해를 도울 수 있다.
Caco-2 셀에 X 레이 유도 효과의 초기 특성 두 보완 측정에 근거 했다, 즉 MTT 색도계 분석 결과 고 Trypan blue 염료 제외 테스트. 이러한 두 가지 분석 실험의 다른 초점에 의해 분명히 일관성 없는 결과 설명할 수 있었다. MTT은 Trypan 파랑 염료 생활 셀 제외 염료 메커니즘에 기반 하면서 oxidoreductase 효소 활동을 평가 합니다.
Caco-2-PBMC 상호 작용의 조사 공동 문화의 2 개의 구획 사이 완전 한 별거에 지도할 수 있는 상피 단층의 생성을 필요 합니다. Caco-2 셀 공동 문화 삽입에 뿌리기의 가능성이 셀 인구 조사 수 있습니다. 공동 문화 조사 후 시작, 이후 PBMC의 어떤 실수로 노출으로 인해 아무 편견이 있다. 이 설정 해야 손상 (또는 오염)을 피하기 위해 신중 하 게 처리 되어야 세포 단층 삽입의 움직임 동안 다른 한 6 잘 플레이트에서 합니다. 신중 하 게 수행 하는 경우 TEER 측정 조사 단층 침투성을 간단 하 고 비-침략 적 방법입니다. 이 분석 결과 엄격 하 게 공동 문화 설정에 관련 된 그리고 단층 침투성의 조사에 대 한 유일한 선택이 아니다. 그것은 잘 신선한 완전 한 매체와 보정은 일단 좋은 재현성을 측정의 수 있습니다. 일반적인 분석 아래 "basolateral" 하나에 위 "꼭대기" 구획에서 화학 염료의 확산에 초점 (예: fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran 분석 결과)16. 그러나, PBMC이이 연구에서 basolateral 구획에 있기 때문에, 우리는 실험에서 화학 시 약의 소개를 방지 하기로.
이 작품에서 채택 하는 다른 기법 중 TEER 측정은 유일 하 게 공동 문화 설정17,18필요 합니다. 그러나, 다른 일반적인 실험실 기술은 설치 생리에 가까운 조건의 조사 수 데이터 강한 생물 학적 중요성으로 셀 공동 문화에 적용 될 때 더 유익한 결과 제공 합니다. 다른 한편으로, 그것은 다공성 지원에 성장 하는 세포를 사용 하 여 서 부 럽 통해 분석할 세포 추출의 준비를 위한 세포 세포의 용 해 등 샘플을 준비 하는 데 필요한 작업에 몇 가지 문제가 발생할 수 언급 해야 합니다.
이 연구에서 채택 하는 시스템 개선, 예를 들면 기질 환경 재현 수 물질의 응용 프로그램으로 추가 될 가능성이 있다. 그러나,이 또한 시스템의 증가 복잡성 귀 착될 것 이다 고 설정의 완전 한 해 부 달성 될 더 어려울 것 이다.
셀 공동 문화에 대 한 설정을 확실히 복잡 한 시스템의 이해에 대 한 생체 외에서 연구의 발전을 위한 강력한 도구를 나타냅니다. 이 기술은 분자 신호에 그리고 가능한 응용 프로그램의 프레임 워크에서 면역 체계의 활동의 변조에 기초 연구 연구에 새로운 입력을 제공 하는 기본 메커니즘에 대 한 지식을 증가 하는 종양학 임상 환자 관리입니다.
Disclosures
저자는 충돌의 관심을 선언합니다.
Acknowledgments
이탈리아 연구소 핵 물리학 (INFN)에 대 한 부분적으로 INFN 자오선 프로젝트를 통해이 작품을 자금. 저자는 INFN 자오선 프로젝트 조정;에 대 한 교수 Edoardo Milotti (물리학과, 대학교의 트리 에스테, 이탈리아)를 인정 닥터 Roberto Chignola (생명 공학 부, 대학교의 베로나, 이탈리아) Caco-2 셀, ohmmeter, 제공 하 고 그의 귀중 한 도움과 훈련에 대 한. 우리는 또한 기술 지원에 대 한 Agnese Solari 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ThinCert 6 Well Cell Culture Inserts for Multiwell Plates |
Greiner Bio-one | 657610 | Equipment |
| Cell Culture Multiwell Plate, 6 Well | Greiner Bio-one | 657160 | Plastic |
| Cell Culture Multiwell Plate, 24 Well | Greiner Bio-one | 662160 | Plastic |
| RPMI 1640 without L-Glutamine | Lonza | 12-167F | Reagents |
| Foetal Bovine Serum | Lonza | DE14-801 | Reagents |
| L-Glutamine 200 mM | Lonza | 17-605C | Reagents |
| Penicillin/Streptomycin 10K/10K | Lonza | 17-602E | Reagents |
| CO2 Incubator | Heal Force | HF240 | Equipment |
| Ficoll Histopaque-1077 | Sigma-Aldrich | 10771 | Reagents |
| Tube, 50 mL, PP, Conical Bottom | Greiner Bio-one | 227261 | Plastic |
| Tube, 15 mL, PP, Conical Bottom | Greiner Bio-one | 188261 | Plastic |
| Centrifuge | ThermoScientific | CL31R | Equipment |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P3813 | Reagents |
| Cell Culture Flask, 25 cm2, PS | Greiner Bio-one | 690175 | Plastic |
| Clinac 2100 Linear Accelerator | Varian | CLINAC 2100C/D | Equipment |
| 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) | Sigma-Aldrich | M5655 | Reagents |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | Reagents |
| Multiwell Plate Reader | GDV | DV990BV6 | Equipment |
| Trypan Blue Solution 0,4 % | Amresco | K940 | Reagents |
| Trypsin-EDTA Solution | Sigma-Aldrich | T4049 | Reagents |
| 1.5 mL tubes | Eppendorf | 0030125150 | Reagents |
| Millicell-ERS voltmeter/ohmeter | Millipore | MERS 00001 | Equipment |
| Cell Lysis Buffer (10x) | Cell Signalling Technology | #9803 | Reagents |
| Bürker Hemocytometer | Sigma-Aldrich | BR719520 | Equipment |
| BCA Protein Quantification Kit | Abcam | ab102536 | Reagents |
| 2x Laemmli Sample Buffer | BioRad | #1610737 | Reagents |
| 2-Mercaptoethanol | BioRad | #1610710 | Reagents |
| Accublock Digital Dry Bath | Labnet International Inc. | D1100 | Equipment |
| 4–20% Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Protein Gels, 10 well, 30 µL | BioRad | #4568093 | Reagents |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gel | BioRad | #1658004 | Equipment |
| PowerPac HC High-Current Power Supply | BioRad | #1645052 | Equipment |
| Precision Plus Protein WesternC Blotting Standards | BioRad | #1610385 | Reagents |
| 10x Tris/Glycine/SDS Running Buffer | BioRad | #1610732 | Reagents |
| Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs | BioRad | #1704156 | Reagents |
| Trans-Blot Turbo Transfer System | BioRad | #1704150 | Equipment |
| Blotting-Grade Blocker | BioRad | #1706404 | Reagents |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | 93773 | Reagents |
| Claudin-1 (D5H1D) XP Rabbit mAb | Cell Signalling Technology | #13255 | Reagents |
| Bovine Serum Albumine | Sigma-Aldrich | A7906 | Reagents |
| ZO-1 (D7D12) Rabbit mAb | Cell Signalling Technology | #8193 | Reagents |
| ZO-2 Antibody | Cell Signalling Technology | #2847 | Reagents |
| Afadin (D1Y3Z) Rabbit mAb | Cell Signalling Technology | #13531 | Reagents |
| Anti-Occludin Antibody | Millipore | ABT146 | Reagents |
| Anti-NF-kB p65 antibody [E379] | Abcam | ab32536 | Reagents |
| Anti-XIAP antibody | Abcam | ab21278 | Reagents |
| Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep) | GE Healthcare Life Sciences | NA931V | Reagents |
| Amersham ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey) | GE Healthcare Life Sciences | NA934V | Reagents |
| Clarity Western ECL Substrate, 200 mL | BioRad | #1705060 | Reagents |
| Carestream Kodak autoradiography GBX developer/replenisher | Sigma-Aldrich | P7042 | Reagents |
| Carestream Kodak autoradiography GBX fixer/replenisher | Sigma-Aldrich | P7167 | Reagents |
| Carestream Kodak BioMax light film | Sigma-Aldrich | Z370401 | Reagents |
| Gel Doc EZ System | BioRad | #1708270 | Equipment |
References
- Cunningham, D., et al. Colorectal cancer. Lancet. 375 (9719), 1030-1047 (2010).
- Mancuso, M., et al. Oncogenic bystander radiation effects in Patched heterozygous mouse cerebellum. PNAS. 105 (34), 12445-12450 (2008).
- Demaria, S., Formenti, S. C. Can abscopal effects of local radiotherapy be predicted by modeling T cell trafficking. J Immunother Cancer. 4 (1), 29 (2016).
- Trott, K. R., et al. Biological mechanisms of normal tissue damage: Importance for the design of NTCP models. Radiother Oncol. 105 (1), 79-85 (2012).
- Derer, A., Deloch, L., Rubner, Y., Fietkau, R., Frey, B., Gaipl, U. S. Radio-immunotherapy-induced immunogenic cancer cells as basis for induction of systemic anti-tumor immune responses - pre-clinical evidence and ongoing clinical applications. Front Immunol. 6, 505 (2015).
- Frey, B., Gaipl, U. S. Radio-immunotherapy: The focused beam expands. Lancet Oncol. 16 (7), 742-743 (2015).
- Prise, K. M., O'Sullivan, J. M. Radiation-induced bystander signalling in cancer therapy. Nat Rev Cancer. 9 (5), 351-360 (2009).
- Sambuy, Y., De Angelis, I., Ranaldi, G., Scarino, M. L., Stammati, A., Zucco, F. The Caco-2 cell line as a model of the intestinal barrier: Influence of cell and culture-related factors on Caco-2 cell functional characteristics. Cell Biol Toxicol. 21 (1), 1-26 (2005).
- Babini, G., et al. Mechanisms of the induction of apoptosis mediated by radiation-induced cytokine release. Radiat Prot Dosim. 166 (1-4), 165-169 (2015).
- Pellegrina, C. D., et al. Effects of wheat germ agglutinin on human gastrointestinal epithelium: Insights from an experimental model of immune/epithelial cell interaction. Toxicol Appl Pharm. 237 (2), 146-153 (2009).
- Pozo-Rubio, T., et al. Immunostimulatory effect of faecal Bifidobacterium species of breast-fed and formula-fed infants in a peripheral blood mononuclear cell/Caco-2 co-culture system. Brit J Nutr. 106 (8), 1216-1223 (2011).
- Parlesak, A., Haller, D., Brinz, S., Baeuerlein, A., Bode, C. Modulation of cytokine release by differentiated CACO-2 cells in a compartmentalized coculture model with mononuclear leucocytes and nonpathogenic bacteria. Scand J Immunol. 60 (5), 477-485 (2004).
- Haller, D. Non-pathogenic bacteria elicit a differential cytokine response by intestinal epithelial cell/leucocyte co-cultures. Gut. 47 (1), 79-87 (2000).
- Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assay. J Immunol Methods. 65 (1-2), 55-63 (1983).
- Morini, J., Babini, G., Barbieri, S., Baiocco, G., Ottolenghi, A. The Interplay between Radioresistant Caco-2 Cells and the Immune System Increases Epithelial Layer Permeability and Alters Signaling Protein Spectrum. Front Immunol. 8, (March) 1-12 (2017).
- Dittmar, S., Harms, H., Runkler, N., Maisner, A., Kim, K. S., Schneider-Schaulies, J. Measles virus-induced block of transendothelial migration of T lymphocytes and infection-mediated virus spread across endothelial cell barriers. J Virol. 82 (22), 11273-11282 (2008).
- Srinivasan, B., Kolli, A. R., Esch, M. B., Abaci, H. E., Shuler, M. L., Hickman, J. J. TEER Measurement Techniques for In Vitro Barrier Model Systems. J Lab Autom. 20 (2), 107-126 (2015).
- Moyes, S. M., Killick, E. M., Morris, J. F., Kadhim, M. A., Hill, M. A., Carr, K. E. Changes produced by external radiation in parameters influencing intestinal permeability and microparticle uptake in vitro. Int J Radiat Biol. 84 (6), 467-486 (2008).
