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Neuroscience

Imagem de cálcio Ratiometric de neurônios individuais se comportando Caenorhabditis Elegans

doi: 10.3791/56911 Published: February 7, 2018
* These authors contributed equally

Summary

Este protocolo descreve o uso de geneticamente codificado Ca2 + repórteres para alterações de registro da atividade neural em se comportando vermes Caenorhabditis elegans .

Abstract

Tornou-se cada vez mais claro que atividade de circuito neural em se comportando animais difere substancialmente que visto em animais anestesiados ou imobilizados. Altamente sensíveis, geneticamente codificados repórteres fluorescentes de Ca2 + revolucionaram a gravação da célula e a atividade sináptica usando abordagens ópticas não-invasiva em comportamento de animais. Quando combinado com genética e optogenetic técnicas, os mecanismos moleculares que modulam a atividade celular e do circuito durante o comportamento de diferente Estados-Membros pode ser identificados.

Aqui descrevemos os métodos para a ratiometric Ca2 + imagem latente de neurônios único em livremente se comportando vermes Caenorhabditis elegans . Podemos demonstrar uma técnica de montagem simples que gentilmente vermes de sobreposições, crescendo em um ágar padrão de nematódeo crescimento Media (NGM) bloqueiam com uma lamela de vidro, permitindo animais para ser gravado em alta resolução durante o movimento irrestrito e comportamento. Com essa técnica, nós usamos sensível Ca2 + repórter GCaMP5 para gravar as alterações no intracelular Ca2 + nos neurônios específico serotoninérgico hermafrodita (HSNs) como eles conduzem o comportamento de oviposição. Expressando co mCherry, uma Ca2 +-proteína fluorescente insensível, podemos rastrear a posição da HSN dentro ~ 1 µm e correto para flutuações na fluorescência causadas por mudanças no foco ou movimento. Imagem de infravermelho, simultânea brightfield permite gravação de comportamento e rastreamento de animais usando um palco motorizado. Integrando essas técnicas microscópicas e fluxos de dados, podemos gravar a atividade de Ca2 + no circuito de postura de c. elegans como progride entre Estados de comportamento ativo e inativo por dezenas de minutos.

Introduction

Um objetivo central da neurociência é compreender como os neurônios se comunicam em circuitos de comportamento animal unidade. Circuitos neurais integram uma gama de diversas pistas sensoriais a fim de mudar atividade do circuito, assim conduzir mudanças comportamentais necessárias para os animais respondem a seus ambientes. O nemátodo do Pinheiro, c. elegans, tem um sistema nervoso simples com 302 neurônios cujas conexões sinápticas têm sido completamente mapeado1. Além disso, os genes que codificam para proteínas envolvidas na neurotransmissão são altamente conservados entre c. elegans e mamíferos2. Apesar da simplicidade anatômica de seu sistema nervoso, ele exibe um repertório complexo de comportamentos conservados, fornecendo uma plataforma fértil para compreender como os neurônios regulam o comportamento3.

C. elegans é passível da aplicação de uma vasta gama de abordagens como a manipulação genética, célula ablação a laser, técnicas eletrofisiológicas, bem como na vivo óptico de imagem de4,5. Estudos recentes produziram mapas detalhados do neurotransmissor importante sinalização sistemas em c. elegans , incluindo o colinérgicos e redes neuronais gabaérgica. Estes estudos, juntamente com estudos em andamento para mapear a expressão dos receptores de proteína G-acoplado todos neuronais Coloque este modelo em uma posição única para alavancar estrutural altamente detalhada e mapas de conectividade neuronal funcional para entender completamente como esses sinal de neurotransmissores diferentes através de receptores diferentes e escalas de tempo diferentes aspectos de unidade de comportamento animal.

A fim de estudar os padrões de actividade neuronal dinâmico em qualquer sistema, um pré-requisito essencial é desenvolver metodologias robustas para registrar a atividade nos neurônios individuais ou circuitos inteiras durante comportamentos. Especialmente importante é a acessibilidade de tais abordagens óticas para visualizar a atividade pré-sináptica que impulsiona a fusão de vesículas sinápticas. Rápido e altamente sensíveis repórteres fluorescentes de intracelular Ca2 +, juntamente com a disponibilidade crescente de fotodetectores sensível, revolucionaram a gravação da célula e a atividade sináptica em animais acordados, vivas durante o comportamento. Porque um resultado importante da atividade elétrica sináptica é regular os canais de Ca2 + , mudanças no intracelular Ca2 + são pensadas para fielmente comportamentalmente relevantes alterações no relatório na atividade das células.

Neste estudo, apresentamos uma abordagem para executar ratiometric Ca2 + imagem do HSN motor neurônios serotoninérgicos que promovem o comportamento de oviposição em c. elegans6,7. Esta abordagem baseia-se esforços anteriores para visualizar o Ca2 + atividade em c. elegans e o circuito de postura durante comportamento5,8,9,10,11 . O método permite simultaneamente correlacionar as mudanças observadas na atividade celular/circuito com eventos de postura, bem como alterações no estado de locomoção animal. Embora nós usamos esta abordagem para estudar a atividade em vermes adultos, trabalho não publicado de nosso laboratório mostra que essa abordagem pode ser estendida para animais juvenis na quarta larval (L4) fase também. É provável que a atividade de outros neurônios de c. elegans que funcionam em circuitos distintos e comportamentos deve ser da mesma forma acessível com esta técnica. Outros recentemente desenvolvido rápido Ca2 + indicadores com disjunto espectros de emissão12,13,14,15,16, ferramentas optogenetic17 e geneticamente codificado ópticas indicadores de membrana de tensão18, deverá permitir-nos realizar penetrantes 'all-optical' investigações como alterações na atividade de circuito neural dirige Estados de comportamento distinto.

Protocol

1. cepas, cultura, mídia e montagem de animais

  1. C. elegans worms a 20 ° C em padrão-60mm nematódeo crescimento médio (NGM) placas de ágar inoculadas com OP50 Escherichia coli alimentar bacteriana19de crescer.
  2. Prepare dois plasmídeos para cada promotor celular específico de interesse: um, dirigindo a expressão de GCaMP5 de registro intracelular Ca2 +e no segundo, dirigindo a expressão de mCherry para permitir a quantificação de ratiometric de GCaMP5 mudanças de fluorescência e simplifica a medição e a descoberta do objeto.
    Nota: GCaMP5:mCherry ratiometric imagem corrige para flutuações na fluorescência GCaMP5 que resultam em mudanças no movimento de foco e animal, não reais mudanças no intracelular Ca2 +.
  3. Injetar GCaMP5 - e mCherry-expressando plasmídeos juntamente com o plasmídeo de marcador de resgate visível pL15EK as gônadas de LX1832 lite-1(ce314), lin-15(n765ts) X animais mutantes e recuperar não-vum lin-15(+) animais expressando GCaMP5 e mCherry de um transgene alta-cópia20,21,22. Use o fundo mutante lite-1 para reduzir o comportamento de evitação de luz azul23,24.
  4. Integre os transgenes de cromossomos para reduzir mosaicismo e simplificar a geração de cepas mutantes composto25.
    Nota: A tensão de LX2004 descrita aqui carrega um transgene integrado de alta-cópia que expressa a GCaMP5 e mCherry nos HSNs do promotor de PNL-3 (ver Tabela de materiais)26,27, 28 , 29. o promotor de PNL-3 foi encontrado a expressão forte de carro nos HSNs de tarde L4 e animais adultos sem causar defeitos significativos no desenvolvimento de HSN ou comportamento de oviposição em comparação com outros promotores testado (e.g.,tph-1, EGL-6e unc-86). Esta estirpe e outros que expressam a GCaMP5 e mCherry no cabo ventral (VC) neurônios, músculos vulvares e células neuroendócrinas uv1 estão disponíveis a partir do centro de genética Caenorhabditis e detalhes de sua construção foram descritas 27.
  5. Aplicar OP50 escolher alimentar bacteriana de uma placa de ágar NGM semeada no fundo de um verme de platina e usá-lo para transferir ~ 20 animais L4 LX2004 tarde que expressam a GCaMP5 e mCherry nos HSNs do promotor de PNL-3 . Certifique-se que a vulva em desenvolvimento aparece em um estereomicroscópio como uma mancha clara escura rodeada por uma lua crescente branca. Incube os animais a 20 ° C por 24-40 h.
  6. Após a incubação, aplicar OP50 para a escolha e transferência ~ 3 dos vermes para uma placa NGM não-semeada, deixando uma pequena quantidade de comida por trás para os vermes que alimentam-se durante a imagem latente. Certifique-se de alimentos suficientes, como também pouca comida bacteriana incentivará os vermes a vaguear longe do centro da placa, enquanto muita comida aumentará a fluorescência de fundo e causar hipóxia.
  7. Use uma espátula plana arredondada para cortar um ~ 20 mm x 20 mm bolão da placa carregando os vermes e transferir o bloco para baixo para o centro de uma lamela limpa 24 x 60 mm #1.5 (Figura 1). Inicie a aplicação de um lado para evitar bolhas sendo presa sob a lamela e interferentes com imagem latente. Uma lamela 22 x 22 mm #1 para o topo do parte para reduzir a degola e evaporação.

2. hardware e instalação de instrumentação

  1. Coloque o encenado, vermes transgênicos para o palco de um microscópio invertido com um ≥ 0,7 numérica abertura plano-Apochromat 20 x estágio objetivo, motorizado de XY controlável com um joystick, um divisor de imagem e fluorescência filtros para GCaMP5 simultânea e mCherry de excitação e emissão, câmeras de infravermelho e fluorescência brightfield de imagem e um sistema de iluminação triggerable do diodo emissor de luz (LED)(Figura 2).
    Nota: Um divisor de feixe de 80/20 envia 80% do sinal de imagem da câmera de fluorescência e 20% para a câmara de brightfield. Um microscópio vertical também pode ser usado, mas o pedaço NGM deve ser colocado entre uma lâmina de vidro e a lamela grande neste caso.
    1. Use as oculares binoculares para selecionar um verme para a imagem latente. Quando um animal é selecionado, deslize o filtro infravermelho no lugar acima do condensador.
  2. Lógica do transistor-transistor (TTL) desencadeia
    1. Conecte cabos coaxiais de cada uma as três linhas de saída do TTL gatilho da câmera de fluorescência. Conecte a primeira saída à entrada BNC #3 do sistema de iluminação LED.
    2. Conecte a saída segunda a um adaptador de BNC 'banana' com verde e marrons fios do conector 8 pinos GPIO GPIO correndo entrada #3 (pino 4) e terra (pino 5) da câmera infravermelha, respectivamente.
    3. Conecte a saída de terceira para um adaptador de 'banana' BNC com fios de jumper, correndo para a entrada digital #8 e terra no dispositivo de aquisição digital (Figura 2B).
  3. Dispositivo de aquisição digital (DAQ)
    1. Conecte a placa do microcontrolador DAQ (ver Tabela de materiais) para o PC através de um cabo USB. Atualize o firmware com o padrão Firmata protocolo (consulte Tabela de materiais) e configurar a porta USB para se comunicar em baud 57600.
  4. Diodos emissores de luz
    1. Executar o software de controlador de LED (veja a Tabela de materiais). Alterne para o modo de gatilho de 'Continuous' para 'Gated' e selecione canal gatilho 3' para ambos os LEDs 470 e 590 nm.
    2. Ligue e digite LED de potência de cada LED (por exemplo, conjunto a 470 nm LED para 20% e a 590 nm LED 40%).
  5. Execute o script 'XY-fase-final' em Bonsai (ver Tabela de materiais) de comunicação serial-palco30. Clique no nó cinzento 'CsvWriter' e selecione uma pasta para salvar o gravado X e Y palco informações (Figura 3). Pressione a seta verde da barra de ferramentas para inicializar o DAQ.
    Nota: O script começa a gravação a posição X e Y do palco, quando a câmara de fluorescência envia um sinal TTL. Este script produz quatro colunas de dados: frame número, X posição (µm), posição Y (µm) e o intervalo entre quadros (s).
  6. A câmera infravermelha, software de gravação (ver Tabela de materiais) em 'Modos de vídeo personalizado', selecione "Modo 1" (binning 2x2; 1.024 x 1.024 pixels), e "Pixel formato Raw 8". Sob ' gatilho / Strobe', defina a linha de entrada de gatilho (GPIO) "3", a polaridade de "Alta", o 'modo' para "14". Alternar 'Habilitar' parar aquisição de quadro até um sinal de gatilho TTL é recebido.
    1. Deixando a janela aberta, clique no botão "Record" vermelho na barra de ferramentas modo de exibição de câmera principal. Selecione a pasta para sequências de imagem ser salvo. Selecione o modo de gravação de 'Tampão' e 'Imagens' de salvar em formato JPEG. Clique em "Iniciar gravação" para inicializar a aquisição.
  7. Câmera e imagem divisor de fluorescência
    Nota: Os canais de fluorescência GCaMP5 e mCherry devem ser recolhidos simultaneamente para garantir o registro de imagem apropriada para quantificação de ratiometric. Um divisor de imagem permite a aquisição de dois canais de fluorescência GCaMP5 e mCherry em um sensor.
    1. Na aba 'Captura' do software de aquisição de imagem tempo de exposição definido (ver Tabela de materiais), a 10 ms, binning 4x, e profundidade de imagem de 16 bits. Selecione um subarray câmera centrada de 512 pixels de largura por 256 pixels de altura. Clique em 'Mostrar opções de gatilho de saída' e definir todos os gatilhos para 'Positivo'.
      Nota: O DAQ ocasionalmente pode perder TTL disparadores se eles são 10 ms ou menos.
    2. Certifique-se de que 'Gatilho 1' e 'Gatilho 2' estão definido como 'Exposição' enquanto 'Gatilho 3' é definida como 'Programável' com um 'período' de 25 MS. sob a aba 'Sequência', selecione 'Time Lapse' com um 'campo Delay1' de 50 ms para coletar imagens em 20 Hz. Select 'Salve Buffer temporário.'
  8. PGTO ganhar e intensidade de laser durante a imagem latente confocal canal três
    1. Defina o ganho de PGTO para a fluorescência de fundo está em um nível acima do mínimo (nível de preto). Aumente a potência de laser (verde) de nm 561 até um único saturado em 12 bits ou 16 bits de pixel é observado no terminal pré-sináptica no canal mCherry.
    2. Ajuste a intensidade de laser (azul) 488 nm para que GCaMP5 fluorescência é apenas visível no terminal pré-sináptica acima do fundo. Essa configuração baixa impede a saturação dos pixels GCaMP5 quando a fluorescência aumenta em resposta a transientes de Ca2 + fortes. Abra o pinhole confocal todo o caminho para maximizar a captura de luz.

3. Ratiometric Ca2 + imagens e gravação de comportamento

  1. Na guia 'Sequência' do software de aquisição de fluorescência, clique em "Start" para começar a gravação. Rastrear o verme com o joystick, mantendo a célula (s) e sinapses de interesse em foco e no centro do campo de visão (FOV). Clique no botão 'Stats' na janela de histograma para mostrar estatísticas de pixel de cada canal.
  2. Ajuste a potência do LED para garantir uma fluorescência máxima mCherry de single-pixel no terminal pré-sináptica de ≥ 8.000 contagens (~ 4.000 photoelectrons), dando um ~ 12 bits intervalo dinâmico acima de fundo (~ 100 photoelectrons). Sinais de GCaMP5 no terminal pré-sináptica durante o descanso (baixo) Ca2 + deve ser em torno de ~ 2.500 conta - apenas visível acima do fundo.
  3. Gravar até atingir uma postura estado ativo; Geralmente, isso ocorre a cada 20-30 min em um verme selvagem-tipo7. Salve um subconjunto de 10 min (12.001 frames), 6.000 quadros antes e após o primeiro evento de postura (quadro 6.001). Certifique-se de manter o mesmo subconjunto de brightfield imagens de worm comportamento e momentos de posição XY, ou a perfeita sincronização de fluxos de dados serão perdida.
  4. Usar o ImageJ e o plugin BioFormats (consulte a Tabela de materiais) para converter sequências de imagem para o formato de imagem padrão Cytometry (ICS) assim pode ser importado para o software de quantificação de Ratiometric.

4. segmentação e análise quantitativa de imagem

  1. Importar sequências de imagem para o software de quantificação de Ratiometric (ver Tabela de materiais). Clique em 'Auto contraste' no menu 'Ferramentas' e ajuste o contraste de cada canal para estabelecer adequado preto (~ 1.800) e branco níveis (10.000). Selecione 'Alterar cores...' no menu ' ferramentas ' para confirmar que mCherry e atribuições de cor GCaMP5 canal estão corretas (Figura 4A - C).
    1. Clique com o botão direito sobre a série de tempo na aba 'Sequência' e configurá-lo para 20 frames/s e 1,25 µm/pixel.
  2. Selecione 'Ratio' no menu 'Ferramentas' e selecione "GCaMP5" para 'Canal' e "mCherry" para 'Canal B'. Clique em "Calcular" ao lado de 'Limite' para subtrair o fundo de cada sequência de imagens. Selecione "Aplicar um arco-íris LUT para o canal de relação".
    Nota: Para uma gravação com uma relação de base média de 0,3 (baixa Ca2 +) e uma proporção máxima de 2-3 (alta Ca2 +), uma tabela de pesquisa adequado seria de 0 (azul) 1 (vermelho).
  3. Gere um canal de intensidade modulada proporção usando o canal de mCherry (Figura 4-D). O canal de intensidade modulada Ratio é uma imagem de milhões-de-cores onde a cor da relação é mapeada para o brilho do canal mCherry.
  4. Na guia 'Medidas', crie um protocolo de pesquisa de objeto, arrastando a ferramenta 'Encontrar objetos usando intensidade' no painel 'Protocolo'. Clique a 'engrenagem' para definir a janela de mCherry valores de intensidade e encontrar objetos.
    1. Selecione a intensidade valores ≥ 2 desvios padrão (SD) acima do plano de fundo (por exemplo, o limite inferior de ~ 2.500, limite máximo de 65.535). Verifique se o terminus pré-sináptica é detectado e que 'atualizar automaticamente feedback' é selecionada no menu de medições.
      Nota: O software também pode identificar objetos pelo seu desvio-padrão de fundo usando um protocolo relacionado 'SD intensidade.' No entanto, se um objeto especialmente brilhante entra o FOV, drasticamente muda a intensidade média durante esses momentos, que afectam as cortes de intensidade usados para localizar o HSN. Esta variabilidade não ocorrerá se os valores de intensidade crua são usados para localizar objetos.
  5. Adicione filtros adicionais visando apenas o canal de mCherry (tamanho, intensidade de Max, etc) se necessário excluir objetos indesejáveis como cabeça, cauda e estripá-fluorescência. Selecione 'Fazer medição Item' no menu de medições e escolha "Todos os momentos."
    Nota: Isto irá executar o protocolo, escrevendo todas as medições para um arquivo de valores separados por vírgula (. csv) que deve ser exportado usando o comando 'Exportar' no menu arquivo.
  6. Abra o arquivo exported.csv e copie o Commit, área (µm2), média (relação de canal), centroide X (µm) e dados de centroide Y (µm) em uma nova folha. Exporte arquivo de a.csv sem cabeçalhos de coluna. O software de quantificação de Ratiometric pode classificar uma célula de interesse, como um ou mais objetos por commit.
    1. Para recombinar esses objetos, use um script personalizado 'AnalzyeGCaMP_2017.m'.
      Nota: O script também identifica Ca2 + (ratio) picos nos dados e salva o arquivo de a.csv de seus momentos, amplitudes de pico e largura dos picos. Ele também gera arquivos postscript para os traços de proporção de matérias-primas e anotado. Com esta informação, devem ser determinadas a amplitude de Ca2 + transitória e intervalo inter transitório.
  7. Adicione a saída de X e Y valores de centroide de cada objeto de fluorescência para os valores X e Y, gravados pelo script XY-estágio de Bonsai. Use a posição líquida de XY para gerar um rastreamento de locomoção worm e para calcular o deslocamento da célula e velocidade que acompanham o comportamento de diferentes Estados31.
  8. Importe as imagens gravadas brightfield ImageJ como uma pilha virtual. Anote eventos de postura e outros comportamentos. Compare o calendário destes eventos de Ca2 + picos do rastreamento de relação.

Representative Results

A técnica de montagem simples descrita aqui (Figura 1) provoca mínimas alterações no ambiente da cultura de L4 e adulto c. elegans , permitindo alta resolução gravação em comportamento de animais através de uma lamela de vidro (Figura 4). Sincronização de fontes de luz LED, controladores de fase e exposições de câmera permite para aquisição de dados de vários fluxos a 20 frames/s para cima de 1 h. intermediário ampliação (20 x) com objectivos de abertura numérica elevada (0,7-0,8) fornece boa resolução espacial da região sináptica no circuito de comportamento de postura, mesmo com 4 x 4 pixel binning (1,25 µm/pixel). Aquisição simultânea de sinais de fluorescência GCaMP5 e mCherry (Figura 4A, B) é usada para gerar um canal de relação pixel por pixel que compensa as alterações na circulação de animais e foco (Figura 4-D). O terminus pré-sináptica HSN é tão grande como muitos corpos celulares neuronais, em c. eleganse mudanças na pré-sináptica HSN Ca2 + podem ser visualizado claramente. O FOV grande da câmera infravermelho brightfield permite que o worm ser manualmente controlados durante a gravação (Figura 4E). Para cada animal, mudanças no intracelular Ca2 + podem ser correlacionadas com comportamentos evidentes na imagem brightfield, incluindo o lançamento de ovo e as alterações na locomoção (Figura 4E).

Quantificação de HSN Ca2 + e velocidade confirma que vermes mudam sua locomoção como eles transição para comportamento de oviposição. Existem diferenças significativas na velocidade de verme antes, durante e após o estado ativo de postura (Figura 5A). Isto não é causado pelo ruído inerente para a imagem ou o sistema de rastreamento. Zoom em uma postura evento, observamos uma forte mudança na fluorescência de GCaMP5 (ΔF/F) antes do evento de poedeiras, enquanto mCherry fluorescência é relativamente inalterada (Figura 5B). Medido mudanças na proporção de GCaMP5:mCherry (ΔR/R) mostram claramente uma HSN Ca2 + transitória ~ 4 antes do s lançamento do ovo (Figura 5B). Uma clara desaceleração de locomoção worm coincidente com a contração muscular vulval, ocorre que termina com ovo libera. Resultados anteriores mostraram que os neurônios colinérgicos de motor VC, que são inervados pelos HSNs, mostrar atividade de pico durante as contrações musculares vulval forte e ovo lançamento 8,10,27. Também mostramos que a optogenetic de ativação dos neurônios VC leva uma desaceleração imediata da locomoção, sugerindo que os neurônios VC podem ser ativados pela contração muscular vulval, assim retardando a locomoção até receber feedback de lançamento de ovo27 .

A imagem latente e rastreamento sistema descrito permite a visualização da organização espacial de comportamento de oviposição (Figura 5-C). Como anteriormente indicado, vermes entram execuções sustentadas de locomoção para a frente antes de ser o estado ativo de32. Vermes gastam a maioria de seu tempo forrageando em bactérias no centro do pedaço de ágar. Antes da entrada em estado ativo, vermes mover-se longe da comida, que é coincidente com a aparência de infrequente HSN Ca2 + transientes. Atividade HSN então as transições para disparar rajada, com vários espaçadas HSN Ca2 + transientes que sustentam a postura eventos. As minhocas então muitas vezes virem, retomar a locomoção para frente e desovar o caminho de volta para sua posição inicial perto as bactérias OP50. Presumimos que podem estar influenciando mudanças no local O2 e/ou concentração de CO2 , onde os vermes se decidir colocar ovos33,34.

Figure 1
Figura 1. C. elegans montagem técnica para geração de imagens de alta resolução da atividade de circuito de postura e comportamento. Top, a montagem final do lado. No fundo, a montagem final como se fosse visto através do fundo da lamela grande. As setas indicam OP50 alimentar bacteriana, worms de c. elegans e ovos, imprensado entre o pedaço de ágar NGM e a lamela de grande 24 x 60 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 . Widefield ratiometric Ca2 + imagem e comportamento de gravação em um microscópio de epifluorescência invertido. (A) posição de verme e comportamento é capturado em brightfield através um 20 x (0,8 NA) plano-Apochromat objetivo usando luz infravermelha (750-790 nm) (setas roxas) emitida por uma lâmpada de halogéneo através do pedaço NGM. Um joystick e palco motorizado controlador é usado para manter o verme no campo de visão durante a gravação. Posição de fase (Δx, Δy) é enviada para o PC pela porta serial. GCaMP5 e mCherry de proteínas expressadas no worm estão animadas usando 470 nm (setas azuis) e 590 nm (setas amarelas) diodos emissores de luz (LED). Emitido GCaMP5 (verde setas) e mCherry (setas laranja) fluorescência juntamente com a luz infravermelha passa através de um espelho dicroico multi-banda (ver Tabela de materiais). Um divisor de feixe de 80/20 envia 20% da luz através de um demagnifer x 0.63 para captura em uma câmera do CMOS infravermelho-sensíveis (seta roxa). Os restantes 80% da luz é enviado através da porta do lado do microscópio para um divisor de imagem que separa o GCaMP5 e mCherry de fluorescência para separar as metades de uma câmera de sCMOS enquanto retira a luz infravermelha brightfield. Dados de ambas as câmaras são transferidos para um PC via cabos USB3. As portas do disparador da câmera sCMOS fluorescência (azul) são usadas para enviar + 5V TTL aciona o sistema de iluminação LED, a câmera CMOS infravermelho brightfield e o dispositivo de aquisição Digital (DAQ). (B) gatilho 3 saída sinais TTL são detectados pelo DAQ no pino digital #8 e enviados para o PC através de uma conexão USB. Estas entradas digitais acionar um ' onde XY' comando serial de um roteiro de software de Bonsai (XY-fase-final) onde se lê o X e Y palco posição para cada imagem de fluorescência/infravermelho GCaMP5/mCherry capturada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 : Layout do script de comunicação serial-estágio de Bonsai XY-fase-final. O top DigitalInput nó (rosa) lê TTL disparadores entrando pin #8 do DAQ. Para cada TTL tensão positiva (verde), o DAQ faz um timestamp (azul) e grava uma sequência de 'Onde XY?' (rosa) para o controlador de fase através da porta serial (cinza). O nó de SerialStringRead (rosa) lê que o X e Y coordenam a resposta do controlador de palco. Essa sequência é então convertida em mícrons e separada em X e Y coordenadas de palco. Finalmente, esses quatro fluxos são combinados usando um nó de fecho de correr (azul) e um arquivo de quatro column.csv está escrito: uma contagem de quadro dos sinais TTL recebido (nó de gama, rosa), as coordenadas X e Y e o intervalo entre momentos subsequentes (tipicamente ~ 50 ms quando gravação a 20 Hz). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4 : Micrografias representativas de fluorescência HSN e todo animal brightfield durante o comportamento de oviposição. (D) Imagem de ratiometric simultânea de fluorescência GCaMP5 e mCherry nos HSNs apenas antes da liberação do óvulo. Termini pré-sináptica HSN é indicadas com setas. (C) fusão de GCaMP5 e mCherry de fluorescência. (D) intensidade modulada GCaMP5:mCherry ratio; um rácio elevado (vermelho) indica alta intracelular Ca2 + no terminal pré-sináptica. (E) Brightfield imagem do verme inteira apenas depois que os ovos foram colocados. Setas indicam as metades anteriores e posteriores da vulva da qual os ovos são postos. Barra de escala para todas as imagens é 50 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5 : Gravação do HSN Ca2 + e locomoção velocidade durante o comportamento de oviposição. (A) vestígios de mudanças de relação GCaMP5:mCherry em resposta a intracelular Ca2 + transientes (ΔR/R; vermelho) juntamente com a velocidade instantânea do worm (µm/s; azul). Eventos de desova são indicados por setas. (B) vestígios de fluorescência GCaMP5 HSN (verde; ΔF/F), mCherry de fluorescência (vermelho; ΔF/F), relação de fluorescência GCaMP5:mCherry (preto; ΔR/R) e worm velocidade (azul) em torno do momento da liberação do óvulo. (C) organização espacial dos comportamentos de postura e locomoção durante a gravação inteira de 10 min. A faixa de worm foi obtida a partir das informações de fase XY que foi adicionadas para a posição do centroide da HSN obtido a partir da gravação de fluorescência mCherry. O timing de transientes HSN (círculos vermelhos), eventos de postura (setas pretas) e o início e fim da gravação (diamantes de verdes e azuis) são indicados. Barra de escala é 1 mm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Transgenes:

Porque mCherry expressão foi melhorada através da inserção de códon-otimização e intrão (e mais disponível GCaMP repórteres não têm), injetar ~ 4 x a quantidade de GCaMP5-expressando de shRNA para assegurar níveis comparáveis de fluorescência GCaMP5 durante forte Ca 2 + transientes. Resgate da mutação lin-15(n765ts) permite a recuperação fácil dos animais transgénicos com efeitos mínimos na postura e outros comportamentos35. Transgenes deve ser integrado para garantir condições entre diferentes animais25de imagem e expressão uniforme. Marcadores selecionáveis, incluindo a resistência aos antibióticos36,37 e resgate de armas letais sensíveis à temperatura38 também devem funcionar, mas, porque os animais não-transgênicos são mortos, confirmação da integração do transgene e homozigotia é mais difícil comparado com marcadores que apresentam um fenótipo visível de25. Marcadores dominantes que perturbam o normal locomoção e diminuem a aptidão, tais como rol-6(dm), devem ser evitada39. Imagem latente na lite-1 fundo mutante é essencial para reduzir a fuga de luz azul respostas durante a imagem23,40,41. Mutação adicional de gur-3, que atua paralelamente à lite-1, pode minimizar ainda mais comportamento residual e alterações fisiológicas causadas pela luz azul42. Convenientemente, gur-3, 1-litee lin-15 estão todos situados na metade direita do cromossomo X, que deve simplificar a construção de novas estirpes de Ca2 + imagens e experiências optogenetic.

Porque os tempos de exposição são curtos e imagens são coletadas em 20 Hz, sinais GCaMP5 e mCherry devem ser brilhantes. A explicação mais provável para barulhento Ca2 + gravações é fluorescência fraca causada pela expressão repórter fraco. Os promotores também devem ser razoavelmente específicos para a região a ser fotografada. Porque o corpo celular HSN e sinapses para os músculos vulvares são no centro do corpo, expressão adicional do promotor de PNL-3 na cabeça e cauda é tipicamente fora do campo de visão e podem ser excluído usando filtros adicionais na Software de quantificação de Ratiometric. Para garantir que observado alterações no resultado de fluorescência GCaMP5 de mudanças reais no intracelular Ca2 +, controle transgenes expressando GFP em vez de GCaMP5 devem ser preparadas de forma independente e analisados26. Mais recente Ca2 + repórteres com diferentes Ca2 + sensibilidades, cinética, cores e expandiram a escolha das ferramentas disponíveis de imagem, mas cada novo repórter deve ser validado usando o Ca2 +-variante fluorescente insensível14 ,16.

Mídia:

Placas NGM para a imagem latente devem ser preparadas com ágar de alta qualidade. Ágar de qualidade inferior não irá dissolver completamente após a autoclavagem, deixando pequenas partículas essa dispersão de luz durante a imagem latente e aumento da fluorescência, plano de fundo. Biologia molecular agarose de grau pode ser usado em vez disso, mas a quantidade adicionada deve ser reduzida para manter a firmeza de placa equivalente.

Comparações com outros métodos de montagem:

Abordagens anteriores, a atividade de imagem no circuito de comportamento de oviposição utilizaram vermes imobilizadas com cola para uma almofada de agarose. Sob estas condições, atividade de circuito e postura de comportamento não é favorecidas sem redução em meios de cultura osmolaridade8,10,44,45. Recentes sugerem que vários comportamentos de worm são modulados por estado de locomoção, levantando questões sobre a relação da atividade das células observadas em animais imobilizados ao observado em livremente, comportando-se animais. Recentemente mostramos que a atividade de circuito de postura é inesperadamente progressivamente com locomoção26,27. Da mesma forma, compartimentada Ca2 + sinalização no interneurônio RIA integra a atividade de neurônios sensoriais e neurônios cabeça durante movimentos46de forrageamento. Comportamento de defecação é também acompanhado de uma mudança de precisa e estereotipada de locomoção que permite que os animais se afastar de seu lugar de forrageio antes de expelir resíduos47. Juntos, estes resultados sugerem que a breves gravações de atividade de circuito de animais imobilizados podem ser fundamentalmente diferentes dos obtidos em livremente, comportando-se animais.

Apesar de ser directamente por baixo de uma lamela, comportamento do worm é semelhante ao visto em placas padrão de NGM. Ovos descontraídos vai continuar a eclodir, e a pequena quantidade de comida depositada permite que as larvas L1 para se transformar em adultos (dados não mostrados). O tamanho de bloco de ágar grande permite a troca gasosa razoável e resiste a desidratação, embora muita comida aumentará a fluorescência de fundo. Enquanto este método funciona melhor para adultos, a técnica também pode ser usado para animais de L4 de imagem. No entanto, a espessura da camada aquosa entre o bloco e a lamela é tal que larvas menores têm dificuldade rastejando e muitas vezes podem ficar preso na sequência de um adulto em movimento.

Uma limitação dessa técnica de montagem é que a estimulação mecânica ou química direta para regiões precisas do corpo é difícil. Desenvolvimentos recentes em técnicas de iluminação modelado permitem a excitação separada da cabeça ou cauda-expresso opsins microbianas com iluminação separada e detecção de fluorescência GCaMP/mCherry da número48,49. Como resultado, pode ser possível superar este problema usando abordagens optogenetic.

Comparações com outro Ca 2 + Abordagens de imagem:

Este método funciona muito bem para gravar alterações no citoplasmática Ca2 + do único, resolvidas as células e as suas regiões sinápticas. Imagem em tempo real, volumétrica de neurônios na cabeça foi recentemente conseguida usando a posição do núcleo de células para a identificação da célula e para dosar alterações no auxílio de cálcio50,,51,52. A relação entre nuclear e sináptica Ca2 + permanece obscura. Nossos dados sugerem que as mudanças mais visíveis no HSN intracelular Ca2 + ocorrem na termini pré-sináptica longe a soma da célula (Figura 4). A termini pré-sináptica do HSN e os neurônios VC é incorporados os músculos vulvares pós-sináptica26. Não está claro se haveria resolução suficiente na dimensão Z mesmo com girando o disco ou técnicas de folha de luz de atribuem pré-sináptica Ca2 + sinais de células específicas, sem depender de alguma forma somático cálcio para identificação de célula . Usando as técnicas descritas aqui, cada 10 min, dois canais de gravação com 12.001 256x256 pixel 16-bit TIFF imagens é ~ 4 GB. Relação proporção e intensidade modulada canais o dobro do tamanho do arquivo para ~ 8 GB. Um experimento típico de gravação 10 animais de cada um dos dois genótipos (tipo selvagem e experimentais) gera cerca de 150 GB de dados primários e requer 20 h para coletar e analisar. Análises volumétrica com 10 fatias de Z por commit exigiria uma ordem de magnitude mais dados e tempo analítico, explicando por que tão poucos tais estudos foram concluídos.

Ferragem:

Podemos gravar e analisar sequências de imagem com alto desempenho, estações de trabalho dual processador placas de vídeo (por exemplo, jogos), 64 GB de RAM, e drives de estado sólido de alta performance (ver Tabela de materiais). Dados devem ser armazenados na rede matriz redundante de discos independentes (RAID) e backup para a nuvem em um centro de dados off-site.

Recomendamos que usando de alta potência colimado LEDs para a excitação da fluorescência pulsado sobre iodetos metálicos ou fontes de luz à base de mercúrio. Vários sistemas de LED multi cores disponíveis comercialmente estão disponíveis. Enquanto alguns desses sistemas de LED têm um custo inicial mais alto, eles têm uma longa vida (> 20.000 h), podem simultaneamente excitar quatro ou mais diferentes fluorophores e oferecem controle temporal preciso, usando um serial e/ou interface TTL com baixa latência (10-300 µs alternar tempo). Desencadeando garante que a amostra só acende quando na verdade estão sendo recolhidos. Normalmente usamos uma exposição de 10 ms cada 50 ms (20% taxa de serviço). Isso reduz a fototoxicidade e borrão de movimento durante a captura de imagem, como relatado anteriormente,43.

Utilizamos câmeras de sCMOS pela sua velocidade e grande matriz de pixels pequenos, sensíveis. Uma câmera do CCD-EM é uma alternativa mais cara, mas efeitos de 'flor' podem resultar em capturados photoelectrons derramando em pixels adjacentes. Nova sCMOS back-iluminado câmeras têm fotossensibilidade semelhante da EM-CCDs a custo significativamente reduzido. De qualquer maneira que sensor é usado, os canais GCaMP5 e mCherry devem ser obtidos simultaneamente. Captura sequencial em mover vermes vai levar a Mal registradas imagens impróprias para quantificação de ratiometric. Imagem de canal duplo pode ser realizada em uma única câmera após a divisão de canais usando um divisor de imagem (Figura 2) ou usando duas câmeras idênticas. Sobre imagens de 8 bits para quantificação exacta ratiometric, recomenda-se a gama dinâmica das imagens de 16 bits. Para imagens de brightfield do comportamento de worm, capturamos usando uma câmera de 1 pol. 4.1 MP infravermelho USB3 para capturar grandes sequências de imagem de 8 bits 1.024 x 1.024 binned de 2 x 2 após a compressão JPEG. O FOV maior disponível em modelos mais novos do microscópio permite um verme adulto ser visualizado em 20 x depois x 0.63 demagnification com apenas leve vinheta (Figura 4E).

Recomendamos usar os sinais de tensão padrão TTL para sincronizar a iluminação e a captura de quadro. Por latências potenciais em diferentes softwares, recomendamos aos usuários configurar a câmara de fluorescência com saídas de gatilho como mestre com saídas TTL, deixando todos os outros dispositivos. Desta forma, informações de posição brightfield e fase serão coletadas para cada medição de Ca2 + .

Fenda - ou ressonantes microscópios confocal ponto-digitalização, tipicamente encontrados em instalações confocal compartilhadas também dar excelente desempenho durante a ratiometric Ca2 + imagem latente. Tais instrumentos podem ser usados para capturar dois ou mais canais de fluorescência juntamente com brightfield24. Neste caso, o pinhole confocal deve ser aberto para seu diâmetro máximo, e um detector espectral deve ser usado para separar os sinais infravermelhos brightfield, mCherry e GCaMP5. Isso maximiza a luz coleção de uma espessa (~ 20 µm) fatia ao ainda permitir a rejeição da fluorescência fora de foco. Uma desvantagem é o FOV menor e mais restrições para personalização de hardware e software.

Software:

A maioria dos fabricantes do navio e instalar suas câmeras e microscópios com software proprietário, incluindo configuração de desencadeamento de entradas e saídas. Podem variar os recursos e desempenho deste software durante a gravação. Porque, movendo-se rápido vermes pode ser um desafio para rastrear, imagem exibir durante a gravação deve ser suave e estável a 20 Hz. Para melhorar o desempenho, sequências de imagem podem ser temporariamente salva na memória RAM com subconjuntos comportamentalmente relevantes, salvos no final do experimento. Esses arquivos de sequência de dois canais de imagem podem ser convertidos para o formato de imagem Cytometry padrão aberto (ICS) para importar para o software de quantificação de Ratiometric. OME-TIFF é um formato de imagem aberto mais recente, embora diferentes instalações podem ser incapazes de salvar sequências de imagem TIFF maior que 4 GB.

Uma característica fundamental do pipeline de quantificação é a geração do canal de relação e, em seguida, um procedimento de segmentação de imagem imparcial usando mCherry fluorescência para encontrar células de interesse. De cada objeto encontrado, o tamanho do objeto, posição do centroide XY e o mínimo, quer dizer, e calculam-se valores de intensidade de fluorescência máxima para cada canal (incluindo o canal de relação). Juntos, esses valores são usados para dosar alterações intracelulares Ca2 + em cada commit na gravação. Medições de objeto para cada commit são então exportadas como arquivo a.csv para análises subsequentes.

Uma limitação importante do protocolo descrito aqui é a dependência de mover os dados em diferentes formas, através de uma colcha de retalhos de produtos de software. Uma irritação adicional é que algum do software aberto e livre, enquanto os outros estão fechados, caro e desigualmente atualizado. Uma melhoria principal seria usar ou desenvolver uma parte de software (idealmente aberto) que fornece níveis semelhantes de desempenho e facilidade de uso de aquisição para análise. Conforme observado acima, análise ratiometric dobra o tamanho do arquivo e o tempo necessário para realizar um experimento. Geração de condutores de câmera que podem ser integrados em estruturas personalizável pelo usuário como Bonsai permitiria imagens e outros fluxos de dados sejam coletados e analisados em tempo real, melhora significativamente a taxa de transferência.

Perspectivas futuras:

Enquanto nós normalmente rastrear movimentos de worm manualmente, rastreamento de centroide worm detectado em gravações de infravermelho brilhante - ou campo escuro deve permitir para nós que fornecem loop fechado de ajuste da posição de palco e automatizados de processamento de imagem adicional rastreamento (Figura 3 e dados não mostrados). A maioria das gravações de fluorescência obtidos com este método é escuro e desprovida de biologicamente interessantes dados. No sensor ou em tempo real pós-aquisição processamento de imagem técnicas que sequências de imagem para objetos relevantes de culturas permitiria para aumento de resolução espacial e agilizar o pipeline de análise de dados, particularmente se Z-fatias adicionais são coletadas para cada Commit para visualizar a atividade dentro de todas as células pré e pós-sinápticas no circuito.

Disclosures

Os autores declaram que não há interesses concorrentes existem.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado por uma concessão do NINDS para KMC (R01 NS086932). LMN foi apoiado por uma bolsa do programa de NIGMS IMSD (R25 GM076419). Estirpes utilizadas neste estudo c. elegans centro de genética, que é financiado pelo NIH escritório de programas de infra-estrutura de pesquisa (OD010440 P40). Agradecemos a James Baker e Mason Klein para debates úteis.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C. elegans growth, cultivation, and mounting
Escherichia coli bacterial strain, OP50 Caenorhabditis Genetic Center OP50 Food for C. elegans. Uracil auxotroph. E. coli B. Biosafety Level 1
HSN GCaMP5+mCherry worm strain Caenorhabditis Genetic Center LX2004 Integrated transgene using nlp-3 promoter to drive GCaMP5 and mCherry expression in HSN.  Full genotype:  vsIs183 [nlp-3p::GCaMP5::nlp-3 3'UTR + nlp-3p::mCherry::nlp-3 3'UTR + lin-15(+)], lite-1(ce314), lin-15(n765ts) X
lite-1(ce314), lin-15(n765ts) mutant strain for transgene preparation author LX1832 Strain for recovery of high-copy transgenes after microinjection with pL15EK lin-15(n765ts) rescue plasmid. Also bears the linked lite-1(ce314) mutation which reduces blue-light sensitivity. Available from author by request
pL15EK lin-15a/b genomic rescue plasmid author pL15EK Rescue plasmid for recovery of transgenic animals after injection into LX1832 lite-1(ce314), lin-15(n765ts) X strain. Available from author by request
pKMC299 plasmid author pKMC299 Plasmid for expression of mCherry in the HSNs from the nlp-3 promoter. Has nlp-3 3' untranslated region
pKMC300 plasmid author pKMC300 Plasmid for expression of GCaMP5 in the HSNs from the nlp-3 promoter. Has nlp-3 3' untranslated region
Potassium Phosphate Monobasic Sigma P8281 For preparation of NGM plates
Potassium Phosphate Dibasic Sigma P5655 For preparation of NGM plates
Magnesium Sulfate Heptahydrate Amresco 0662 For preparation of NGM plates
Calcium Chloride Dihydrate Alfa Aesar 12312 For preparation of NGM plates
Peptone Becton Dickinson 211820 For preparation of NGM plates
Sodium Chloride Amresco 0241 For preparation of NGM plates
Cholesterol Alfa Aesar A11470 For preparation of NGM plates
Agar, Bacteriological Type A, Ultrapure Affymetrix 10906 For preparation of NGM plates
60 mm Petri dishes VWR 25384-164  For preparation of NGM plates
24 x 60 mm micro cover glasses, #1.5 VWR 48393-251 Cover glass through which worms are imaged
22 x 22 mm micro cover glasses, #1 VWR 48366-067 Cover glass that covers the top of the agar chunk
Stereomicroscope with transmitted light base Leica M50 Dissecting microscope for worm strain maintenance, staging, and mounting
Platinum iridium wire, (80:20), 0.2mm ALFA AESAR AA39526-BW For worm transfer
Calcium imaging microscope
Anti-vibration air table TMC 63-544 Micro-g' Lab Table 30" x 48" anti-vibration table with 4" CleanTop M6 on 25mm top
Inverted compound microscope Zeiss 431007-9902-000 Axio Observer.Z1 inverted microscope
Sideport L80/R100 (3 position) Zeiss 425165-0000-000 To divert 20% of output to brightfield (CMOS) camera, 80% to fluorescence (sCMOS) camera
Tilt Back Illumination Carrier Zeiss 423920-0000-000 For infrared/behavior imaging
Lamphousing 12V/100W w/ Collector Zeiss 423000-9901-000 For infrared/behavior imaging
Halogen lamp 12V/100W Zeiss 380059-1660-000 For infrared/behavior imaging. White-light LEDs do not emit significant infrared light, so they will not allow brightfield imaging after the infrared bandpass filter
32 mm Infrared bandpass filter (750-790 nm) for Halogen lamp Zeiss 447958-9000-000 BP 750-790; DMR 32mm, for infrared illumination for brightfield and behavior
6-filter Condenser Turret (LD 0.55 H/DIC/Ph), Motorized Zeiss 424244-0000-000 For infrared/behavior imaging
Condenser & Shutter Zeiss 423921-0000-000 For infrared/behavior imaging
Binocular eyepiece with phototube for infrared CMOS camera Zeiss 425536-0000-000 For infrared/behavior imaging
Eyepiece 10x, 23mm Zeiss 444036-9000-000 For worm localization on the agar chunk
C-Mount Adapter 2/3" 0.63x demagnifier Zeiss 426113-0000-000 Mount for infrared CMOS camera
CMOS camera for infrared brightfield and behavior (1" sensor) FLIR (formerly Point Grey Research) GS3-U3-41C6NIR-C Camera for brightfield imaging
USB 3.0 Host Controller Card FLIR (formerly Point Grey Research) ACC-01-1202 Fresco FL1100, 4 Ports
8 pins, 1m GPIO Cable, Hirose HR25 Circular Connector  FLIR (formerly Point Grey Research) ACC-01-3000 Cable for TTL triggering. The green wire connects to GPIO3 / Pin 4 and the brown wire connects to Ground / Pin 5
Plan-Apochromat 20x/0.8 WD=0.55 M27 Zeiss 420650-9901-000 Best combination of magnification, numerical aperture, and working distance
6-cube Reflector Turret, Motorized Zeiss 424947-0000-000 For fluorescence imaging
Fluorescence Light Train, Motorized Zeiss 423607-0000-000 For fluorescence imaging
Fluorescence Shutter Zeiss 423625-0000-000 For fluorescence imaging
GFP and mCherry dual excitation and emission filter cube (for microscope) Zeiss 489062-9901-000 FL Filter Set 62 HE BFP+GFP+HcRed for fluorescence imaging
LED illumination system Zeiss 423052-9501-000 Triggerable Colibri.2 LED system for fluorescent illumination
GFP LED module (470 nm) Zeiss 423052-9052-000 Colibri.2 LED for GFP fluorescence excitation
mCherry LED module (590 nm) Zeiss 423052-9082-000 Colibri.2 LED for mCherry fluorescence excitation
Iris stop slider for incident-light equipment Zeiss 000000-1062-360 Field aperture iris to limit LED illumination to the camera field of view
C-Mount Adapter 1" 1.0x Zeiss 426114-0000-000 Adapter for image-splitter and sCMOS fluorescence camera
Image splitter Hamamatsu A12801-01 Gemini W-View, other image splitters may be used, but they may not be optimized for the large sensor size of the sCMOS cameras
GFP / mCherry dichroic mirror (image splitter) Semrock Di02-R594-25x36 Splitting GCaMP5 from mCherry and infrared signals
GFP emission filter (image splitter) Semrock FF01-525/30-25 Capturing GCaMP5 fluorescence
mCherry/ emission filter (image splitter) Semrock FF01-647/57-25 This filter is necessary to exclude the infrared light used for brightfield imaging
sCMOS camera for fluorescence (1" sensor) Hamamatsu A12802-01 / C11440-22CU Orca FLASH 4.0 V2. Newer models allow for separate image acquisition settings on separate halves of the sensor, allowing acquisition of two-channel images in combination with an image splitter
Motorized XY Stage Märzhäuser SCAN IM 130 x 100 Stage movement; the XY resolution of this stage is 0.2µm per step 
XY Stage controller with joystick LUDL MAC6000, XY joystick Manual tracking of worms. MAC6000 controller should be connected to the PC through the serial (RS-232) port configured to 115200 baud
Digital Acquisition board (DAQ) Arduino Uno Receiving TTL triggers from sCMOS camera. The Uno should be loaded with the standard Firmata package, and the computer USB port configured to 57600 baud
BNC Male to BNC Male Cable - 6 ft Hosa Technology HOBB6 BNC connectors for TTL triggering
Gold-Plated BNC Male to SMA male coaxial cable (8.8") uxcell 608641773651 To connect the fluorescence camera trigger outputs
BNC turn head adapter Hantek RRBNCTH21 BNC to Banana Plug Adapter (4mm)
BNC female to female connector Diageng 20130530009 Female to female BNC adapter to connect the BNC output from the camera to the Banana Plug
Solderless flexible breadboard jumper wires Z&T GK1212827 To connect the BNC trigger outputs to the Arduiono DAQ.  Male to male.
High performace workstation HP Z820 Windows 7, 64GB RAM, Dual Xeon processor, solid state C: drive, serial (RS-232) port, multiple PCIe3 slots for ethernet connectivity, USB 3.0 cards, and additional solid state drives
M.2 Solid state drive Samsung MZ-V5P512BW High-speed streaming and analysis of image data
M.2 Solid state drive adapter for workstations Lycom DT-120 M.2 to PCIe 3.0 4-lane adapter
Network attached storage Synology DS-2415+ Imaging data storage and analysis
Hard disk drives Western Digital WD80EFZX RED 8 TB, 5400 RPM Class SATA 6 Gb/s 128MB Cache 3.5 Inch. Storage of imaging data (10 drives + 2 drive redundancy)
Software
Fluorescence Acquisition Hamamatsu HCImage DIA Recording of two channel (GCaMP5 and mCherry) fluorescence image sequences at 20 fps
Brightfield Acquisition FLIR (formerly Point Grey Research) Flycapture Recording of brightfield JPEG image sequences
Stage Serial Port Reader Bonsai https://bitbucket.org/horizongir/bonsai Facilitates tracking of worms during behavior
LED controller software Zeiss Micro Toolbox Test 2011 To set up the intensity and trigger inputs for the different LEDs in the Colibri.2 unit
ImageJ  NIH https://imagej.net/Fiji/Downloads Simple review of image sequences and formatting changes for import into Ratiometric Quantitation software
Excel Microsoft  2002984-001-000001 For generating subsets of comma-separated value data from Volocity for MATLAB analysis
Peak Finding MATLAB R2017a Script used for Ratio peak feature calculations
Ratiometric Quantitation Perkin Elmer Volocity 6.3 Facilitates calculation of ratiometric image channels, image segmentation for object finding, and ratio measurement of found objects
Scripts
XY-stage-final.bonsai Bonsai TTL-triggered DAQ and stage position serial port reader Records X and Y stage position (in microns) when the attached Arduino receives a positive TTL signal from sCMOS camera during frame exposure. Script writes a .csv file with four columns: frame number, X position (microns), Y position (microns), and the time elapsed between frames (typically ~50 msec when recording at 20 fps).  X and Y stage position from this output (columns 2 and 3, respectively) are added to the X and Y centroid positions from the AnalyzeGCaMP_2017.m MATLAB script (columns 4 and 5, respectively), to give the final X and Y position of the fluorescent object for the recording. 

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References

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Imagem de cálcio Ratiometric de neurônios individuais se comportando <em>Caenorhabditis Elegans</em>
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Ravi, B., Nassar, L. M., Kopchock III, R. J., Dhakal, P., Scheetz, M., Collins, K. M. Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans. J. Vis. Exp. (132), e56911, doi:10.3791/56911 (2018).More

Ravi, B., Nassar, L. M., Kopchock III, R. J., Dhakal, P., Scheetz, M., Collins, K. M. Ratiometric Calcium Imaging of Individual Neurons in Behaving Caenorhabditis Elegans. J. Vis. Exp. (132), e56911, doi:10.3791/56911 (2018).

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